專利名稱：一種半枝蓮制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥提取分離及制劑的制備，更具體的說是臨床一種具有抗腫 瘤、抗病毒、提高機體免疫力的半枝蓮提取物及其制備方法，及以該提取物為 主要成分制成的各種中藥制劑。屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
半枝蓮分布資源極其豐富，在我國用于臨床己有幾百年歷史，但以往由于 缺乏對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機理的研究，影響了它的開發(fā)與利用。半枝蓮主要含 黃酮、多糖、甾醇、有機酸、生物堿等類成分。半枝蓮中的總黃酮尤其是野黃 芩苷含量的高低與其療效有相關(guān)性。因此，有效的開發(fā)和利用半枝蓮中黃酮類 化學成分具有重要的意義。
基于上述目的，我們從臨床有效方藥中拆方篩選出有效抗腫瘤、抗病毒、 提高機體免疫力藥物半枝蓮，對其有效化學成份、藥理藥效及作用機理等方面 進行了廣泛的研究，在此基礎(chǔ)上研制了單味半枝蓮總黃酮制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是要提供一種對多種腫瘤細胞具有生長抑制 作用，而對正常組織無傷害、同時具有抗病毒、提高機體免疫力作用，且質(zhì)量 比較容易控制，總黃酮含量高的半枝蓮提取物制劑，以提高臨床療效。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供了制備以半枝蓮提取物有效部位為主要活 性成分的各種中藥制劑的制備工藝。
為解決上述問題，本發(fā)明研究制定了如下技術(shù)方案
一種半枝蓮抗癌、抗病毒、提高機體免疫力制劑，是以半枝蓮總黃酮提取 物或提取液為主要成分；所說的半枝蓮總黃酮提取物中總黃酮含量大于75%;所說的半枝蓮總黃酮提取液中總黃酮含量大于5%。
上述半枝蓮總黃酮提取物或提取液中富含野黃芩苷、蘆丁等黃酮類成分
(見附圖3~5)。所述半枝蓮總黃酮提取物中，野黃芩苷含量為25%~40%以上。 所述半枝蓮總黃酮提取液中，野黃芩苷含量為1.5%~3%以上。 本發(fā)明半枝蓮制劑的制備方法和步驟如下
(1)總黃酮提取液制備將半枝蓮全草粗粉碎，用0.1%~0.3% (W/W)精 氨酸水溶液(pH6.0 8.5);常溫浸泡、攪拌提取，得pH值為7~9的半枝蓮總 黃酮提取液，其總黃酮含量大于5%;
(2) 總黃酮提取物制備將步驟(1)得到的提取液用20% (W/W)醋酸 調(diào)pH2 3或用10% (W/W)鹽酸調(diào)pH3 4放置，分離、洗滌沉淀即為半枝蓮總 黃酮提取物，其總黃酮含量在75%以上；
(3) 將步驟(2)的半枝蓮總黃酮提取物和半枝蓮納米粉按質(zhì)量比分別 為15%~55%和45%~85%混合制成口服固體制劑；
或者是將步驟(1)得到的半枝蓮水提液，微米濾膜濾過去除雜質(zhì)制成
液體制劑；口服液體制劑中半枝蓮總黃酮含量為5% 35%;
或者是將步驟(2)的半枝蓮總黃酮提取物加精氨酸水溶液溶解，微米
濾膜過濾，制成口服液體制劑，口服液體制劑中半枝蓮總黃酮含量為5% 35%。 本發(fā)明中所說的口服固體制劑包括顆粒劑、片劑、微丸。半枝蓮納米粉是
半枝蓮全草經(jīng)超微粉碎后粒徑在50nm 150nm范圍，植物細胞100%破壁。 本發(fā)明中所說的口服液體制劑包括口服液、合劑，口服液體制劑中半枝蓮
總黃酮含量為5%~35%。
本發(fā)明所制備的半枝蓮總黃酮提取物含量測定方法包括以下方法中的一
種或兩種
