專利名稱：用δ阿片受體拮抗劑緩解阿爾茨海默癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療阿爾茲海默癥(Alzheimer' s disease，AD)，尤其是涉及用δ阿 片受體(DOR)拮抗劑或κ阿片受體(KOR)拮抗劑來(lái)治療阿爾茲海默癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默癥是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是造成癡呆的最主要病因之一。 目前對(duì)于阿爾茨海默癥發(fā)病原因最重要的假說(shuō)是β-淀粉樣蛋白(Αβ)假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為 淀粉樣蛋白斑的主要成分Αβ在阿爾茨海默癥的發(fā)生中起根本性作用，在復(fù)雜的遺傳和環(huán) 境因素長(zhǎng)期作用下，神經(jīng)細(xì)胞異常地大量產(chǎn)生Αβ，積累形成Αβ寡聚體和淀粉樣蛋白斑， Αβ通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)(包括自由基反應(yīng)、線粒體氧化損傷和炎癥反應(yīng)等直接或間接地 作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)，導(dǎo)致突觸功能異常和神經(jīng)元損傷，并且引起小膠質(zhì)細(xì)胞和星型 膠質(zhì)細(xì)胞激活，加速神經(jīng)纖維絲纏結(jié)的形成，長(zhǎng)期作用后導(dǎo)致認(rèn)知障礙。最近幾年的研究發(fā) 現(xiàn)，Αβ寡聚體與突觸功能異常的關(guān)系尤其密切。從Αβ前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠大腦 中分離得到的Αβ的12聚體(Αβ*)能夠損傷突觸功能，影響學(xué)習(xí)記憶。A β是I型跨膜蛋白APP經(jīng)過(guò)β -分泌酶和Y -分泌酶順序剪切的產(chǎn)物。APP也可 以被α-分泌酶(a-secretase)剪切，由于剪切位點(diǎn)在A β區(qū)域內(nèi)，破壞了 A β蛋白域，所 以不產(chǎn)生完整的A β。具有β -分泌酶活性的蛋白有β -APP-轉(zhuǎn)變酶1 (BACEl)和BACE2， 都是具有天冬氨酸蛋白酶活性的一次跨膜蛋白，其中BACEl被認(rèn)為是體內(nèi)負(fù)責(zé)β-分泌酶 剪切的主要蛋白，因?yàn)锽ACEl缺失的APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)不產(chǎn)生Αβ。APP經(jīng)過(guò)β -分泌酶 的剪切，產(chǎn)生sAPP β和C99，C99再經(jīng)過(guò)γ -分泌酶剪切產(chǎn)生A β。研究表明，APP并不是BACE和γ -分泌酶的唯一的底物，BACE還介導(dǎo)P-選擇糖 蛋白配體-I(PSGL-I)，2，6-sialtransferase 1 (ST6Gal 1)，APLP1/2 等蛋白的剪切；Y-分 泌酶的底物還包括Notch，Ν/Ε-鈣粘蛋白(Cadherin)，APLP1/2, ErbB_4，低密度脂蛋白受 體相關(guān)蛋白(LRP)等。這些蛋白的剪切產(chǎn)物具有重要的生理功能，比如Notch經(jīng)過(guò)剪切產(chǎn) 生的胞內(nèi)段Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而參與發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn) 決定；鈣粘蛋白則是細(xì)胞黏附中的重要分子；APLP1/2是APP家族中另外兩個(gè)成員，它們與 APP類似，經(jīng)歷α-分泌酶，β-分泌酶和Y-分泌酶的剪切。由于BACE和Y-分泌酶底 物的多樣性和缺乏特異性，為了避免可能的副作用，我們需要尋找能夠特異地抑制BACE和 Y -分泌酶對(duì)于APP的剪切，而不影響對(duì)于其他底物的剪切活性的方法，這也成為目前分泌 酶抑制劑研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前通過(guò)FDA批準(zhǔn)在多國(guó)上市的用于阿爾茨海默癥臨床治療的藥物分為兩類，第 一類包括多奈哌齊，利斯的敏和加蘭他敏，屬于乙酰膽堿酯酶抑制劑，能通過(guò)抑制乙酰膽堿 的降解，增加膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，改善認(rèn)知；第二類是美金剛，它是一個(gè)NMDA受體的非競(jìng) 爭(zhēng)性拮抗劑，被認(rèn)為可以保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。但是它們都不能從根本 上治療阿爾茨海默癥，而只能起到暫時(shí)緩解癥狀的作用。正處于研發(fā)過(guò)程或者臨床實(shí)驗(yàn)階 段的藥物包括分泌酶調(diào)節(jié)物，β -淀粉樣蛋白免疫療法，β -淀粉樣蛋白沉積的抑制劑，抗炎癥藥物，神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)劑，降低膽固醇的藥物，激素療法，抗氧化物等。其中分泌酶調(diào)節(jié)物 一直受到廣泛關(guān)注和研究，但如前所述，由于分泌酶底物的多樣性和缺乏特異性，如何特異 性地抑制分泌酶對(duì)于APP的剪切活性是目前相關(guān)藥物異發(fā)必需解決的關(guān)鍵命題。阿片受體屬于Gi/Go蛋白偶聯(lián)受體。目前為止已被克隆的阿片受體包括D0R，κ阿 片受體(KOR)，μ阿片受體(MOR)和阿片樣受體1 (ORLl)。D0R，K0R和MOR的氨基酸序列存 在65%的同源性，它們的跨膜區(qū)和胞內(nèi)環(huán)區(qū)域的序列都具有高度的相似性，而胞外環(huán)區(qū)域， N-末端和C-末端的序列則差異較大，這些區(qū)域序列的差異決定了這幾種受體與各自選擇 性的配體的結(jié)合以及各自不同的胞內(nèi)信號(hào)通路。阿片受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達(dá)，包 括受AD影響的最主要的腦區(qū)海馬和皮層。阿片受體參與鎮(zhèn)痛，成癮，情緒等重要的生理病 理過(guò)程，并且在突觸形成，學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起重要作用。阿片受體的拮抗劑被證明能夠改善 小鼠的空間記憶能力。1983年的一項(xiàng)雙盲，安慰劑對(duì)照的臨床研究工作也報(bào)告了非選擇性 的阿片受體拮抗劑納絡(luò)酮(naloxone)對(duì)于AD病人認(rèn)知功能的改善作用。雖然之后的幾項(xiàng) 研究沒(méi)有驗(yàn)證納絡(luò)酮(naloxone)或者納曲酮(naltrexone)對(duì)于病人認(rèn)知功能的改善，但 由于當(dāng)時(shí)診斷和監(jiān)測(cè)阿爾茨海默癥手段的有限性，這一結(jié)論主要是通過(guò)認(rèn)知量表得出的， 可能具有一定的局限性。同時(shí)，由于阿片受體基因敲除小鼠的研究證明幾種阿片受體在鎮(zhèn) 痛，成癮，情緒中起到不同的甚至相反的作用，所以也不排除使用選擇性阿片受體拮抗劑能 夠得到陽(yáng)性結(jié)果的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供治療阿爾茨海默癥的物質(zhì)及其篩選方法。具體而言，本發(fā)明第一方面涉及一種物質(zhì)在制備用于治療阿爾茲海默癥的藥物中 的用途，該物質(zhì)選自(1)抑制阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)的物質(zhì)；( 抑制阿片受體 與β-分泌酶和Y-分泌酶形成復(fù)合物的物質(zhì)；C3)抑制阿片受體、β-分泌酶和Y-分泌 酶所形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)。本發(fā)明另一方面提供了一種篩選用于治療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)的方法，該方 法包括以下步驟(a)將候選物質(zhì)與表達(dá)阿片受體的體系接觸；(b)觀察候選物質(zhì)對(duì)于該體系中阿片受體的表達(dá)水平的影響；其中，若所述候選物質(zhì)能降低該體系中阿片受體的表達(dá)水平，則表明該候選物質(zhì) 是治療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)。本發(fā)明者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因模型小鼠中降低δ阿片受體(DOR)的表達(dá)水平 或者用DOR拮抗劑阻斷受體信號(hào)，能夠顯著地降低BACE和γ -分泌酶的對(duì)于APP的剪切活 性，從而降低淀粉樣蛋白的水平，減輕淀粉樣蛋白斑病理，緩解與之相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障 礙。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)可根據(jù)下文進(jìn)一步的詳細(xì)描述得知。


圖1表明針對(duì)小鼠DOR的小干擾RNA有效降低DOR的mRNA水平和蛋白水平。(A) 在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HA-DOR的HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染小干擾RNA，2天后進(jìn)行免疫共沉淀和免疫印 跡，檢測(cè)DOR的蛋白水平。圖中顯示了密度計(jì)量分析結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，**P < 0. 01。(B) 3個(gè)月大的TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠的左右側(cè)海馬分別注射針對(duì)小鼠DOR的 小干擾RNA慢病毒和對(duì)照慢病毒，注射慢病毒后2個(gè)月，小鼠被處死，抽取兩側(cè)海馬組織的 RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)DOR和MOR的mRNA水平。數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤 差，η = 6，< 0. 05。圖2表明降低DOR的表達(dá)水平顯著地延緩TgCRNDS小鼠海馬中淀粉樣蛋白斑的形 成。㈧3個(gè)月大的TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠的左右側(cè)海馬分別注射針對(duì)小鼠DOR的小干擾RNA 慢病毒和對(duì)照病毒，注射慢病毒后2個(gè)月，小鼠被處死，制備腦片進(jìn)行免疫熒光染色。上圖 慢病毒表達(dá)的GFP熒光顯示病毒在小鼠兩側(cè)海馬中的表達(dá)位置和表達(dá)強(qiáng)度。中圖和下圖 用Αβ抗體6Ε10進(jìn)行的免疫熒光染色結(jié)果顯示小鼠海馬區(qū)(中圖)和皮層區(qū)(下圖)的 淀粉樣蛋白斑水平。標(biāo)尺所示長(zhǎng)度代表200微米。(B)通過(guò)軟件分析免疫熒光染色的結(jié)果， 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)兩側(cè)海馬和皮層中淀粉樣蛋白斑所占圖像面積的百分比。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均 值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ<0. 05。圖3表明NTI給藥不影響APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的游泳速度和在水迷宮可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn) 練中的行為。APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因陰性的同窩野生型小鼠在給藥結(jié)束后接受水迷 宮訓(xùn)練。(A)各組小鼠的游泳速度。η = 8-17，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，P = O. 834。 (B)各組小鼠在水迷宮可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中的行為。η = 8-17，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，P =0. 473。圖4表明NTI給藥顯著地緩解APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。APP/PS轉(zhuǎn)基 因小鼠和轉(zhuǎn)基因陰性的同窩野生型小鼠在給藥結(jié)束后接受水迷宮訓(xùn)練。(A)各組小鼠在水 迷宮不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中的行為，η = 8-17，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。< 0. 01，用 two-wayRM-ANOVA進(jìn)行顯著性分析。⑶和(C)，最后一次訓(xùn)練結(jié)束后M小時(shí)去除平臺(tái)的測(cè) 試中，相對(duì)于安慰劑組的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠，NTI給藥組的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠在先前平臺(tái) 所在的象限呆更長(zhǎng)的時(shí)間(B)，同時(shí)經(jīng)過(guò)原先平臺(tái)位置的次數(shù)也更多(C)。n = 8-17，數(shù)據(jù) 顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05。(D)去除平臺(tái)的測(cè)試中，各組小鼠的具代表性的探索 路線。黑色圓點(diǎn)代表原先平臺(tái)所在的位置。圖5表明NTI給藥不影響野生型小鼠的學(xué)習(xí)記憶。野生型小鼠在給藥結(jié)束后接受 水迷宮訓(xùn)練。(A)各組小鼠在水迷宮不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中的行為。η = 8，數(shù)據(jù)顯示平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤差。P > 0. 05，用two-way RM-ANOVA進(jìn)行顯著性分析。(B)最后一次訓(xùn)練結(jié)束后M 小時(shí)去除平臺(tái)的測(cè)試中，各組小鼠經(jīng)過(guò)原先平臺(tái)位置的次數(shù)。