專利名稱：具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與基因工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種能促血小板生成的具有 高效升血小板作用的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
血小板在機(jī)體生命活動中發(fā)揮著重要作用，血小板減少可引起出血、感染，甚至危 及生命。隨著社會的發(fā)展，血小板減少癥患者越來越多見，資料表明，絕大多數(shù)血小板減少 癥的發(fā)生都是由于血小板生成障礙所致。血小板的前體是巨核細(xì)胞，其生成過程遵循造血 干細(xì)胞典型的階段式分化模式骨髓造血干細(xì)胞_早期髓系共同祖細(xì)胞_巨核/紅系祖細(xì) 胞_巨核祖細(xì)胞_巨核細(xì)胞_血小板。可見，巨核細(xì)胞增殖分化在血小板的生成過程中發(fā) 揮著重要角色。研究表明，血小板生成素(TP0)是巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成過程中最重要 的調(diào)控因子，它又稱為巨核細(xì)胞生長與發(fā)育因子(MGDF)。體內(nèi)外實驗證實，TP0通過結(jié)合并 激活其受體-c-Mpl而發(fā)揮促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成的作用。c-Mpl是I型細(xì) 胞因子受體超家族的一員，主要表達(dá)于巨核系各分化階段的細(xì)胞。然而，由于一種通過基因 工程制備并經(jīng)聚乙二醇化的功能型TP0在臨床試用過程中有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性TP0抗體的現(xiàn) 象，因此，至今美國FDA都未批準(zhǔn)重組人TP0進(jìn)入臨床。在這種情況下，人們不得不尋找并 研發(fā)新一代的升血小板藥物。TP0模擬肽(TMP)是一種與天然TP0完全不同源但生物活性卻十分相似的短肽， 總共只有 14 個氨基酸殘基組成(Cwirla SE et al，Science, 1997，276 :1696_1699)。體外 實驗證實，該短肽與TP0受體-c-Mpl有著很高的親和力，并能夠刺激TP0細(xì)胞依賴株(Ba/ F3/c-Mpl)增殖與分化。研究表明，當(dāng)兩個c-Mpl形成同源二聚體時才能有效激活其下游 信號通路。因此，與單個TP0模擬肽相比，兩個串聯(lián)TP0模擬肽的促血小板生成活性更突出 (Cwirla SE et al，Science，1997，276 :1696_1699)。但由于 TPO 模擬肽分子量非常小，無 論是單個還是兩個串聯(lián)的TP0模擬肽在體內(nèi)的代謝排除都很快，因而使其在體內(nèi)的應(yīng)用受 到限制。生長激素(GH)是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)因子，由于它可以有效動員 并刺激造血干和多系造血祖細(xì)胞(包括巨核系祖細(xì)胞)的增殖與分化，目前國內(nèi)外的一 些單位已經(jīng)嘗試將重組人生長激素(rhGH)用于治療腫瘤化/放療所引起的全血細(xì)胞減少 (Sirohi B et al, Bone Marrow Transplant，2007，39 :115_120)。已知，生長激素生物學(xué) 功能的發(fā)揮主要是通過其受體-GHR介導(dǎo)完成，而且GHR也是I型細(xì)胞因子受體超家族的一 員。GHR與TP0受體c-Mpl所激活的信號通路一樣，都需要有蛋白激酶JAK2的參與和反饋 調(diào)節(jié)。因此，GHR與c-Mpl信號通路之間可能會存在著一定的交叉對話和相互調(diào)節(jié)作用。已經(jīng)授權(quán)的發(fā)明專利ZL200510057217.7，我們將單個TP0模擬肽與人生長激素分 子進(jìn)行融合，通過基因工程方法制備出重組融合蛋白rTMP-GH。由于TPO模擬肽可以識別并 結(jié)合巨核細(xì)胞表面的TP0受體c-Mpl，因此，在該融合蛋白中單個TP0模擬肽主要是發(fā)揮靶
3向引導(dǎo)人生長激素分子至巨核細(xì)胞的作用。由于單個TP0模擬肽只能結(jié)合一個c-Mpl，所以 不能有效激活其受體信號通路，使得rTMP-GH融合蛋白主要通過人生長激素分子發(fā)揮升血 小板作用，其生物利用低，作為藥劑時用量大、毒副作用較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能促血小板生成的具有高效升血小板作用的融合蛋白 及其制備方法，該融合蛋白由兩個串聯(lián)的TP0模擬肽和一個人生長激素分子構(gòu)成，能顯著 提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作為藥劑時用量小、毒副作用小。本發(fā)明可以大 大減少治療周期和治療時間，并且所述融合蛋白升血小板的效果更顯著。本發(fā)明的技術(shù)方案是具有高效升血小板作用的融合蛋白，由兩個串聯(lián)的TP0模擬肽和一個人生長激素 分子組成。其中，兩個TP0模擬肽的氨基酸序列相同，均由14個氨基酸組成(序列表SEQ ID NO 1)；人生長激素分子則是由191個氨基酸組成(序列表SEQ ID NO 2)。所述融合蛋白的兩個TP0模擬肽可以通過C-C端(尾-尾)串聯(lián)，也可以通過C-N 端(尾-頭)串聯(lián)，而且在兩個TP0模擬肽之間設(shè)有3-15個氨基酸組成的橋接肽，其中以 Pro-Ser-Gly-Pro 4個氨基酸組成的橋接肽為優(yōu)選。