專利名稱：：一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品
技術領域：
，特別涉及一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗。
背景技術：
：豬鏈球菌病是一種常見的傳染病，是由多種不同群的鏈球菌引起的不同癥狀類型的總稱。目前許多國家和地區(qū)都有豬鏈球菌病的報道，并且其流行呈明顯上升趨勢。該病以導致豬敗血癥、化膿性淋巴結炎、腦膜炎、關節(jié)炎為主要特征，在某些特定誘因作用下，發(fā)病豬群死亡率可達80%左右，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。國內豬鏈球菌病自上世紀60年代以來，在廣西、廣東、福建、湖南、江西、安徽、江蘇、四川等地陸續(xù)發(fā)生，該病流行范圍廣、發(fā)病率和死亡率高，造成了嚴重的經濟損失。鏈球菌的血清群多，主要為蘭氏C群，其次為蘭氏D、E群。各血清群之間交互免疫能力不強，所以，有些豬場雖然進行了該病的免疫預防，但仍得不到有效控制，免疫失敗現象時有發(fā)生。究其原因，主要是接種疫苗的菌株僅含1-2個血清群，與當時當地流行的豬鏈球菌病的病原血清群不相符所致。近年來，在我國各地發(fā)生的豬鏈球菌病，其病原血清群各有差異，不盡相同，給該病的預防和治療帶來了一定難度。目前用于豬鏈球菌病免疫預防的疫苗主要是以C群獸疫鏈球菌為疫苗株的滅活疫苗或弱毒疫苗，而該病的病原流行菌株已不局限于C群獸疫鏈球菌，D、E、L、R等血清群的鏈球菌在病原學調查中也占有一定比例。因此，需要發(fā)明一種新的豬鏈球菌病四價滅活疫苗以解決上述問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供一種安全、可靠的豬鏈球菌病四價滅活疫苗，所述疫苗可同時預防免疫由蘭氏C群、D群、E群鏈球菌和豬鏈球菌2型引起的四種豬鏈球菌病。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備豬鏈球菌病四價滅活疫苗的方法。本發(fā)明提供一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗，所述豬鏈球菌病四價滅活疫苗包含抗原和佐劑；其中，所述抗原包含已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原、蘭氏E群鏈球菌C55949抗原和豬鏈球菌2型HA9801抗原；所述佐劑為氫氧化鋁膠。作為本發(fā)明豬鏈球菌病四價滅活疫苗的優(yōu)選實施方式，所述四種抗原的比例為"蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原蘭氏D群鏈球菌C55914抗原蘭氏E群鏈球菌C55949抗原豬鏈球菌2型HA9801抗原二5:5:5:2";所述四種抗原總體積為所述疫苗總體積的75%85%。作為本發(fā)明豬鏈球菌病四價滅活疫苗的優(yōu)選實施方式，所述佐劑的體積為所述疫苗總體積的15%25%。作為本發(fā)明豬鏈球菌病四價滅活疫苗的優(yōu)選實施方式，所述疫苗中還含有所述疫苗總量0.01%的硫柳滎?！N豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備方法，包含以下步驟3a.分別將C群C55138菌種、D群C55914菌種、E群C55949菌種和豬鏈球菌2型HA9801菌種增殖培養(yǎng)，得到C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液；b.分別向上述培養(yǎng)好C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液中按總量加入0.2%的甲醛溶液，放置于37。C滅活，其間攪拌35次。c.向上述已滅活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液中加入適量的15%25%氫氧化鋁膠搖勻，常溫靜置沉淀，氫氧化鋁膠和所述菌液中的抗原結合形成顆粒狀結合物，靜置，在重力作用下沉降。除去上層清液后，以無菌生理鹽水重懸沉淀物，從而得到已濃縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液；d.分別將上述已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液按照5:5:5:2的比例混合均勻，并加入一定量的疫苗防腐劑硫柳汞，從而得到新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗；e.以適量體積分裝豬鏈球菌病四價滅活疫苗，蓋上瓶蓋，并壓鋁蓋。