η = 8，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo) 準(zhǔn)誤差，Student’ s t test, P > 0. 05。圖6表明NTI給藥顯著降低APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的淀粉樣蛋白斑的形成。各 給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，制備腦片進(jìn)行硫磺素S染色(A上)和抗 Αβ抗體6Ε10的免疫熒光染色(Α下)。圖中顯示代表性結(jié)果(A)和軟件分析得到的統(tǒng)計(jì) 學(xué)結(jié)果(B)。標(biāo)尺所示長(zhǎng)度代表50微米。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05。圖7表明NTI給藥有效延緩APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層中Αβ的積累。各給 藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，海馬組織(上)和皮層組織(下)用SDS 和FA先后提取蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白提取液中A β 40和A β 42水平。η = 6， 數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01。圖8表明NTI給藥顯著降低APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的水平。各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，制備腦片進(jìn)行抗GFAP (A 上)和抗CDllb(AT)的免疫熒光染色。圖中顯示代表性結(jié)果(A)和軟件分析得到的統(tǒng)計(jì) 學(xué)結(jié)果(B)。標(biāo)尺所示長(zhǎng)度代表50微米。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05， **Ρ < 0· 01。圖9表明NTI給藥有效延緩TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中Αβ的積累。用緩釋泵給 藥觀天后的TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織用SDS和FA先后提取蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)蛋白提取液中A β 40和A β 42 7jC平。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，< 0.01ο圖10表明NTI給藥不影響APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的NEP或者IDE的活性水平。 各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織進(jìn)行NEP和IDE的活性測(cè)定。η = 5，數(shù)據(jù)顯示平 均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，P > 0. 05。圖11表明NTI給藥顯著增加APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的APP-CTF的水平，而不 影響全長(zhǎng)APP的水平。各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織樣品用針對(duì)APP的C末端 的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。圖中顯示代表性結(jié)果(A)和密度計(jì)量分析結(jié)果(B)。η = 5，數(shù) 據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05。圖12表明NTI給藥不影響APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的Notch，N-鈣粘蛋白，APLPl 的剪切。各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織樣品用于免疫印跡檢測(cè)。NI⑶由特異性識(shí) 別Notchl胞內(nèi)段的抗體進(jìn)行免疫沉淀后檢測(cè)。N-Cad/CTFl和APLP1-CTF分別由識(shí)別N-鈣 粘蛋白和APLPl的C末端的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。圖中顯示代表性結(jié)果(A)和密度計(jì)量 分析結(jié)果(B)。η = 5，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，P > 0. 05。圖13表明DOR的激活增強(qiáng)BACE和γ -分泌酶的活性。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DOR的ΗΕΚ293Τ 細(xì)胞株在NTI (1 μ Μ)預(yù)處理或者不預(yù)處理的情況下，用DADLE (1 μ Μ)處理30分鐘。之后用 熒光底物分泌酶活性檢測(cè)方法測(cè)定各組細(xì)胞的分泌酶活性。數(shù)據(jù)顯示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均 值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，#Ρ< 0.01。圖14表明DADLE或者NTI處理不影響ΗΕΙ^93Τ細(xì)胞中的Notch剪切。HEI^93T細(xì) 胞轉(zhuǎn)染DOR和帶myc標(biāo)記的N Δ E后48小時(shí)進(jìn)行如圖所示的處理7小時(shí)。收集細(xì)胞裂解液 用于myc抗體的免疫印跡反應(yīng)。圖中顯示代表性結(jié)果和密度計(jì)量分析結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示三次 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，< 0. 01。圖15表明DOR激活增加APP/CTFi3的剪切，但不影響ΝΔE的剪切。穩(wěn)定過(guò)表達(dá) DOR 的 ΗΕΙ^93Τ 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 CMV-β -gal, MH100 禾口 ΝΔΕ-GVP 或者 APP/CTF3 -GVP 的質(zhì)粒， 共轉(zhuǎn)染PSl質(zhì)粒的作為陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)，進(jìn)行如圖所示的處理12小時(shí)。收細(xì)胞 檢測(cè)熒光素酶活性和半乳糖苷酶活性。圖中顯示帶復(fù)孔重復(fù)的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 士 標(biāo)準(zhǔn)誤差，**Ρ < 0. 01，*Ρ < 0. 05。圖16表明DOR激活后，細(xì)胞膜表面的BACE和PSl水平下降。過(guò)表達(dá)3，HA-BACE 和5，F(xiàn)LAG-DOR的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞進(jìn)行如圖所示的處理30分鐘。細(xì)胞膜表面的蛋白用 EZ-linkSulfo-NHS-LC-Biotin標(biāo)記后用Mi^ptavidin偶聯(lián)的凝膠珠沉淀下來(lái)進(jìn)行免疫印 跡檢測(cè)。圖中顯示代表性結(jié)果(A)和密度計(jì)量分析結(jié)果(B)。數(shù)據(jù)顯示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平 均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P < 0. 05。圖17表明DOR激活后，BACE和PSl發(fā)生共內(nèi)吞。過(guò)表達(dá)RFP-BACE，GFP-PSl和 FLAG-DOR的HEK293T細(xì)胞用DADLE處理，每隔3秒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)(C)。白色箭頭指示有代表性的包含RFP-BACE和GFP-PSl的小體的內(nèi)吞。對(duì)照細(xì)胞不轉(zhuǎn)染DOR(A)或者不用 DADLE處理(B)。標(biāo)尺代表長(zhǎng)度為10 μ m。圖18表明DOR激活后，BACE和PSl在內(nèi)吞體中的定位增加。過(guò)表達(dá)HA-BACE， GFP-Rab7和FLAG-DOR的HEI^93T細(xì)胞用DADLE處理30分鐘后固定，用針對(duì)PSl和HA的抗 體進(jìn)行免疫熒光染色后用共聚焦顯微鏡觀察。對(duì)照細(xì)胞不用DADLE處理。圖中顯示有代表 性的蛋白定位情況，Rab7 (綠色)，BACE (紅色)，PSl (藍(lán)色)。標(biāo)尺代表長(zhǎng)度為10 μ m。圖19表明MOR，DORMT, MORDT激活后，細(xì)胞膜表面的BACE和PSl水平。過(guò)表達(dá) 3，HA-BACE 和 5，F(xiàn)LAG-MOR (A, B)或者 5，F(xiàn)LAG-D0RMT (C, D)，5，F(xiàn)LAG-MORDT (E，F(xiàn))的 HEI^93T 細(xì)胞進(jìn)行如圖所示的處理30分鐘。細(xì)胞膜表面的蛋白用EZ-linkSulfo-NHS-LC-Biotin 標(biāo)記后用^MPtavidin偶聯(lián)的凝膠珠沉淀下來(lái)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。圖中顯示代表性結(jié)果 (A，C，E)和密度計(jì)量分析結(jié)果(B，D，F(xiàn))。數(shù)據(jù)顯示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P < 0. 05。圖20表明MOR或者DORMT，MORDT激活后，BACE和PSl在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。過(guò) 表達(dá) HA-BACE，GFP-Rab7 和 FLAG-M0R 或者 FLAG-DORMT，F(xiàn)LAG-MORDT 的 HEI^93T 細(xì)胞用相 應(yīng)的激動(dòng)劑處理30分鐘后固定，用針對(duì)PSl和HA的抗體進(jìn)行免疫熒光染色后用共聚焦顯 微鏡觀察。對(duì)照細(xì)胞不用激動(dòng)劑處理。圖中顯示有代表性的蛋白定位情況，Rab7(綠色)， BACE (紅色)，PSl (藍(lán)色)。標(biāo)尺代表長(zhǎng)度為10 μ m。圖21表明MOR或者DORMT，MORDT激活對(duì)于分泌酶活性和A β產(chǎn)生的影響。穩(wěn)定 過(guò)表達(dá) APPswe 的 ΗΕΙ^93Τ 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 FLAG-D0R 或者 FLAG-M0R，F(xiàn)LAG-D0RMT，F(xiàn)LAG-M0RDT， 然后進(jìn)行如圖所示的處理，用于分泌酶活性檢測(cè)的細(xì)胞，處理30分鐘，用于Αβ檢測(cè)的細(xì) 胞，處理7小時(shí)。之后用熒光底物分泌酶活性檢測(cè)方法測(cè)定各組細(xì)胞的分泌酶活性，用酶聯(lián) 免疫吸附實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的Aβ 40和Αβ 42的水平。數(shù)據(jù)顯示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，< 0. 01。圖22表明MOR或者DORMT，MORDT激活對(duì)于APP/CTF β禾Π N Δ E的剪切的影響。 ΗΕΚ293Τ細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的受體以及CMV-β -gal，ΜΗ100禾Π N Δ E-GVP或者APP/CTF β -GVP的 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)，進(jìn)行如圖所示的處理12小時(shí)。收細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶活性和半 乳糖苷酶活性。圖中顯示帶復(fù)孔重復(fù)的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，**Ρ < 0. 01，< 0. 05。圖23表明BNTX，GNTI, β -FNA給藥對(duì)于APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力 的影響。各組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠在給藥結(jié)束后接受水迷宮訓(xùn)練。(A)各組小鼠在水迷宮可 見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練過(guò)程中的行為。P >0.05。(B)各組小鼠在水迷宮不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中的行為。 **P < 0.01o (C)各組小鼠在去除平臺(tái)后的測(cè)試中的行為。*Ρ < 0. 05。(D)各組小鼠的游 泳速度。P > 0. 05。η = 8-17，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖M表明BNTX，GNTI，β -FNA給藥對(duì)于APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的淀粉樣蛋白 斑，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞水平的影響。各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠處死，制備腦片 進(jìn)行抗A β抗體6E10(A)，抗GFAP(B)和抗CDllb (C)的免疫熒光染色。圖中顯示軟件分析 得到的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05，< 0. 01。圖25表明BNTX，GNTI, β -FNA給藥對(duì)于APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層中Aβ水 平的影響。