專利名稱：附紅細胞體裸鼠感染模型的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種預防醫(yī)學領域的疾病動物模型的構建方法，具體涉及一種附 紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法。
背景技術：
附紅細胞體(Eperythrozoon)病是由EH引起多種哺乳動物感染的一種常見傳染 病，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害，同時近年來越來越多的人感染EH的病例報告以及流行病 學調查證實EH感染嚴重威脅人類健康，并將其定義為一種新發(fā)人獸共患病，構成潛在的公 共衛(wèi)生問題。該病原主要寄生于人和動物的紅細胞表面、血漿及骨髓中，以貧血、黃疸、發(fā)熱 等為主要臨床癥狀。并有隱性感染、慢性遷延、條件致病、急性發(fā)病時致死率高的特征。因 此，建立一個穩(wěn)定的附紅細胞體病感染特點的動物模型對于研究該病的致病機理，免疫學， 流行病學都尤為重要。經(jīng)過對現(xiàn)有方法的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，附紅細胞體動物模型的研究主要是通過以附紅 細胞體的全血感染切脾或注射地塞米松的實驗動物來獲得。如劉冰等在2007年《中國獸 醫(yī)科學》37期12-15頁中，描述了一種附紅細胞體裸鼠感染模型的建立方法。利用摘除脾或 注射地塞米松的昆明小白鼠，以腹腔注射方式人工感染附紅細胞體全血建立了附紅細胞體 感染模型，這種方法雖然可以建立附紅細胞體的動物模型，但是，此模型存在兩個缺陷(1) 采用全血作為感染源會將白細胞等其它血液組分一起注射至實驗動物體內，而這些血液組 分對實驗動物來講是一大類免疫原，將會嚴重影響試驗結果。(2)采用免疫抑制劑或切脾等 狀態(tài)下的建立動物模型，步驟繁瑣且容易引起外傷感染。因此，如果一個動物模型可以穩(wěn)定 地復制出附紅細胞體感染，并且能克服這兩個缺陷，對附紅細胞體的深入研究將具有獨特 的價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題，本發(fā)明提供一種附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方 法。本發(fā)明采用分離純化的附紅細胞體作為感染源通過靜脈注射SPF裸鼠得到。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明包括以下步驟①從感染附紅細胞體病的抗凝血中分離純化出附紅細胞體；所述的分離純化的附紅細胞體是指從附紅細胞體感染血液中通過熱處理(50度 處理10分鐘)，將附紅細胞體與紅細胞解離，梯度離心分離附紅細胞體重懸于無菌的生理 鹽水中，此懸液為分離純化的附紅細胞體懸液。②裸鼠的飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室內；③對裸鼠靜脈接種；所述的對裸鼠靜脈接種，是指對裸鼠接種純化的附紅細胞體懸液，具體為對7周 齡SPF裸鼠尾靜脈注射IOOul純化的附紅細胞體懸液，其中附紅細胞體數(shù)目大于等于IO7
④動物模型的檢測，驗證附紅細胞體裸鼠感染模型顯示出附紅細胞體感染紅細胞 的結構。所述的檢測，是包括鮮血壓片鏡檢，PCR檢測和透射電鏡鏡檢三步法的綜合檢測。其中PCR檢測引物是根據(jù)附紅細胞體16S rRNA序列設計，上游為 5 ‘ -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3 ‘，下游為5 ‘ -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3 ‘.可擴增出長度 為396bp的片段。根據(jù)上述步驟，通過三種檢測方法驗證，證實本發(fā)明中附紅細胞體SPF裸鼠感染 模型構建成功。所述的感染，以分離純化的附紅細胞體作為感染源。由于感染源單一，使模型的建 立更為標準和穩(wěn)定。所述的接種，是指靜脈注射，對實驗動物無需進行切脾手術或者注射 地賽米松等也能獲得較高的感染率。所述的裸鼠為一種免疫缺陷型無胸腺裸鼠，有利于病 原在動物體內復制。本發(fā)明完全彌補了目前附紅細胞體動物模型構建的缺陷，是一種理想的動物模 型。本發(fā)明的意義在于該模型可以用于附紅細胞體病的致病機理，免疫學，流行病學等方面 的提供研究依據(jù)和實驗手段。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。SPF裸鼠，即無特定病原(Specific pathogen free animal, SPF)裸鼠的簡稱。為 實驗用鼠的一個國際通用標準級別，適用于大部分實驗研究。實施例1附紅細胞體SPF裸鼠感染模型的構建(1)分離純化附紅細胞體首先無菌采集患有附紅細胞體抗凝血200ml，2000r/min離心lOmin，去上清。將沉 淀紅細胞泥加入等體積生理鹽水重懸為紅細胞懸液。在新的離心管中加入等體積的淋巴細 胞分離液和紅細胞懸液，2500r/min離心20min，去最上層和中間的白細胞層，取下層紅細 胞層。用等體積的生理鹽水重懸紅細胞層，50°C水浴15min后，油鏡下可觀察到附紅細胞體 與紅細胞分離，此時用2000r/min離心lOmin，取上清于一離心管。將沉淀重懸于生理鹽水 中再2000r/min離心lOmin，取上清。將兩次所得的上清一起收集，12000r/min離心，去上 清。將沉淀重懸于適量生理鹽水中，即為純化的附紅細胞體懸液。O) SPF裸鼠的飼養(yǎng)試驗前隔離室和飼養(yǎng)裸鼠的鼠籠需徹底消毒。先用來蘇爾溶液擦拭隔離室地 面、門、窗和鼠籠，用紫外光照射12小時，然后對飼養(yǎng)裸鼠的房間進行熏蒸。首先測量房間 的體積大小，按福爾馬林30毫升/立方米、高錳酸鉀15克/立方米和水15毫升/立方米 計算用量。在房間熏蒸消毒之前，檢查房間的密閉性。熏蒸時，先將水倒入陶瓷容器內，后 加入高錳酸鉀，攪拌均勻，再加入福爾馬林，人即離開，密閉房間。熏蒸消毒M小時以上，然 后換氣通風。實驗開始時，工作人員進入隔離室前，都必須進行手臂部消毒(1 1000稀釋的新潔爾滅)，然后換上無菌工作服和口罩。7周齡裸鼠購自中國科學院上海試驗動物中心，飼 喂滅菌鼠糧和滅菌水。SPF裸鼠分為對照組和感染組各30只，分別飼養(yǎng)在不同的隔離室。