專利名稱：：一種重組豬α-干擾素的凍干制劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及冷凍干燥制劑的制備領(lǐng)域。更具體地涉及一種重組豬α-干擾素的凍干制劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著新毒株、新菌株的不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)藥物和疫苗效力下降，我國動物疾病的防治面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。以往研究表明，豬α干擾素作為動物機體重要的細胞因子有廣譜的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能，可作為動物病毒性疫病治療的替代藥物。重組豬α干擾素(rPoIFN-α)在應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)的實踐中存在液體劑型熱穩(wěn)定性差、不易長期保存和遠距離運輸?shù)葐栴}。較理想的解決辦法是進行制品的干燥保存，這樣不僅可以利用簡易條件延長保存期，而且有利于長距離運輸。蛋白質(zhì)藥品干燥技術(shù)有冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧_冷凍干燥、超臨界干燥等幾種技術(shù)，其中應(yīng)用最廣泛的是冷凍干燥技術(shù)。干擾素對熱比較敏感，為很好地保持制品的生物學(xué)活性，干擾素的干燥劑型多是采用真空冷凍干燥方法。醫(yī)用干擾素凍干保護劑的研究頗多，人血清白蛋白作為醫(yī)用干擾素保護劑應(yīng)用最廣泛，但人血清白蛋白是血液制品，價格昂貴，也容易傳播疾病。2000年，董義藍等篩選出右旋糖苷作為血清白蛋白的替代品，并申請了專利(專利號00110069.6)，2002年姜崴(姜崴，張春利，王雪豐等.凍干干擾素保護劑的篩選.微生物學(xué)免疫學(xué)進展[J].2002，30(4)40-43)等研究采用右旋糖苷、山梨醇和苯甲酸鈉作為重組人干擾素的凍干保護劑，效果也比較好。國外的醫(yī)用干擾素的劑型研究比較早，由于每一種干燥技術(shù)都有各自的局限，研究者一直致力于改進工藝，優(yōu)化配方的研究。2001年，Sebeka等(SebekaHK,StarkuvieneB,Trepsiene0V.Comparativeeffectsofstabilizingadditivesontheratesofheatinactivationofrecombinanthumaninterferona_2binsolution[J].AntiviralRes2001，50:117_127.)研究了人干擾素在熱鈍化溫度為60°C時，氨基酸、多羥基醇、糖類、非離子表面活性劑等穩(wěn)定劑能延長干擾素抗病毒活性的半衰期。2005年，巴西學(xué)者Virgilio等(VirgilioTJ.,DuclercFP,BronislawP,etal.EffectoflyophilizationonthestructureandphasechangesofPEGylated-bovineserumalbumin[J]·IntJPharm.2005，304:124-134.)通過拉曼光譜法、差示掃描量熱法、卡爾費休滴定殘余水分等方法的檢測，觀察到聚乙二醇和牛血清白蛋白以10.25的比例結(jié)合比10.5的比例更能減少蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。2009年，Vineet等(VineetK,VikasKS,DevendraS.Insituprecipitationandvacuumdryingofinterferonalpha~2a-Developmentofasingle-stepprocessforobtainingdry,stableproteinformulation[J].IntJPharm，2009，366:88_98.)把人干擾素作為蛋白模型研究一步法干燥過程獲得穩(wěn)定的蛋白配方。但在國內(nèi)外對rPoIFN-α劑型的研究至今還未見文獻報道。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種重組豬α—干擾素的凍干制劑及其相應(yīng)的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種重組豬α-干擾素的凍干制劑。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述重組豬α-干擾素凍干制劑的制備方法。本發(fā)明的再一個目的是提供上述重組豬α-干擾素凍干制劑的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組豬α-干擾素的凍干制劑，以制劑的總重量計，所述的制劑中含有77-98w/w%的甘露醇。在另一優(yōu)選例中，以制劑的總重量計，其中重組豬α-干擾素和甘露醇的總量占97-99w/w%。在另一優(yōu)選例中，其中含有87-98w/w%的甘露醇。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的凍干制劑的制備方法，所述的方法包括步驟將重組豬α-干擾素和甘露醇的混合溶液進行冷凍干燥，得到如上所述的本發(fā)明提供的凍干制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟(a)將含有重組豬α-干擾素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到混合溶液；和(b)將混合溶液進行冷凍干燥，得到如上所述的本發(fā)明提供的凍干制劑；以含有甘露醇的溶液的總體積計，其中甘露醇的濃度為5_90mg/mL；以含有甘露醇、重組豬α-干擾素的混合溶液的總體積計，甘露醇和重組豬α-干擾素形成的總?cè)苜|(zhì)濃度為6.5-91.5mg/mL。