在上述制備過程中，從步驟a培養(yǎng)好的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液中取樣，進行純粹檢驗和活菌計數；從步驟b已滅活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液取樣進行滅活檢驗和安檢；對步驟d得到的豬鏈球菌病四價滅活疫苗進行無菌檢驗、安全檢驗和疫苗效力檢驗，以確保疫苗的安全性、可靠性。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，生物技術在疫病防制方面得到廣泛應用.并取得了顯著成效。但近年來免疫豬群屢屢發(fā)生免疫失敗的情況，造成了較大的經濟損失。七、八十年代豬鏈球菌病在我國許多省(市)都有發(fā)生，由此研制出了豬鏈球菌病滅活疫苗和弱毒活疫苗，使該病曾一度得到控制。近年有關豬群暴發(fā)該病的報道很多，且常常和其他疾病合并發(fā)生，發(fā)病率、死亡率均很高。有的豬場雖然進行了預防該病的l-2個血清群疫苗免疫接種，但仍得不到有效控制。有關學者對各地豬鏈球菌病的流行病學調查表明，目前該病的流行株已不僅僅局限于C群獸疫鏈菌，D、E、L、R等血清群的鏈球菌也占有很大比例。目前，用于該病免疫預防的疫苗主要是以C群獸疫鏈球菌為疫苗株的滅活疫苗或弱毒活疫苗，而與當地的豬鏈球菌病流行株并不相符，這正是豬鏈球菌病不能得到有效控制的主要原因。本發(fā)明制備的新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗，克服了目前市面上現有疫苗只能預防由鏈球菌蘭氏C群引起的鏈球菌感染的不足。本發(fā)明采用了獨特的毒素去除方法和適宜的配苗技術制備得到了豬鏈球菌病四價滅活疫苗，該疫苗可以同時預防由蘭氏C群、D群、E群鏈球菌和豬鏈球菌2型引起的四種豬鏈球菌病。達到了一針多防的效果。本發(fā)明制備得到的疫苗具有以下特點(1)本發(fā)明的新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的菌種采用菌種庫篩選的菌種并且菌種均經敏感豬體復壯，不僅免疫原性強、抗原譜廣、遺傳性能穩(wěn)定，而且是近年來豬鏈球菌病的流行株，以其作為菌種對實際防疫更具有針對性。(2)本發(fā)明的新鮮豬鏈球菌病四價滅活疫苗，一次接種可同時預防由蘭氏C群、D群、E群鏈球菌和豬鏈球菌2型引起的四種豬鏈球菌病。具有現用疫苗無法到達的便捷性和實用性。(3)本發(fā)明的新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗中還含有0.01%體積比的硫柳汞。硫柳汞是一種可以抑制甚至殺滅霉菌的化學物質。在疫苗出廠前，加入硫柳汞，防止在疫苗的生產和使用過程中受到霉菌污染。(4)本發(fā)明的一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備過程中采用了獨特的毒素去除技術。在細菌培養(yǎng)增殖過程中，細菌凋亡破裂后釋放出毒素，對動物機體有毒害作用。本發(fā)明中采用獨特的毒素去除技術，使用具有吸附作用的氫氧化鋁膠吸附細菌菌體，氫氧化鋁膠和細菌結合后形成顆粒，并在重力作用下，沉降于液體下面，而毒素等小物質則不能吸附，通過除去上層清液而達到了去除毒素的效果，從而得到去除毒素的菌液，大大減少了疫苗中由細菌毒素引起的副反應，提高了疫苗的安全性。(5)本發(fā)明的一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備過程中，經過了滅活檢驗、安檢和無菌檢驗步驟，嚴格控制疫苗質量，提高了疫苗的可靠性和安全性。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。本發(fā)明的具體實驗方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇〇五年版)》及附錄。其他未特別注明的試劑或原料均可由本領域技術人員根據現有技術獲得。實施例1—種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗，由已滅活、濃縮并且安檢合格，采用獨特的毒素去除技術處理過的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原、蘭氏E群鏈球菌C55949抗原和豬鏈球菌2型HA9801抗原，與佐劑氫氧化鋁膠混合配制得到。1.菌種a.蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應。b.蘭氏D群鏈球菌C55914株中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應。c.蘭氏E群鏈球菌C55949株中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應。d.豬鏈球菌2型HA9801株中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應。