專利名稱：一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病是一種常見(jiàn)的傳染病，是由多種不同群的鏈球菌引起的不同癥狀類型 的總稱。目前許多國(guó)家和地區(qū)都有豬鏈球菌病的報(bào)道，并且其流行呈明顯上升趨勢(shì)。該病 以導(dǎo)致豬敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為主要特征，在某些特定誘因作用下，發(fā) 病豬群死亡率可達(dá)80%左右，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。 國(guó)內(nèi)豬鏈球菌病自上世紀(jì)60年代以來(lái)，在廣西、廣東、福建、湖南、江西、安徽、江 蘇、四川等地陸續(xù)發(fā)生，該病流行范圍廣、發(fā)病率和死亡率高，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鏈球 菌的血清群多，主要為蘭氏C群，其次為蘭氏D、E群。各血清群之間交互免疫能力不強(qiáng)，加 之菌株易變等特點(diǎn)，所以，有些豬場(chǎng)雖然進(jìn)行了該病的免疫預(yù)防，但仍得不到有效控制，免 疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。究其原因，主要是接種疫苗的菌株血清群與當(dāng)時(shí)當(dāng)?shù)亓餍械呢i鏈球 菌病的病原血清群不相符所致。近年來(lái)，在我國(guó)各地發(fā)生的豬鏈球菌病，其病原血清群各有 差異，不盡相同，給該病的預(yù)防和治療帶來(lái)了一定難度。目前用于豬鏈球菌病免疫預(yù)防的疫 苗主要是以C群獸疫鏈球菌為疫苗株的滅活疫苗或弱毒疫苗，而該病的病原流行菌株已不 局限于C群獸疫鏈球菌，D、E、L、R等血清群的鏈球菌在病原學(xué)調(diào)查中也占有一定比例。因 此，需要發(fā)明一種新的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗以解決上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種安全、可靠的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，所述疫苗
可同時(shí)預(yù)防免疫由蘭氏C群、D群和E群鏈球菌引起的三種豬鏈球菌病。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的方法。 本發(fā)明提供一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，所述豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗包含抗
原和佐劑；其中，所述抗原包含已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群
鏈球菌C55914抗原和蘭氏E群鏈球菌C55949抗原；所述佐劑為氫氧化鋁膠。 作為本發(fā)明豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述三種抗原等比例混合，
其總體積為所述疫苗總體積的75% 85%。 作為本發(fā)明豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述佐劑的體積為所述疫 苗總體積的15% 25%。 作為本發(fā)明豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述疫苗中還含有所述疫 苗總量0.01%的硫柳滎。 —種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，包含以下步驟 a.分別將C群C55138菌種、D群C55914菌種和E群C55949菌種增殖培養(yǎng)，得到 C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液；b.分別向上述培養(yǎng)好C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液中按
3總量加入0. 2%的甲醛溶液，放置于37t:滅活，其間攪拌3 5次。 c.向上述已滅活的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液中加入 適量的15% 25%氫氧化鋁膠搖勻，常溫靜置沉淀48 72小時(shí)，氫氧化鋁膠和所述菌液 中的抗原結(jié)合形成顆粒狀結(jié)合物，靜置，在重力作用下沉降。除去上層清液后，以無(wú)菌生理 鹽水重懸沉淀物，從而得到已濃縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群 C55949菌液; d.分別將上述已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌 液等比例混合均勻，并加入一定量的疫苗防腐劑硫柳汞，從而得到新型豬鏈球菌病三價(jià)滅 活疫苗； e.以適量體積分裝豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，蓋上瓶蓋，并壓鋁蓋。
在上述制備過(guò)程中，從步驟a培養(yǎng)好的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群 C55949菌液中取樣，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)；從步驟b已滅活的C群C55138菌液、D群 C55914菌液和E群C55949菌液取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和安檢；對(duì)步驟d得到的豬鏈球菌病三 價(jià)滅活疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和疫苗效力檢驗(yàn)，以確保疫苗的安全性、可靠性。
隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，生物技術(shù)在疫病防制方面得到廣泛應(yīng)用.并取得了顯著成 效。但近年來(lái)免疫豬群屢屢發(fā)生免疫失敗的情況，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。七、八十年代 豬鏈球菌病在我國(guó)許多省(市)都有發(fā)生，由此研制出了豬鏈球菌病滅活疫苗和弱毒活疫 苗，使該病曾一度得到控制。近年有關(guān)豬群暴發(fā)該病的報(bào)道很多.且常常和其他疾病合并 發(fā)生，發(fā)病率、死亡率均很高。有的豬場(chǎng)雖然進(jìn)行了該病的免疫接種，但仍得不到有效控制。 有關(guān)學(xué)者對(duì)各地豬鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查表明，目前該病的流行株已不僅僅局限于C群 獸疫鏈菌，D、E、L、R等血清群的鏈球菌也占有很大比例。目前，用于該病免疫預(yù)防的疫苗主 要是以C群獸疫鏈球菌為疫苗株的滅活疫苗或弱毒活疫苗，而與當(dāng)?shù)氐呢i鏈球菌病流行株 并不相符，這正是豬鏈球菌病不能得到有效控制的主要原因。 本發(fā)明制備的新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，克服了目前市面上現(xiàn)有疫苗只能預(yù) 防由鏈球菌蘭氏C群引起的鏈球菌感染的不足。本發(fā)明采用了獨(dú)特去除毒素的方法和適宜 的配苗技術(shù)制備得到了豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，該疫苗可以同時(shí)預(yù)防由蘭氏C群、D群和 E群鏈球菌引起的三種豬鏈球菌病。達(dá)到了一針多防的效果。
本發(fā)明制備得到的疫苗具有以下特點(diǎn) (1)本發(fā)明的新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的菌種采用菌種庫(kù)篩選的菌種并且菌 種均經(jīng)敏感豬體復(fù)壯，不僅免疫原性強(qiáng)、抗原譜廣、遺傳性能穩(wěn)定，而且是近年來(lái)豬鏈球菌 病的流行株，以其作為菌種對(duì)實(shí)際防疫更具有針對(duì)性。
(2)本發(fā)明的新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，一次接種可同時(shí)預(yù)防由蘭氏C群、D 群和E群鏈球菌引起的三種豬鏈球菌病。具有現(xiàn)用疫苗無(wú)法到達(dá)的便捷性和實(shí)用性。
(3)本發(fā)明的新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗中還含有0. 01%體積比的硫柳汞。硫 柳汞是一種可以抑制甚至殺滅霉菌的化學(xué)物質(zhì)。在疫苗出廠前，加入硫柳汞，防止在疫苗的 生產(chǎn)和使用過(guò)程中受到霉菌污染。 (4)本發(fā)明的一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備過(guò)程中，采用了獨(dú)特的毒 素去除技術(shù)。在細(xì)菌培養(yǎng)增殖過(guò)程中，細(xì)菌凋亡破裂后釋放出毒素，對(duì)動(dòng)物機(jī)體有毒害作 用。本發(fā)明中采用獨(dú)特的毒素去除技術(shù)，使用具有吸附作用的氫氧化鋁膠吸附細(xì)菌菌體，氫氧化鋁膠和細(xì)菌結(jié)合后形成顆粒，并在重力作用下，沉降于液體下面，而毒素等小物質(zhì)則不 能吸附，通過(guò)除去上層清液而達(dá)到了去除毒素的效果，從而得到已去除毒素的菌液，大大減 少了疫苗中由細(xì)菌毒素引起的副反應(yīng)，提高了疫苗的安全性。 (5)本發(fā)明的一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了滅活檢驗(yàn)、 安檢和無(wú)菌檢驗(yàn)步驟，嚴(yán)格控制疫苗質(zhì)量，提高了疫苗的可靠性和安全性。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。本發(fā)明的具 體實(shí)驗(yàn)方法可參見(jiàn)《中華人民共和國(guó)獸藥典(二〇〇五年版)》及附錄。其他未特別注明的 試劑或原料均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得。
實(shí)施例1 —種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，由已滅活、濃縮并且安檢合格，采用獨(dú)特的毒 素去除技術(shù)處理過(guò)的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗 原和蘭氏E群鏈球菌C55949抗原，與佐劑氫氧化鋁膠混合配制得到，其中所述三種抗原比 例相等。
1.菌種 a.蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應(yīng)。 b.蘭氏D群鏈球菌C55914株中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應(yīng)。 c.蘭氏E群鏈球菌C55949株中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應(yīng)。 將上述蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株經(jīng)靜脈注射1_3月齡的健康敏感豬，