在另一優(yōu)選例中，以混合溶液的總體積計，其中含有鹽濃度為0.008-0.012摩爾/升；所述的鹽選自磷酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述混合溶液的pH6-7。在另一優(yōu)選例中，總?cè)苜|(zhì)的濃度為21.5-51.5mg/mL；甘露醇的濃度為20_50mg/mL。在另一優(yōu)選例中，在整個冷凍干燥過程中冷凍干燥是在擱架溫度保持在零下40°C-零上28°C下進行的。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)品，包括(a)一個裝有如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑的容器；和(b)關(guān)于凍干制劑在稀釋劑中重建成重建制劑中溶質(zhì)的量為6.5-91.5mgmg/mL的說明；所述的溶質(zhì)包括重組豬α-干擾素和甘露醇.在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)品中還包含另一個裝有稀釋劑的容器。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的凍干制劑的用途，用作或用于制備抗病毒治療和/或提高免疫力的藥物。據(jù)此，本發(fā)明提供了提供一種重組豬α-干擾素的凍干制劑及其相應(yīng)的制備方法。具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)使用一定比例的甘露醇作為凍干保護劑可以有效獲得一種穩(wěn)定的重組豬α-干擾素凍干制劑。具體地，本發(fā)明提供的重組豬α-干擾素的凍干制劑，以制劑的總重量計，所述的制劑中含有77-98w/w%的甘露醇。較佳地，以制劑的總重量計，其中重組豬α-干擾素和甘露醇的總量占97_99w/w%。本發(fā)明的重組豬α-干擾素(rPoIFN-α)是本領(lǐng)域熟知的基因工程重組豬α-干擾素，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法制備得到。其中優(yōu)選通過畢赤酵母高效分泌表達菌株篩選、表達和發(fā)酵得到的(參見“黃海，謝蓓，于瑞嵩，等.豬IFNα基因在畢赤酵母中的高效分泌表達[J]·遺傳，2005，27(2):215-220.”和“藍勝芝，于瑞嵩，俞明月，等.豬IFNa在畢赤酵母中分泌表達條件的優(yōu)化及高密度發(fā)酵[J].南京師范大學(xué)報，2006，3(29)76-80.”)。本發(fā)明凍干制劑的重組豬α-干擾素最好是基本上純凈，最好基本上是均相的(即沒有雜蛋白等)?！盎旧霞儍簟钡闹亟M豬α-干擾素指的是組分包含至少約90%(重量)(以組分的總重量計)的重組豬α-干擾素，較佳的為至少約95%(重量)?！盎旧暇唷钡闹亟M豬α-干擾素指的是以組分的總重量計，組分包含至少99%(重量)的重組豬α-干擾素?！胺€(wěn)定”的制劑是指其中的重組豬α-干擾素在保藏時可基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性。穩(wěn)定性可在選定的溫度下和時間內(nèi)測定。為進行快速篩選，制劑可在40°C下保藏2星期至1個月并同時測定穩(wěn)定性。當(dāng)制劑要保藏在2-8°C時，通常制劑應(yīng)該在30°C或40°C下穩(wěn)定至少1個月和/或在2-8°C下穩(wěn)定至少2年。當(dāng)制劑要保藏在30°C下時，通常制劑應(yīng)在30°C下穩(wěn)定至少2年和/或在40°C穩(wěn)定至少6個月。例如在凍干和保藏后的干擾素生物活性可作為重組豬α-干擾素穩(wěn)定性的一個標(biāo)志(見實施例)。例如，“穩(wěn)定”的制劑是制劑中的重組豬α-干擾素的生物活性同凍干前相比，損失小于約15%，較佳地小于約5%，最佳地小于2%?！爸亟ā被颉皬?fù)溶”制劑是指通過將凍干重組豬α_干擾素制劑溶解在稀釋劑中使重組豬α-干擾素分散在重建制劑中。“凍干保護劑”指一種分子，當(dāng)它與感興趣的重組豬α-干擾素結(jié)合時，能阻止或減少重組豬α-干擾素在凍干和后續(xù)保藏時的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性。本發(fā)明凍干保護劑是甘露醇。凍干保護劑加入未凍干制劑中的量“溶解保護量”指重組豬α-干擾素在溶解保護量的凍干保護劑存在時，在凍干和保藏時基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性及完整性。按照凍干前溶液重量體積比是的甘露醇。這里感興趣的“稀釋劑”是藥學(xué)上可接受的(對于豬體給藥是安全無毒的)，能用于制備重建制劑。典型的稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌劑(BWFI)、ρΗ緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)、無菌鹽溶液、林格溶液或葡萄糖液?！爸委煛敝竸游锛膊≈委熀皖A(yù)防措施。那些需要治療的受用者包括已經(jīng)患有疾病和預(yù)防疾病的動物。需要治療的“動物”指除人以外的動物，包括家畜和農(nóng)場動物和動物園、運動場動物或?qū)櫸?，如豬、狗、牛、貓等。較佳的動物是豬?！凹膊　笔悄艿靡嬗谥亟M豬α-干擾素治療的疾病。它包括病毒感染性疾病，和/或免疫力低下的疾病。本發(fā)明提供的重組豬α-干擾素凍干制劑的制備方法，是將重組豬α-干擾素和甘露醇的混合物進行冷凍干燥。所述的混合物是將含有重組豬α-干擾素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到的混合溶液。在冷凍干燥過程中，可以使用本領(lǐng)域熟知的條件進行預(yù)凍、升華干燥、和解析干燥。較佳地，整個冷凍干燥過程中冷凍干燥是在擱架溫度保持在零下40°C-零上28°C下進行的。