專利名稱：用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向給藥的藥物載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組輪狀病毒Vp6基因的表達(dá)及體外組裝，尤其涉及利用該組裝產(chǎn) 物用于淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病的靶向供藥(靶向治療性供藥、靶向造影和巨噬細(xì)胞標(biāo)記等)。
背景技術(shù)：
病毒樣顆粒(virus like particles, VLP)是一類無復(fù)制能力、由病毒蛋白自組裝成 的沒有基因組的蛋白質(zhì)。在一定的條件下，蛋白亞基可在體外環(huán)境中自組裝成籠型結(jié)構(gòu) 或其它形狀的病毒樣納米顆粒；它們有規(guī)則的結(jié)構(gòu)形態(tài)，在納米范圍內(nèi)不同的病毒具有 不同的尺寸(20nm-200nm);結(jié)構(gòu)有序，單分散性好；許多病毒的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)在原子水 平被解析；能大量的生產(chǎn)，得到克級(jí)甚至是公斤級(jí)的病毒粒子；有很大的表面積，內(nèi)表 面、外表面及亞基與亞基分界面，都可以用化學(xué)修飾的方法對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行修飾，特異 地連接上其它物質(zhì)，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)或材料科學(xué)；重復(fù)有序的表面結(jié)構(gòu)修飾上識(shí)別配體后， 能在總體上協(xié)同增強(qiáng)與細(xì)胞受體的親和力；通過基因重組的方法，可以按照人們的意圖 改造外表面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使其具有靶向性或能包裹特定的藥物，這樣可避免藥物聚集和 被體內(nèi)環(huán)境降解、增加藥物生物相容性、減少藥物毒性、增加體內(nèi)停留時(shí)間。所以較之 于合成的納米粒子，在載體應(yīng)用方面具有許多優(yōu)點(diǎn)。輪狀病毒(rotavirus RV)是一類消化道感染病毒，主要感染小腸上皮戎毛膜細(xì) 胞，然后感染游動(dòng)的淋巴細(xì)胞，并由淋巴細(xì)胞經(jīng)過淋巴循環(huán)而把病毒帶到身體各個(gè)部 位。RV主要的結(jié)構(gòu)蛋白Vp6在天然狀態(tài)下以三聚體形式存在，其晶體結(jié)構(gòu)已被解析。 在PH4的環(huán)境中，真核表達(dá)的Vp6可以自組裝成70nm左右的病毒樣顆粒。但是，真核 表達(dá)的蛋白量較少，表達(dá)成本較高，大大限制其在商業(yè)中的利用。 巨噬細(xì)胞活化綜合癥是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的過度活化及增殖引起的，以發(fā) 熱，肝脾、淋巴結(jié)腫大，全血細(xì)胞減少，輕至重度肝功能損害，神經(jīng)系統(tǒng)受累等為特征 的綜合征，又被認(rèn)為是繼發(fā)性或反應(yīng)性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多(hemophagocytic lymohohistiocymsis， HLH)。 MAS是慢性風(fēng)濕類疾病，尤其是全身性幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié) 炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis, SOJIA)患者中的嚴(yán)重的、潛在危及生命的并 發(fā)癥。 在腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)下，起源于骨髓的白細(xì)胞可分化形成具有獨(dú)特表型的巨噬 細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK)的抗腫瘤活性、支持腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管形成。這些細(xì)胞 被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage, TAM)。 在某些情況下，TAM可 構(gòu)成實(shí)體瘤細(xì)胞群體的50% 80%，這種TAM的廣泛浸潤與乳腺癌、宮頸癌及膀胱癌的 不良預(yù)后相關(guān)。 對(duì)于MAS和TAM，目前尚無特異的靶向藥物，迫切需要一種安全有效的靶向載 體進(jìn)行巨噬細(xì)胞的特異性治療。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際藥物研制應(yīng)用中的迫切需求，本發(fā)明的目的在 于提供一種用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體及其制法，利用輪狀病毒外殼蛋 白體外自組裝和巨噬細(xì)胞特異性靶向的特性，經(jīng)化學(xué)修飾，可把治療性藥物或示蹤性藥 物定向到巨噬細(xì)胞。