將上述蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138株、豬鏈球菌2型HA9801株經靜脈注射13月齡的健康敏感豬，蘭氏D群鏈球菌C55914株、蘭氏E群鏈球菌C55949株經關節(jié)腔注射13月齡的健康敏感豬，在負壓動物房經敏感豬體復壯并凍干保存。2.菌種的繁殖a.—級種子的繁殖上述凍干菌種，用馬丁肉湯稀釋，劃線接種于鮮血平皿上，置37t:培養(yǎng)1824小時，選取符合要求的菌落，接種于含有羊鮮血瓊脂斜面上，37t:培養(yǎng)1824小時，作為一級種子。b.二級種子的繁殖用少量緩沖肉湯洗上述一級種子的血瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于加有1%4%血清和0.2%葡萄糖的緩沖肉湯大管中，置37t:培養(yǎng)1824小時取出，經檢驗純粹后作為二級種子。3.菌液的培養(yǎng)在鏈球菌培養(yǎng)基(商售)中加入血清2%、葡萄糖0.2X，將C群C55138菌種、D群C55914菌種、E群C55949菌種和豬鏈球菌2型HA9801菌種分別按5%的量加進培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37t:中培養(yǎng)；當菌液pH降低到6以下時停止培養(yǎng)。得到四種菌液。4.純粹檢驗從上述培養(yǎng)好的四種菌液中取樣，用馬丁瓊脂依《中華人民共和國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，應純粹。5.活菌計數從上述培養(yǎng)好的四種菌液中取樣，用血瓊脂平皿培養(yǎng)進行活菌計數，以確定培養(yǎng)菌數。6.滅活向上述四種培養(yǎng)好的菌液中，按總量加入0.2X的甲醛溶液，放置于37t:滅活，其間攪拌35次。7.滅活檢驗滅活后，取上述四種已滅活的菌液5mL接種于100mL含2X血清、0.2%的葡萄糖的鏈球菌培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)24小時，再移植于上述100mL培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)24小時。取滅活菌液0.5mL接種于血瓊脂平皿上，37t:培養(yǎng)24小時。兩種方法培養(yǎng)后，均應無菌生長。8.毒素檢驗取上述四種已滅活的菌液靜脈注射1822g的SPF小鼠5只，每只0.2mL，三天內5/5健活。9.沉淀濃縮向上述四種已滅活并安檢合格的菌液中加入適量的氫氧化鋁膠搖勻，常溫靜置沉淀進行沉淀濃縮。10.去毒素向上述四種已滅活、安檢合格并濃縮的菌液中加入1525%的氫氧化鋁膠，搖勻，所述氫氧化鋁膠和所述滅活后的菌液中的抗原結合形成顆粒狀結合物，在重力作用下沉降。靜置，除去上層清液后，以無菌生理鹽水重懸沉淀物，從而得到去除了毒素的菌液。11.疫苗配制將按照上述步驟處理過的四種菌液根據活菌計數的結果，按照每頭份所述疫苗含C55138株50億、C55914株50億、C55949株50億、豬鏈球菌2型HA9801株20億混合，并加入疫苗總量0.01%的疫苗防腐劑硫柳汞，從而得到豬鏈球菌病四價滅活疫苗。12.疫苗的無菌檢驗取上述疫苗，按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，應無菌生長。13.疫苗的安全檢驗取上述疫苗肌肉注射健康易感豬4頭，每頭4mL，10天內4/4健活，方為合格。14.分裝以20m1/瓶100m1/瓶分裝，蓋上瓶蓋，并壓鋁蓋。實施例2疫苗的效力檢驗用健康易感豬20頭，各肌肉注射上述疫苗2ml，含1個使用劑量，21天后，將注射了疫苗的免疫試驗豬等分為四組，分別用所述C群C55138、D群C55914、E群C55949鏈球菌強毒株攻擊和豬鏈球菌2型HA9801株。對照組豬20頭，等分為四組，分別用所述四種C群C55138、D群C55914、E群C55949鏈球菌強毒株和豬鏈球菌2型HA9801株攻擊。鏈球菌C群C55138株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，注射致死量的C群C55138株強毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護，對照豬4/5以上死亡為合格。鏈球菌D群C55914株取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，注射致死量的D群C55914株強毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護，對照豬5/5發(fā)病為合格。鏈球菌E群C55949株取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，注射致死量的E群C55949株強毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護，對照豬5/5發(fā)病為合格。