各給藥組APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，海馬組織(A-B)和皮層組織(C-D)用SDS和FA先后提取蛋白，用免疫酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)蛋白提取液中A β 40和A β 42水 平。η = 6，數(shù)據(jù)顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ < 0. 05, **Ρ < 0. 01。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一個(gè)方面涉及物質(zhì)在制備用于治療阿爾茲海默癥的藥物中的用途，該物質(zhì) 選自(1)抑制阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)的物質(zhì)；( 抑制阿片受體與β-分泌酶 和Y-分泌酶形成復(fù)合物的物質(zhì)；C3)抑制阿片受體、分泌酶和Y-分泌酶所形成的復(fù) 合物轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)。本發(fā)明者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因模型小鼠中降低δ阿片受體(DOR)的表達(dá)水平 或者用DOR拮抗劑阻斷受體信號(hào)，能夠顯著地降低BACE和γ -分泌酶的對(duì)于APP的剪切活 性，從而降低淀粉樣蛋白的水平，減輕淀粉樣蛋白斑病理，緩解與之相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障 礙。同時(shí)，DOR的拮抗劑處理并不影響B(tài)ACE和Y-分泌酶對(duì)其它底物，如Notch，鈣粘蛋白 和APLP的剪切。進(jìn)一步分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，DOR能與BACE和分泌酶形成復(fù)合物，在 DOR被激活的情況下，發(fā)生DOR介導(dǎo)的BACE和γ -分泌酶的共內(nèi)吞，從而使BACE和γ -分 泌酶進(jìn)入晚期內(nèi)吞小體和溶酶體，調(diào)節(jié)APP剪切和Αβ的產(chǎn)生?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域技術(shù) 人員能夠理解所有能夠在基因水平或蛋白質(zhì)水平阻遏阿片受體(尤其是S阿片受體或κ 阿片受體)的物質(zhì)均適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中是通過(guò)抑制阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)來(lái)減少 阿片受體的水平，從而抑制阿片受體與BACE和Y-分泌酶形成復(fù)合物，降低BACE和γ-分 泌酶對(duì)APP的剪切活性?？梢种凭幋a阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄及/或翻譯的物質(zhì)包括阿片受體基因或其片段 的反義核酸。本發(fā)明對(duì)于反義核酸的長(zhǎng)度沒(méi)有特別的限制，但通常反義核酸片段的長(zhǎng)度為 lO-lOObp，較佳地為15-50bp，更佳地為20-2^p。所用的反義核酸片段可以是一種或多種 反義核酸片段，如果使用多種反義核酸片段，各反義核酸片段之間可以不存在重迭區(qū)域，也 可存在重迭區(qū)域。所述反義核酸分子/片段可用化學(xué)方法來(lái)合成，采用的是天然的核苷酸或設(shè)計(jì)成 可提高分子生物穩(wěn)定性或增高與阿片受體基因形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的各種修飾的 核苷酸。該反義序列可用生物學(xué)方法制得，用表達(dá)載體以重組質(zhì)粒，嗜菌?；驕p毒病毒形式 引入細(xì)胞內(nèi)，在該細(xì)胞內(nèi)反義序列在高度有效的調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生，其活性可由引入載 體的細(xì)胞類型決定。含反義序列的核酸分子可用常規(guī)技術(shù)例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染及物理技術(shù) (如電穿孔及微量注射)引入對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)。化學(xué)方法例如DNA共同沉淀及合并入脂質(zhì)體 也可用來(lái)輸送反義序列。這些分子也可以氣溶膠或灌洗形式輸送。用來(lái)轉(zhuǎn)移核酸分子的適 當(dāng)?shù)妮d體或克隆載體為本領(lǐng)域所知。適當(dāng)?shù)妮d體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體 及DNA病毒載體?？梢种凭幋a阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄及/或翻譯的物質(zhì)也可以是阿片受體基因的 (小)干擾RNA(siRNA)。RNA干擾(RNA interference)也是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種封閉 基因表達(dá)的有效方法。它采用與目的基因同源的21-23核苷酸長(zhǎng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì) 胞。RNA干擾的作用過(guò)程包括兩個(gè)步驟——起始步驟和效應(yīng)步驟。在起始步驟中，導(dǎo)入的 dsRNA被特異性識(shí)別dsRNA的RNaseIII家族成員消化成21_23nt大小的小干擾RNA，每個(gè)siRNA的3’端都有2 3個(gè)突出核苷酸，5’端帶磷酸基團(tuán)。在效應(yīng)步驟中，siRNA與核酸 酶復(fù)合物(包括核酸外切酶，核酸內(nèi)切酶，解旋酶和類RecA蛋白等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的 沉默復(fù)合物(RNAinduced silence complex, RISC)，RISC 在 ATP 存在的情況下將 siRNA 解 鏈成單鏈從而激活RISC，激活后的RISC通過(guò)堿基配對(duì)特異性識(shí)別目的基因的mRNA，繼而將 mRNA降解。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩 條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈 來(lái)制備。因此，舉例來(lái)講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過(guò)退火雜交，產(chǎn)生 合成的雙鏈RNA復(fù)合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的小干擾RNA分子為如下的siRNA序 列(5，端至 3，端)GGC CAA GCU GAU CAA UAU A。本發(fā)明對(duì)所述siRNA的合成方法沒(méi)有特別的限制，比如可采用化學(xué)合成法、體外 轉(zhuǎn)錄法等。將外源核酸轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域周知的，大致可分為兩大類，即 生物方法和物理化學(xué)方法。物理化學(xué)方法中常用的有磷酸鈣法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以及最近出現(xiàn)的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術(shù)。生物方法則主要是 以病毒作為載體，通過(guò)病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺 病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。磷酸鈣在良好的轉(zhuǎn)染條件下，可以在等細(xì)胞的轉(zhuǎn)染達(dá)到較高 的轉(zhuǎn)染效率。此外，轉(zhuǎn)染方法還包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，具體為帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電 的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。適用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體法的陽(yáng)離子脂質(zhì)體是本領(lǐng)域周知 的，并且可從各種商業(yè)途徑購(gòu)得。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案中，可通過(guò)抑制阿片受體與β-分泌酶和Y-分泌酶 形成復(fù)合物或抑制該復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)降低BACE和γ -分泌酶對(duì)APP的剪切活性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是阿片受體拮抗劑。具體而言，所述 阿片受體拮抗劑可以例如(括號(hào)內(nèi)給出CAS號(hào))納洛酮(Naloxone，465-65-6)；納洛 阱(Naloxonazine,82824-01-9) ；Cyprodime(118111-54-9)；納布啡(20594-83-6)； RX 8008M(40994-80-7) ；SDZ210-096(109026-86-0) ；Clocinnamox(117332-69-1)； NIH 10236 (88167-37-7) ；BU 165 (173321-27-2) ；BU 164 (173429-52-2) ；BU 158(173429-53-3) ；BU 160(173429-56-6) ；BU161 (173429-57-7) ；BU 162(173429-58-8)； 丁丙諾啡(52485-79-7) ； IOXY (141392-28-1) ；NPC168 (115160-07-1)；納洛剎腙 (73674-85-8) ；N-Methylnaloxonium Iodide (93302-47-7) ；3_ 甲氧基納曲酮氯化物； 7-苯亞甲基納曲酮(129468-28-6) ；Naltrindole Isothiocyanate(126876-64-0)； BNTX(153611-34-8) ；Naltriben(111555-58-9)；納曲酮(16590-41-3)；納美芬 (55096-26-9) ；氯代納曲胺(67025-94-9) ；二丙諾啡(14357-78-9) ；nor-Binaltorphi mine(105618-27-7) ；Naltrindole (111555-53-4) ；GNTI (219655-57-9)等。本發(fā)明的阿片受體拮抗劑能夠適當(dāng)?shù)匾韵率鲂问奖皇褂蒙韺W(xué)可接受的無(wú)機(jī)酸 鹽(例如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽)或有機(jī)酸的鹽(例如甲磺酸鹽、對(duì)-甲苯磺 酸鹽、碳酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽)；或作為水合物使用。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，阿片受體宜為δ阿片受體或κ阿片受體。因此，本 發(fā)明的物質(zhì)優(yōu)選δ阿片受體或κ阿片受體的拮抗劑，更優(yōu)選的是δ阿片受體或κ阿片 受體的選擇性拮抗劑。雖然在本申請(qǐng)實(shí)施例中列舉了 BNTX、NTI、GNTI作為例子，但是本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠理解這些拮抗劑的其它藥學(xué)上可接受的鹽形式也能用于本發(fā)明。
上述物質(zhì)可以配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH 通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而 有所變化。配制好的藥物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)皮內(nèi)、透皮 (如緩釋劑型)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、硬腦膜外、局部和鼻內(nèi)途徑?？刹捎萌魏?其它治療有效的給藥途徑，如通過(guò)表皮或內(nèi)皮組織吸收，或作基因治療。對(duì)于胃腸道外給藥 (如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))，可將該活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的胃腸外運(yùn)載體(如水、鹽水、葡 聚糖溶液)和維持等滲(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖劑)的添加劑一起， 配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。采用常規(guī)技術(shù)給該制劑滅菌。給予個(gè)體的劑量，單 劑或多劑，可視多種因素而不同，包括藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、病人狀況和特征(性別、 年齡、體重、健康、體形)、癥狀程度、同時(shí)的治療方法、治療頻率和需要的效果。本發(fā)明的藥物還可與其它已知能夠治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病的藥物，同時(shí)、 依次或分別使用。這些藥物例如包括，但不局限于膽堿酯酶抑制劑，優(yōu)選乙酰膽堿酯酶抑 制劑和/或丁酰膽堿酯酶抑制劑，如杜尼匹次、雷司替明、加蘭他敏、塔克林、阿米瑞丁、米 那普林、福定堿、石杉?jí)A、雙-四氫氨基吖啶(雙-THA)、咪唑、1，2，4-噻二唑啉啶酮、苯并氮 雜卓、4’4_ 二吡啶、茚并喹啉酰胺、十烷雙胺、騰喜龍、毒扁豆堿、敵百蟲(chóng)、丙錠、法西庫(kù)拉素、 有機(jī)磷、氨基甲酸酯、1，2，3，4_四氫環(huán)戊基[b]吲哚氨基甲酸亞胺、N-嘧啶4-乙酰苯胺、 7-芳氧基香豆素、氨基甲酸炔丙胺酯、維生素E、N0S抑制劑，ACh前體如膽堿和吡咯烷膽堿、 或膽堿能受體激動(dòng)劑(如煙酸，特別是α 7和毒蕈堿)；降A(chǔ) β毒性制劑，例如布洛芬、吲 哚美辛、舒林酸硫化物、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)抑制劑如3-氨基噠嗪衍生物、環(huán)氧化酶 (C0X-1和-2)抑制劑、抗氧化劑如維生素C和E、NMDA調(diào)節(jié)劑如美金剛胺、MAO抑制劑如雷 沙吉蘭、司來(lái)吉蘭和反苯環(huán)丙胺；激素替代制劑，如刺激素；降脂藥物，如3-羥基-3-甲戊 基輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑、抑制素、洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、西姆伐他汀、 弗魯伐他汀、西立伐他汀、羅素伐他汀、美伐他汀、莫維諾林、美華斯太汀、維沙他汀、維羅他 汀、辛伐他汀、雷伐他汀、亞大伐汀、彼塔伐他汀、甲基-β -環(huán)糊精、7-脫氫膽固醇還原酶、 ?