專利名稱：：豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗。
背景技術(shù)：
：巴氏桿菌病是目前我國豬的主要的細(xì)菌傳染病之一。巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染引起的細(xì)菌性疾病，可引起敗血癥、肺炎。巴氏桿菌按莢膜分可分為A、B、D、E四種莢膜血清型。巴氏桿菌病世界各地都有發(fā)生，熱帶地區(qū)較為嚴(yán)重。目前已流行的巴氏桿菌病以A、B群為主，還有少量的D群。巴氏桿菌可引起豬體的混合感染，其常常導(dǎo)致豬群出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，由于混合感染和濫用抗生素，導(dǎo)致一病多型、一病多癥、一癥多病的現(xiàn)象非常普遍，造成豬病日趨復(fù)雜，診斷難度越來越大，漏診和誤診時(shí)有發(fā)生。抗生素藥物的殘留，使肉用動(dòng)物在出口時(shí)面臨不能通過的難題。所以，豬巴氏桿菌病的預(yù)防疫苗就顯得更加重要了。目前，市面上使用的控制巴氏桿菌病的疫苗只有分別預(yù)防巴氏桿菌莢膜A群、B群菌感染的活疫苗，并且只能夠各自預(yù)防一種細(xì)菌感染。另外，現(xiàn)有巴氏桿菌疫苗是活的細(xì)菌疫苗，用活的細(xì)菌作為免疫原，存在一定的散毒情況。因此，需要發(fā)明一種新的豬巴氏桿菌病疫苗以解決上述問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的之一在于基于現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種可以預(yù)防由巴氏桿菌莢膜A群和B群菌所引起的細(xì)菌感染、免疫安全的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種操作簡便的制備豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的方法。本發(fā)明提供一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗包括抗原和佐劑所述的抗原由已滅活的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)濃縮液和已滅活的巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)濃縮液以等菌量混合而成，所述的抗原為7585體積份數(shù)；所述的佐劑為氫氧化鋁凝膠，所述的佐劑為1525體積份數(shù)。本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，由于采用莢膜血清A、B型的多殺性巴氏桿菌菌種制備二價(jià)滅活疫苗，可以預(yù)防由兩種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。上述兩個(gè)菌株的免疫原性強(qiáng)，適合作為生產(chǎn)菌株。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗中還含有0.01%體積比的硫柳汞。硫柳汞是一種可以抑制霉菌的化學(xué)物質(zhì)。防止疫苗生產(chǎn)和使用過程中受到霉菌污染。本發(fā)明還提供一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟(1)分別將巴氏桿菌莢膜A群菌和巴氏桿菌莢膜B群菌增殖，得到巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)增殖得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液滅活；(3)向滅活后的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液分別加入氫氧化鋁凝膠進(jìn)行濃縮，在分別得到的濃縮液中，所述的氫氧化鋁凝膠的體積份數(shù)為1525，上述兩種培養(yǎng)液的體積份數(shù)分別為7585;(4)將步驟(3)得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液濃縮液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液濃縮液按等量菌數(shù)進(jìn)行混合，得到豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗。本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，操作簡便，制備得到的產(chǎn)品能夠預(yù)防由兩種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，滅活方式為在步驟(1)增殖得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液中，按總體積分別加入0.2%的甲醛溶液，放置于37t:滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。上述兩個(gè)菌株的免疫原性強(qiáng)，適合作為生產(chǎn)菌株。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，該制備方法還包括步驟(5)向所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗加入0.01%體積比的硫柳汞。加入硫柳汞的作用在于抑制霉菌。作為本發(fā)明豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(2)在滅活后還可以分別對巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)。進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)的作用在于對制造過程疫苗質(zhì)量的控制。具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇〇五年版)》及附錄。