蘭氏D群鏈球菌C55914株、蘭氏E群鏈球菌C55949株經(jīng)關(guān)節(jié)腔注射1 3月齡的健康敏
感豬，在負(fù)壓動(dòng)物房經(jīng)敏感豬體7天后復(fù)壯并凍干保存。 2.菌種的繁殖 a. —級(jí)種子的繁殖 上述凍干菌種，用馬丁肉湯稀釋，劃線接種于鮮血平皿上，置37t:培養(yǎng)18 24小 時(shí)，選取符合要求的菌落，接種于含有羊鮮血瓊脂斜面上，37t:培養(yǎng)18 24小時(shí)，作為一級(jí) 種子。 b. 二級(jí)種子的繁殖 用少量緩沖肉湯洗上述一級(jí)種子的血瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于加有1% 4%血 清和0. 2%葡萄糖的緩沖肉湯大管中，置37t:培養(yǎng)18 24小時(shí)取出，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二 級(jí)種子。 3.菌液的培養(yǎng) 在鏈球菌培養(yǎng)基(商售)中加入血清2%、葡萄糖0. 2X，將C群C55138菌種、D 群C55914菌種和E群C55949菌種分別按5%的量加進(jìn)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37°C 中培養(yǎng)；當(dāng)菌液PH降低到6以下時(shí)停止培養(yǎng)。得到三種菌液。
4.純粹檢驗(yàn) 從上述培養(yǎng)好的三種菌液中取樣，用馬丁瓊脂依《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)
行純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。 5.活菌計(jì)數(shù)
從上述培養(yǎng)好的三種菌液中取樣，用血瓊脂平皿培養(yǎng)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以確定培養(yǎng) 菌數(shù)。 6.滅活 向上述三種培養(yǎng)好的菌液中，按總量加入0. 2%的甲醛溶液，放置于37t:滅活，其 間攪拌3 5次。
7.滅活檢驗(yàn) 滅活后，取上述三種已滅活的菌液5mL接種于100mL含2X血清、0. 2%的葡萄糖的 鏈球菌培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)24小時(shí)，再移植于上述100mL培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)24小時(shí)。取滅 活菌液0. 5mL接種于血瓊脂平皿上，37t:培養(yǎng)24小時(shí)。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
8.安檢 取上述三種已滅活的菌液靜脈注射18 22g的SPF小鼠5只，每只0. 2mL，三天內(nèi) 5/5健活，方為滅活徹底。
9.沉淀濃縮 向上述三種已滅活并安檢合格的菌液中加入適量的氫氧化鋁膠搖勻，常溫靜置沉
淀進(jìn)行沉淀濃縮。 10.去毒素 向上述三種已滅活、安檢合格并濃縮的菌液中加入15 25%的氫氧化鋁膠，搖 勻，所述氫氧化鋁膠和所述滅活后的菌液中的抗原結(jié)合形成顆粒狀結(jié)合物，在重力作用下 沉降。靜置，除去上層清液后，以無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀物，從而得到去除了毒素的菌液。
11.疫苗配制 將按照上述步驟處理過(guò)的三種菌液根據(jù)活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，按每頭份所述疫苗含 C55138株50億、C55914株50億、C55949株50億混合，并加入疫苗總量0. 01 %的疫苗防腐 劑硫柳汞，從而得到豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗。
12.疫苗的無(wú)菌檢驗(yàn) 取上述疫苗，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
13.疫苗的安全檢驗(yàn) 取上述疫苗肌肉注射健康易感豬4頭，每頭4mL， 10天內(nèi)4/4健活，方為合格
14.分裝 以20ml/瓶 100ml/瓶分裝，蓋上瓶蓋，并壓鋁蓋。 實(shí)施例2 疫苗的效力檢驗(yàn) 用健康易感豬15頭，各肌肉注射上述疫苗2ml，含1個(gè)使用劑量，21天后，將注射 了疫苗的免疫試驗(yàn)豬等分為三組，分別用所述C群C55138、D群C55914和E群C55949鏈球 菌強(qiáng)毒株攻擊。對(duì)照組豬15頭，等分為三組，分別用所述三種C群C55138、 D群C55914和 E群C55949鏈球菌強(qiáng)毒株攻擊。 鏈球菌C群C55138株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射致死量 的C群C55138株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對(duì)照豬4/5以上死亡為合格。
鏈球菌D群C55914株取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射致死量的 D群C55914株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對(duì)照豬5/5發(fā)病為合格。
