專利名稱：：一種水包油型復(fù)方疫苗佐劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種水包油型復(fù)方疫苗佐劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：已知如何通過使用疫苗來給予特定的抗原，從而故意剌激機體免疫反應(yīng)，該程序可使機體產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答狀態(tài)，使機體與抗原接觸時可產(chǎn)生更為迅速而有效的應(yīng)答。有些抗原只有微弱的免疫原性，它們不能引發(fā)充足的免疫應(yīng)答生物體獲得有效保護。然而，通過與一種稱為佐劑的物質(zhì)的混合使用，可以增加抗原的免疫原性。佐劑通過直接對免疫系統(tǒng)作用，或者通過修飾抗原的藥物動力學(xué)特性來增加對抗原的應(yīng)答，這樣就增加了抗原與免疫系統(tǒng)相互作用的時間。當(dāng)前，國內(nèi)獸用疫苗以油佐劑為主，即以非離子型表面活性劑(Tween-80、Span-80)作為劑型穩(wěn)定劑和抗原在高剪切力作用下制備成油包水型乳劑疫苗，該疫苗黏度大、注射困難，產(chǎn)生免疫保護慢且易對動物胴體品質(zhì)造成不良影響。近年來，國外也有成功制備出水包油型疫苗佐劑的案例(US6733754B2，US7371395B2)，前者以卵磷脂-礦物油為油相，以表面活性劑(Tween、Span)作為劑型穩(wěn)定劑制備出水包油型佐劑，后者以礦物油為油相，通過改變表面活性劑(Tween、Span)的比例制備出水包油型佐劑，但是價格昂貴，很少見到有國內(nèi)疫苗廠家應(yīng)用推廣。維生素E本身是一種很好的抗氧化劑，它可以進(jìn)入皮膚細(xì)胞具有抗自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，缺乏對人類或動物的免疫功能均有影響，適量攝取維生素E對細(xì)胞免疫也有很大幫助。蜂膠是一種稀有珍貴的蜂產(chǎn)品，一般情況下每群蜂幾萬只每天只能生產(chǎn)生0.2克左右。蜂膠具有天然的防腐、抑菌、殺菌、抗病毒作用，且有提高機體免疫能力，抑制腫瘤細(xì)胞，鎮(zhèn)痛，降低血糖等功能，所以有著廣泛的醫(yī)療和保健作用。因此，我國權(quán)威藥典《中華本草》列舉蜂膠有八大功效抗病原微生物；增強免疫功能；調(diào)節(jié)神經(jīng)機能；促進(jìn)組織修復(fù)；改善血液循環(huán)；保護肝功；清除自由基；無毒副作用。蜂膠在溶解后超聲波破碎，能加速其中有效物質(zhì)的溶解。目前，科技工作者已經(jīng)基本搞清了蜂膠的組成成份，其有效成分是樹脂(55%)、蜂蠟(30%)、精油(10%)與花粉所組成的混合物(5%)。樹脂是植物的分泌物，含有許多具有抗氧化作用的類黃酮素。蜂膠中主要作用的功效成份是黃酮類化合物，目前已經(jīng)分離確認(rèn)的就有30多種。還有阿魏酸等10多種芳香酸，香豆酸苯乙醋等30多種芳香醋，當(dāng)歸酸等30多種脂肪酸及醋類化合物，賴氨酸等20多種氨基酸，沒藥醇等10多種菇烯類化合物，鋅等30多種礦物質(zhì)，維生素P等多種維生素，胰蛋白酶等多種活性酶。蜂膠里含有其特有的芳香味，就是來自植物的精油，而這些香精亦具有療效。蜂膠佐劑在人用疫苗上研究較多(申請?zhí)?005100459649)，通常是先制成浸膏，再和抗原混合制備成納米疫苗，但由于其制備過程極其復(fù)雜，導(dǎo)致成本較高。因此，研制有效的可用于動物疫苗，且能夠解決上述問題的佐劑是非常有意義的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水包油型復(fù)方疫苗佐劑，該佐劑可以降低滅活疫苗的黏度，使疫苗注射更簡單，可使注射動物快速產(chǎn)生免疫保護作用。本發(fā)明另一目的在于提供上述水包油型復(fù)方疫苗佐劑的制備方法，該方法操作簡單，成本低廉。