專利名稱：：豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗。
背景技術(shù)：
：豬鏈球菌病和巴氏桿菌病是目前我國(guó)豬的最主要的兩種細(xì)菌傳染病。豬鏈球菌病是由多種鏈球菌感染引的的一種多癥狀的豬病，主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、胸膜炎、組織膿腫、關(guān)節(jié)炎等癥狀，死亡率較高，流行時(shí)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)。國(guó)內(nèi)豬鏈球菌病自上世紀(jì)60年代以來(lái)，在廣西、廣東、福建、湖南、江西、安徽、江蘇、四川等地陸續(xù)發(fā)生，該病流行范圍廣，發(fā)病率和死亡率高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，主要血清型為蘭氏C群，其次為蘭氏D群、E群。近年來(lái)廣東、江蘇、上海和四川等地發(fā)現(xiàn)有R群的病例出現(xiàn)，1991年廣東省最早報(bào)導(dǎo)R群(豬鏈球菌2型)的出現(xiàn)，1998年長(zhǎng)江大洪水后，江蘇部分地區(qū)豬鏈球菌病爆發(fā)，并造成25人感染，14人死亡，經(jīng)鑒定為R群，C群也同時(shí)大量存在，使用C群疫苗后，疫情得到控制，2005年四川部分地區(qū)爆發(fā)R群疫情。巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染引起的細(xì)菌性疾病，可引起敗血癥、肺炎。另外，可引起豬體的混合感染，其常常導(dǎo)致豬群出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，由于混合感染和濫用抗生素，導(dǎo)致一病多型、一病多癥、一癥多病的現(xiàn)象非常普遍，造成豬病日趨復(fù)雜，診斷難度越來(lái)越大，漏診和誤診時(shí)有發(fā)生。巴氏桿菌按莢膜分可分為A、B、D、E四種莢膜血清型。巴氏桿菌病世界各地都有發(fā)生，熱帶地區(qū)較為嚴(yán)重。目前已流行的巴氏桿菌病以A、B群為主，還有少量的D群。目前，市面上使用的控制豬鏈球菌病的疫苗只有單獨(dú)預(yù)防C群鏈球菌、巴氏桿菌莢膜A群、B群菌感染的活疫苗，而針對(duì)豬鏈球菌其他血清型的疫苗還沒有。針對(duì)豬鏈球菌病的滅活疫苗和同時(shí)針對(duì)豬鏈球菌病與巴氏桿菌病的滅活疫苗，國(guó)內(nèi)也還是空白。現(xiàn)有巴氏桿菌疫苗是活的細(xì)菌疫苗，用活的細(xì)菌作為免疫原，存在一定的散毒情況。另外，由于濫用抗生素，導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，使藥物治療趨向無(wú)效、浪費(fèi)；抗生素藥物的殘留，使肉用動(dòng)物在出口時(shí)面臨不能通過(guò)的難題。于是，用疫苗來(lái)預(yù)防疾病的方法就顯得更加受歡迎。因此，需要發(fā)明一種新的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗以解決上述問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的之一在于基于現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種可以同時(shí)預(yù)防由蘭氏C群馬鏈球菌、豬鏈球菌2型、巴氏桿菌莢膜A群和B群菌所引起的細(xì)菌感染、免疫安全的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便的制備豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的方法。本發(fā)明提供一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，所述的豬鏈球菌病、多3殺性巴氏桿菌病滅活疫苗包括抗原和佐劑所述的抗原由已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株培養(yǎng)濃縮液、豬鏈球菌2型HA9801株培養(yǎng)濃縮液，巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)濃縮液、巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)濃縮液等菌量混合而成，所述的抗原為7585體積份數(shù)；所述的佐劑為氫氧化鋁凝膠，所述的佐劑為1525體積份數(shù)。本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，由于采用蘭氏C群馬鏈球菌、豬鏈球菌2型、莢膜血清A、B型的多殺性巴氏桿菌菌種制備多價(jià)滅活疫苗，可以預(yù)防由多種不同血清群鏈球菌引起的豬鏈球菌感染以及由多種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。上述兩個(gè)菌株的免疫原性強(qiáng)，適合作為生產(chǎn)菌株。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗中還含有0.01%體積比的硫柳汞。硫柳汞是一種可以抑制甚至殺滅細(xì)菌和真菌的化學(xué)物質(zhì)。防止疫苗生產(chǎn)和使用過(guò)程中受到霉菌污染。本發(fā)明還提供一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟(1)分別將蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、豬鏈球菌2型HA9801株、巴氏桿菌莢膜A群菌和巴氏桿菌莢膜B群菌增殖，得到培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)增殖得到的培養(yǎng)液滅活；(3)向滅活后的培養(yǎng)液分別加入氫氧化鋁凝膠進(jìn)行濃縮，在分別得到的濃縮液中，所述的氫氧化鋁凝膠的體積份數(shù)為1525，上述培養(yǎng)液各自的體積份數(shù)分別為7585;(4)將步驟(3)得到的培養(yǎng)液濃縮液按等量菌數(shù)進(jìn)行混合，得到豬鏈球菌、巴氏桿菌多價(jià)滅活疫苗。本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，操作簡(jiǎn)便，制備得到的產(chǎn)品能夠預(yù)防由多種不同血清群鏈球菌引起的豬鏈球菌感染以及由多種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，滅活方式為在步驟(1)增殖得到的培養(yǎng)液中，按總體積分別加入0.2%的甲醛溶液，放置于37"滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。積比的硫柳汞。加入硫柳汞的作用在于抑制霉菌。作為本發(fā)明豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(2)在滅活后還可以分別對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)。