其他未特別注明的試劑或原料均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得。實(shí)施例1本品是選用致病性的巴氏桿菌莢膜A群、B群強(qiáng)毒菌株，接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)物經(jīng)甲醛溶液滅活后，加氫氧化鋁膠濃縮制成二價(jià)滅活疫苗，用于預(yù)防由巴氏桿菌莢膜A群和B群菌感染所引起的細(xì)菌性疾病。制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株及莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-1株等強(qiáng)毒株，均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所4鑒定、保管和供應(yīng)。1菌種制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為巴氏桿菌莢膜A群、B群強(qiáng)毒菌株，為獲得免疫原性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯后凍干保存。2疫苗制造及半成品檢驗(yàn)2.1生產(chǎn)用種子的制備2.1.1—級種子的繁殖凍干菌種，用馬丁肉湯稀釋，劃線接種于鮮血平皿上，置37t:培養(yǎng)1824小時(shí)，選取生長良好的菌落，接種于含有羊鮮血瓊脂斜面上，37t:培養(yǎng)1824小時(shí)，作為一級種子。2.1.2二級種子的繁殖用少量緩沖肉湯洗一級種子的血瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于緩沖肉湯大管中，置37t:培養(yǎng)1824小時(shí)取出，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二級種子。2.2制苗用培養(yǎng)基采用商售的巴氏桿菌培養(yǎng)基。2.3制苗用菌液的制備2.3.1制苗用菌液的培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入血清2%，2株制苗用菌種液分別按5%的量加進(jìn)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37t:中培養(yǎng)；當(dāng)菌液pH降低到6以下時(shí)停止培養(yǎng)。2.3.2純粹檢驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)束后，分別從制苗菌液取樣，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(二OO五年版》中細(xì)菌類活疫苗純粹檢驗(yàn)方法進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，菌液應(yīng)純粹。2.3.3活菌計(jì)數(shù)分別從制苗菌液取樣，用肺疫瓊脂平皿進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以確定培養(yǎng)菌數(shù)。2.3.4滅活在培養(yǎng)好的強(qiáng)毒菌液中，按總量加入0.2X的甲醛溶液，放置于37t:滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。2.3.5滅活檢驗(yàn)滅活后，取滅活菌液5ml接種于100ml含2%血清的培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)24小時(shí)，再移植于上述培養(yǎng)基100ml中37t:培養(yǎng)24小時(shí)；取滅活菌液0.5ml接種于血瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。上述兩種方法培養(yǎng)均應(yīng)無菌生長。2.3.6毒素檢驗(yàn)取滅活菌液靜脈注射1822g的SPF小鼠5只，每只0.2ml，3天內(nèi)應(yīng)5/5健活。2.3.7沉淀濃縮經(jīng)滅活及毒素檢驗(yàn)合格后，按滅活菌液加入適量的氫氧化鋁膠搖勻進(jìn)行沉淀濃縮，混勻，置常溫沉淀4872小時(shí)。2.3.8去毒素向滅活好的菌液按比例加入15-25%的鋁膠，混勻，將細(xì)菌的毒素最大限度地去掉。細(xì)菌在培養(yǎng)增殖過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)，如增殖過程的分泌在培養(yǎng)基中外毒素(以蛋白質(zhì)為主)和在增殖過程中細(xì)菌凋亡破裂后釋放出來的內(nèi)毒素(以脂多糖為主)，以及一些有機(jī)酸和酶。這些物質(zhì)均對動(dòng)物機(jī)體有毒害作用(以過敏反應(yīng)等為最常見)。氫氧化鋁膠是一種弱的具有吸附作用的膠體，它能吸附細(xì)菌菌體，與之結(jié)合后，形成顆粒，并在重力作用下，沉降于液體下面，但不能吸附或極重量吸附細(xì)菌毒素等小物質(zhì)。同時(shí)，氫氧化鋁膠是一種免疫剌激劑，可以增強(qiáng)抗原的非特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原(細(xì)菌)在液體培養(yǎng)基中增殖及滅活完成，根椐活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，往抗原液中添加適量滅菌氫氧化鋁膠，攪拌均勻后，靜置。氫氧化鋁膠和抗原(細(xì)菌)結(jié)合物則沉降于下部，細(xì)菌毒素等有害物質(zhì)在殘留在上清液中。將上清去除后，以無菌生理鹽水將沉淀物重懸，配制成的疫苗成品，將大大提高產(chǎn)品的安全性。3配苗與分裝3.1混合根椐2.3.3的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將2.3.8的剩余物按菌數(shù)等比例混合，各個(gè)菌株按每2毫升含適宜菌數(shù)配苗，按總量加入0.01%硫柳汞。3.2半成品檢驗(yàn)取分裝前苗樣，按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。