A、總黃酮取野黃芩苷對照品，加甲醇制成每lml含0.28mg的溶液，搖勻，即得對 照品溶液；精密吸取對照品溶液0.4， 0.8， 1.2， 1.6， 2.0ml ，分別加0.3%精 氨酸溶液至25ml ，以0.3°/。精氨酸溶液為空白，照分光光度法(中國藥典2005 年版一部附錄VIA )，在327nm的波長處測定吸收度，以濃度為橫坐標，吸 收度為縱坐標，繪制標準曲線；精密吸取半枝蓮總黃酮提取液，以0.3%精氨 酸溶液為空白，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄VIA),在327nm 的波長處測定吸收度，計算，即得；本半枝蓮總黃酮提取物含總黃酮以野黃苳 苷(C21H18012)計，不得少于75%。
B、野黃芩苷
照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定。用十八烷 基硅垸鍵合硅膠為填充劑，體積比為35:61:2的甲醇:水:醋酸為流動相，檢測波 長為327nm;理論板數(shù)按野黃芩苷峰計算，不低于1500;精密稱取野黃苳苷 對照品，加流動相制成每lml中含野黃芩苷0.88mg的溶液，搖勻，即得對照 品溶液；取本半枝蓮總黃酮提取物作為供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液 與供試品溶液各10^1，注入液相色譜儀，測定，計算，即得；本半枝蓮總黃酮 提取物含野黃芩苷不得少于25%。見附圖4~5。
本發(fā)明所述的口服制劑，用于臨床的劑量為每日服用按生藥材計30 60g。
本發(fā)明的優(yōu)點在于
(1) 半枝蓮總黃酮中藥制劑為單味中藥的有效成分組成，是一種以抑制血管再 生為作用靶點的抗腫瘤藥物，并有抗病毒、提高機體免疫力的作用。經(jīng)動物實 驗觀察表明，產(chǎn)品吸收利用度好，無不良反應(yīng)，療效好，經(jīng)濟安全。
(2) 本發(fā)明選用材料科學，制備工藝簡單先進、經(jīng)濟實用，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。 由于半枝蓮總黃酮中大部分是黃酮苷類，少量或不含黃酮苷元類，極易溶于堿 性溶液。同時考慮黃酮類化合物對酸堿的不穩(wěn)定性。故本發(fā)明使用了一種前未有的有效提取方法，將精氨酸水溶液作為總黃酮提取溶劑。本發(fā)明中還將原 藥材納米粉碎，也是創(chuàng)新之一。
(3) 半枝蓮總黃酮提取液經(jīng)過實驗驗證，活性炭對半枝蓮中黃酮類成分有強烈 的吸附作用，所以在制備工藝中沒有選用活性炭處理。
(4) 本發(fā)明半枝蓮總黃酮中藥制劑為純中藥制劑，因此避免了服用和注射西藥 所帶來的過敏反應(yīng)和一些毒副作用。異常毒性檢查結(jié)果表明，半枝蓮總黃酮溶 液對小鼠異常毒性試驗合格；全身過敏試驗結(jié)果表明，半枝蓮總黃酮溶液對豚 鼠無全身過敏反應(yīng)；刺激性試驗結(jié)果表明，局部刺激性試驗符合規(guī)定。


圖1為半枝蓮黃酮提取物對HUVEC內(nèi)皮細飽小管形成的影晌對照圖；其中A: 對照；B D: 25、 50、 100mg/L半枝蓮黃酮提取物
圖2為半枝蓮黃酮提取物對內(nèi)皮細飽遷移的影晌；其中A:對照；B D: 25、
50、 100mg/L半枝蓮黃酮提取物
圖3為戸丁標準品HPLC圖譜。
圖4為野黃芩苷標準品HPLC圖譜。
圖5為半枝蓮黃酮提取液HPLC圖譜。
具體實施例方式
實施例l:各種藥物制劑的制備實例
(1) 總黃酮提取液制備將半枝蓮全草粗粉碎，用0.1%~0.3% (W/W)精氮酸 水溶液(pH6.0 8.5);常溫浸泡、攪拌提取，得pH值為7 9的半枝蓮總黃酮
提取液，其總黃酮含量大于5%;