(3)接種采取尾靜脈注射接種法，感染組每只裸鼠均接種IOOul純化的附紅細胞體懸液 (IOOul懸液中附紅細胞體數(shù)目不少于IO7個)。對照組每只裸鼠接種IOOul無菌生理鹽水。(4)鮮血壓片檢測感染3天后，分別將感染組和對照組裸鼠進行尾靜脈采血，將采集的血液壓片，在1000倍油鏡下觀察，可看到感染組裸鼠紅細胞均出現(xiàn)明顯變形。而對照 組的裸鼠紅細胞為正常的雙凹狀。(5) PCR 檢測根據(jù)附紅細胞體16S rRNA序列設計特異性引物，上游為 5' -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3‘，下游為5' -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3‘.實驗組和對照 組裸鼠分別心臟采血lml，按基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)說明提取模板DNA。PCR反 應體系為IXPCR buffer, 1. 5mM MgC12，250uM NTPs，12. 5pmole 引物，1. 25U Taq DNA聚合 酶和 Iul 模板 DNA。反應條件為94°C 5min 后，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，進行 36 個循 環(huán)后72°C延伸lOmin，實驗組的樣本均可擴增出長度為233bp的片段，經(jīng)上海生工生物公司 測序后證明此片段為附紅細胞體。而對照組樣本不能擴增出相應條帶。(6)透射電鏡檢測將實驗組裸鼠尾靜脈血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三 次，1 %鋨酸固定液固定2-3h，再用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次。分別用50%乙醇，70% 乙醇，90%乙醇，90%乙醇90%丙酮(1 1)，90%丙酮和100%丙酮進行梯度脫水。丙酮 加包埋液逐級浸透，包埋。用Leica (徠卡)-ULTRACUT超薄切片機切片機切片厚度為60nm，3 %醋酸鈾-枸櫞 酸鉛雙染色后，用HitachU日立)-7650透射電子顯微鏡觀察，拍片(X 10000)。從圖片中 可以觀察到附紅細胞體可以疏松地結合在紅細胞表面，而不貫穿紅細胞膜。附紅細胞體附 著在紅細胞表面導致紅細胞膜內陷，附紅細胞體則嵌在內陷的紅細胞膜中，附紅細胞體與 紅細胞膜之間有一定間隙(如

圖1)。本實施例成功構建了附紅細胞體病SPF裸鼠感染模型，該模型可用于該病的致病 機理，免疫學，流行病學等方面的研究。
權利要求
1.一種附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于步驟如下①從感染附紅細胞體病的血中分離純化出附紅細胞體，從附紅細胞體病血中分離出來 的附紅細胞體重懸于無菌的生理鹽水中，此懸液為分離純化的附紅細胞體懸液；②裸鼠的飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室內；③對裸鼠靜脈接種，對裸鼠接種純化的附紅細胞體懸液，具體為對7周齡SPF裸鼠尾 靜脈注射IOOul純化的附紅細胞體懸液；④動物模型的檢測，驗證附紅細胞體裸鼠感染模型顯示出附紅細胞體感染紅細胞的結構。
2.如權利要求1所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所述的附 紅細胞體懸液中附紅細胞體數(shù)目大于等于IO7個。
3.如權利要求1所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所述的感 染是以分離純化的附紅細胞體作為感染源。
4.如權利要求1所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所述的接 種是指靜脈注射。
5.如權利要求1所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所述的檢 測包括鮮血壓片鏡檢、PCR檢測和透射電鏡鏡檢三步法的綜合檢測。
6.如權利要求1或5所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所述 的鮮血壓片檢測是指感染3天后，分別將感染組和對照組裸鼠進行尾靜脈采血，將采集的 血液壓片，觀察。
7.如權利要求1或5所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所 述的PCR檢測，其的引物是根據(jù)根據(jù)附紅細胞體16S rRNA序列設計特異性引物，上游為 5' -CACGCCGTAACGATGGGTAT-3‘，下游為5' -CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3‘.
8.如權利要求1或5所述的附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于所 述的透射電鏡檢測，是指將實驗組裸鼠尾靜脈血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷 酸漂洗液漂洗三次，鋨酸固定液固定2-!3h，再用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，梯度脫 水，逐級浸透，包埋，切片，觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種預防醫(yī)學領域的疾病動物模型的構建方法，具體涉及一種附紅細胞體的裸鼠感染模型的構建方法，其特征在于步驟如下(1)附紅細胞體的分離純化；(2)SPF裸鼠飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室中；(3)接種；(4)動物模型檢測評估。本發(fā)明完全彌補了目前附紅細胞體動物模型構建的缺陷，是一種理想的動物模型。本發(fā)明的意義在于該模型可以用于附紅細胞體病的致病機理，免疫學，流行病學等方面的提供研究依據(jù)和實驗手段。
文檔編號A61P33/02GK102068462SQ20091019922
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權日2009年11月20日
發(fā)明者王志超 申請人:上海瑞基生物科技有限公司