本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明的凍干制劑的產(chǎn)品和它的重建和/或用法的說明。產(chǎn)品包括一個容器。合適的容器包括，例如玻璃瓶、小瓶(如雙室小瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。容器可用各種材料如玻璃或塑料制得。容器中有凍干制劑，容器上的或和容器配套的標(biāo)簽說明了重建和/或施用的方法。例如，標(biāo)簽可以指示將凍干制劑重建至使重組豬α-干擾素濃度為2.0-3.OX105IU/mL。裝有凍干制劑的容器可以是多次性使用小瓶，它可重復(fù)進行重建制劑的給藥(如給藥2-6次)。產(chǎn)品還可包括另一個有合適稀釋劑(如注射用水)的容器。在混合稀釋劑和凍干制劑時，重建制劑中的重組豬α-干擾素最終濃度至少為2.0X105IU/mL。從商業(yè)和用戶角度出發(fā)，產(chǎn)品還可包括其它物品，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾膜、針、注射器以及裝有說明書的包裹。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、提供的凍干制劑非常穩(wěn)定。2、采用的冷凍工藝簡便、經(jīng)典，益于廣泛使用。下面將結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1材料與方法1.1試劑和儀器牛血清白蛋白購自華美生物公司；醫(yī)用20%甘露醇；人干擾素α國家準(zhǔn)標(biāo)品購自中國藥品生物制品檢定所；真空冷凍干燥機18L為美國LABC0NC0公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀ELX-800型為美國BIO-TEK公司產(chǎn)品；電子顯微鏡TS100為日本Nikon公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱240L為德國Heraeus公司產(chǎn)品。1.2樣品重組基因工程豬α干擾素由本室制備(由巴斯德畢赤酵母發(fā)酵表達，參見“張麗曼、于瑞嵩、段作營、李震、毛忠貴，重組畢赤酵母產(chǎn)豬IFNa的誘導(dǎo)條件，生物加工過程，第5卷第2期”)；制品活性檢測采用細胞病變抑制法，以WISH細胞(人羊膜傳代細胞株)-VSV(濾泡性口炎病毒)為檢測系統(tǒng)，采用人α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)為IU。1.3凍干保護劑的配方分別選擇甘露醇(manitol，MAN)和牛血清白蛋白作為凍干輔料(表1)。表1凍干前溶液的保護劑含量權(quán)利要求1.一種重組豬α-干擾素的凍干制劑，其特征在于，以制劑的總重量計，所述的制劑中含有77-98W/W%的甘露醇。2.如權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其特征在于，以制劑的總重量計，其中重組豬α-干擾素和甘露醇的總量占97-99/%。3.如權(quán)利要求1或2所述的凍干制劑，其特征在于，其中含有87-98W/W%的甘露醇。4.一種如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟將重組豬α-干擾素和甘露醇的混合溶液進行冷凍干燥，得到如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑。5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)將含有重組豬α-干擾素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到混合溶液；(b)將混合溶液進行冷凍干燥，得到如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑；以含有甘露醇的溶液的總體積計，其中甘露醇的濃度為5-90mg/mL；以含有甘露醇、重組豬α-干擾素的混合溶液的總體積計，甘露醇和重組豬α-干擾素形成的總?cè)苜|(zhì)濃度為6.5-91.5mg/mL。6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，總?cè)苜|(zhì)的濃度為21.5-51.5mg/mL；甘露醇的濃度為20-50mg/mL。7.如權(quán)利要求4-6任一所述的制備方法，其特征在于，在整個冷凍干燥過程中冷凍干燥是在擱架溫度保持在零下40°C-零上下進行的。8.一種產(chǎn)品，包括(a)一個裝有如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑的容器；和(b)關(guān)于凍干制劑在稀釋劑中重建成重建制劑中溶質(zhì)的量為6.5-91.5mgmg/mL的說明；所述的溶質(zhì)包括重組豬α-干擾素和甘露醇.9.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品還包含另一個裝有稀釋劑的容器。10.一種如權(quán)利要求1-3任一所述的凍干制劑的用途，用作或用于制備抗病毒治療和/或提高免疫力的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組豬α-干擾素的凍干制劑及其制備方法和用途。所述的重組豬α-干擾素的凍干制劑，以制劑的總重量計，所述的制劑中含有77-98w/w％的甘露醇。文檔編號A61K47/26GK102058546SQ20091019866公開日2011年5月18日申請日期2009年11月12日優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日發(fā)明者于瑞嵩,史仲平,朱于敏,李震,段作營,沈世緣,董世娟,金虎,高敏杰申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江南大學(xué)