；o酶A 膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、或PlI抑制劑如渥曼青霉素；分泌酶調(diào)節(jié) 劑，β-和/或Y-分泌酶抑制劑的抑制劑、或α-分泌酶促進(jìn)分子；A β凝聚抑制劑，包括 但不局限于，BACE和BACE2抑制劑，例如三肽醛1、烷氧基被取代的四氫萘；Y _分泌酶抑制 劑是二氟代酮為基礎(chǔ)的化合物、羥基被取代的肽脲、丙氨酸-苯基甘氨酸衍生物、己內(nèi)酰 胺、苯(并)二氮、己酰胺、氨磺酰葑胺、雙環(huán)氨磺酰、異香豆素、二芳基乙炔、咪唑并吡啶、聚 氧化芳族結(jié)構(gòu)；α -分泌酶促進(jìn)分子是蛋白激酶C活化劑、谷氨酸、碳酰膽堿、蕈毒堿激動(dòng) 劑、親神經(jīng)藥物，或含銅(II)化合物；神經(jīng)纖維化抑制劑，如GSK3 β抑制劑如LiCI、GSK3i3 和cdk5抑制劑如靛玉紅和paulones、鈣蛋白酶抑制劑，或紫杉醇及相關(guān)藥物；或β -樣淀 粉分解代謝抑制劑，例如鋅金屬蛋白酶(如腦啡肽酶、內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶、胰島素降解酶 (如IDE，insulysin)和血纖蛋白溶酶，或腦啡肽酶抑制劑。本發(fā)明另一方面還提供了一種篩選用于治療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)的方法，該 方法包括以下步驟(a)將候選物質(zhì)與表達(dá)阿片受體的體系接觸；(b)觀察候選物質(zhì)對(duì)于該 體系中阿片受體的表達(dá)水平的影響；其中，若所述候選物質(zhì)能降低該體系中阿片受體的表 達(dá)水平，則表明該候選物質(zhì)是治療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述阿片受體是δ阿片受體或κ阿片受體。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、 重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中 有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷 (D. N. Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B. D. Hames 和S. J. Higgins編輯· 1984)；《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐》第2版(Springer-Verlag, N. Y.)， 以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》I-IV卷(D. C. Wfeir和C. C. Blackwell編輯1986)?；蛘撸砂凑赵?劑生產(chǎn)商所提供的說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株HEK293和HEK293T人胚胎腎細(xì)胞系，購(gòu)自ATCC ；細(xì)胞培養(yǎng)于含有5%二氧化碳的 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱。采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染。所有實(shí)驗(yàn)均以轉(zhuǎn)染半乳糖苷酶(β-gal)作為 對(duì)照。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物· APP/PS 轉(zhuǎn)基因模型小鼠(39)，C3H/C57BL6 遠(yuǎn)交系，表達(dá) APP 的 K670N，M671L 突 變體和PSl的Δ E9突變體，購(gòu)自Jackson Laboratory (004462)。雜合子APP/PS轉(zhuǎn)基因小 鼠與B6C3/F1工具鼠交配繁殖子代，子代小鼠經(jīng)基因型鑒定后用于實(shí)驗(yàn)?！?TgCRND8 轉(zhuǎn)基因模型小鼠 00)，C3H/C57BL6 遠(yuǎn)交系，表達(dá) APP 的 K670N，M671L， V717F University of Alberta ^ David Westgway貝曾。TgCRNDS 轉(zhuǎn)基因小鼠與B6C3/F1工具鼠交配繁殖子代，子代小鼠經(jīng)基因型鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒
· DOR, M0R, DORMT 和 MORDT 通過(guò) RT-PCR 方法克隆構(gòu)建；· GFP-Rab7 由王平博士(University of Minnesota School of Medicine)提 供； 慢病毒載體質(zhì)粒由 David Baltimore 教授(California Institute of Technology)提供；# myc-tagged Notch Δ E 由 Raphael Kopan 教授(Washington University)提 供；· Gal4-driven 熒光素酶報(bào)告基因，APP/CTF β -GVP 和 ΝΔΕ-GVP 質(zhì)粒由 JohanLundkvist 教授(Karolinska Institutet)提供?？贵w· Αβ 鼠源單抗 6Ε10 購(gòu)自 Covance 公司，Cat. #SIG_39320 ；· GFAP 大鼠源多抗購(gòu)自 Zymed 公司，Cat. #13-0300 ；· Alexa Fluor 488 偶聯(lián)的 CDl Ib 鼠源單抗購(gòu)自 BD 公司，Cat. #557672 ；· TRITC偶聯(lián)的HA鼠源單抗購(gòu)自Sigma公司，Cat. #H9037 ；
· Flag 兔源多抗購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #F7425 ；· HA 兔源多抗購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #H_6908 ；· PSl-NTF 兔源多抗購(gòu)自 Calbiochem 公司，Cat. #529591 ；· N-鈣粘蛋白鼠源單抗購(gòu)自BD公司，Cat. #610920 ；
· E-鈣粘蛋白鼠源單抗購(gòu)自BD公司，Cat. #610181 ；· APP-CTF 兔源多抗購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #A8717 ；· APLPI-CTF 兔源多抗購(gòu)自 Calbiochem 公司，Cat. #171615 ；· Cleaved Notch 1 (Val 1744)兔源多抗購(gòu)自 Cell Signaling 公司，Cat. #2421 ；· Myc 鼠源單抗 9E10 購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #M_5546 ；· HA 鼠源單抗 12CA5 購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #H9658 ；
· Actin 兔源多抗購(gòu)自 Sigma 公司，Cat. #A2066 ；· IRDye800CW 偶聯(lián)山羊抗小鼠 IgG 二抗購(gòu)自 Rockland 公司，Cat. #610-131-121 ；· IRDye800CW 偶聯(lián)山羊抗兔 IgG 二抗購(gòu)自 Rockland 公司，Cat. #611-131-122 ；· CT3偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG 二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司， Cat. #112-165-167 ；· CY5偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司， Cat. #111-175-144 ；· FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG 二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司， Cat. #115-095-146 ；其他試劑 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)人源A β 40和A β 42用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑 盒購(gòu)自Biosource公司；· DADLE 購(gòu)自 Sigma 公司；· naltrindole 購(gòu)自 Sigma 公司；· γ-分泌酶抑制劑L-685,458購(gòu)自Calbiochem公司；· γ-分泌酶抑制劑DAPT購(gòu)自Calbiochem公司； 分泌酶熒光底物購(gòu)自Calbiochem公司； 質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；· EZ-Iink Sulfo-NHS-LC-Biotin 購(gòu)自 Thermo 公司；· Thioflavin-S 購(gòu)自 Sigma 公司； 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；· β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；· FLAG抗體偶聯(lián)的凝膠珠購(gòu)自Sigma公司；· FLAG肽段在吉爾生化(上海)有限公司合成； 滲透壓緩釋泵購(gòu)自Alzet公司，型號(hào)2004。實(shí)驗(yàn)方法APP/PS小鼠和TgCRND8小鼠基因型鑒定按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取鼠尾DNA。剪取約0.5cm長(zhǎng)的鼠尾尖端，加入0.5ml裂解液(含 有4M尿素、IOmM EDTA、0. IM Tris HCl (ρΗ 8. 0)、0· 2M NaCl、0· 5% Sarkosyl 和 lmg/ml 蛋白 酶K)，置于56°C水浴直至鼠尾完全溶解。然后加入0. 7ml酚氯仿并混勻，于4°C以9，OOOrpm 離心15min。取上清，加入等體積的異丙醇并混勻，于4°C以9，OOOrpm離心15min沉淀DNA。 棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀DNA。溶解DNA后測(cè)定濃度。APP/PS小鼠基因型鑒定
PCR 鑒定 APP 基因引物為oIMR1597 :GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG(SEQ IDNO :1)； οIMRl598 :CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG(SEQ ID NO :2)。PCR 反應(yīng)體系10XPCR 緩沖液 2 μ l,25mM MgCl 2 1. 6μ l,2mM dNTP 2 μ 1，DNA 模板 lOOng，10 μ MoIMR15970. 5 μ 1，10 μ M oIMR1598 0. 5μ 1, Taq 酶 3_5u，加水補(bǔ)足 20 μ 1。PCR 反應(yīng)條件94°C 初始變性 3min，94°C 變性30s，69°C復(fù)性60s，72°C擴(kuò)增60s，循環(huán)35次。PCR 鑒定 PSl 基因引物為oIMR1588 :GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC (SEQID NO 3) ；oIMR1644 :AATAGAGAACGGCAGGAGCA (SEQ ID NO :4)。PCR 反應(yīng)體系10 XPCR 緩沖液 2 μ l,25mM MgC121. 2μ l,2mM dNTP 2 μ 1，50%甘油 4 μ 1，DNA 模板 100ng，10 μ M oIMR1588 0· 5 μ 1，10 μ M oIMR1644 0. 5 μ 1，Taq 酶 3_5u，加水補(bǔ)足 20 μ 1。PCR 反應(yīng)條件94°C初始變 性 15min，94°C變性 30s，55°C復(fù)性 45s，72°C擴(kuò)增 90s，循環(huán) 40 次。TgCRND8小鼠基因型鑒定PCR 鑒定 APP 基因引物為DW229 5，-TGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAA-3，( SEQ ID N0:5) ；DW191 :5’ -GGCCGCGGAGAAATGAAGAAACGCCAAGCGCCGTGACT-3’ (SEQ ID N0: 6)。PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 緩沖液 2 μ 1，2mM dNTP 2 μ 1，DNAl00ng, 10 μ M DW2290. 5 μ 1， 10yMDW191 0. 5μ 1，50% 甘油 4μ 1，Taq 3_5units，加水補(bǔ)足 20 μ 1。PCR 反應(yīng)條件94°C 初始變性3min ；94°C變性30sec ；60°C復(fù)性30sec ；72°C擴(kuò)增90sec ；循環(huán)35次。Morris 水迷宮本實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)報(bào)道(Westerman，Μ·A.，et al. J Neurosci (2002) 22, 1858-67)。小鼠首先接受兩天可見(jiàn)平臺(tái)的訓(xùn)練，水面略低于平臺(tái)(以小鼠可爬上平臺(tái)為 宜)，小鼠從象限分隔線靠近水箱壁處放入水中，任其自由探索1分鐘，如1分鐘內(nèi)沒(méi)有爬 上平臺(tái)，則把小鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上。然后讓它在平臺(tái)上停留30秒，取出，擦干鼠毛，放回籠中。 每只小鼠每天訓(xùn)練8次，每次訓(xùn)練放入位置為四個(gè)象限分隔線之一(隨機(jī))，平臺(tái)放在四個(gè) 象限之一的中心(隨機(jī))，每次訓(xùn)練間隔20-40分鐘。其間記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。從第三天 開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)6天的不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練，不可見(jiàn)平臺(tái)固定放在某一象限的中心，不作 改變。