(2) 總黃酮提取物制備將步驟(l)得到的提取液用20。/。(W/W)醋酸調(diào)pH2~3 或用10% (W/W)鹽酸調(diào)pH3 4放置，分離、洗滌沉淀即為半枝蓮總黃酮提取 物，其總黃酮含量在75%以上；(3)制備顆粒劑和片劑
按配置總量計稱取15%-55%的半枝蓮總黃酮提取物，加入45%-85% 的半枝蓮納米粉，充分攪拌混合均勻，以70% (V/V)乙醇做黏合劑，制成軟 材，過14目尼龍篩網(wǎng)制成顆粒，(將此濕顆粒直接可在包衣鍋中滾成微丸，無 需加任何輔料)，濕顆粒于60'C千燥2~3小時，干燥顆粒過14目篩整粒，使 每克顆粒含半枝蓮總黃酮提取物200~600mg既得。
將此干顆粒直接可壓成片劑。
制備口服液或合劑
按配置總量計稱取15%~55%的半枝蓮總黃酮提取物，加0.3%精氨酸水溶 液溶解稀釋至一定體積，調(diào)節(jié)pH6.5~8，冷藏24小時，濾過，濾液加水調(diào)整 總量達標示量，攪勻，0.22微米濾膜濾過，灌裝即得，使每毫升口服液含半枝 蓮總黃酮提取物50 300mg?；蛑苯訉胫ι徔傸S酮提取液采用流通蒸汽100°C 加熱30min， 4"C冷藏放置24h，經(jīng)0.22微米濾膜濾過，調(diào)配使每毫升口服液 含半枝蓮總黃酮提取物50~300mg灌裝即得。 實施例2:總黃酮含量測定方法 (1)紫外吸收波長的確立
精密稱取野黃岑苷對照品，加入0.3%精氨酸水溶液(pH8.5)，制成濃度為 0.028mg/mL的野黃芩苷對照品溶液，進行紫外全波長(190nm 900nm)掃描， 結(jié)果野黃芩苷在A^277nm和A^327mn處各有一個吸收峰，半枝蓮總黃酮提取液的 紫外吸收光譜與野黃苳甙的紫外吸收光譜基本一致。實驗證明，半枝蓮藥材中 其它脂溶性成分在277nm波長處也有紫外吸收,對該峰影響較大，而半枝蓮中總 黃酮以外的其它成分則在327nm波長處吸收很小。所以確定在327nm處測定半枝 蓮總黃酮的吸收度。 (2)標準曲線的建立精密稱取野黃芩苷對照品1.700mg，置10mL量瓶中，加入0.3%精氨酸水溶 液(pH8.5)至刻度，定容。精密吸取野黃芩苷對照品溶液0.4， 0.8， 1.2， 1.6， 2.0ml分別置于25ml量瓶中，力叫.3%精氨酸水溶液(pH8.5)至刻度，搖勻。按 2005年版中國藥典中紫外分光光度法項下，以0.3%精氨酸水溶液(pH8.5)為空 白，在327nm波長處分別測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，溶液濃度(X) 為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=14.369x-0.0211 ，r = 0.9994(n=5)， 結(jié)果表明半枝蓮總黃酮在0.0027072-0.0135360 mg'ml"呈良好的線性關(guān)系。
(3) 精密度試驗
將同一批次的半枝蓮提取液用上法重復(fù)檢測5次，計算提取液總黃酮含量， RSD為1.5。/。，精密度良好。
(4) 穩(wěn)定性試驗
取上述已測定的對照品溶液及樣品溶液，放置3、 6、 9、 12小時后，經(jīng)紫外 光譜測定，其吸收值基本不變，說明對照品溶液及樣品溶液都是很穩(wěn)定的。
(5) 加樣回收試驗
精密稱取已知總黃酮含量的半枝蓮黃酮提取液lml，共9份，分為低、中、 高3組，分別加入野黃芩苷對照品溶液(相當于野黃芩苷0.025、 0.050、 0.075mg)， 測定半枝蓮黃酮提取液中黃酮含量，計算回收率，RSD為1.87y。，結(jié)果見表l。
表l加樣回收率試驗結(jié)果
Groups Numbers content/mg added/mg found/mg Recovery/% Mean/% RSD/%