3.3分裝以100m1/瓶，或20m1/瓶分裝，蓋上瓶塞，并壓鋁蓋。在其他實(shí)施例中，還可以采用其他的制致病性的巴氏桿菌莢膜A群、B群強(qiáng)毒菌株，并不僅局限于實(shí)施例1中所采用的兩個(gè)菌株。滅活的方式也可以采用e-丙內(nèi)酯(BPL)、Y-射線照射和加熱等其他滅活方法。作為防腐劑的硫柳汞可以采用其他含汞物質(zhì)代替，例如二甲基汞，或者基于安全的原因，硫柳汞也可以不添加。實(shí)施例2效力研究用健康易感豬20頭，各肌肉注射實(shí)施例1制得的疫苗2ml，含1個(gè)使用劑量；21天后，用各個(gè)強(qiáng)毒菌株進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊。巴氏桿菌P71株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，注射P71株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，對照豬4/5以上死亡，免疫豬4/5以上保護(hù)。巴氏桿菌C44-1株選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，各靜脈注射C44-l株強(qiáng)毒菌液，觀察10天，對照豬4/5以上死亡，免疫豬4/5以上保護(hù)。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。權(quán)利要求一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗包括抗原和佐劑所述的抗原由已滅活的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)濃縮液和已滅活的巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)濃縮液以等菌量混合而成，所述的抗原為75～85體積份數(shù)；所述的佐劑為氫氧化鋁凝膠，所述的佐劑為15～25體積份數(shù)。2.如權(quán)利要求l所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。3.如權(quán)利要求1所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。4.如權(quán)利要求1所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗中還含有0.01%體積比的硫柳汞。5.—種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟(1)分別將巴氏桿菌莢膜A群菌和巴氏桿菌莢膜B群菌增殖，得到巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)增殖得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液滅活；(3)向滅活后的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液分別加入氫氧化鋁凝膠進(jìn)行濃縮，在分別得到的濃縮液中，所述的氫氧化鋁凝膠的體積份數(shù)為1525，上述兩種培養(yǎng)液的體積份數(shù)分別為7585;(4)將步驟(3)得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液濃縮液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液濃縮液按等量菌數(shù)進(jìn)行混合，得到豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗。6.如權(quán)利要求5所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，滅活方式為在步驟(1)增殖得到的巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液中，按總體積分別加入0.2%的甲醛溶液，放置于37t:滅活24小時(shí)，其間攪拌35次。7.如權(quán)利要求5所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜A群菌的菌株為莢膜A群多殺性巴氏桿菌P71株。8.如權(quán)利要求5所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的巴氏桿菌莢膜B群菌的菌株為莢膜B群多殺性巴氏桿菌C44-l。9.如權(quán)利要求5所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，還包括步驟(5)向所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗加入0.01%體積比的硫柳汞。10.如權(quán)利要求5所述的豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)在滅活后分別對巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)液和巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)。全文摘要本發(fā)明提供一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗，可以預(yù)防由兩種不同莢膜血清型的多殺性巴氏桿菌引起的感染，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。本發(fā)明還提供一種豬巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的制備方法。文檔編號A61P31/04GK101766814SQ200910193900公開日2010年7月7日申請日期2009年11月13日優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日發(fā)明者以體強(qiáng),張毓金,楊球,林旭埜,游啟有,郭沈濤申請人:廣東永順生物制藥有限公司