水面高過(guò)平臺(tái)1厘米。小鼠從象限分隔線靠近水箱壁處放入水中，任其自由探索1 分鐘，如1分鐘內(nèi)沒(méi)有爬上平臺(tái)，則把小鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上，然后讓它在平臺(tái)上停留30秒，取 出，擦干鼠毛，放回籠中。每只小鼠每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練放入位置為四個(gè)象限分隔線(隨 機(jī))，平臺(tái)固定，每次訓(xùn)練間隔20-40分鐘。其間記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。最后一天訓(xùn)練后M 小時(shí)進(jìn)行測(cè)試，此時(shí)不放置平臺(tái)。小鼠從象限分隔線靠近水箱壁處放入水中，任其自由探索 1分鐘，取出，擦干鼠毛，放回籠中。其間記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。實(shí)驗(yàn)用水箱直徑1.22米，深 0.5米，放置在房間固定位置，分隔為四個(gè)象限。水中加入奶粉，水溫保持23士 1°C。可見(jiàn)平 臺(tái)(插小旗)和不可見(jiàn)平臺(tái)直徑為10厘米。慢病毒的包裝純化和立體定位注射本實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)(Qin，X.F.，等Proc Natl Acad Sci USA (2003) 100，183-8)。 使用的 siRNA 序列如下針對(duì)小鼠 DORl 的 siRNA(5，-GGC CAA GCU GAU CAA UAU A-3，) (SEQ IDNO :7)，打亂序列的對(duì)照 siRNA (5，-GCA CGA UAU ACA AGG AUC U_3，) (SEQ ID NO 8)。重組慢病毒顆粒通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞獲得。將病毒核心質(zhì)粒TO12、包裝質(zhì)粒pRSVREV 和pMDLg/pRRE以及表達(dá)質(zhì)粒pHCMVG通過(guò)磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第2和 第3天收集細(xì)胞培養(yǎng)基，2500rpm離心IOmin后，用0. 45 μ m孔徑濾膜過(guò)濾，然后28，OOOrpm超速離心池后，棄去上清。向沉淀加入適量生理鹽水，4°C放置過(guò)夜溶解沉淀，分裝后保 存于-80°C備用。病毒載體中包含綠色熒光蛋白GFP的編碼序列，病毒的滴度通過(guò)感染 HEK293T細(xì)胞，依據(jù)GFP的表達(dá)測(cè)定，約為1 X IO9個(gè)感染單位/毫升。TgCRNDS小鼠雙側(cè)海馬立體定位注射慢病毒。小鼠用水合氯醛G00mg/kg)深 度麻醉后置于立體定位儀上進(jìn)行手術(shù)，按照以下坐標(biāo)設(shè)定注射位點(diǎn)前后-2. Omm;內(nèi)外 士 1. 5mm ；背腹-2. 0mm。雙側(cè)海馬分別注射DOR小干擾RNA慢病毒和對(duì)照小干擾RNA慢病 毒2 μ 1，注射速度為0. 5 μ 1/min。注射結(jié)束后針頭停留5分鐘，讓病毒在腦組織中充分?jǐn)U 散后，緩慢移出枕頭。手術(shù)60天后，心臟灌流生理鹽水處死小鼠，灌流4%多聚甲醛固定，快 速取出大腦組織浸泡于4%多聚甲醛繼續(xù)固定他，30%蔗糖溶液脫水處理，制作14μπι厚度 冠狀冰凍切片。用熒光顯微鏡觀察慢病毒表達(dá)的GFP熒光以檢測(cè)慢病毒表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量RT-PCR總RNA按照hvitrogene使用指南用TRIzol Reagent提取。逆轉(zhuǎn)錄采用 oligo(dT)和 superscriptll 系統(tǒng)。實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)在 Mratagene Mx3000p 中完成。所 用引物小鼠 DOR 有義鏈5，-GCT GGT GGA CAT CAA TCG G_3，(SEQ ID NO 9)；反義鏈 5，-GCG TAG AGAACC GGG TTG AG-3，(SEQ ID NO :10)；小鼠 MOR 有義鏈5，-TGG CTC CTG GCT CAACTT G-3，(SEQ ID NO :11)；反義鏈5' -CAG CGT GCT AGT GGC TAA GG-3，(SEQ ID NO 12)；小鼠HPRT有義鏈5'-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G_3，(SEQ ID NO :13)， 反義鏈5，-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3，(SEQ ID NO :14)。免疫熒光和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)HEK293T細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用0. 2%I~riton X-100通透，然后加入FITC偶 聯(lián)的抗HA抗體和Cy3偶聯(lián)的抗FLAG抗體孵育。細(xì)胞樣品用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2A0BS)觀察并獲得圖像。小鼠大腦冠狀切片分別使用6E10抗體，GFAP抗體或者CDllb抗體檢測(cè)淀粉樣蛋 白斑，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。對(duì)于硫黃素S(Thioflavin S)染色，小鼠大腦冠狀切片 用1 %硫黃素S溶液孵育8分鐘，然后用100 %的乙醇洗一遍，再用80 %的乙醇溶液洗兩遍， 最后用水漂洗10分鐘后封片。圖像中的染色反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)面積用Image-Pro Plus 5. 1軟件分析和統(tǒng)計(jì)。每只 小鼠取3-5張切片統(tǒng)計(jì)，其平均值作為該只小鼠測(cè)量值。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染相應(yīng)的受體質(zhì)粒，UAS報(bào)告基因質(zhì)粒MH100，CMV_i3 -半乳糖苷 酶質(zhì)粒，APP/CTF β -GVP或者Notch Δ E-GVP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)做相應(yīng)激動(dòng)極，拮抗劑或 者抑制劑的處理，處理12小時(shí)后收細(xì)胞測(cè)定熒光素酶活性，同時(shí)測(cè)定β -半乳糖苷酶活性 作為內(nèi)參。膜蛋白生物素標(biāo)記經(jīng)過(guò)相應(yīng)轉(zhuǎn)染和處理的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞用預(yù)冷的PBS (0. IM磷酸鈉，0. 15Μ氯化 鈉，ρΗ8. 0)清洗后，在含有 2mM EZ-Iink Sulfo-NHS-LC-Biotin 的 PBS 中 4°C 孵育 2 小 時(shí)。之后用含有IOOmM甘氨酸的PBS清洗三遍并終止生物素標(biāo)記反應(yīng)。用RIPA緩沖液 (50mM HEPESpH 7. 5,150mM NaCl，10%甘油，1 % Triton) 4°C裂解細(xì)胞 1 小時(shí)，收獲的蛋白與 streptavidin-Sepharose孵育，結(jié)合到kpharose上的被生物素標(biāo)記的蛋白用免疫印跡方14法檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A β水平穩(wěn)定表達(dá)APP “Swedish”突變體的HEK293細(xì)胞在轉(zhuǎn)染4 后，藥物處理細(xì)胞Ih 并收集培養(yǎng)基。用人源Aβ 40和Αβ 42酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒按照廠商提供方法進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)基的A β水平。通過(guò)心臟灌流生理鹽水處死APP/PS小鼠或者TgCRNDS小鼠，開(kāi)顱并分離大腦組 織，立即用液氮速凍，保存于-80°C。實(shí)驗(yàn)前向大腦組織加入2% SDS溶液，置于室溫解凍， 然后超聲波破碎組織。待組織完全破碎后以100，OOOg于4°C離心lh。上清為SDS可溶性 蛋白質(zhì)組分。沉淀中加入70%甲酸溶液，重懸后再次離心，上清為甲酸可溶性蛋白質(zhì)組分， 加入20倍體積的中和緩沖液(含IM Tris和0. 5M Na2HPO4)。SDS和甲酸組分分別稀釋后 用人源Aβ 40和Αβ 42酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒按照廠商提供方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分泌酶熒光底物活性方法細(xì)胞或組織用裂解緩沖液(含有5mM Tris-HCl (pH 7. 4)，5mM EDTA和5mM EGTA) 裂解，胰島素針?lè)磸?fù)抽吸破碎細(xì)胞。用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取一定量組分經(jīng) 12，00(^于41離心301^11，棄去上清。沉淀用反應(yīng)緩沖液重懸后，于37°C水浴中反應(yīng)(對(duì) 于α-分泌酶，IOmM Tris-HCl, pH 7. 5，反應(yīng)1小時(shí)；對(duì)于BACE，50mM醋酸鈉，pH 4.5，反 應(yīng) 30 分鐘；對(duì)于 γ -分泌酶，50mM Tris-HCI, pH 6. 8,2mM EDTA，0. 25% CHAPSO，反應(yīng) 2 小 時(shí))。反應(yīng)產(chǎn)物用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光值，設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)λ 和發(fā)射光波長(zhǎng)λΜ。對(duì) 于 α -分泌酶，λ ex = 325nm，λ em = 393nm ；對(duì)于 BACE，λ ex = 430nm，λ em = 520nm ；對(duì)于 Y -分泌酶，λ ex = 355nm, λ em = 440nm。免疫沉淀和免疫印跡棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗兩遍細(xì)胞后，向細(xì)胞中加入裂解緩沖液(含 有 50mMTris-HCl(pH 7. 5)、150mM NaCl、5mM EDTA、10 % 甘油、0. 5mg/ml 牛血清蛋白、1 % TritonX-100和蛋白酶抑制劑)。收集細(xì)胞后于4°C裂解lh。細(xì)胞裂解完畢后，以12，OOOg 于4°C離心15min。取上清，加入偶聯(lián)抗Flag抗體的凝膠珠，于4°C孵育6_8小時(shí)。然后以 2，OOOg于4°C離心收集凝膠珠，用裂解緩沖液洗3次后加入30 μ 1 SDS-聚丙烯酰胺電泳上 樣緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。用免疫印跡雜交方法檢測(cè)免疫沉淀產(chǎn)物。對(duì)于連續(xù)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，用裂解緩沖液洗3次后的凝膠珠用Flag肽段(終濃度 150ng/yl)孵育lh，把結(jié)合在凝膠珠上的蛋白洗脫下來(lái)，預(yù)留部分用于Western雜交外，其 余部分加入偶聯(lián)抗HA抗體的凝膠珠，于4°C孵育6-8小時(shí)。然后以2，OOOg于4°C離心收集 凝膠珠，用裂解緩沖液洗3次后加入30μ 1 SDS-聚丙烯酰胺電泳上樣緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。 用免疫印跡雜交方法檢測(cè)免疫沉淀產(chǎn)物。對(duì)于免疫印跡，蛋白條帶通過(guò)IRDyeSOOCW偶聯(lián)二抗激發(fā)遠(yuǎn)紅外熒光，由Odyssey 遠(yuǎn)紅外圖像系統(tǒng)取得，隨后在kion Image軟件上進(jìn)行定量分析。NEP和IDE活性檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)(Li,C.&Hersh，L. B. ^prilysin :assay methods, purification, andcharacterization Methods Enzymol (1995) 248, 253-63)。小鼠大腦用 Iml緩沖液勻漿5秒(50mM磷酸鉀緩沖液pH 7. 3，200 μ M PMSF, 5 μ g/ml抑肽酶)，勻漿液在 4°C用IOOOg離心20分鐘，取上清再用100，000離心10分鐘。離心后得到的上清用于IDE活性檢測(cè)，沉淀部分用200 μ 1含有200 μ M PMSF和5 μ g/ml抑肽酶的20mM MES (ρΗ6· 5)溶液重懸后用于NEP活性的檢測(cè)。IDE 活性用熒光底物 OmM Abz-GGFLRKHGQ-EDDnp)在 20mM 磷酸鉀緩沖液(pH7. 3) 中反/S。ΝΞΡ igt生吏用 glutaryl-Ala-Ala-Phe-4-methoxy-2-naphthylamide (Sigma)。Notch 剪切HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染DOR和Myc-tagged Notch Δ E后兩天用相應(yīng)的激動(dòng)劑，拮抗劑或 者抑制經(jīng)處理7小時(shí)后，用SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞中用于免疫印跡。N-鈣粘蛋白和E-鈣粘蛋白剪切經(jīng)過(guò)相應(yīng)轉(zhuǎn)染和處理后的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞用lml/100mm平皿的低滲緩沖液 (IOmMMOPS pH 7. 0和IOmM KCl)處理，并在冰上進(jìn)行勻漿，之后在4°C用IOOOg離心15分 鐘，取上清再用16，OOOg離心40分鐘。離心得到的沉淀部分用反應(yīng)緩沖液(150mM檸檬酸 鈉pH6. 4，和全蛋白酶抑制劑混合物(complete protease inhibitor cocktail))重懸，并 在37°C反應(yīng)2小時(shí)，對(duì)照管中加入L-685，458。剪切反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系用免疫印跡方法 檢測(cè)?