所述融合蛋白的兩個TP0模擬肽的串聯(lián)體與人生長激素分子之間設(shè)有3-15個氨 基酸組成的橋接肽，其中以Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 6個氨基酸組成的橋接肽為優(yōu)選。所述由兩個串聯(lián)的TP0模擬肽和一個人生長激素分子組成的融合蛋白有四種組 成形式，第一種形式是兩個TP0模擬肽尾-頭相連形成的TP0模擬肽串聯(lián)體位于融合蛋白 的N-末端，人生長激素位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID N0:3)；第二種形式是兩 個TP0模擬肽尾-尾相連形成的TP0模擬肽串聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，人生長激素 位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO 4)；第三種形式是人生長激素位于融合蛋白 的N-末端，兩個TP0模擬肽尾-頭相連形成的TP0模擬肽串聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端 (序列表SEQ ID N0:5)；第四種形式是人生長激素位于融合蛋白的N-末端，兩個TP0模擬 肽尾-尾相連形成的TP0模擬肽串聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO 6)； 其中優(yōu)選的是前兩種形式。編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ ID NO :7_10)和攜帶該DNA序列的
重組表達(dá)載體。制備、表達(dá)本發(fā)明所述融合蛋白的方法，其中表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主可以是 細(xì)菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞等，其中優(yōu)選的是大腸桿菌；對于重組表達(dá)的本發(fā)明融合蛋白可 以通過多種方法從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行提取、純化，這些方法包括離心、超濾及液相層 析等技術(shù)，其中液相層析又包括了離子交換、疏水和分子篩等層析技術(shù)。本發(fā)明所述融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑使用，這些藥物載體包括 水、鹽水、糖類等。由本發(fā)明融合蛋白制成的藥物制劑優(yōu)選的是含水液體制劑和含水量低 于10%或不含水的凍干制劑，這些藥物制劑可以通過靜脈輸注或注射(包括皮下和肌肉注 射)進(jìn)行給藥。本發(fā)明采用兩個TP0模擬肽的串聯(lián)體與人生長激素分子進(jìn)行融合，TP0模擬肽串 聯(lián)體不僅可以發(fā)揮靶向結(jié)合巨核細(xì)胞的作用，而且還能同時激活兩個相臨的c-Mpl，從而有
4效激活TP0受體信號通路，即兩個c-Mpl形成的同源二聚體能有效激活其下游信號通路，刺 激巨核細(xì)胞增殖分化和生成血小板。此外，激活的TP0受體信號通路還可以通過交叉對話 與GHR信號通路進(jìn)行相互調(diào)節(jié)，從而使兩者在促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成方面的 作用得到協(xié)同加強(qiáng)。由于兩個串聯(lián)的TP0模擬肽可以更有效地激活其受體和下游信號通 路，因此，本發(fā)明所述由兩個串聯(lián)TP0模擬肽與人生長激素分子構(gòu)成的融合蛋白(TMP2-hGH 融合蛋白)與單個TP0模擬肽和人生長激素分子構(gòu)成的融合蛋白(TMP-GH融合蛋白)相比 較，在促巨核細(xì)胞增殖分化方面的作用會更加突出，升血小板的效果將更顯著。動物實驗表 明，本發(fā)明所述的TMP2-hGH融合蛋白與TMP-GH融合蛋白相比，TMP2_hGH融合蛋白可以提前 6天的時間使急性放射損傷小鼠外周血血小板水平恢復(fù)至正常值的70%。本發(fā)明可以大大 減少治療周期和治療時間，為搶救危重病人贏得寶貴的時間。本發(fā)明有益效果是1、兩個串聯(lián)的TP0模擬肽能夠有效激活巨核系細(xì)胞表面的TP0受體c-Mpl，從而啟 動TP0受體依賴的促巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成反應(yīng)；而生長激素分子可以通過結(jié)合 并激活其自身受體GHR，從而啟動非TP0受體依賴方式的促巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生 成反應(yīng)。此外，TP0受體與GHR信號通路之間還會通過交叉對話進(jìn)行相互調(diào)節(jié)和協(xié)同加強(qiáng) 作用。因此，本發(fā)明的融合蛋白具有強(qiáng)效的促巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成作用。2、通過與人生長激素分子進(jìn)行融合，可以使兩個TP0模擬肽串聯(lián)體的分子量顯著 增加，從而延長其在體內(nèi)的生物半排期，提高其在體內(nèi)的作用效果。3、通過與TP0模擬肽進(jìn)行融合，可以使人生長激素分子靶向作用于巨核細(xì)胞，從 而顯著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作為藥劑時用量小、毒副作用小。本發(fā)明的融合蛋白用于制備治療藥物制劑可用于治療多種原發(fā)性或繼發(fā)性血小 板減少癥等疾病，這些疾病包括再生障礙性貧血、白血病、淋巴瘤、原發(fā)性血小板減少性紫 癜、慢性腎病、急性放射病、腫瘤放化療引起的血小板減少等。下面用實施例來進(jìn)一步說明本方明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此。