豬鏈球菌2型HA9801株取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，注射致死量的豬鏈球菌2型HA9801株強毒菌液，觀察10天，免疫豬4/5以上保護，對照豬4/5以上死亡為合格。檢驗結果如表l所示。表1疫苗效力檢驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。權利要求一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗，其特征是，所述豬鏈球菌病四價滅活疫苗包含抗原和佐劑；所述抗原包含已滅活的蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原、蘭氏E群鏈球菌C55949抗原和豬鏈球菌2型HA9801抗原；所述佐劑為氫氧化鋁膠。2.如權利要求1所述的一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗，其特征是，所述四種抗原的比例為"蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原蘭氏D群鏈球菌C55914抗原蘭氏E群鏈球菌C55949抗原豬鏈球菌2型HA9801抗原二5:5:5:2";所述四種抗原總體積為所述疫苗總體積的75%85%。3.如權利要求1所述的一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗，其特征是，所述佐劑的體積為所述疫苗總體積的15%25%。4.如權利要求1所述的一種豬鏈球菌病四價滅活疫苗，其特征是，所述豬鏈球菌病四價滅活疫苗中還含有疫苗總量0.01%的硫柳汞。5.—種豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備方法，其特征是，包含如下步驟a.分別將C群C55138菌種、D群C55914菌種、E群C55949菌種和豬鏈球菌2型HA9801菌種增殖培養(yǎng)，得到C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液；b.分別將步驟a培養(yǎng)得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液進行滅活；c.分別向已滅活的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型說9801菌液中加入15%25%氫氧化鋁膠，搖勻，常溫靜置沉淀除去上層清液后，以無菌生理鹽水重懸沉淀物，得到已濃縮、去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液；d.將上述已滅活、濃縮并且已去除毒素的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液按照5:5:5:2的比例混合均勻，并加入疫苗總量0.01%的硫柳汞，得到豬鏈球菌病四價滅活疫苗；e.對步驟d得到的豬鏈球菌病四價滅活疫苗進行分裝。6.如權利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備方法，其特征是，對步驟a得到的C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液進行純粹檢驗和活菌計數。7.如權利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備方法，其特征是，步驟b滅活后分別對C群C55138菌液、D群C55914菌液、E群C55949菌液和豬鏈球菌2型HA9801菌液進行滅活檢驗和安檢。8.如權利要求5所述的一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗的制備方法，其特征是，對步驟d配制得到的豬鏈球菌病四價滅活疫苗進行無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。全文摘要一種新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗，采用蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種C55138抗原、蘭氏D群鏈球菌C55914抗原、蘭氏E群鏈球菌C55949抗原和豬鏈球菌2型HA9801抗原，經過菌種繁殖、菌液培養(yǎng)、純粹檢驗、活菌計數、滅活、滅活檢驗、沉淀濃縮、去毒素、混合配苗、疫苗無菌檢驗、疫苗安全檢驗、效力檢驗和分裝步驟制備而成。本發(fā)明制備得到的新型豬鏈球菌病四價滅活疫苗，通過一次接種可以同時預防由蘭氏C群、D群、E群鏈球菌和豬鏈球菌2型引起的四種豬鏈球菌病，具有廣闊的應用前景。文檔編號A61K39/116GK101703769SQ200910193899公開日2010年5月12日申請日期2009年11月13日優(yōu)先權日2009年11月13日發(fā)明者以體強,張毓金,楊球,林旭埜,游啟有,王少英,郭沈濤申請人:廣東永順生物制藥有限公司