本發(fā)明的第一個(gè)目的，其實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案是 用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體，其特征在于該藥物載體為對(duì)巨 噬細(xì)胞有特異識(shí)別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經(jīng)原核表達(dá)、自組裝而成的病毒樣顆 粒。 進(jìn)一步地，前述用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體，其中該病毒樣顆 粒為中空結(jié)構(gòu)，且其內(nèi)表面或外表面化學(xué)修飾有藥物分子，所述藥物分子包括治療性藥 物或示蹤性藥物或兩者混合。
本發(fā)明的第二個(gè)目的，該藥物載體制法的技術(shù)方案是 用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其特征在于首先提 取A組輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因；然后將這些結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因克隆到原核表達(dá)載 體；再在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)；最后把表達(dá)的蛋白與藥物進(jìn)行交聯(lián)、組裝成病毒 樣顆粒。 進(jìn)一步地，前述用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其中 該結(jié)構(gòu)蛋白Vp6的來源包括猴的輪狀病毒Vp6基因、豬的輪狀病毒Vp6基因和人的輪狀 病毒Vp6基因，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，可以選用這些Vp6基因的其中的一種，也可以選用 多種混合使用。 更進(jìn)一步地，前述用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其 中該病毒樣顆粒與治療性藥物或示蹤性藥物的組裝為體外組裝。 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在利用病毒樣顆粒對(duì)巨噬細(xì)胞的特異性識(shí)別能力，把 藥物輸送到巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶向供藥和緩釋的功能，能有效降低藥物的用量和毒性，避 免體內(nèi)環(huán)境對(duì)藥物的降解，提高治療效果；同時(shí)，利用原核表達(dá)的方法及輪狀病毒蛋白 Vp6體外組裝的特性，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)，并降低制造成本。


圖1是輪狀病毒Vp6蛋白純化和表達(dá)的示意圖； 圖2是輪狀病毒Vp6蛋白復(fù)性的示意圖； 圖3a是輪狀病毒Vp6標(biāo)記阿霉素后的照片示意圖； 圖3b是對(duì)標(biāo)記后的輪狀病毒Vp6通過考馬斯亮藍(lán)染色的照片示意圖； 圖4是對(duì)標(biāo)記后的輪狀病毒Vp6采用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)示意圖； 圖5a是本發(fā)明病毒樣顆粒的電鏡照片示意圖； 圖5b是本發(fā)明病毒樣顆粒的原子力顯微鏡照片示意圖； 圖6A是本發(fā)明病毒樣顆粒與巨噬細(xì)胞孵育后的熒光顯微鏡示意圖； 圖6B是圖6A的陰性對(duì)照示意圖； 圖7A是本發(fā)明病毒樣顆粒與A549細(xì)胞孵育后的熒光顯微鏡示意 圖7B是圖7A的陰性對(duì)照示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用的Vp6基因均為A組輪狀病毒，分別是來源于猴的輪狀病毒Vp6基 因；人的Vp6基因和豬的Vp6基因。這些基因及編碼的蛋白分別見序列1、 2、 3，各是 由1356個(gè)核苷酸組成，編碼397個(gè)氨基酸，開放閱讀框?yàn)?4-1217位核苷酸。把這些基 因克隆到原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得到分子量在45KD左右的 蛋白質(zhì)，再把表達(dá)的蛋白與藥物進(jìn)行交聯(lián)，進(jìn)行體外組裝，得到巨噬細(xì)胞的靶向藥物載 體。 本發(fā)明用于巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病靶向給藥的藥物載體的詳細(xì)制法為
—、質(zhì)粒的構(gòu)建 培養(yǎng)的病毒經(jīng)由RT-PCR，獲得Vp6的編碼基因。操作是
在正向引物(Ps: 5' ATCATATGGATGTT TTGTATTCA-3')禾P3'端反向引物 (PAs: 5' -ATCCGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC-3')中分別引入限制性核苷酸內(nèi)切酶 位點(diǎn)Ndel和Sacl(下劃線)。VP6編碼基因擴(kuò)增反應(yīng)體系為100微升，其中模板DNA(攜 帶RV VP6基因的質(zhì)粒pTB-VP6)1微升；10XPCR緩沖液10微升；dNTPs(25mmol/L)2.5 微升；引物Ps(20pmo1/微升)和Pas(20pmo1/微升)各2微升；Taq酶(3U/微升)1.5微升， 滅菌超純水81微升。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3分鐘；94。C變性30秒，56。C退火 30秒，72t:延伸反應(yīng)40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸IO分鐘。VP6基因的PCR產(chǎn) 物經(jīng)純化后，用Nde I/Sac I雙酶切，制備插入基因片段。表達(dá)質(zhì)粒pET同樣經(jīng)Nde I/Sac I雙酶切，制備載體基因片段。插入基因片段和載體基因片段經(jīng)T4DNA連接酶連接后， 轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切鑒定，篩選陽性菌落，制備攜帶VP6編碼基因的重組表 達(dá)質(zhì)粒pET-VP6，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。