圖1為pBV220/TMP2_hGH重組質(zhì)粒的構(gòu)建；圖2為純化所得TMP2_hGH融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖3為TMP2_hGH融合蛋白的升血小板活性分析結(jié)果。
具體實施例方式材料和試劑1. Pyrobest DNA Polymerase PCR 試劑盒(Takara 公司產(chǎn)品，中國大連)2. QIAprep Spin質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司，美國)3. DNA膠回收試劑盒(Omega公司，美國)4. T4DNA連接酶試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國大連)5. EcoR I.Sal I限制性核酸內(nèi)切酶(New England BioLabs公司產(chǎn)品，美國)6. pMD-hGH質(zhì)粒(本室保存)
7.質(zhì)粒載體pbv220(由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供)
8.大腸桿菌DH5a(本室保存，其構(gòu)建方法參見申請?zhí)枮?00510057217. 7發(fā)明專
9.氨芐青霉素(roche公司產(chǎn)品，德國)
10.尿素、mgs04(上海生工生物工程公司)
11.sp陽離子層析柱、q陰離子層析柱、supdex 75層析柱(ge公司產(chǎn)品，美國)
12.酵母提取物、胰蛋白胨(oxford公司產(chǎn)品，美國)
13.lb培養(yǎng)基 酵母提取物5g 胰蛋白胨 10g nacl10g
溶于1000ml去離子水中，并用lmol/l的naoh調(diào)節(jié)ph值至7.0，高壓蒸氣滅菌。
14.發(fā)酵培養(yǎng)基
酵母提取物20g胰蛋白胨10gkh2po42. 3gna2hp0413g甘油20g
利) 列以含有人生長激素的質(zhì)粒pmd-hgh(本室保存，其構(gòu)建方法參見申請?zhí)枮?200510057217. 7發(fā)明專利)為模板，通過pcr擴(kuò)增將編碼tp0模擬肽和橋接肽的dna序列 加載到hgh的n-末端。所用pcr引物序列如下p1 5' -att gag gga cca aca tta cgt cag tgg ctg get gca cgt get ccaggt tct ggt tct ggt ttc cca act att cca ctg agt c~3'p2 -gca rrt cra cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc~3'在pi中黑體部分為編碼tp0模擬肽(序列表seq id n01)的核苷酸序列，斜體部 分為編碼橋接肽pro-gly-ser-gly-ser-gly的核苷酸序列，3'-末端正規(guī)體部分為人生長 激素的上游特異性引物序列。在p2中下畫線部分為內(nèi)切酶sal i的識別位點，3'-末端 正規(guī)體部分為人生長激素的下游特異性引物序列。pcr引物由上海生工生物工程公司合成。如圖1所示，以pmd-hgh質(zhì)粒dna為模板，以p1和p2為上、下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò) 增。pcr擴(kuò)增條件如下第一階段95°c預(yù)變性5分鐘；第二階段94°c變性1分鐘，55°c退火
溶于1000ml去離子水中，并用lmol/l的naoh調(diào)節(jié)ph值至7.0，高壓蒸氣滅菌。
15.包涵體洗滌液 tris20mm edta 10mm triton x-100 0. 5%
16.重組tmp-hgh融合蛋白(構(gòu)建過程見申請?zhí)枮?00510057217.7的發(fā)明專利) 實施例1 重組表達(dá)質(zhì)粒pbv220/tmp2-hgh的構(gòu)建及鑒定
(1)首先獲得編碼一個tp0模擬肽與人生長激素的融合蛋白(tmp-hgh)的基因序
61分鐘，72°C延伸1分鐘，循環(huán)32次；第三階段72°C延伸5分鐘，10°C放置10分鐘。所獲得 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測為650bp左右，回收PCR產(chǎn)物。(2) pBV220/TMP2-hGH 重組質(zhì)粒的獲得如圖1所示，以上一步所得PCR產(chǎn)物為模板，通過再次PCR擴(kuò)增將編碼第二個TP0 模擬肽和橋接肽的編碼序列加載至TMP-hGH的N-末端。所用PCR引物序列如下P3 5' -gag gaa ttc atg ate gaa ggt cct act ctg aga cag tgg ctg getgea