；罴?xì)胞共聚焦顯微鏡HEK293T細(xì)胞在35mm玻璃底的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)染RFP-BACE，GFP-PSl和 HA-tagged DOR。轉(zhuǎn)染后42小時(shí)，用DADLE刺激細(xì)胞，同時(shí)每隔3秒用搭載60 X 1. 4N. Α.物 鏡，配備 UltraView 軟件(PerkinElmer)的 Ultraview laser spinning disc 共聚焦顯微 鏡(PerkinElmer)掃描記錄RFP和GFP熒光。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)于Morris水迷宮的數(shù)據(jù)，用Two-way repeatedmcasures analysis of variance (two-way RMAN0VA)分析，并用 Tukey post hoc tests進(jìn)行事后檢驗(yàn)，給藥組別和訓(xùn)練天數(shù)作為兩個(gè)參數(shù)。其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或者 ANOVA分析數(shù)據(jù)。結(jié)果降低DOR的表達(dá)水平緩解阿爾茨海默癥模型小鼠的淀粉樣蛋白斑病理首先研究了 DOR是否參與到阿爾茨海默癥的發(fā)病中。本發(fā)明者用TgCRNDS轉(zhuǎn)基因 小鼠作為模型，這種小鼠是帶有“Swedish”和“ hdiana”雙突變的APP的轉(zhuǎn)基因小鼠，表現(xiàn) 認(rèn)知功能障礙和大腦內(nèi)的淀粉樣蛋白斑病變(Chishti，Μ. Α.，等.J Biol Chem (2001) 276, 21562-70)。本發(fā)明者先設(shè)計(jì)合成了能夠有效降低小鼠DOR表達(dá)水平的小干擾RNA，然后依 據(jù)其序列包裝純化了表達(dá)針對(duì)DOR的小干擾RNA的慢病毒和打亂序列的對(duì)照siRNA的慢病 毒。本發(fā)明者在3個(gè)月大的TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦的海馬區(qū)立體定位注射慢病毒，在左 側(cè)海馬中注射表達(dá)針對(duì)DOR的小干擾RNA的慢病毒，而對(duì)照siRNA的慢病毒則注射到同一 只小鼠的右側(cè)海馬中。定量實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照病毒，針對(duì)DOR的小干擾 RNA的慢病毒有效地降低了海馬中DOR的水平(圖1)。慢病毒表達(dá)的GFP顯示了其在海馬內(nèi)的表達(dá)區(qū)域和表達(dá)水平，表達(dá)針對(duì)DOR的小 干擾RNA的慢病毒和對(duì)照慢病毒表達(dá)水平相當(dāng)，主要感染了海馬的齒狀回區(qū)神經(jīng)元，分布 于胞體和樹(shù)突上，在軸突上也有一定分布(圖2A)。用抗Αβ抗體6Ε10進(jìn)行免疫組織化學(xué) 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淀粉樣蛋白斑，發(fā)現(xiàn)在注射了表達(dá)DOR小干擾RNA的慢病毒的一側(cè)海馬組織切片中，淀粉樣蛋白斑明顯減少(圖2A)。在沒(méi)有注射慢病毒的其他腦區(qū)(如皮層)中，雙側(cè)組 織切片中的淀粉樣蛋白斑沒(méi)有明顯差異(圖2A)。圖像的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果證實(shí)了以上發(fā)現(xiàn)，抑 制海馬的DOR表達(dá)確實(shí)減少了淀粉樣蛋白斑的形成，而未感染慢病毒的雙側(cè)皮層組織切片 中的淀粉樣蛋白斑數(shù)量則沒(méi)有明顯的差異(圖2B)。同時(shí)，本發(fā)明者通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定TgCRNDS小鼠大腦組織中的Αβ 40和 A β 42水平。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在SDS可溶組分和甲酸FA組分中，感染了表達(dá)DOR小干擾RNA 的慢病毒的海馬組織中的Αβ 40和Αβ 42水平都明顯下降。以上結(jié)果證明，降低TgCRNDS 小鼠海馬中的DOR水平可以顯著地延緩淀粉樣蛋白斑的形成和Αβ的產(chǎn)生，證明DOR參與 到阿爾茨海默癥的發(fā)病中。DOR拮抗劑處理緩解阿爾茨海默癥模型小鼠的認(rèn)知障礙和病理改變?yōu)榱颂剿鱀OR作為阿爾茨海默癥治療靶點(diǎn)的可能性，以及進(jìn)一步研究DOR是 否在阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知障礙中起作用，本發(fā)明者進(jìn)行了 DOR拮抗劑的實(shí) 驗(yàn)。這里本發(fā)明者利用另一種轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PS進(jìn)行研究。APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠同時(shí)表 達(dá)APP的Κ670Ν，M671L突變體和PSl的ΔΕ9突變體，在6個(gè)月大時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)出明顯的 學(xué)習(xí)記憶障礙，并且在皮層海馬等腦區(qū)可以檢測(cè)到淀粉樣蛋白的積累(Garcia-Alloza， Μ. ， φ NeurobiolDis(2006) 24,516-24 ；Reiserer, R. S. ， Harrison, F. Ε. ， Syverud, D. C. McDonald, Μ. P.，GenesBrain Behav Q007) 6，54-65)。本發(fā)明者把 4 個(gè)月大的 APP/PS 轉(zhuǎn)基因小鼠分配到年齡和性別相當(dāng)?shù)膬山M，其中一組接受每天一次的NaItriondole(NTI) (5mg/kg,n = 9)灌胃給藥，另一組則接受溶劑水的灌胃，作為安慰劑組(n = 17)。同時(shí)，轉(zhuǎn) 基因陰性的同窩野生型小鼠也接受NTI或者安慰劑給藥(n = 8)。NTI是一種非肽段類的 DOR的選擇性拮抗劑(Ki = 0. 29nM, Ke = 0. 49ηΜ)，具有很好的血腦屏障通透性和生物利 用性，因而適合進(jìn)行全身給藥。選擇5mg/kg的劑量是依據(jù)以前很多研究工作，證明使用與 之相當(dāng)?shù)膭┝靠梢杂行У匾种艱OR所介導(dǎo)的動(dòng)物行為。另外，NTI皮下注射20mg/kg或者 鞘內(nèi)注射30 μ g的劑量依然能夠特異性地阻斷DOR的激動(dòng)劑引起的鎮(zhèn)痛，而不影響MOR或 者KOR的激動(dòng)劑引起的鎮(zhèn)痛所以，可以預(yù)計(jì)NTI 口服5mg/kg的劑量體現(xiàn)的是特異性地阻斷 DOR信號(hào)所產(chǎn)生的作用。以前的研究表明對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期的NTI給藥不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副 作用(Fernandez，B.，等人 PharmacolBiochem Behav (1999) 62，145-9)。本發(fā)明者在給藥過(guò) 程中監(jiān)測(cè)了小鼠的體重和健康狀況，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)給藥造成的不良影響。在給藥結(jié)束以后，本發(fā) 明者使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)藥物處理對(duì)于改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。因 為據(jù)報(bào)道，海馬和皮層最早出現(xiàn)老年斑，是受到阿爾茨海默癥影響最明顯的腦區(qū)，而水迷宮 實(shí)驗(yàn)中的空間學(xué)習(xí)記憶能力依賴于海馬的功能，成為評(píng)價(jià)阿爾茨海默癥模型小鼠學(xué)習(xí)記憶 能力的最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)小鼠的游泳速度，NTI給藥沒(méi)有明顯地影響小鼠 的運(yùn)動(dòng)能力(圖3A)。同時(shí)，在可見(jiàn)平臺(tái)的訓(xùn)練階段，各組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間沒(méi)有明顯的 差異，也進(jìn)一步證明給藥沒(méi)有影響小鼠的視力，動(dòng)機(jī)和運(yùn)動(dòng)能力(圖3B)。然而，在不可見(jiàn)平臺(tái)的訓(xùn)練階段，小鼠需要通過(guò)記憶水桶周邊的標(biāo)記物來(lái)找到平 臺(tái)時(shí)，APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間明顯比對(duì)照的野生型小鼠長(zhǎng)(F(l，115) = 8. 780， P = O. 007)，證明了 APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)能力的障礙。而NTI給藥組的APP/PS轉(zhuǎn) 基因小鼠能夠比安慰劑組的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠更快地找到平臺(tái)的位置(APP/PS vs. APP/ PS+NTIF(1,120) = 13. 103,P < 0. 001)，說(shuō)明NTI給藥有效地改善了 APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)能力(圖4A)。另外，在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后M小時(shí)，本發(fā)明者去除平臺(tái)讓小鼠 自由探索1分鐘的測(cè)試過(guò)程中，相對(duì)于安慰劑組的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠，NTI給藥組的APP/ PS轉(zhuǎn)基因小鼠在先前平臺(tái)所在的象限呆更長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)經(jīng)過(guò)原先平臺(tái)位置的次數(shù)也更多 (圖4B-D)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，NTI給藥顯著地緩解了 APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的 學(xué)習(xí)記憶障礙。野生型小鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NTI給藥并不影響野生型小鼠的空間 學(xué)習(xí)能力(圖幻，說(shuō)明NTI給藥并不是廣泛地提高小鼠的學(xué)習(xí)能力，而更可能是通過(guò)影響淀 粉樣蛋白病理，特異性地改善AD小鼠的認(rèn)知能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，本發(fā)明者對(duì)給藥后的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了病理 學(xué)的檢測(cè)。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，NTI給藥組的APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層區(qū)域的硫磺素S陽(yáng)性 的淀粉樣蛋白斑的水平明顯比安慰劑組小鼠的低(圖6)。同樣的，用針對(duì)Αβ的6Ε10抗體 進(jìn)行免疫熒光染色的結(jié)果也證明，NTI給藥降低了 APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層區(qū)域的淀粉 樣蛋白的沉積(圖6)。同時(shí)，本發(fā)明者通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬 和皮層中的Αβ 40和Αβ 42水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SDS可溶組分和甲酸FA組分中，NTI給藥 組小鼠的Αβ 40和Αβ 42水平都明顯低于安慰劑組的小鼠(圖7)。這些結(jié)果表明，NTI給 藥有效地降低了 APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)淀粉樣蛋白的水平。以前的研究工作證明，在阿爾茨海默癥病人的大腦中，以及阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因 模型小鼠的大腦中，淀粉樣蛋白斑的周圍常伴隨有免疫細(xì)胞的激活和聚積，比如星形膠質(zhì) 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞被認(rèn)為參與β-淀粉樣蛋白的清除，并在過(guò)度激活的情況下 產(chǎn)生毒性。在APP/PS轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦內(nèi)，本發(fā)明者也通過(guò)免疫熒光染色的方法觀察到了 GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和CDllb陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞在淀粉樣蛋白斑周圍的聚積。有趣的 是，NTI給藥組小鼠的GFAP和⑶lib水平都明顯地低于安慰劑組的小鼠(圖8)。阿爾茨海默癥模型小鼠的種類很多，包括在不同的啟動(dòng)子下單獨(dú)過(guò)表達(dá)APP，PSl 或者tau的一種突變體，或者同時(shí)過(guò)表達(dá)其中的兩種或者三種。為了驗(yàn)證NTI給藥在不同模 型小鼠中的作用的普遍性，尤其為了證明NTI作用不依賴于PSl Δ E9，本發(fā)明者在單獨(dú)過(guò)表 達(dá)APP突變體的TgCRNDS小鼠中進(jìn)行了 NTI給藥實(shí)驗(yàn)。為了更好地實(shí)現(xiàn)持續(xù)給藥的目的， 本發(fā)明者使用了滲透壓緩釋泵。2個(gè)月大的TgCRNDS轉(zhuǎn)基因小鼠被隨機(jī)分配到年齡和性別 相匹配的兩組，通過(guò)手術(shù)在兩側(cè)肩胛骨之間進(jìn)行皮下埋泵，對(duì)照組的緩釋泵中注滿溶劑水， NTI組的緩釋泵中注滿200 μ 1的5mg/ml的NTI溶液，持續(xù)緩慢釋放28天后處死小鼠檢測(cè) 大腦中A β的水平。根據(jù)緩釋的速度，約相當(dāng)于每天1.5mg/kg的劑量。