本發(fā)明上述目的是通過以下方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明水包油型復(fù)方疫苗佐劑包括油相部分和水相部分，其中油相部分包含維生素E、卵磷脂、蜂膠、礦物油和表面活性劑；水相部分為水性載體；其中，水性載體包括磷酸緩沖液和親水性表面活性劑。其中，所述油相部分中各組分在水包油型復(fù)方疫苗佐劑總體積中，按體積百分?jǐn)?shù)計分別為0.52X維生素E、16%卵磷脂、28%蜂膠、1530%礦物油、915%表面活性劑；水相部分的體積為余量。所述水相部分的體積為油相部分體積的12倍。所述維生素E優(yōu)選注射用a生育酚。所述卵磷脂優(yōu)選磷脂酰膽堿含量>90%的注射用大豆或蛋黃卵磷脂。所述礦物油為醫(yī)用白油。所述水性載體為磷酸緩沖液和親水性表面活性劑，磷酸緩沖液優(yōu)選pH=7.2的等滲磷酸緩沖鹽水。所述表面活性劑包括親油性表面活性劑、親水性表面活性劑中的一種或兩種的混合物；其中，親油性表面活性劑為Span，親水性表面活性劑為Tween，二者的HLB值為912;其中，油相部分所用表面活性劑優(yōu)選親油性表面活性劑，如Span-20、Span-40、Span-60、Span_65、Span-80或Span-85，最優(yōu)選為Span-80;還可在水相部分加入親水性表面活性劑，如Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-65、Tween-80、Tween-81或Tween-85，優(yōu)選Tween-80。表面活性劑的濃度取決于很多因素，如佐劑中油的濃度越高，乳化佐劑所需要的表面活性劑就越多；佐劑中卵磷脂的濃度越高，乳化所需要的表面活性劑就越少；表面活性劑的濃度還取決于用于佐劑的集中表面活性劑的HLB值和佐劑在疫苗組合物中的濃度。本發(fā)明中對表面活性劑的選用中，在油相部分的表面活性劑組分中，既可以選擇親油性表面活性劑，也可以選擇親水性表面活性劑，而水相部分的表面活性劑就只可以選擇親水性表面活性劑。當(dāng)油相部分選擇親油性表面活性劑時，油相與水相的兩種表面活性劑相混合，二者的HLB值為912時，可以達(dá)到很好的乳化效果；當(dāng)油相部分選擇親水性表面活性劑時，油相與水相的親水性表面活性劑相混合，乳化效果相對于油相部分選擇親油性表面活性劑時的乳化效果稍差。上述水包油型復(fù)方疫苗佐劑的制備方法步驟如下(1)將蜂膠和70%酒精按照1:11:4的體積比混合溶解，破碎蜂膠得到蜂膠溶液；(2)卵磷脂和醫(yī)用酒精按1:11:4的體積比混合溶解，得到卵磷脂溶液；(3)將維生素E、蜂膠溶液和卵磷脂溶液混合后，加至滅菌Span和礦物油中，得到油相部分；(4)將pH為7.2的等滲磷酸緩沖鹽水和Tween-80滅菌后混合，得到水相部分；(5)將油相倒入水相中攪拌，得到乳液；(6)將乳液通過均質(zhì)機處理，即得。水包油型復(fù)方疫苗佐劑的制備方法優(yōu)選為(1)無菌條件下，將蜂膠和70體積％酒精按照1:11:4的體積比混合溶解，超聲破碎法破碎蜂膠得到蜂膠溶液；(2)卵磷脂和醫(yī)用酒精按1:11:4的體積比混合溶解，得到卵磷脂溶液；(3)將維生素E、蜂膠溶液和卵磷脂溶液混合后，加至滅菌Span和礦物油中，得到油相部分；(4)將pH為7.2的磷酸緩沖液和Tween滅菌后混合，得到水相部分；(5)將油相倒入水相中緩慢攪拌，充分混勻成為乳液；(6)將乳液通過均質(zhì)機處理，即得。制備油相過程中，由于卵磷脂的溶解速度較慢，而蜂膠幾乎不溶，因此選用酒精作為助溶劑，在后續(xù)的動物免疫試驗過程中，佐劑中酒精含量過高會加大動物的應(yīng)激反應(yīng)，因此，通過多次試驗，確定上述制備方法中的步驟(1)和步驟(2)中酒精的加入量。