cgt get cca tct ggt cca att gag gga cca aca tta cg-3'P2 -gca ggt cga cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc~3'在P3中下畫線部分為EcoR I酶切位點識別序列，黑體部分為編碼TPO模擬肽(序 列表SEQ ID N01)的核苷酸序列，加框部分為翻譯起始密碼子序列，斜體部分為編碼橋接肽 Pro-Ser-Gly-Pro的核苷酸序列，3'-末端正規(guī)體部分為編碼第一個TP0模擬肽的N-端部 分氨基酸的DNA序列。在P2中下畫線部分為內(nèi)切酶Sal I的識別位點，3'-末端正規(guī)體 部分為人生長激素的下游特異性引物序列。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件同前，膠回收所得PCR產(chǎn)物并進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切。 酶切后的PCR產(chǎn)物與經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后的質(zhì)粒載體pBV220進(jìn)行連接，連接 產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化DH5 a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑菌并培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA， 經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后可見700bp左右DNA片段出現(xiàn)。對此重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測 定，測序結(jié)果表明在PBV220質(zhì)粒的EcoR I和Sal I位點之間插入有與序列信息表SEQ ID N07堿基序列一致的DNA片段。該重組質(zhì)粒命名為pBV220/TMP2-hGH，其表達(dá)的融合 蛋白N端為兩個串聯(lián)的TP0模擬肽，C端為人生長激素，在第一個TP0模擬肽與第二個 TP0模擬肽之間有Pro-Ser-Gly-Pro進(jìn)行連接，在第二個TP0模擬肽與人生長激素之間有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 進(jìn)行連接。實施例2 :TMP2-hGH融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化(1)高表達(dá)TMP2_hGH融合蛋白的陽性菌株篩選挑取至少10個轉(zhuǎn)化有pBV220/TMP2_hGH重組質(zhì)粒的DH5 a大腸桿菌單克隆，接 種于含有2ml LB培養(yǎng)基的搖菌管中，32°C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜，次日取lOOul過夜菌按 1 10比例接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，32°C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24小時，之后更換溫度至42°C 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5小時。12000rpm離心2分鐘收菌，700MPa進(jìn)行高壓勻漿破菌，12000rpm離 心20分鐘提取包涵體蛋白，包涵體洗滌液洗滌包涵體蛋白，然后用含6N尿素的20mM TRIS 緩沖液(PH8. 0)溶解包涵體，樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。選擇蛋白表達(dá)水平表達(dá)最高的 菌株為后續(xù)發(fā)酵的種子菌。(2)工程菌發(fā)酵將篩選出的種子菌株劃線接種于LB平板，挑取外觀優(yōu)良的單個 菌落接種于10ml LB培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)8小時，之后將10ml培養(yǎng)液按1 10 比例放大至100ml LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37°C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)8小時后再次放大至1L LB 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8小時，然后按1 10比例接種至裝有10L發(fā)酵培養(yǎng) 基的15L發(fā)酵罐中(B. Braun公司，德國)進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵罐中加入10g MgS04，酵溫度控制 在32°C，發(fā)酵5小時后，調(diào)節(jié)溫度至42°C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5小時。(3) TMP2_hGH融合蛋白的純化按前述方法離心收取菌體，并提取發(fā)酵菌包涵體蛋 白，用含6N尿素的20mM TRIS緩沖液(pH8. 0)溶解包涵體，然后用含1N尿素的20mM TRIS