ELISA測(cè)定A β的 水平，結(jié)果表明，通過(guò)緩釋泵接受NTI給藥的TgCRNDS小鼠大腦海馬的SDS組分和FA組分 中的A β 40禾Π A β 42的水平都有顯著的下降(圖9)，證明了 NTI作用的普遍性，也證明NTI 的作用并不依賴于PSlA Ε9。DOR特異性地影響B(tài)ACE和γ -分泌酶剪切產(chǎn)生A β大腦內(nèi)的Αβ的水平處于Αβ產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡中，所以NTI給藥組小鼠腦 內(nèi)Αβ的水平的下降可能是因?yàn)棣ˇ庐a(chǎn)生的減少，也可能是因?yàn)棣ˇ虑宄脑黾?。本發(fā)明 者首先檢測(cè)了 Αβ清除的水平。參與Αβ清除的酶主要有腦啡肽酶(ΝΕΡ)，胰島素降解 酶(IDE)，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)變酶(ECE)，和血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)等(Miners，J. S.，等.Brain Pathol (2008) 18,240-52)。本發(fā)明者用熒光底物體外反應(yīng)的方法檢測(cè)了各組小鼠腦內(nèi)NEP和IDE的活性水平，發(fā)現(xiàn)NTI給藥對(duì)NEP和IDE的活性沒(méi)有明顯的影響(圖10)。接著，本發(fā)明者檢測(cè)APP的剪切過(guò)程。APP-CTF的抗體可以檢測(cè)到APP的全長(zhǎng)以 及經(jīng)過(guò)α-分泌酶和BACE剪切產(chǎn)生的C端產(chǎn)物，CTF α (C83)和CTF β (C99)，它們同時(shí)也是 Y-分泌酶的剪切底物。各組給藥小鼠腦組織的勻漿液通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)APP的水平在各組小 鼠之間沒(méi)有明顯的不同，而CTFa和CTFii的水平在NTI給藥組小鼠中有明顯的升高，說(shuō)明 APP的表達(dá)水平?jīng)]有受到給藥的影響，但是APP的剪切過(guò)程，也就是分泌酶的活性可能受到 了 NTI給藥的影響(圖11)。所以本發(fā)明者用熒光底物體外反應(yīng)的方法直接檢測(cè)了各組小 鼠腦內(nèi)的分泌酶活性水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-分泌酶的活性在組間沒(méi)有明顯的不同，但是BACE 和Y-分泌酶在NTI給藥組中的活性明顯低于安慰劑組的小鼠。這一結(jié)果提示，NTI給藥 通過(guò)降低BACE和Y-分泌酶的活性，降低了小鼠腦內(nèi)Αβ的水平，并改善了小鼠的認(rèn)知障 礙。值得注意的是，APP并不是BACE和Y -分泌酶唯一的底物，BACE還作用于 APLP1/2，PSGL-I和LRP等，而其他很多I型跨膜蛋白經(jīng)過(guò)Y -分泌酶的剪切，產(chǎn)生可以進(jìn) 入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的片斷，發(fā)揮重要的生理功能，其中最重要的是Note和鈣粘蛋 白。正是由于BACE和Y-分泌酶底物的多樣性和缺乏選擇性，很多分泌酶的抑制劑在抑制 Αβ產(chǎn)生的同時(shí)也影響了其他底物的剪切，產(chǎn)生了嚴(yán)重的副作用，從而阻礙了它們?cè)谥委煱?爾茨海默癥中的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明者檢測(cè)了 NTI給藥對(duì)于BACE和Y-分泌酶其它 底物的剪切過(guò)程的影響。本發(fā)明者免疫沉淀了 Notch經(jīng)過(guò)剪切之后的終產(chǎn)物Notch胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域(Ni⑶)，通過(guò)免疫印跡的方法比較發(fā)現(xiàn)各組小鼠的NI⑶水平相當(dāng)(圖12)。類似地， 本發(fā)明者用免疫印跡的方法檢測(cè)了 N-鈣粘蛋白的剪切中間產(chǎn)物，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在各組小鼠 之間有明顯的差異(圖12)。APLPl和APLP2是兩個(gè)已知的APP類似蛋白，同樣經(jīng)過(guò)α -分 泌酶，BACE和Y-分泌酶的剪切。本發(fā)明者用針對(duì)APLP1-CTF的抗體檢測(cè)了中間產(chǎn)物的水 平，發(fā)現(xiàn)NTI給藥對(duì)APLPl的剪切過(guò)程也沒(méi)有明顯的影響(圖12)。這些結(jié)果表明，NTI給 藥特異性地抑制了 APP剪切產(chǎn)生A β的過(guò)程，而對(duì)于BACE和γ -分泌酶其他底物的剪切過(guò) 程沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響。本發(fā)明者利用體外系統(tǒng)研究DOR對(duì)于分泌酶活性的影響。ΗΕΚ293Τ細(xì)胞是信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)研究中常用的細(xì)胞系，具有內(nèi)源的BACE和Y-分泌酶的活性，能夠正常地分泌產(chǎn)生A β， 所以也被非常廣泛地應(yīng)用于阿爾茨海默癥研究領(lǐng)域。本發(fā)明者建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DOR的 ΗΕΚ293Τ穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，DOR的選擇性激動(dòng)劑[D_Ala2，D-Leu5]-enkephalin(DADLE)刺激 細(xì)胞30分鐘導(dǎo)致了 BACE和γ -分泌酶活性的顯著上升，而α -分泌酶的活性沒(méi)有受到明 顯的影響(圖13)。NTI預(yù)處理則可以阻斷DADLE處理所導(dǎo)致的BACE和γ -分泌酶活性的 上升(圖13)。進(jìn)而本發(fā)明者在體外系統(tǒng)中驗(yàn)證了 DOR對(duì)于APP剪切調(diào)控的特異性。Notch的缺失 胞外端的突變體ΝΔE可以在缺乏胞外信號(hào)的情況下，由γ -分泌酶進(jìn)行組成性的S3切割， 產(chǎn)生胞內(nèi)片斷NI⑶。本發(fā)明者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y-分泌酶的抑制劑DAPT和L-685，458處 理導(dǎo)致產(chǎn)物NI⑶的減少，以及底物N Δ E的積累，而DADLE或者NTI的處理對(duì)NICD和N Δ E 的比例都沒(méi)有明顯的影響(圖14)。類似的，N-鈣粘蛋白和E-鈣粘蛋白的剪切也沒(méi)有受到DADLE或者NTI的處理的影響。本發(fā)明者進(jìn)一步利用熒光素酶報(bào)告基因定量檢測(cè)了 DOR對(duì)于APP以及Notch 剪切的影響。本發(fā)明者在DOR的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)Gal4-driven Iuciferase reporter gene, Gal4/VP16_tagged APP/CTF β (APP/CTF β -GVP)或者 Gal4/VP16_tagged Notch Δ E (N Δ E-GVP)以及作為內(nèi)參的CMV- β -半乳糖苷酶。APP/CTF β -GVP或者N Δ E-GVP 經(jīng)過(guò)Y -分泌酶的剪切產(chǎn)生能夠激活熒光素酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活熒光素酶基 因的轉(zhuǎn)錄翻譯，因而本發(fā)明者可以通過(guò)測(cè)定熒光素酶的活性來(lái)衡量Y -分泌酶對(duì)于APP或 者Notch的剪切水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOR的激活導(dǎo)致表達(dá)APP/CTF β -GVP的細(xì)胞的熒光素酶 活性的顯著增加，而對(duì)于表達(dá)ΝΔΕ-GVP的細(xì)胞的熒光素酶的活性則沒(méi)有明顯的影響(圖 15)。這一結(jié)果表明，DOR的激活選擇性地影響了 Y-分泌酶對(duì)于APP的剪切活性，而不影 響Y -分泌酶對(duì)于Notch的剪切。DOR與BACE和γ -分泌酶形成復(fù)合物，并增加BACE和γ -分泌酶向內(nèi)吞小體的轉(zhuǎn) 運(yùn)為了研究DOR導(dǎo)致的BACE和γ -分泌酶的活性的上升是否出于同樣的機(jī)制，本發(fā) 明者首先用免疫沉淀的方法驗(yàn)證DOR是否與BACE和Y-分泌酶發(fā)生相互作用。在ΗΕΚ293Τ 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-BACE和FLAG-D0R，當(dāng)FLAG-DOR被沉淀下來(lái)時(shí)，HA-BACE以及內(nèi)源的PSl 也被沉淀下來(lái)，說(shuō)明DOR能夠與BACE和γ -分泌酶發(fā)生相互作用。為了檢驗(yàn)DOR與BACE和Y -分泌酶是否在同一個(gè)復(fù)合體中，本發(fā)明者使用連續(xù)免 疫沉淀的方法，首先把FLAG-DOR沉淀下來(lái)，然后用FLAG肽段把沉淀下來(lái)的蛋白從凝膠珠上 洗脫下來(lái)，用HA抗體偶聯(lián)的凝膠珠進(jìn)行第二輪的免疫沉淀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第一輪和第二輪 的沉淀物中都同時(shí)有HA-BACE,FLAG-DOR和Y -分泌酶的存在，說(shuō)明三者是在同一個(gè)復(fù)合物 中的。那么是否當(dāng)DOR被激動(dòng)劑激活發(fā)生內(nèi)吞時(shí)，HA-BACE，F(xiàn)LAG-DOR和γ -分泌酶組成 的復(fù)合物發(fā)生了共內(nèi)吞呢？為了研究這一點(diǎn)，本發(fā)明者用生物素標(biāo)記細(xì)胞膜表面蛋白追蹤 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面的HA-BACE，F(xiàn)LAG-DOR和PSl都能夠被生物素有效地 標(biāo)記，在DADLE刺激細(xì)胞30分鐘后，被生物素標(biāo)記的細(xì)胞表面的HA-BACE，F(xiàn)LAG-DOR和PSl 都有顯著下降，而NTI的預(yù)處理可以阻止細(xì)胞表面HA-BACE，F(xiàn)LAG-DOR和PSl水平的下降 (圖16)。這一結(jié)果提示，HA-BACE, FLAG-DOR和PSl可能在DOR激活的情況下發(fā)生了共內(nèi) 吞。為了更為直接地證明HA-BACE，F(xiàn)LAG-D0R和PSl的共內(nèi)吞，本發(fā)明者用共聚焦顯微鏡實(shí) 時(shí)追蹤了熒光標(biāo)記的BACE和PSl蛋白在DOR激活的情況下發(fā)生的轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在 HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染RFP-BACE，GFP-PSl和DOR時(shí)，可以觀察到RFP-BACE，GFP-PSl的紅 色熒光和綠色熒光的共定位，而在只轉(zhuǎn)染RFP-BACE和GFP-PSl，不轉(zhuǎn)染DOR的細(xì)胞中，則觀 察不到RFP-BACE和GFP-PSl的共定位(圖17)。同時(shí)，當(dāng)用DADLE刺激共轉(zhuǎn)染RFP-BACE， GFP-PSl和DOR的細(xì)胞時(shí)，3秒每幀的動(dòng)態(tài)圖片中可以觀察到從細(xì)胞膜表面向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)的黃 色顆粒，提示了 RFP-BACE和GFP-PSl在DOR激活情況下的共內(nèi)吞(圖17C)。接下來(lái)，本發(fā)明者用GFP_Rab7標(biāo)記內(nèi)吞小體，來(lái)研究BACE和PSl是否被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入 內(nèi)吞小體。本發(fā)明者在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了 HA-BACE，F(xiàn)LAG-D0R和GFP_Rab7，用DADLE 刺激30分鐘后，用多聚甲醛固定細(xì)胞，用抗HA和PSl的抗體分別染BACE和PS1，并且分 別標(biāo)記為紅色和藍(lán)色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DADLE刺激30分鐘后的細(xì)胞中，紅，綠，藍(lán)三色的熒光兩兩之間，以及三者之間有明顯的共定位，而沒(méi)有刺激的細(xì)胞則沒(méi)有明顯的共定位，說(shuō)明 HA-BACE, FLAG-DOR在DOR激活之后轉(zhuǎn)運(yùn)到了內(nèi)吞小體中(圖18)。DOR的內(nèi)吞后轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)BACE和γ -分泌酶的轉(zhuǎn)運(yùn)并特異性地增加A β的產(chǎn)生以上的結(jié)果證明在DOR激活的情況下，BACE和γ -分泌酶與DOR —起轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)吞 小體中，導(dǎo)致了 BACE和Y-分泌酶活性的增加。那么，DOR的什么特性是這一現(xiàn)象所必需 的，其他哪些受體對(duì)于BACE和Y-分泌酶活性有同樣的影響呢？接下來(lái)本發(fā)明者研究這方 面的機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道，DOR在激動(dòng)劑刺激的情況下發(fā)生內(nèi)吞，并且通過(guò)內(nèi)吞小體和溶酶體 進(jìn)入蛋白降解途徑，DOR的C末端尾巴與分選蛋白GASP (G-prote in-coupled receptor associatedsorting protein)的相互結(jié)合是這一過(guò)程所必需的。相應(yīng)的，MOR的C末端 尾巴和GASP之間沒(méi)有相互作用，所以MOR被激活發(fā)生內(nèi)吞后不進(jìn)入蛋白降解途徑，而是很 快地返回細(xì)胞膜表面。當(dāng)把DOR和MOR的C末端尾巴互換之后，受體的內(nèi)吞后轉(zhuǎn)運(yùn)方式也 發(fā)生互換。所以這里本發(fā)明者使用了 M0R，以及DOR和MOR互換C末端尾巴的兩個(gè)突變體 DORMT (帶MOR的C末端尾巴的D0R)和MORDT (帶DOR的C末端尾巴的M0R)。首先本發(fā)明者用免疫共沉淀方法檢測(cè)了突變體和BACE，PSl的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn) DOR, M0R, DORMT, MORDT 與 BACE，PSl 的結(jié)合能力相當(dāng)。