二、蛋白的表達(dá) 經(jīng)核苷酸序列測(cè)定證明準(zhǔn)確無誤后，將該重組質(zhì)粒pET-VP6轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感 受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含Amp+LB培養(yǎng)基平皿中，37t:過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落接種 于含3ml(含氨芐青霉素)LB培養(yǎng)液試管中培養(yǎng)6h后，取50微升培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)于250ml LB 培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素200微克/毫升)，于37t:(12 16小時(shí))培養(yǎng)表達(dá)。4,000rpm/ min離心收集菌體，加超聲裂解緩沖液(200mmol/LNaCl， 50mmoL/L Tris， 5%甘油，5% Triton X-IOO， 2mmol/LEDTA， lmmol/L DTr)懸浮，于冰水浴中超聲破碎菌體。裂解液 經(jīng)12,000rpm/min， 4°C， 30min離心，棄上清，沉淀(主要是包涵體蛋白)用8mol/L尿素 溶解后，分裝保存于-20%冰箱。
三、重組表達(dá)VP6的SDS PAGE檢測(cè) 取樣品20微升，加5微升5倍樣品變性緩沖液，10(TC煮沸5分鐘，進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳(5X濃縮膠，12%分離膠)，電壓60V。當(dāng)溴酚藍(lán)跑至凝膠底部時(shí)， 停止電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液[10% (V/V)醋酸，5X(V/V)乙醇]脫色。 四、VP6蛋白的純化與復(fù)性 VP6蛋白的純化溶解在8moL/L尿素中的包涵體蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠(5X
5的濃縮膠，10%的分離膠)分離，用150mmol/L KC1顯色，切膠收集VP6所在位置的膠 條，膠條中的VP6蛋白經(jīng)15X的SDS-PAGE凝膠柱回收至溶液中，在收集的含VP6蛋 白的溶液中加入20mmol/L的KCI除去SDS，用12%的PAGE檢測(cè)純化效果。VP6純化 蛋白的復(fù)性實(shí)驗(yàn)將經(jīng)純化的VP6蛋白溶液稀釋(蛋白濃度40.5mg/ml)，并向其中加入 尿素至濃度為8mol/L，同時(shí)加入含100mmol/LTris-Cl(pH8.5)， 10mmol/L GSH， lmmol/L GSSG， 2mmol/LEDTA， 50mmol/LDTT，在室溫放置2 3h。將上述蛋白液裝入透析袋 內(nèi)，并置透析袋于裝有復(fù)性液的燒杯中，4t:磁力攪拌透析。各復(fù)性液除尿素濃度分別為 6、 4、 2、 lmol/L不同外，其余各組成成分相同(100mmol/L NaCl、 50mmoL/L Tris-HCl、 lmmol/LGSSG、 lmmol/LGSH。 pH8.5)，每次透析8h，然后用10mmol/LPBS(含lmmo1/ L GSSG， lmmol/L GSH)pH7.4透析8h，之后更換大體積10mmol/L PBS(pH7.4)透析12h。 復(fù)性結(jié)束后將透析袋放入蔗糖中濃縮，濃縮后的樣品離心去除沉淀，復(fù)性蛋白用非變性 及非還原凝膠電泳檢測(cè)。 表達(dá)和純化的蛋白如圖l所示，從左往右的方向，第一泳道為蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)(KD)，從上到下分別是97.4、 66.2、 43、 31、 20.1;第二和第四泳道都為在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達(dá)的Vp6，可見在43KD附件出現(xiàn)表達(dá)的條帶。第三泳道為純化的蛋白； 第五泳道為未加表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌的對(duì)照。 復(fù)性的蛋白如圖2所示，左邊的為純化的蛋白，右邊的復(fù)性的蛋白，蛋白在復(fù)
性后遷移率降低。五、Western blot檢測(cè) 蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至(轉(zhuǎn)移條件為恒流160mA， 1.5h)硝 酸纖維膜上；硝酸纖維膜在4。C封閉液[5% (w/V)脫脂奶粉/TBST(20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/LNaCl， 0.05% Tween-20)]中封閉過夜；經(jīng)與一抗豚鼠抗SA11抗血清(1 : 200 稀釋)和二抗(山羊抗豚鼠IgG)l : 1,000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG反 應(yīng)；最后用底物DAB(二氨基聯(lián)苯胺四羥基鹽酸)顯色。 六、阿霉素通過EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽反應(yīng)交聯(lián) 到蛋白Vp6上 復(fù)性后的Vp6按摩爾比為Vp6 : NHS(碳二亞胺)EDC :阿霉素=