本發(fā)明將幾種具有免疫增強作用的藥劑結(jié)合起來制備出復(fù)方水包油型佐劑，使其優(yōu)勢互補，與抗原簡單混合后即可以充分包被抗原，能顯著增強免疫系統(tǒng)識別抗原的效力和抗原遞呈作用，特別在動物飼養(yǎng)的關(guān)鍵時期，如免疫系統(tǒng)未發(fā)育完善、免疫紊亂或免疫功能低下及應(yīng)激時，起著更強大的免疫剌激作用，有效改善體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，加強抗體水平，誘導(dǎo)IgA、IgG和IgM的產(chǎn)生。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明水包油型復(fù)方疫苗佐劑具有如下有益效果本發(fā)明水包油型復(fù)方疫苗佐劑比傳統(tǒng)油佐劑疫苗能更早誘導(dǎo)更高的免疫反應(yīng)，可以使實驗動物獲得更早的攻毒保護，且疫苗吸收完全，在接種部位幾乎不引起炎癥反應(yīng)，不會對機體胴體造成影響。本發(fā)明方法簡單易行，降低了生產(chǎn)成本。圖1為實施例8中的1號佐劑所制備的新城疫滅活疫苗粒度分布；圖2為實施例8中的2號佐劑所制備的新城疫滅活疫苗粒度分布；圖3為實施例8中的3號佐劑所制備的新城疫滅活疫苗粒度分布；圖4為實施例8中的5號佐劑所制備的新城疫滅活疫苗粒度分布。具體實施例方式以下就具體實施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但并不對本發(fā)明做任何限定。實施例15佐劑的配方表1佐劑的配方實施例序號維生素E卵磷脂蜂膠各成分(體積％)礦物油Span80磷酸鹽緩沖液Tween80114620/54152244253.65110.4314624/53124248263.6488.45144233.6568.4上述佐劑的制備方法如下(1)無菌條件下，將蜂膠和70體積％酒精按照1:4的體積比混合溶解，超聲破碎法破碎蜂膠得到蜂膠溶液；(2)卵磷脂和醫(yī)用酒精按1:1的體積比混合溶解，得到卵磷脂溶液；(3)將維生素E、蜂膠溶液和卵磷脂溶液按比例混合后，加至滅菌Span和礦物油中，得到油相部分；(4)將pH為7.2的等滲磷酸緩沖鹽水和Tween滅菌后混合，得到水相部分；(5)將油相倒入水相中緩慢攪拌，充分混勻成為乳液；(6)將乳液通過均質(zhì)機處理，即得。實施例15中制備得到的疫苗佐劑分別為15號。實施例6不同配方佐劑的穩(wěn)定性測定實施例1中制備的佐劑，分別置4t:冰箱及培養(yǎng)箱25t:恒溫保存，定期抽樣觀察乳劑的穩(wěn)定性(試驗結(jié)果如表2和表3)。結(jié)果表明佐劑在4t:條件下保存，穩(wěn)定性較好，在25t:保存也有較好的穩(wěn)定性，尤其以兩種表面活性劑聯(lián)合運用效果最佳。4號佐劑由于分散劑和分散相的比例相近，表現(xiàn)出一定的相的轉(zhuǎn)換，最終分離成了兩相。表2不同配方佐劑fC保存穩(wěn)定性4'C條件下，穩(wěn)定性(天)佐劑序號1715304560901802————————3——一—————4———±/+±/++十+5———_—————————表示均勻的乳劑，顯微鏡下觀察無可見的油滴；-表示在水相中有小油滴，顯微鏡下觀察有少量的油滴；±表示在水相中有小油滴，肉眼可見；+表示兩相，油相和水相徹底分開；±/+表示兩相，水相上有一層棕黃色的物質(zhì)。表3不同配方佐劑25t:保存穩(wěn)定性25'C條件下，穩(wěn)定性(天)佐劑序號1715304560901802————一———3————一_——4——士/+±,/+++++—表示均勻的乳劑，顯微鏡下觀察無可見的油滴；-表示在水相中有小油滴，顯微鏡下觀察有少量的油滴；±表示在水相中有小油滴，肉眼可見；+表示兩相，油相和水相徹底分開；±/+表示兩相，水相上有一層棕黃色的物質(zhì)。實施例7不同配方佐劑制備新城疫滅活疫苗安全性及免疫效果試驗滅活新城疫病毒和相應(yīng)的佐劑按(體積比)2:l混合后制備出新城疫滅活疫苗，同時制備出普通油包水型疫苗，使得同體積的疫苗抗原含量相同。