1 2.69 0.0258 2.7154 98.45
低 2 2.69 O.0251 2.7149 99.20
3 2.69 0'0249 2-7152 I01'"
^ ^ 0.0512 2.7414 100.39
巾 5 2.69 0.0519 2.7417 99.61 100.52 1.87
6 2.69 0.0517' 2.7432 102.90
^ ^ 0.0757 2.7682 103.31
8 269 0.0751 2.7663 101.60
9 76Q 0.0753 2.7638 98.01(6)樣品測定
取制備好的半枝蓮黃酮提取液，將提取液在327nm處測定吸收度，利用標準曲 線外標法定量，計算半枝蓮黃酮提取液中總黃酮的含量，結(jié)果見表2。
表2不同批次半枝蓮黃酮提取液總黃酮含量測定結(jié)果
Batches The amount of total flavone /mg.mr Mean /mg-mr
1 5.69
2 5.67
3 5.72 5.69±0.046
4 5.63
5 5.75
實施例3:療效觀察
材料和方法
(1) 材料
人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)、宮頸癌Hela細胞株由揚州大學醫(yī)學院中 醫(yī)藥研究所提供；半枝蓮黃酮類化合物提取物由揚州大學醫(yī)學院中醫(yī)藥研究所 提供；成纖維生長因子(bFGF)和Matrigel分別購自Sigma和BD公司；人 VEGF的ELISV試劑盒購自武漢博士德公司；NO試劑盒購自南京建成生物工 程研究所;AnnexinV聯(lián)合PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司； 將用二甲基亞砜(DMSO)、 M199及DMEM培養(yǎng)基配置成lg/L的母液，抽濾 后-2(TC保存，實驗當天取出稀釋成實驗所需濃度；HUVEC和Hela細胞均在 孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，以胰蛋白酶消化后進行傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。 在預(yù)實驗中通過MTT比色法確定半枝蓮黃酮提取物的IC10為104.08mg/L， 選擇與IC10接近的整數(shù)濃度并倍數(shù)遞減作為實驗的濃度。
(2) 方法
Q)內(nèi)皮細胞小管形成實驗將24孔板每孔加預(yù)先置4'C過夜的Matrigel300|il，在37。C、 50ml/LCO2培養(yǎng)箱中聚合lh,將HUVEC用胰酶消化 后用培養(yǎng)液調(diào)2xl()S/L濃度的細胞懸液，并添加10pg/LbFGF和分別25、 50、 100mg/L的半枝蓮黃酮提取物，另設(shè)空白組(孔內(nèi)加細胞不加藥)和溶媒對照 組(培養(yǎng)液中含有0.1g/LDMSO),混勻放入37。C、 50ml/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h后在100倍Olympus倒置顯微鏡下觀察小管形成的情況，每孔取5個視野計 數(shù)小管形成數(shù)，取平均值。
