專利名稱：：一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，特別涉及一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：荷葉為睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaertn.)的葉片，主產(chǎn)于江蘇、浙江、湖南、湖北、安徽和江西等地，資源十分豐富，產(chǎn)量巨大。荷葉除了含有碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學(xué)成分外，還主要含有生物堿、多酚和黃酮三大類化合物，它在食用和藥用領(lǐng)域均有較廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明荷葉具有清除自由基、抗氧化、降脂減肥、抑菌、抗病毒、清熱解暑等作用?！侗静菥V目》中就有"荷葉服之，令人瘦劣，故單服可以消陰水浮腫之氣"的記載?！吨袊幍洹?005版記載有"清熱解暑，升發(fā)清陽，涼血止血"的功效。1991年月11月被衛(wèi)生部列入第二批既是食品又是藥品名單。由于荷葉具有較好的抗氧化、去脂減肥、降血壓、抑菌等作用，而且來源廣泛，價格低廉，是最有開發(fā)價值的植物之一。目前我國種植蓮藕的目的是為了收獲根莖食用，荷葉的利用率則很低。每年僅百噸左右應(yīng)用于食品、醫(yī)藥生產(chǎn)作為中草藥煎劑或其它保健品的輔料，剩余大部分荷葉都是作為肥料爛在荷田里，沒有得到有效的利用。國內(nèi)外較多的研究結(jié)果及本實驗室的研究證明均證明荷葉具有較強的抗氧化活性。目前，國內(nèi)外對與荷葉抗氧化活性有關(guān)；的發(fā)明專利申請僅見荷葉黃酮制備工藝或制備方法(專利申請?zhí)?00610069039.4;200610085626.2;02139048.7)及荷葉提取物的制備(專利申請?zhí)?00810018866.x;200610053065.8;200610141952.0;200610141953.5)。但專門針對荷葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝未見任何相關(guān)專利和研究報道。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)的高分子吸附材料，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積。由于其具有簡單易行、成本低、效率高、穩(wěn)定性好和容易再生等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取與分離工業(yè)生產(chǎn)中。本專利在實驗室前期對不同極性種類的大孔吸附樹脂篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上采用AB-8作為分離純化荷葉抗氧化活性物質(zhì)的填料。采用AB-8進(jìn)行分離、純化后獲得荷葉抗氧化活性物質(zhì)，該方法能對荷葉抗氧化活性進(jìn)行大幅度提高，其三價鐵還原抗氧化能力測試(FRAP)值由荷葉原料的85.26mg/g提高到荷葉抗氧化活性物質(zhì)的3.53g/g,增加到原來的41.4倍；其總多酚含量從荷葉原料的24.58mg/g提高到荷葉抗氧化活性物質(zhì)的132.78mg/g，增加到原來的5.4倍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種適合于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的低成本方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，其提取方法的步驟如下-(D.將荷葉在6(TC以下烘干、粉碎，過3050目篩，制備得到荷葉粉；(2).在荷葉粉中加入濃度為4080%的乙醇溶液進(jìn)行振蕩提取，提取溫度為5080'C，提取料液比為l:101:20(w/v),提取時間2060min，重復(fù)浸提25次，提取液濃縮后采用蒸餾水超聲溶解混懸液后上樣大孔吸附樹脂柱純化，采用動態(tài)上樣方式，以TLC(薄層層析)和三氯化鐵溶液監(jiān)測樹脂是否吸附飽和；(3).采用36倍柱床體積(BV)的蒸餾水洗脫，除去多糖、蛋白等水溶性雜質(zhì)；(4).采用35倍柱床體積(BV)的40~80%濃度的乙醇溶液洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥、粉碎、混合均勻后得到抗氧化活性物質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是.l.