7緩沖液(PH8. 0)透析12小時以復(fù)性目的蛋白，復(fù)性后樣品上SP陽離子柱以吸附雜蛋白， 使融合蛋白流穿，收集含有融合蛋白的流穿液并上Q陰離子柱，使目的蛋白吸附，用0. 1N Nacl洗脫融合蛋白，洗脫峰收集液隨后上Supdex 75分子篩層析柱，收集并獲得純化后的 融合蛋白。上述純化所得融合蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測可見大小為26KD的單一蛋白 帶(圖2)。HPLC顯示為單一蛋白峰，純度大于98%。實施例3 :TMP2-hGH融合蛋白的升血小板活性測定(1)復(fù)制血小板減少癥小鼠實驗動物模型以BALB/c小鼠為實驗對象，6°Co y射 線5Gy全身一次性照射實驗小鼠，復(fù)制輻射損傷致血小板減少癥動物模型(這種情況常見 于急性放射病和腫瘤放療所致的血小板減少癥)。(2)實驗分組實驗動物分三組第一組照射后給予重組TMP2_hGH融合蛋白治療，100ug/kg/d,皮下注射，連續(xù)用7 天；第二組照射后給予重組TMP-hGH治療，100ug/kg/d,皮下注射，連續(xù)用7天；第三組為生理鹽水對照組。(3)方法與結(jié)果照射后7天開始小鼠尾靜脈取血，每次取血10ul，于西南醫(yī)院 血液科血球計數(shù)儀上進(jìn)行血小板計數(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明融合蛋白TMP 2-hGH可以顯 著抑制受照射小鼠外周血血小板的減少，其升高血小板的速度和幅度顯著優(yōu)于融合蛋白 TMP-hGH(圖3)。各組小鼠外周血血小板計數(shù)恢復(fù)至70%正常水平的時間分別為本發(fā)明 融合蛋白TMP2-hGH治療組為照后第16天，TMP-hGH治療組為照射后第22天，生理鹽水對照 組為照后第26天?？梢?，與TMP-GH相比，本發(fā)明TMP2-hGH融合蛋白可以提前6天時間使 急性放射損傷小鼠外周血血小板水平恢復(fù)至正常值的70%。結(jié)論本發(fā)明所述TMP2_hGH融合蛋白與TMP-hGH融合蛋白相比較，本發(fā)明所述融 合蛋白升血小板活性更強(qiáng)，能顯著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，減少用量、降 低毒副作用。所述TMP2-hGH融合蛋白可以大大減少治療周期和治療時間，并且升血小板的 效果更顯著，更適用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥疾病。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制備方法<130><160>10<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>14<212>PRT<213>Artificial<220><223>TP0模擬肽的氨基酸序列<400>1lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala
80096]15100097]<210>20098]<211>1910099]<212>PRT0100]<213>人生長激素的氨基酸序列0101]<400>20102]Phe Pro ThrlieProLeuSerArgLeuPheAspAsnAlaMetLeu0103]1510150104]Arg Ala HisArgLeuHisGinLeuAlaPheAspThrTyrGinGlu0105]2025300106]Phe Glu GluAlaTyrlieProLysGluGinLysTyrSerPheLeu0107]3540450108]Gin Asn ProGinThrSerLeuCysPheSerGluSerlieProThr0109]5055600110]Pro Ser AsnArgGluGluThrGinGinLysSerAsnLeuGluLeu0111]6570750112]Leu Arg lieSerLeuLeuLeulieGinSerTrpLeuGluProVal0113]8085900114]Gin Phe LeuArgSerValPheAlaAsnSerLeuValTyrGlyAla0115]951001050116]Ser Asp SerAsnValTyrAspLeuLeuLysAspLeuGluGluGly0117]1101151200118]lie Gin ThrLeuMetGlyArgLeuGluAspGlySerProArgThr0119]1251301350120]Gly Gin liePheLysGinThrTyrSerLysPheAspThrAsnSer0121]1401451500122]His Asn AspAspAlaLeuLeuLysAsnTyrGlyLeuLeuTyrCys0123]1551601650124]Phe Arg LysAspMetAspLysValGluThrPheLeuArglieVal0125]1701751800126]Gin Cys ArgSerValGluGlySerCysGlyPhe0127]1851900128]<210>30129]<211>2290130]<212>PRT0131]<213>Artificial0132]<220>0133]<223>融合蛋白-1 K氨基酸序列，其中兩個TP0模擬肽尾-頭相連的串聯(lián)體位于融合蛋白的N_末端，人生長激素位于融合蛋白的C_末端。在兩個TP0模擬肽之間有Pro-Ser-Gly-Pro進(jìn)行連接，在第二個TP0模擬肽與人生長激素之間有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 進(jìn)行連接