l:5:2: i的比例，4。c反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)后的樣品裝入透析膜(截留分子量
8000-14000)中進(jìn)行透析，透析液為pH7.4的磷酸鹽緩沖液，4。C透析48小時(shí)，其間每隔
12小時(shí)換液一次。 1)、阿霉素標(biāo)記的檢測(cè) 如圖3a和圖3b所示，用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳和表面拉曼增強(qiáng)光譜對(duì)標(biāo)記的 蛋白進(jìn)行檢測(cè)。圖3a所示的Vp6標(biāo)記上阿霉素后，由于阿霉素本身帶有紅色，電泳后可 見Vp6的紅色條帶(圖3左)，圖3b所示的為同一塊膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，可見標(biāo)記了 阿霉素的Vp6電泳比Vp6本身的蛋白電泳速度要稍慢，因?yàn)榻宦?lián)后蛋白分子量變大，且 所帶負(fù)電荷減少。 本申請(qǐng)發(fā)明人還利用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)標(biāo)記后的Vp6進(jìn)行了檢測(cè)。由于Vp6 本身沒有拉曼信號(hào)，而阿霉素在經(jīng)納米銀顆粒(20-100納米)增強(qiáng)后有比較強(qiáng)的拉曼信 號(hào)。如圖4所示，峰的歸屬為383 : S (C = 0) ; 453 : S (C = 0) ; 1230 : S (0-H);1266 : S (0-H) ; 1330 : ring stretch ; 1401 : ring stretch。
2)、阿霉素標(biāo)記后蛋白的組裝 透析后的帶有阿霉素分子的Vp6蛋白在PBS磷酸鹽緩沖液(pH3-PH7)中進(jìn)行組 裝4t:-3(TC， 2-20小時(shí)，組裝完后在水中充分透析。
3)、組裝后的表征 如圖5a和圖5b所示，分別用電鏡和原子力顯微鏡對(duì)組裝的病毒樣顆粒進(jìn)行形貌 表征，觀察到30-80納米的病毒樣顆粒。 上述方法所制備的藥物載體，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Vp6-Dox病毒樣顆粒在巨 噬細(xì)胞RAW和肺上皮細(xì)胞A549中的分布。
第一步、細(xì)胞的培養(yǎng)和預(yù)處理 Raw和A549在六孔板中生長成接近單層時(shí)，用PBS洗細(xì)胞3次，每次每孔2毫 升，用維持液(不加小牛血清的1640培養(yǎng)基)洗一次，每孔加入2毫升維持液，然后加入 IOO微升的Vp6-Dox病毒樣顆粒，孵育3小時(shí)后，用25t:的PBS洗細(xì)胞，每次每孔2毫 升。 第二步、細(xì)胞的固定和復(fù)水 預(yù)處理好后的細(xì)胞在-201:預(yù)冷的無水甲醇中固定20分鐘，依次在PBS配制的 70%， 30%， 10%預(yù)冷的乙醇中各復(fù)水10分鐘，PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第三步、細(xì)胞膜的透化處理 復(fù)水后的細(xì)胞用PBS配制的0.2%的Triton X-100進(jìn)行透化處理，25。C處理5分 鐘，用PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第四步、免疫熒光檢測(cè) 透化處理的細(xì)胞每孔加1 : 100(PBS稀釋) 一抗(Vp6抗豚鼠血清，自制)200微 升，37t:孵育30分鐘，PBS-T(加0.2X的Tween-20)洗5次，每次每孔2毫升，25。C搖床 3分鐘，然后每孔加l : 400(PBS稀釋)的二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗豚鼠IgG， Santa Cruz Biotechnology)200微升，37。C避光孵育30分鐘，PBS-T(加0.2%的Tween-20)洗5次，每
次每孔2毫升，25t:搖床3分鐘，熒光顯微鏡下觀察。見圖6和7。
觀察的結(jié)果 圖6A: Vp6-Dox病毒樣顆粒和巨噬細(xì)胞孵育后，經(jīng)一抗和FITC標(biāo)記的二抗處
理，熒光顯微鏡下在細(xì)胞質(zhì)中可見強(qiáng)烈的綠色熒光。圖6B為陰性對(duì)照，沒加Vp6-Dox
病毒樣顆粒的巨噬細(xì)胞，經(jīng)和A—樣的處理后，熒光顯微鏡下沒見到熒光。 圖7A : Vp6-Dox病毒樣顆粒和A549細(xì)胞孵育后，經(jīng)一坑和FITC標(biāo)記的二抗處
理，熒光顯微鏡下在細(xì)胞中沒有熒光。圖7B為對(duì)照，沒加Vp6-Dox病毒樣顆粒的A549
細(xì)胞，經(jīng)和A—樣的處理后，熒光顯微鏡下沒見到熒光。
結(jié)論 以上檢測(cè)及觀察結(jié)果可知用原核表達(dá)體系表達(dá)的Vp6蛋白，通過EDC(l-乙 基_3_(3_二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)反應(yīng)在Vp6上交聯(lián)阿霉素，在酸性條件下自 組裝成病毒樣顆粒。實(shí)驗(yàn)顯示Vp6-Dox病毒樣顆?？蛇M(jìn)入巨噬細(xì)胞，不能進(jìn)入A459細(xì) 胞，能對(duì)巨噬細(xì)胞特異性識(shí)別，這樣的病毒樣顆粒能成為優(yōu)良的MAS和TAM相關(guān)疾病 的給藥載體