進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)的作用在于對(duì)制造過(guò)程疫苗質(zhì)量的控制。具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)方法可參見《中華人民共和國(guó)獸藥典(二〇〇五年版)》及附錄。其他未特別注明的試劑或原料均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得。實(shí)施例1本品是選用致病性的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、豬鏈球菌2型HA9801株，巴氏桿菌莢膜A群、莢膜B群菌接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)物經(jīng)甲醛溶液滅活，去除殘留毒素，加氫氧化鋁膠濃縮配制而成，用于預(yù)防由鏈球菌蘭氏C群、豬鏈球菌2型菌，巴氏桿菌莢膜A群、莢膜B群菌所引起的各種細(xì)菌菌感染。這包括了目前流行的幾種最主要的細(xì)菌性疾病。制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株及莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l(效檢可用C44-8)株等強(qiáng)毒株，均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)，豬鏈球菌2型HA9801株由廣東永順生物制藥有限公司保管和使用。1菌種制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為致病性的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、豬鏈球菌2型HA9801株，巴氏桿菌莢膜A群、莢膜B群菌，為獲得免疫原性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯后凍干保存。2疫苗制造及半成品檢驗(yàn)2.1生產(chǎn)用種子的制備2.1.1—級(jí)種子的繁殖凍干菌種，用馬丁肉湯稀釋，劃線接種于鮮血平皿上，置37t:培養(yǎng)1824小時(shí)，選取生長(zhǎng)良好的菌落，接種于含有羊鮮血瓊脂斜面上，37t:培養(yǎng)1824小時(shí)，作為一級(jí)種子。2.1.2二級(jí)種子的繁殖用少量緩沖肉湯洗一級(jí)種子的血瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于緩沖肉湯大管中，置37t:培養(yǎng)1824小時(shí)取出，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二級(jí)種子。2.2制苗用培養(yǎng)基采用商售的鏈球菌培養(yǎng)基、巴氏桿菌培養(yǎng)基。2.3制苗用菌液的制備2.3.1制苗用菌液的培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入血清2%，2株制苗用菌種液分別按5%的量加進(jìn)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37t:中培養(yǎng)；當(dāng)菌液pH降低到6以下時(shí)停止培養(yǎng)。2.3.2純粹檢驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)束后，分別從制苗菌液取樣，根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典(二OO五年版》中細(xì)菌類活疫苗純粹檢驗(yàn)方法進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，菌液應(yīng)純粹。2.3.3活菌計(jì)數(shù)分別從制苗菌液取樣，用血瓊脂平皿進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以確定培養(yǎng)菌數(shù)。2.3.4滅活在培養(yǎng)好的強(qiáng)毒菌液中，按總量加入0.2X的甲醛溶液，放置于37t:滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。2.3.5滅活檢驗(yàn)滅活后，取滅活菌液5ml接種于100ml含2%血清的培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)24小時(shí)，再移植于上述培養(yǎng)基100ml中37t:培養(yǎng)24小時(shí)；取滅活菌液0.5ml接種于血瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。上述兩種方法培養(yǎng)均應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。2.3.6毒素檢驗(yàn)取滅活菌液靜脈注射1822g的SPF小鼠5只，每只0.2ml，3天內(nèi)應(yīng)5/5健活。2.3.7沉淀濃縮經(jīng)滅活及毒素檢驗(yàn)合格后，按滅活菌液加入適量的氫氧化鋁膠搖勻進(jìn)行沉淀濃縮，混勻，置常溫沉淀4872小時(shí)。2.3.8去毒素向滅活好的菌液按比例加入15-25%的鋁膠，混勻，將細(xì)菌的毒素最大限度地去掉。細(xì)菌在培養(yǎng)增殖過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)，如增殖過(guò)程的分泌在培養(yǎng)基中外毒素(以蛋白質(zhì)為主)和在增殖過(guò)程中細(xì)菌凋亡破裂后釋放出來(lái)的內(nèi)毒素(以脂多糖為主)，以及一些有機(jī)酸和酶。這些物質(zhì)均對(duì)動(dòng)物機(jī)體有毒害作用(以過(guò)敏反應(yīng)等為最常見)。氫氧化鋁膠是一種弱的具有吸附作用的膠體，它能吸附細(xì)菌菌體，與之結(jié)合后，形成顆粒，并在重力作用下，沉降于液體下面，但不能吸附或極重量吸附細(xì)菌毒素等小物質(zhì)。同時(shí)，氫氧化鋁膠是一種免疫剌激劑，可以增強(qiáng)抗原的非特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原(細(xì)菌)在液體培養(yǎng)基中增殖及滅活完成，根椐活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，往抗原液中添加適量滅菌氫氧化鋁膠，攪拌均勻后，靜置。氫氧化鋁膠和抗原(細(xì)菌)結(jié)合物則沉降于下部，細(xì)菌毒素等有害物質(zhì)在殘留在上清液中。將上清去除后，以無(wú)菌生理鹽水將沉淀物重懸，配制成的疫苗成品，將大大提高產(chǎn)品的安全性。3配苗與分裝3.1混合根椐2.3.3的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將2.3.8的剩余物按菌數(shù)等比例混合，各個(gè)菌株按每2毫升含適宜菌數(shù)配苗，按總量加入0.01%硫柳汞。