本發(fā)明采用價格低廉、來源廣泛的荷葉為原料制備強抗氧化的活性物質(zhì)；且工藝較為簡單，設(shè)備等投資較小，容易放大，較適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為深入開發(fā)荷葉功能性食品、提高其附加值奠定了基礎(chǔ)。2.所制備的抗氧化活性物質(zhì)產(chǎn)品適用于食品抗氧化劑、功能性食品和醫(yī)藥等行業(yè)的原料。圖1為荷葉抗氧化活性物質(zhì)提取、純化工藝流程圖。具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)一步詳述。實施例一本發(fā)明所涉及的從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法步驟如下(1).將荷葉烘干、粉碎，過40目篩，形成荷葉粉；(2).稱取400g荷葉粉，采用l:15(w/v)的料液比向該荷葉粉中加入6000mL濃度為60%乙醇溶液，60'C振蕩提取時間30min,重復(fù)浸提3次，提取液合并后釆用大孔吸附樹脂AB-8動態(tài)上樣進(jìn)行純化；以TLC(薄層層析)和三氯化鐵溶液監(jiān)測柱子流出液，至開始有泄漏時停止上樣；(3).采用6倍柱床體積的蒸餾水洗脫，充分洗凈多糖、蛋白等大量水溶性雜質(zhì)；(4).釆用60X的乙醇溶液洗脫至TLC和三氯化鐵溶液監(jiān)測樹脂洗脫液中沒有抗氧化活性物質(zhì)流出為止，洗脫液合并、濃縮、冷凍干燥，粉碎并混合均勻后得到荷葉抗氧化活性物質(zhì)產(chǎn)品28.90g。將此粉末產(chǎn)品用無水乙醇配制成50、100和150ng/mL溶液，以相同濃度的BHT(2,4二叔丁基甲基苯酚)、槲皮素和銀杏葉提取物(GBE)為陽性對照采用測定總還原力、FRAP法抗氧化能力和清除DPPH自由基測試各樣品的抗氧化能力，其結(jié)果如表l、2、3所示。表1樣品FRAP法抗氧化能力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2樣品總還原力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3樣品DPPH自由基清除率測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表格中同一行不同字母表示相同濃度的不同樣品具有不同水平的顯著性差異由表l、2、3可以看出，采用實施例一中的提取、分離和純化工藝經(jīng)AB-8純化后的荷葉抗氧化活性物質(zhì)具有很強的抗氧化活性，其抗氧化能力(OD593值和DPPH自由基清除率)盡管比相同濃度的陽性對照Vc弱(PO.001或PO.Ol),但在50-150ng/mL濃度范圍內(nèi)均顯著性高于另外兩個陽性對照BHT和銀杏葉提取物(PO.001或PO.01)。在總還原力的測定結(jié)果中，荷葉抗氧化活性物質(zhì)的還原能力盡管低于BHT和Vc，但仍顯著性高于陽性對照銀杏葉提取物(PO.01或PO.OOl)。實施例二(1).將荷葉烘干、粉碎，過30目篩，形成荷葉粉；(2).稱取200g荷葉粉，釆用l:IO的料液比(w/v)向該荷葉粉中加入2000mL濃度為70%乙醇溶液，70'C振蕩提取時間40min，重復(fù)浸提3次，提取液合并后采用大孔吸附樹脂AB-8動態(tài)上樣進(jìn)行純化；以TLC(薄層層析)和三氯化鐵溶液監(jiān)測柱子流出液，至開始有泄漏時停止上樣；(3).釆用3倍柱床體積的蒸餾水洗脫，洗去多糖、蛋白等水溶性雜質(zhì)；(4).采用70X的乙醇溶液洗脫至TLC和三氯化鐵溶液監(jiān)測樹脂洗脫液中沒有抗氧化活性物質(zhì)流出為止，洗脫液合并、濃縮、冷凍干燥，粉碎并混合均勻后得到荷葉抗氧化活性物質(zhì)產(chǎn)品15.55g。將此粉末產(chǎn)品用無水乙醇配制成50、100和150pg/mL溶液，以相同濃度的BHT、槲皮素和銀杏葉提取物(GBE)為陽性對照采用測定總還原力、FRAP法抗氧化能力和清除DPPH自由基測試各樣品的抗氧化能力，其結(jié)果如表4、5、6所示。