② 內(nèi)皮細胞遷移實驗將內(nèi)皮細胞消化后以lxl()S/L種入24孔板，在培養(yǎng) 基中加入半枝蓮黃酮提取物，藥物終濃度為25、 50、 100mg/L，終體積2ml，并 設(shè)陰性對照組和溶媒對照組共5組，37°C 、 50ml/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后消 化，并用無血清M199培養(yǎng)基調(diào)整密度為lxl08/L。在Tmnswell上室的聚碳酸 脂膜上加入3mg/L的Matrigel20pl,37。C聚合30min，在Transwell的下室加入 60(^1Hela細胞條件培養(yǎng)液，同時上室分別種入用無血清M199稀釋的內(nèi)皮細胞: 每孔100pl，培養(yǎng)18h后取出小室，用棉簽拭去濾膜上層未遷移的內(nèi)皮細胞，固 定，染色，用刀片取下濾膜，中性樹脂固定于載玻片上，在顯微鏡下隨機計數(shù) 中間和周圍共5個視野細胞數(shù)，各組計數(shù)4個樣本，求出平均值。
③ 對Hela細胞VEGF和NO表達的影響將Hela細胞消化后以3xl08/L 濃度種植6孔板，培養(yǎng)24h后,用PBS清洗2次，加入100mg/L NBS的DMEM 培養(yǎng)基和藥物，終濃度為25、 50、 100mg/L，終體積2ml，37°C、 50ml/LCO2培 養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h后收集培養(yǎng)上清，12000r/min離心lOmin,取上清經(jīng) 0.22jim濾膜抽濾后，用ELISA和NO試劑盒測定上清中VEGF和NO含量。
統(tǒng)計學處理:采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件分析,實驗結(jié)果以mean 士 SD表示，進 行方差分析和t驗驗。 (3)結(jié)果
(D半枝蓮黃酮提取物對內(nèi)皮細胞小管形成及遷移的影響25mg/L的低濃度 作用后對小管形成數(shù)無明顯影響，當濃度達到50mg/L以上時對小管形成有明顯影響，不僅小管數(shù)目減少，而且管腔不完整，與空白組相比有差異(PO.05)，濃度達到100mg/L時，很少有完整小管形成(表3，圖1)。HUVEC經(jīng)50、 100mg/L的半枝蓮黃酮提取物作用后，內(nèi)皮細胞的遷移數(shù)明顯減少(pO.Ol)，且遷移的內(nèi)皮細胞數(shù)隨著濃度的增加而減少(表3,圖2)。
表3半枝蓮黃酮提取物對內(nèi)皮細胞小管形成及遷移的影響mean士SD， n=4
分組_小管數(shù)/視野(％)_遷移(cell/視野)(％)
30.2±5.4 68.0±8.2溶媒對照 30.4±6.4 63.3±13.125mg/L 27.3±8.1 52.3±14.350mg/L 9.7±4.5a 37.7±10.7blOOmg/L_1.8±1.2a_13.7±6.0b_
ap<0.05, bp<0.01， vs對照組
表4半枝蓮黃酮提取物對Hela細胞分泌VEGF和N0的影響mean士SD， n=4
VEGF ng/L NOy mol/L
_^_^_^_^_
231.1±6.4 232.2±9.6 70.1±9.1 68.0±3.9
溶媒對照225.8±21.3225.0±11.0 71.2±3.8 66.0±3.8
25mg/L 169,5±12.5b 147.1±15,5b 60.2±5.2b 51.1±3.2b
50mg/L 135.6±14.6b 114.3±15.8b 42.3±2.3b 28.3±3.5blOOmg/L 108.3±7.7b77.8+10.8b_25.9±5.2b 14.7±5.6b
bp<0.01， vs對照組