3.2半成品檢驗(yàn)取分裝前苗樣，按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。3.3分裝以100m1/瓶，或20m1/瓶分裝，蓋上瓶塞，并壓鋁蓋。在其他實(shí)施例中，還可以采用其他的制致病性的巴氏桿菌莢膜A群、B群強(qiáng)毒菌株，并不僅局限于實(shí)施例1中所采用的菌株。滅活的方式也可以采用e-丙內(nèi)酯(BPL)、Y-射線照射和加熱等其他滅活方法。作為防腐劑的硫柳汞可以采用其他含汞物質(zhì)代替，例如二甲基汞，或者基于安全的原因，硫柳汞也可以不添加。實(shí)施例2效力研究用健康易感豬20頭，各肌肉注射實(shí)施例1制得的疫苗2ml，含1個(gè)使用劑量；21天后，用各個(gè)強(qiáng)毒菌株進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊。鏈球菌C群C55138株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射C55138株致死量的強(qiáng)毒菌液，觀察IO天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對(duì)照豬4/5以上死亡為合格。豬鏈球菌2型HA9801株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，用HA9801強(qiáng)毒株致死劑量攻擊，觀察10天，對(duì)照組4/5以上死亡，免疫組4/5以上保護(hù)，判為合格。巴氏桿菌P71株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射P71株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，對(duì)照豬4/5以上死亡，免疫豬4/5以上保護(hù)。巴氏桿菌C44-1株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對(duì)照豬5頭，注射P71株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，對(duì)照豬4/5以上死亡，免疫豬4/5以上保護(hù)。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。權(quán)利要求一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，其特征在于，所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗包括抗原和佐劑所述的抗原由已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株培養(yǎng)濃縮液、豬鏈球菌2型HA9801株培養(yǎng)濃縮液，巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)濃縮液、巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)濃縮液等菌量混合而成，所述的抗原為75～85體積份數(shù)；所述的佐劑為氫氧化鋁凝膠，所述的佐劑為15～25體積份數(shù)。2.如權(quán)利要求1所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。3.如權(quán)利要求1所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。4.如權(quán)利要求1所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，其特征在于，所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗中還含有0.01%體積比的硫柳汞。5.—種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟(1)分別將蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、豬鏈球菌2型HA9801株、巴氏桿菌莢膜A群菌和巴氏桿菌莢膜B群菌增殖，得到培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)增殖得到的培養(yǎng)液滅活；(3)向滅活后的培養(yǎng)液分別加入氫氧化鋁凝膠進(jìn)行濃縮，在分別得到的濃縮液中，所述的氫氧化鋁凝膠的體積份數(shù)為1525，上述培養(yǎng)液各自的體積份數(shù)分別為7585;(4)將步驟(3)得到的培養(yǎng)液濃縮液按等量菌數(shù)進(jìn)行混合，得到豬鏈球菌、巴氏桿菌多價(jià)滅活疫苗。6.如權(quán)利要求5所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，滅活方式為在步驟(1)增殖得到的培養(yǎng)液中，按總體積分別加入0.2%的甲醛溶液，放置于37t:滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。7.如權(quán)利要求5所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。8.如權(quán)利要求5所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。9.如權(quán)利要求5所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，還包括步驟(5)向所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗加入0.01%體積比的硫柳汞。10.如權(quán)利要求5所述的豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)在滅活后分別對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)。全文摘要本發(fā)明提供一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗，可以預(yù)防由多種不同血清群鏈球菌引起的豬鏈球菌感染以及由多種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。本發(fā)明還提供一種豬鏈球菌病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法。文檔編號(hào)A61P31/04GK101745105SQ200910193898公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2009年11月13日優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日發(fā)明者以體強(qiáng),張毓金,楊球,林旭埜,游啟有,郭沈濤申請(qǐng)人:廣東永順生物制藥有限公司