分別肌肉注射免疫7日齡SPF雞(0.2mL/只)，設(shè)置無佐劑抗原組和PBS對照組，14天后加強免疫1次，最后一次免疫后20天進(jìn)行攻毒保護試驗，統(tǒng)計各組SPF雞的死亡情況(結(jié)果詳見表4)。表4新城疫滅活疫苗對SPF雞的攻毒保護組別1234568疫苗1236抗原PBS佐劑序號123白油*//m/n3/201/202/201/201/2015/2020/20*表示不同油包水型佐劑，制備出油包水型疫苗；/表示不添加佐劑；m/n表示各組SPF雞的死亡數(shù)/總數(shù)。各實驗組SPF雞免疫后均未出現(xiàn)精神狀況差、食欲減退等不良反應(yīng)，說明各佐劑制備的新城疫疫苗對實驗動物SPF雞是安全的。攻毒后各組SPF雞的死亡情況可以反應(yīng)出不加佐劑的抗原不足以抵抗同源強毒的攻擊，各種佐劑制備的新城疫疫苗均可以使免疫動物獲得較好的保護，說明本案佐劑和普通油包水型疫苗佐劑均具備較好的佐劑效果。實施例8不同配方佐劑制備新城疫疫苗粒度測定對實施例7制備的水包油型新城疫滅活疫苗進(jìn)行粒度測定，結(jié)果(詳見圖14)表明兩種表面活性劑聯(lián)合運用制備的水包油型疫苗粒徑較單一的親水性表面活性劑制得疫苗的粒徑小，且顆粒分布相對集中。尤其以5號佐劑最佳，粒徑O.22um以下的占所有顆粒的99.96%，粒徑約0.08um0.22um之間的占所有顆粒的90%以上。實施例9不同配方佐劑制備新城疫滅活疫苗免疫SPF雞后抗體消長及對胴體的影響同實施例7的方法，以滅活新城疫病毒抗原和相應(yīng)的佐劑按(體積比)2:1混合后制備出新城疫滅活疫苗，同時制備出普通油包水型疫苗，使得同體積的疫苗抗原含量相同。分別肌肉注射免疫7日齡SPF雞(0.2mL/只)，設(shè)置抗原及PBS對照組，14天后加強免疫1次，分別于第一次免疫前及最后一次免疫后每10天采血，分離血清，_201:保存(試驗結(jié)束后一起檢測HI抗體，試驗結(jié)果詳見表5);最后一次免疫后60天，撲殺各組SPF雞，剖檢，統(tǒng)計各組實驗雞注射部位組織病變情況(試驗結(jié)果詳見表6)。表5不同佐劑制備的新城疫滅活疫苗在SPF雞中的佐劑效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>每組20只SPF雞，m代表各實驗組雞免疫疫苗所用的佐劑序號，n代表免疫后的天數(shù)，X代表免疫前；AVE代表抗體的平均值，STD代表離平均值的標(biāo)準(zhǔn)差；*代表油包水型佐劑，能制備出普通油包水型疫苗；/代表無佐劑，抗原對照組，〃代表PBS對照組。如表5所示，各疫苗組與單抗原對照組比，均可以有效地剌激SPF雞使其獲得較高的特異性抗體。第二次免疫后，以水包油型疫苗產(chǎn)生抗體較快，充分體現(xiàn)了劑型優(yōu)勢。5號佐劑制備的疫苗產(chǎn)生的抗體均勻度最高，且在二免后60天，還具有同油苗相近的抗體水平。表6不同佐劑制備的新城疫滅活疫苗在SPF雞注射部位的殘留情況組別1234567疫苗1236抗原PBS佐劑序號1235白油*//m/n4/202/203/200/20l簡0/200/20m代表各實驗組雞免疫疫苗后，注射部位存在肉眼可見病變的只數(shù)，n代表各實驗組雞的總數(shù)；*代表油包水型佐劑，能制備出普通油包水型疫苗；/代表無佐劑，抗原對照組，〃代表PBS對照組。如表6所示，各疫苗組在免疫60天后，單抗原及PBS對照組，沒有發(fā)現(xiàn)注射對實驗動物SPF雞胴體造成影響，可以排除抗原在注射部位殘留的可能。各實驗組中，以油苗對免疫動物SPF雞的影響最大(20只雞中，18有殘留及無菌膿腫)，5號佐劑制備的新城疫滅活疫苗效果最好，沒有發(fā)現(xiàn)注射部位有肉眼可見的殘留及病變。權(quán)利要求一種水包油型復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于該佐劑包括油相和水相兩部分，其中，油相部分包含維生素E、卵磷脂、蜂膠、礦物油和表面活性劑，水相部分為水性載體；其中，水性載體包括磷酸緩沖液和親水性表面活性劑。