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通過以上介紹可見本發(fā)明的靶向供藥藥物載體及其制法具有突出的優(yōu)點(diǎn)
1、利用輪狀病毒外殼蛋白自組裝的特性，用基因工程的方法體外對(duì)蛋白進(jìn)行操 作，并用化學(xué)修飾的方法對(duì)其進(jìn)行藥物交聯(lián)，把藥物修飾到中空的病毒樣顆粒的內(nèi)表面 和外表面，并利用病毒對(duì)巨噬細(xì)胞特異識(shí)別的能力，把藥物輸送到巨噬細(xì)胞中，這樣可 降低藥物的毒性，降低藥物的用量，避免體內(nèi)環(huán)境對(duì)藥物的降解，達(dá)到靶向和緩釋的功 能，降低用藥成本，提高治療效果。 2、現(xiàn)有的組裝往往是在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行，這樣得到的病毒樣顆粒的量十分有 限，本發(fā)明用原核表達(dá)的方法，在大腸桿菌中高效表達(dá)了輪狀病毒蛋白Vp6，并在體外 自組裝成病毒樣顆粒，可獲得大量的蛋白，降低制造成本。 3、和其它的納米靶向給藥載體(脂質(zhì)體、樹枝狀分子、嵌段共聚物、碳納米管) 等相比，病毒蛋白毒性較小，安全性較高，體內(nèi)容易降解。 4、利用輪狀病毒外殼蛋白體外自組裝和巨噬細(xì)胞靶向的特性，經(jīng)化學(xué)修飾，可 把治療性藥物或示蹤性藥物定向到巨噬細(xì)胞。
權(quán)利要求
用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特征在于所述藥物載體為對(duì)巨噬細(xì)胞有特異識(shí)別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經(jīng)原核表達(dá)、自組裝而成的病毒樣顆粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特征在于所 述病毒樣顆粒為中空結(jié)構(gòu)，且其內(nèi)表面或外表面化學(xué)修飾有藥物分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特征在于所述病毒樣顆粒內(nèi)表面或外表面通過化學(xué)修飾的藥物為治療性藥物或示蹤性藥物，或兩者 混合。
4. 權(quán)利要求1所述用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其特征在于首先提取A組輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因；然后將這些結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因克隆到原核 表達(dá)載體；再在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)；最后把表達(dá)的蛋白與藥物分子進(jìn)行交聯(lián)，并組裝成病毒樣顆粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其特征 在于所述結(jié)構(gòu)蛋白Vp6包括猴的輪狀病毒Vp6基因、豬的輪狀病毒Vp6基因和人的輪 狀病毒Vp6基因之一或多種混合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體的制備方法，其特征 在于所述病毒樣顆粒與藥物的組裝為體外組裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于巨噬細(xì)胞疾病靶向供藥的藥物載體及其制備方法，該藥物載體為對(duì)巨噬細(xì)胞有特異識(shí)別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經(jīng)原核表達(dá)、自組裝而成的中空病毒樣顆粒，其內(nèi)表面或外表面化學(xué)修飾有藥物分子。其制法首先提取A組輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因；然后將這些結(jié)構(gòu)蛋白Vp6基因克隆到原核表達(dá)載體；再在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)；最后把表達(dá)的蛋白與藥物進(jìn)行交聯(lián)，并組裝成病毒樣顆粒。本發(fā)明利用病毒樣顆粒對(duì)巨噬細(xì)胞的特異性識(shí)別能力，把藥物輸送到巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶向供藥和緩釋的功能，能有效降低藥物的用量和毒性，避免體內(nèi)環(huán)境對(duì)藥物的降解，提高治療效果；同時(shí)也能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)，降低制造成本。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101690822SQ200910183928
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者張智軍, 趙慶歡, 黃潔 申請(qǐng)人:蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所