0134]<400>30135]lie GluGlyProThrLeuArgGinTrpLeuAlaAlaArgAlaPro0136]1510150137]Ser GlyProLieGluGlyProThrLeuArgGinTrpLeuAlaAla0138]2025300139]Arg AlaProGlySerGlySerGlyPheProThrlieProLeuSer0140]3540450141]Arg LeuPheAspAsnAlaMetLeuArgAlaHisArgLeuHisGin0142]5055600143]Leu AlaPheAspThrTyrGinGluPheGluGluAlaTyrliePro0144]6570750145]Lys GluGinLysTyrSerPheLeuGinAsnProGinThrSerLeu0146]8085900147]Cys PheSerGluSerlieProThrProSerAsnArgGluGluThr0148]951001050149]Gin GinLysSerAsnLeuGluLeuLeuArglieSerLeuLeuLeu0150]1101151200151]lie GinSerTrpLeuGluProValGinPheLeuArgSerValPhe0152]1251301350153]Ala AsnSerLeuValTyrGlyAlaSerAspSerAsnValTyrAsp0154]1401451500155]Leu LeuLysAspLeuGluGluGlylieGinThrLeuMetGlyArg0156]1551601650157]Leu GluAspGlySerProArgThrGlyGinliePheLysGinThr0158]1701751800159]Tyr SerLysPheAspThrAsnSerHisAsnAspAspAlaLeuLeu0160]1851901950161]Lys AsnTyrGlyLeuLeuTyrCysPheArgLysAspMetAspLys0162]2002052100163]Val GluThrPheLeuArglieValGinCysArgSerValGluGly0164]2152202250165]Ser CysGlyPhe0166]<210>40167]<211>2290168]<212>PRT0169]<213>Artificial0170]<220>
<223>序列特征融合蛋白-2的氨基酸序列，其中兩個TPO模擬肽尾-尾相 連的串聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，人生長激素位于融合蛋白的C-末端。在兩個TPO 模擬肽之間有Pro-Ser-Gly-Pro進(jìn)行連接，在第二個TPO模擬肽與人生長激素之間有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 進(jìn)行連接。<400>4lie Glu Gly ProThr Leu ArgGln Trp Leu AlaAla Arg Ala Pro151015Ser Gly Pro Ala Arg Ala AlaLeu Trp Gln ArgLeu Thr Pro Gly202530Glu lie Pro Gly Ser Gly SerGly Phe Pro Thrlie Pro Leu Ser354045Arg Leu Phe AspAsn Ala MetLeu Arg Ala HisArg Leu His Gln505560Leu Ala Phe AspThr Tyr GlnGlu Phe Glu GluAla Tyr lie Pro657075Lys Glu Gln LysTyr Ser PheLeu Gln Asn ProGln Thr Ser Leu808590Cys Phe Ser Glu Ser lie ProThr Pro Ser AsnArg Glu Glu Thr95100105Gln Gln Lys Ser Asn Leu GluLeu Leu Arg lieSer Leu Leu Leu110115120lie Gln Ser TrpLeu Glu ProVal Gln Phe LeuArg Ser Val Phe125130135Ala Asn Ser Leu Val Tyr GlyAla Ser Asp SerAsn Val Tyr Asp140145150Leu Leu Lys AspLeu Glu GluGly lie Gln ThrLeu Met Gly Arg155160165Leu Glu Asp Gly Ser Pro ArgThr Gly Gln liePhe Lys Gln Thr170175180Tyr Ser Lys PheAsp Thr AsnSer His Asn AspAsp Ala Leu Leu185190195Lys Asn Tyr Gly Leu Leu TyrCys Phe Arg LysAsp Met Asp Lys200205210Val Glu Thr PheLeu Arg lieVal Gln Cys ArgSer Val Glu Gly215220225Ser Cys Gly Phe<210>5<211>229<212>PRT
<213>Artificial<220><223>序列特征融合蛋白-3的氨基酸序列，其中兩個TPO模擬肽尾-頭相 連的串聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，人生長激素位于融合蛋白的N-末端。在兩個TPO 模擬肽之間有Pro-Ser-Gly-Pro進(jìn)行連接，在第一個TPO模擬肽與人生長激素之間有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 進(jìn)行連接。<400>5
Phe Pro Thr lie Pro Leu SerArg Leu Phe AspAsn Ala Met Leu151015