2.如權(quán)利要求1所述的水包油型復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述油相部分中各組分在水包油型復(fù)方疫苗佐劑總體積中，按體積百分?jǐn)?shù)計分別為0.52%維生素E、l6%卵磷脂、28%蜂膠、1530%礦物油、915%表面活性劑；水相部分的體積為余量。3.如權(quán)利要求1或2所述的水包油型復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述維生素E為注射用a生育酚。4.如權(quán)利要求1或2所述的水包油型復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述卵磷脂為磷脂酰膽堿質(zhì)量含量^90%的注射用大豆或蛋黃卵磷脂。5.如權(quán)利要求1或2所述的水包油復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述表面活性劑包括親油性表面活性劑、親水性表面活性劑中的一種或兩種的混合物；其中，親油性表面活性劑為Span，親水性表面活性劑為Tween。6.如權(quán)利要求5所述的水包油復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述親油性表面活性劑為Span-20、Span-60或Span-80。7.如權(quán)利要求1或5所述的水包油復(fù)方疫苗佐劑，其特征在于所述親水性表面活性劑為Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81或Tween-85。8.權(quán)利要求1所述的水包油復(fù)方疫苗佐劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將蜂膠和70體積％酒精按照i:ii:4的體積比混合溶解，破碎蜂膠得到蜂膠溶液；(2)卵磷脂和醫(yī)用酒精按i:ii:4的體積比混合溶解，得到卵磷脂溶液；(3)將維生素E、蜂膠溶液和卵磷脂溶液混合后，加至滅菌Span和礦物油中，得到油相部分；(4)將磷酸緩沖液和Tween滅菌后混合，得到水相部分；(5)將油相倒入水相中攪拌，得到乳液；(6)將乳液通過均質(zhì)機處理，即得。9.如權(quán)利要求8所述的水包油復(fù)方疫苗佐劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)無菌條件下，將蜂膠和70體積％酒精按照1:11:4的體積比混合溶解，超聲破碎法破碎蜂膠得到蜂膠溶液；(2)卵磷脂和醫(yī)用酒精按i:ii:4的體積比混合溶解，得到卵磷脂溶液；(3)將維生素E、蜂膠溶液和卵磷脂溶液混合后，加至滅菌Span和礦物油中，得到油相部分；(4)將pH為7.2的磷酸緩沖液和Tween滅菌后混合，得到水相部分；(5)將油相倒入水相中緩慢攪拌，充分混勻成為乳液；(6)將乳液通過均質(zhì)機處理，即得。全文摘要本發(fā)明公開了一種水包油型復(fù)方疫苗佐劑及其制備方法，包括油相和水相兩部分，其中，油相部分包含維生素E、卵磷脂、蜂膠、礦物油和表面活性劑，水相部分為水性載體；其中，水性載體包括磷酸緩沖液和親水性表面活性劑。本發(fā)明水包油型復(fù)方疫苗佐劑可以降低滅活疫苗的黏度，使疫苗注射更容易，可使動物快速產(chǎn)生免疫保護作用且局部反應(yīng)小；本發(fā)明水包油型復(fù)方疫苗佐劑的制備方法簡單，成本低廉，便于疫苗的大量生產(chǎn)。文檔編號A61P37/04GK101703771SQ200910193930公開日2010年5月12日申請日期2009年11月13日優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日發(fā)明者佘曉彬,宋延華,楊明柳,鄧雨修申請人:廣東溫氏食品集團有限公司