②半枝蓮黃酮提取物對Hela細胞分泌VEGF和NO的影響半枝蓮黃酮提取物作用24h， 48h后能抑制Hela細胞VEGF的表達(p<0.01),但是作用24h后各組之間比較沒有差異，作用48h后，中、高濃度組(50、 100mg/L)之間比較有差異，且經(jīng)中、高濃度組作用后的Hda細胞VEGF表達24h和48h之間比較有差異(p<0.05)。 50、 100mg/L半枝蓮黃酮提取物作用細胞24h后能明顯抑制腫瘤細胞的NO表達，具有顯著差異，且各濃度組之間比較有差異作用后各濃度均能抑制細胞的表達，有顯著差異(pO.Ol)，且各濃度組之間比較有差異，作用48h后各濃度均能抑制Hela細胞NO的表達，有顯著差異(pO.Ol)，各組同一濃度體系，24h與48h相比在50， 10Omg/L時對NO表達影響具有顯著差異(p<0.01)，其他濃度相比沒有顯著差異(表4)。(4)結(jié)論
半枝蓮黃酮類化合物能抑制內(nèi)皮細胞小管樣結(jié)構(gòu)形成和腫瘤細胞條件培養(yǎng)液剌激下的內(nèi)皮細胞遷移，實驗表明其作用機制可能與其能抑制腫瘤細胞分泌NEGF及NO這些血管生成促進因子有關(guān)，為進一步探討半枝蓮在腫瘤治療方面的前景奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種半枝蓮制劑，其特征在于，是以半枝蓮總黃酮提取物或提取液為主要成分；所說的半枝蓮總黃酮提取物中總黃酮含量大于75％；所說的半枝蓮總黃酮提取液中總黃酮含量大于5％。
2. 按權(quán)利要求1所述的半枝蓮制劑，其特征在于，所述半枝蓮總黃酮提取物或 提取液中含有野黃芩苷、蘆丁。
3. 按權(quán)利要求2所述的半枝蓮制劑，其特征在于，所述半枝蓮總黃酮提取物 中，野黃芩苷含量為25%~40%。
4. 按權(quán)利要求2所述的半枝蓮制劑，其特征在于，所述半枝蓮總黃酮提取液 中，野黃芩苷含量為1.5% 3%。
5. 權(quán)利要求l中所述半枝蓮制劑的制備方法，其特征在于(1) 總黃酮提取液制備將半枝蓮全草粗粉碎，用pH6.0 8.5、 0.1% 0.3%精 氨酸水溶液常溫浸泡、攪拌提取，得pH值為7~9的半枝蓮總黃酮提取液，其 總黃酮含量大于5%。；(2) 總黃酮提取物制備將步驟(1)的提取液用20。/。醋酸調(diào)pH2 3或用10% 鹽酸調(diào)pH3 4放置，分離、洗滌沉淀即為半枝蓮總黃酮提取物，其總黃酮含 量在75%以上；(3) 將步驟(2)的半枝蓮總黃酮提取物和半枝蓮納米粉按質(zhì)量比分別為 15%~55%和45%~85%混合制成口服固體制劑；或者是將步驟(1)得到的半枝蓮水提液，微米濾膜濾過去除雜質(zhì)制成 液體制劑；口服液體制劑中半枝蓮總黃酮含量為5%~35%;或者是將步驟(2)的半枝蓮總黃酮提取物加精氨酸水溶液溶解，微米濾膜過濾，制成口服液體制劑，口服液體制劑中半枝蓮總黃酮含量為5%~35%。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種具有抗腫瘤、抗病毒、提高機體免疫力的半枝蓮制劑及其制備方法。所說的半枝蓮制劑是以半枝蓮總黃酮提取物或提取液為主要成分；所說的半枝蓮總黃酮提取物中總黃酮含量大于75％；所說的半枝蓮總黃酮提取液中總黃酮含量大于5％。本發(fā)明半枝蓮總黃酮中藥制劑為純中藥制劑，避免了服用和注射西藥所帶來的過敏反應(yīng)和一些毒副作用，具有選用材料科學，制備工藝簡單先進、經(jīng)濟實用，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。
文檔編號A61K36/539GK101623326SQ20091018318
公開日2010年1月13日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者平 卜, 俊 周, 瑾 李, 榮 胡 申請人:揚州大學