Arg Ala His Arg Leu His GlnLeu Ala Phe AspThr Tyr Gln Glu202530Pne Glu Glu Ala Tyr lie ProLys Glu Gln LysTyr Ser Phe Leu354045Gln Asn Pro Gln Thr Ser LeuCys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr505560Pro Ser Asn Arg Glu Glu ThrGln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu657075Leu Arg lie Ser Leu Leu Leulie Gln Ser TrpLeu Glu Pro Val808590Gln Phe Leu Arg Ser Val PheAla Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95100105Ser Asp Ser Asn Val Tyr AspLeu Leu Lys AspLeu Glu Glu Gly110115120lie Gln Thr Leu Met Gly ArgLeu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125130135Gly Gln lie Phe Lys Gln ThrTyr Ser Lys PheAsp Thr Asn Ser140145150His Asn Asp Asp Ala Leu LeuLys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155160165Phe Arg Lys Asp Met Asp LysVal Glu Thr PheLeu Arg lie Val170175180Gln Cys Arg Ser Val Glu GlySer Cys Gly PhePro Gly Ser Gly185190195Ser Gly lie Glu Gly Pro ThrLeu Arg Gln TrpLeu Ala Ala Arg200205210Ala Pro Ser Gly Pro Lie GluGly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu215220225Ala Ala Arg Ala<210>6
<211>229<212>PRT<213>Artificial<220><223>序列特征融合蛋白-4的氨基酸序列，其中兩個TPO模擬肽尾-尾相 連的串聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，人生長激素位于融合蛋白的N-末端。在兩個TPO 模擬肽之間有Pro-Ser-Gly-Pro進(jìn)行連接，在第一個TPO模擬肽與人生長激素之間有 Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 進(jìn)行連接。<400>6Phe Pro Thr lie Pro Leu SerArg Leu PheAsp Asn Ala Met Leu151015Arg Ala His Arg Leu His GlnLeu Ala PheAsp Thr Tyr Gln Glu202530Phe Glu Glu Ala Tyr lie ProLys Glu GlnLys Tyr Ser Phe Leu354045Gln Asn Pro Gln Thr Ser LeuCys Phe SerGlu Ser lie Pro Thr505560Pro Ser Asn Arg Glu Glu ThrGln Gln LysSer Asn Leu Glu Leu657075Leu Arg lie Ser Leu Leu Leulie Gln SerTrp Leu Glu Pro Val808590Gln Phe Leu Arg Ser Val PheAla Asn SerLeu Val Tyr Gly Ala95100105Ser Asp Ser Asn Val Tyr AspLeu Leu LysAsp Leu Glu Glu Gly110115120lie Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu AspGly Ser Pro Arg Thr125130135Gly Gln lie Phe Lys Gln ThrTyr Ser LysPhe Asp Thr Asn Ser140145150His Asn Asp Asp Ala Leu LeuLys Asn TyrGly Leu Leu Tyr Cys155160165Phe Arg Lys Asp Met Asp LysVal Glu ThrPhe Leu Arg lie Val170175180Gln Cys Arg Ser Val Glu GlySer Cys GlyPhe Pro Gly Ser Gly185190195Ser Gly lie Glu Gly Pro ThrLeu Arg GlnTrp Leu Ala Ala Arg200205210Ala Pro Ser Gly Pro Ala Arg Ala Ala LeuTrp Gln Arg Leu Thr215220225