鏈球菌E群C55949株取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射致死量的 E群C55949株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對(duì)照豬5/5發(fā)病為合格。檢驗(yàn)結(jié) 果如表l所示。表1疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果
菌株類型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組
蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株5/5死亡4/5保護(hù)
蘭氏D群鏈球菌C55914株5/5發(fā)病5/5保護(hù)
蘭氏E群鏈球菌C55949株5/5發(fā)病5/5保護(hù) 最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
權(quán)利要求
一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征是，所述豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗包含抗原和佐劑；所述抗原包含已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原和蘭氏E群鏈球菌C55949抗原；所述佐劑為氫氧化鋁膠。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征是，所述三種抗原的比例相等，其總體積為所述疫苗總體積的75% 85%。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征是，所述佐劑的體積為所述疫苗總體積的15% 25%。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征是，所述豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗中還含有疫苗總量0. 01%的硫柳汞。
5. —種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征是，包含如下步驟a. 分別將C群C55138菌種、D群C55914菌種和E群C55949菌種增殖培養(yǎng)，得到C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液；b. 分別將步驟a培養(yǎng)得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液進(jìn)行滅活；c. 分別向已滅活的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液中加入15X 25%氫氧化鋁膠，搖勻，常溫靜置沉淀48 72小時(shí)，除去上層清液后，以無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀物，得到已濃縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液；d. 將上述已滅活、濃縮并且已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液等比例混合，并加入疫苗總量0. 01 %的硫柳汞，得到豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗；e. 對(duì)步驟d得到的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行分裝。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征是，對(duì)步驟a得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征是，步驟b滅活后分別對(duì)C群C55138菌液、D群C55914菌液和E群C55949菌液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和安檢。
8. 如權(quán)利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征是，對(duì)步驟d配制得到的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。
全文摘要
一種新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，采用蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原和蘭氏E群鏈球菌C55949抗原，經(jīng)過(guò)菌種繁殖、菌液培養(yǎng)、純粹檢驗(yàn)、活菌計(jì)數(shù)、滅活、滅活檢驗(yàn)、沉淀濃縮、去毒素、混合配苗、疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)、疫苗安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和分裝步驟制備而成。本發(fā)明制備得到的新型豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，通過(guò)一次接種可以同時(shí)預(yù)防由蘭氏C群、D群和E群鏈球菌引起的三種豬鏈球菌病，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/09GK101721695SQ20091019389
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者以體強(qiáng), 張毓金, 楊球, 林旭埜, 游啟有, 王少英, 郭沈濤 申請(qǐng)人:廣東永順生物制藥有限公司