接下來(lái)，本發(fā)明者用生物素標(biāo)記的方法檢測(cè)了受體突變體被激活的情況下，BACE 和Y-分泌酶的定位情況。與DOR激活后BACE和Y-分泌酶在細(xì)胞膜上定位減少的現(xiàn)象 不同，用特異性激動(dòng)劑 DAMGO ([D-Ala2，NMePhe4, Gly (ol) 5] enkephalin)激活 MOR 后，BACE 和Y -分泌酶在細(xì)胞膜上的水平?jīng)]有明顯的改變，說(shuō)明MOR和DOR對(duì)于BACE和γ -分泌酶 的轉(zhuǎn)運(yùn)有不同的影響(圖30Α-Β)。DORMT激活后并不導(dǎo)致BACE和γ -分泌酶在細(xì)胞膜上 的減少(圖19C-D)，相反的，MORDT激活后BACE和γ -分泌酶在細(xì)胞膜上的水平明顯下降 (圖 19E-F)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，用DAMGO激活MOR后，BACE和Y-分泌酶沒(méi)有在內(nèi)吞 體中發(fā)生明顯的富集，DORMT激活后也并不導(dǎo)致BACE和Y _分泌酶在內(nèi)吞體中的富集，相 反的，MORDT激活后BACE和Y -分泌酶在內(nèi)吞體中發(fā)生明顯富集(圖20)。這些結(jié)果證明， DOR激活后轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)吞小體和溶酶體這一特性是其導(dǎo)致BACE和Y-分泌酶在內(nèi)吞體中的富 集所必需的。本發(fā)明者檢測(cè)分泌酶活性也發(fā)現(xiàn)，MORDT的激活與DOR的激活一樣，導(dǎo)致BACE和 Y -分泌酶活性的明顯增加，而MOR和DORMT的激活并不影響分泌酶的活性(圖21Α)。類 似的，MORDT的激活和DOR的激活導(dǎo)致A β水平的明顯升高，而MOR和DORMT的激活并不影 響Αβ水平(圖21Β)。接下來(lái)，本發(fā)明者用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，MORDT的激活和DOR的激活都明 顯地增加APP的剪切，但是對(duì)于Notch Δ E的剪切沒(méi)有明顯的影響，證明MORDT和DOR特異 性地影響分泌酶對(duì)于APP的剪切(圖22)。其他阿片受體的拮抗劑對(duì)阿爾茨海默癥模型小鼠的認(rèn)知障礙和病理改變的影響以上結(jié)果證明，MOR的激活對(duì)于BACE和Y -分泌酶活性沒(méi)有明顯的影響，本發(fā)明者 推測(cè)，在模型小鼠上進(jìn)行MOR拮抗劑的處理不會(huì)對(duì)小鼠的病癥有明顯的影響。為了證實(shí)本 發(fā)明者的推測(cè)，本發(fā)明者選用MOR的選擇性拮抗劑β-FNA。同時(shí)，為了研究KOR對(duì)于阿爾茨海默癥的影響，本發(fā)明者使用了 KOR的選擇性拮抗劑GNTI (5' -guanidinonaltrindole)。 另外，為了驗(yàn)證NTI所體現(xiàn)的作用并不局限于這個(gè)化合物本身的作用，而是通過(guò)DOR 受體起作用，本發(fā)明者還用了 DOR的另一個(gè)選擇性拮抗劑BNTX(7-苯亞甲基納曲酮 (7-Benzylidenenaltrexone))0本發(fā)明者對(duì)4個(gè)月大的APP/PS小鼠進(jìn)行每天一次，歷時(shí)兩個(gè)月的灌胃給藥， 動(dòng)物分組如下對(duì)照(水)，NTI (5mg/kg. day)，BNTX (lmg/kg. day)，GNTI (lmg/kg. day)， β -FNA(20mg/kg. day)，(η = 8-17/group)。給藥劑量的選擇是通過(guò)查閱參考文獻(xiàn)，選用了 能夠達(dá)到拮抗受體激活效果的濃度。給藥過(guò)程中本發(fā)明者仔細(xì)監(jiān)測(cè)了小鼠的體重和健康狀 況，沒(méi)有觀察到藥物處理的不良影響。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照小鼠，NTI， BNTX或者GNTI的處理可以使小鼠在訓(xùn)練過(guò)程中以更短的時(shí)間找到平臺(tái)，并且在除去平臺(tái) 的測(cè)試階段，在原先平臺(tái)所在的象限停留更長(zhǎng)的時(shí)間，證明它們的學(xué)習(xí)記憶障礙得到了有 效的改善，能夠更好地利用周邊的指示物記憶空間方位。而β-FNA處理則沒(méi)有起到相應(yīng)的 作用(圖23)。藥物處理的作用并不是通過(guò)改變小鼠的運(yùn)動(dòng)能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)楦魈幚斫M小 鼠的游泳速度沒(méi)有顯著的差異。同時(shí)，本發(fā)明者對(duì)同樣給藥的轉(zhuǎn)基因陰性小鼠進(jìn)行了水迷 宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)給藥對(duì)正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有明顯的影響，提示給藥對(duì)于轉(zhuǎn)基因 小鼠的特異性影響。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，本發(fā)明者用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淀粉樣蛋白的水平， 同時(shí)用免疫熒光檢測(cè)了 淀粉樣蛋白，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的水平。結(jié)果表明，和 水迷宮的結(jié)果一致，NTI, BNTX或者GNTI的處理可以顯著地降低皮層區(qū)域的β -淀粉樣蛋 白，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的水平，而β-FNA處理則沒(méi)有起到相應(yīng)的作用(圖Μ)。同時(shí)，在海馬和皮層區(qū)域，SDS可溶組分和FA組分中的Αβ 40和Αβ 42的水平都 在ΝΤΙ,ΒΝΤΧ或者GNTI的處理組中有明顯的下降(圖25)。β -FNA的處理在這些指標(biāo)上同 樣沒(méi)有顯示明顯的效果(圖25)。以上結(jié)果表明ΒΝΤΧ和NTI類似，能夠有效地改善阿爾茨海默癥模型小鼠的認(rèn)知 障礙和病理改變，說(shuō)明BNTX和NTI是通過(guò)受體DOR起作用的。另外，MOR的拮抗劑β -FNA 處理對(duì)于阿爾茨海默癥模型小鼠的認(rèn)知障礙和病理改變沒(méi)有明顯的影響，驗(yàn)證了本發(fā)明者 之前在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果。而KOR拮抗劑GNTI與NTI作用相當(dāng)，說(shuō)明KOR可能和 DOR有類似的作用和機(jī)制。DOR拮抗劑對(duì)于分泌酶活性調(diào)節(jié)的特異性綜合本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默癥的轉(zhuǎn)基因模型小鼠上進(jìn)行 DOR的拮抗劑給藥能夠明顯地減少淀粉樣蛋白的積累，并緩解與之相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙。 DOR拮抗劑緩解病癥的作用通過(guò)降低BACE和γ -分泌酶對(duì)于APP的剪切活性，從而減少A β 的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)。有趣的是，DOR拮抗劑減少APP剪切的同時(shí)卻不影響B(tài)ACE和Y -分泌酶對(duì)于 其它底物，比如Notch，鈣粘蛋白，APLP的剪切，體現(xiàn)了對(duì)于APP剪切的特異性影響。分子機(jī) 制的研究表明，DOR與BACE和Y-分泌酶形成復(fù)合物，在DOR激活的情況下，發(fā)生共內(nèi)吞， 通過(guò)早期內(nèi)吞小體，進(jìn)入晚期內(nèi)吞小體和溶酶體，在那里的酸性環(huán)境中產(chǎn)生較高的APP剪 切活性。而B(niǎo)ACE和Y-分泌酶的其它底物發(fā)生剪切的位置可能不在晚期內(nèi)吞小體和溶酶 體中，所以沒(méi)有受到明顯的影響。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。除非特別指出， 本申請(qǐng)中所有實(shí)施方案中的各個(gè)技術(shù)特征可以任意組合構(gòu)成新的技術(shù)方案，所有這些技術(shù) 方案均被認(rèn)為包括在本申請(qǐng)文件的字面記載范圍內(nèi)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些 在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均納入本文作參考。 序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 <120>用δ阿片受體拮抗劑緩解阿爾茨海默癥 <130)095103 <160>14<170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>1gactgaccac tcgaccaggt tctg24<210>2 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>2cttgtaagtt ggattctcat atccg25<210>3 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>3gtggataacc cctcccccag cctagacc28<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223> 引物<400>4aatagagaac ggcaggagca20<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>5tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa a31<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>6ggccgcggag aaatgaagaa acgccaagcg ccgtgact38<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223> 針對(duì)小鼠 DORl 的 siRNA<400>7ggccaagcug aucaauaua19<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>打亂序列的對(duì)照siRNA<400>8gcacgauaua caaggaucu19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220> <223>引物 <400>9gctggtggac atcaatcgg19<210>10 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>10gcgtagagaa ccgggttgag20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tggctcctgg ctcaacttg19<210>12 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>12cagcgtgcta gtggctaagg20<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13cctgctggat tacattaaag cactg25<210>14<211>21<212>DNACN 102049046 A
<213>人工序列<220><223> 引物<400>14ttcaacactt cgagaggtcc t2權(quán)利要求
1.物質(zhì)在制備用于治療阿爾茲海默癥的藥物中的用途，該物質(zhì)選自(1)抑制阿片受 體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)的物質(zhì)；( 抑制阿片受體與β-分泌酶和Y-分泌酶形成復(fù)合 物的物質(zhì)；C3)抑制阿片受體、β-分泌酶和Y-分泌酶所形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述阿片受體是δ阿片受體或κ阿片受體。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)是δ阿片受體選擇性拮抗劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述δ阿片受體選擇性拮抗劑選自ΒΝΤΧ、 NTI或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)是κ阿片受體選擇性拮抗劑。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述κ阿片受體選擇性拮抗劑是GNTI或其 藥學(xué)上可接受的鹽。
7.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述抑制阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá) 的物質(zhì)是針對(duì)所述阿片受體的小干擾RNA。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述小干擾RNA是5’-GGCCAA GCU GAUCAA UAU A-3，。
9.一種篩選用于治療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(a)將候選物質(zhì)與表達(dá)阿片受體的體系接觸；(b)觀察候選物質(zhì)對(duì)于該體系中阿片受體的表達(dá)水平的影響；其中，若所述候選物質(zhì)能降低該體系中阿片受體的表達(dá)水平，則表明該候選物質(zhì)是治 療阿爾茲海默癥的潛在物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述阿片受體是δ阿片受體或κ阿片受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用δ阿片受體拮抗劑緩解阿爾茨海默癥，具體地說(shuō)涉及物質(zhì)在制備用于治療阿爾茲海默癥的藥物中的用途，該物質(zhì)選自(1)抑制阿片受體的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)的物質(zhì)；(2)抑制阿片受體與β-分泌酶和γ-分泌酶形成復(fù)合物的物質(zhì)；(3)抑制阿片受體、β-分泌酶和γ-分泌酶所形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102049046SQ20091019793
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者滕林, 裴鋼, 趙簡(jiǎn) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院