Pro Gly Glu lie<210>7<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>編碼融合蛋白-1 (SEQ ID NO 3)的DNA序列<400>7atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccaatt 60gagggaccaa cattacgtca gtggctggct gcacgtgctc caggttctgg ttctggtttc 120ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc t a a 693<210>8<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>編碼融合蛋白_2 (SEQ ID NO 4)的DNA序列
<400>8
atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccagct 60cgtgcagctc tgtggcagcg tttaacacca ggagagattc caggttctgg ttctggtttc 120ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc t a a 693<210>9<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>編碼融合蛋白_3 (SEQ ID NO 5)的DNA序列<400>9atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180 accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240
ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccaat tgagggacca 660acattacgtc agtggctggc tgcacgtgct t a a 693<210>10<211>693<212>DNA<213>Artificial<220><223>編碼融合蛋白_4(SEQ ID NO 6)的DNA序列<400>10atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420
aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480
tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccagc tcgtgcagct 660ctgtggcagc gtttaacacc aggagagatt t a a 693.
權(quán)利要求
一種具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白由兩個串聯(lián)在一起的TPO模擬肽和一個人生長激素分子組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于TPO模擬肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；人生長激素的氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于兩個TPO模 擬肽通過C-C端串聯(lián)或通過C-N端串聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于兩個串聯(lián)的 TPO模擬肽位于該融合蛋白的N-末端，人生長激素位于該融合蛋白的C-末端；或兩個串聯(lián) 的TPO模擬肽位于該融合蛋白的C-末端，人生長激素位于該融合蛋白的N-末端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于兩個串聯(lián)的 TPO模擬肽之間以及TPO模擬肽與人生長激素分子之間均設(shè)有3-15個柔性氨基酸組成的橋 接肽。
6.編碼權(quán)利要求1-5所述的融合蛋白的DNA序列。
7.包含權(quán)利要求7所述的DNA序列的重組表達(dá)載體。
8.制備權(quán)利要求1-5所述的融合蛋白的方法，包括將權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，分離、純化所述融合蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于原核表達(dá)為大腸桿菌，真核表達(dá)為酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于所述的融 合蛋白可以用于治療多種原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有高效升血小板作用的融合蛋白，所述融合蛋白由兩個串聯(lián)在一起的TPO模擬肽和一個人生長激素分子構(gòu)成。所述融合蛋白能顯著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，減少用量、降低毒副作用。本發(fā)明可以大大減少治療周期和治療時間，并且所述融合蛋白升血小板的效果更顯著。所述融合蛋白用于藥物制劑可用于治療多種原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥等疾病。
文檔編號A61P7/00GK101812135SQ20091019145
公開日2010年8月25日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者王軍平, 王崧, 申明強(qiáng), 粟永萍, 許楊, 陳芳, 陳默 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)