表4樣品FRAP法抗氧化能力測定結(jié)果樣品荷葉抗氧化活性物質(zhì)銀杏葉提取物BHTVc濃度統(tǒng)計分析OD593501.059±0.0130.423±0.0070.502±0.0222.123±0.027PO.001BDCA1000.781±0.0210.289±0.0410.434±0.021.621±0.019PO.001BDCA1500.413±0.0160.132±0.0040.256±0.0080.801±0.032P<0.001BDCA表格中同一行不同字母表示相同濃度的不同樣品具有不同水平的顯著性差異6表5樣品總還原力測定結(jié)果樣品荷葉抗氧化活性物質(zhì)銀杏葉提取物BHTVc濃度((xg/mL)統(tǒng)計分析OD700500.179±0層0.048±0.0040.323±00.581逸009PO.001CDBA1000.330±0.0040.010±0.0020.574±0.0121.242±0.012P<0.001CDBA1500.580±0.0110.167±0.0020.733±0.0111.886±0.035PO.01CDBA表格中同一行不同字母表示相同濃度的不同樣品具有不同水平的顯著性差異表6樣品DPPH自由基清除率測定結(jié)果樣品荷葉抗氧化活性物質(zhì)銀杏葉提取物BHTVc濃度統(tǒng)計分析DPPH自由基清除率(％)5069.294±1.83026.235±0.83265.765±1.16584.353±0.166PO.05BDCA10072.352±0.16656.353±0.16668.353±0.49994.706±1.165P<0.01BDCA15075.765±070.588±0.66666.353±0.66695.294±0.333PO.OlBCDA表格中同一行不同字母表示相同濃度的不同樣品具有不同水平的顯著性差異由表4、5、6可以看出，在本發(fā)明的工藝范圍內(nèi)改變提取和分離純化參數(shù)后獲得的荷葉抗氧化活性物質(zhì)仍具有很強的抗氧化活性，其抗氧化能力(OD593值和DPPH自由基清除率)盡管比相同濃度的陽性對照Vc弱(P<0.05、P<0.01或PO.OOl),但在50-150ng/mL濃度范圍內(nèi)均顯著性高于另外兩個陽性對照BHT和銀杏葉提取物(P<0.05、PO.01或P<0.001)。在總還原力的測定結(jié)果中，荷葉抗氧化活性物質(zhì)的還原能力盡管低于BHT和Vc(PO.001或PO.Ol)，但仍顯著性高于陽性對照銀杏葉提取物(PO.Ol或PO.001)。通過FRAP法抗氧化能力、總還原力和DPPH自由基清除率的測定結(jié)果可以得出結(jié)論，采用本專利所提出的工藝獲得的提取液經(jīng)大孔吸附樹脂AB-8純化后的荷葉提取物具有非常強的抗氧化活性，可以作為抗氧化保健食品的主要原料來源。權(quán)利要求1、一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于按照下述方法進(jìn)行(1).將荷葉在60℃以下烘干、粉碎，過30～50目篩，制備得到荷葉粉；(2).在荷葉粉中加入濃度為40～80％的乙醇溶液進(jìn)行振蕩提取，提取溫度為50～80℃，提取料液比以質(zhì)量與體積之比計為1∶10～1∶20，提取時間20～60min，重復(fù)浸提2～5次，提取液濃縮后采用蒸餾水超聲溶解混懸液后上樣大孔吸附樹脂柱純化，采用動態(tài)上樣方式，以薄層層析和三氯化鐵溶液監(jiān)測樹脂是否吸附飽和；(3).采用3～6倍柱床體積的蒸餾水洗脫，除去多糖、蛋白等水溶性雜質(zhì)；(4).采用3～5倍柱床體積的40～80％濃度的乙醇溶液洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥、粉碎、混合均勻后得到粉末狀抗氧化活性物質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂優(yōu)選AB-8型大孔吸附樹脂。全文摘要本發(fā)明一種從荷葉中提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域。按照下述方法進(jìn)行(1)將荷葉在60℃以下烘干、粉碎，過30～50目篩，制備得到荷葉粉；(2)在荷葉粉中加入濃度為40～80％的乙醇溶液進(jìn)行提取，提取溫度50～80℃，提取料液比為1∶10～1∶20，提取時間20～60min，提取2～5次，提取液濃縮后采用蒸餾水超聲溶解混懸液后上樣AB-8型大孔吸附樹脂柱純化；(3)采用3～6倍柱床體積的蒸餾水洗脫，除去雜質(zhì)；(4)采用3～5倍柱床體積的40～80％濃度的乙醇溶液洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥、粉碎、混合均勻后得到粉末狀抗氧化活性物質(zhì)。本發(fā)明工藝較為簡單，設(shè)備等投資較小，為深入開發(fā)荷葉功能性食品、提高其附加值奠定了基礎(chǔ)。文檔編號A61K36/185GK101612201SQ20091018153公開日2009年12月30日申請日期2009年7月20日優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日發(fā)明者任曉鋒,何榮海,吳士云,江慎華,王振斌,蔡健榮,馬海樂,琳駱申請人:江蘇大學(xué)