專利名稱：：抗Cyr61蛋白的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，該抗體能與Cyr61蛋白結合，具有抑制類風關滑膜細胞和惡性腫瘤細胞增殖、粘附和遷延的作用，還可用于Cyr61蛋白的體外檢測。
背景技術：
：人Cyr61蛋白(hCyr61)由381個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸和脯氨酸殘基，相對分子質量為42kDa。目前已知，Cyr61廣泛表達于多種正常組織細胞，包括成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、膀胱及血管平滑肌細胞、間質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞等。此外，Cyr61還在某些腫瘤細胞中高表達，目前已知的有乳腺癌細胞、肝癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞、黑色素瘤細胞等，是重要的細胞基質調節(jié)因子，廣泛參與調控細胞增殖、粘附、遷移、分化、凋亡等多種功能。由于Cyr61蛋白富含半胱氨酸，在表達時容易形成二硫健而導致出現(xiàn)多種構象，而且，Cyr61作為重要的基質蛋白，保守性很強，在哺乳動物之間的同源性很高，尤其是與小鼠的Cyr61同源性高達93%，因此，制備單抗的技術難度較高。由于種種原因，到目前為止，世界上只有商業(yè)化的抗Cyr61的多克隆抗體(SantaCrus，USA)，而沒有單克隆抗體。本實驗室曾經制備了2株抗Cyr61單抗，分別為雜交瘤CGMCCNO.2766和CGMCCNO.2767(已經申請專利)。為了深入研究Cyr61的功能及進行后續(xù)的臨床應用，本發(fā)明報道了新制備和篩選出的單抗4株這4株單抗均為IgGlk型、分別結合不同的Cyr61蛋白的不同區(qū)片斷、生物學功能也不同。因此，本發(fā)明中的4株單抗可用于下列研發(fā)應用如制備人源化抗體、構建用于檢測人樣本中Cry61表達量的試劑盒等，有巨大的潛在商業(yè)價值。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，該抗體能與Cyr61蛋白結合。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體在抑制細胞增殖、粘附和遷延中的應用。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體在Cyr61蛋白體外檢測中應用。本發(fā)明所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其能與Cyr61蛋白N端126-267序列(SEQIDNo1)專一性結合。根據引物設計原則及GeneBank(NMJ)01554)中公布的人Cyr61全長eDNA序列2295bp，利用引物設計軟件Primer5.0進行設計，去除信號肽部分，兩端各加相應的限制性酶切位點構建人Cyr61蛋白(hCyr61(26-381))(SEQIDNo2)表達載體和人Cyr61蛋白N端126-267序列(hCyr61(126-267))表達載體并于工程菌中表達。雜交瘤技術為本領域技術人員制備單克隆抗體所熟知，將具有分泌抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤，使得融合細胞具有兩種親本細胞的特性，即成為能夠分泌抗體并能在體外長期繁殖的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞經過克隆化后成為單個細胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。該技術一般包括三個步驟(一)細胞融合和篩選；(二)培養(yǎng)基培養(yǎng)和篩選，以及(三)細胞克隆和培養(yǎng)。本發(fā)明使用常用的雜交瘤技術制備抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，包括按照常規(guī)免疫方法(如腹腔、皮下和靜脈)，在皮內注射蛋白抗原(如人Cyr61蛋白)免疫哺乳動物，將免疫動物的脾細胞與同種系來源的骨髓瘤細胞融合。本發(fā)明中，純化的重組人Cyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠(常規(guī)方法)。于免疫結束后取小鼠脾臟淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP20/Ag-14在聚乙二醇(PEG)作用下進行融合，通過ELISA篩選穩(wěn)定分泌抗hCyr61的單克隆雜交瘤細胞株，ELISA方法鑒定單克隆抗體的亞類和亞型，并比較陽性克隆培養(yǎng)上清抗體的效價。利用純化的人Cyr61N端融合蛋白片段(hCyr61(126-267))包被固相，通過ELISA方法初步分析篩選出單克隆抗體的結合表位所在區(qū)域。選擇重鏈亞型為IgGl的雜交瘤細胞株，通過無血清培養(yǎng)及親和層析獲取少量純化抗體，從中再選擇效價較高的雜交瘤細胞注入BALB/c小鼠腹腔，制備大量高效價的單克隆抗體，用ProteinA-S印harose柱純化腹水單克隆抗體并定量。最后，通過WesternBlotting進一步明確純化單克隆抗體的特異性及其抗原結合表位分布區(qū)域。本發(fā)明選擇雜交瘤細胞株CGMCC3298和CGMCC3351制備抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，所制得的抗體為IgGl亞型k亞類。這些抗體具有抑制類風關滑膜細胞增殖、抑制類風關滑膜細胞粘附、抑制人乳腺癌細胞增殖、粘附、遷移和侵襲。本發(fā)明抗Cyr61蛋白的單克隆抗體能與Cyr61蛋白體外檢測中應用，如ELISA方法體外檢測Cyr61蛋白本發(fā)明技術方案實現(xiàn)的有益效果本發(fā)明通過常用的雜交瘤技術篩選出2株Cyr61蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞。經測定，這些抗Cyr61蛋白的單克隆抗體屬于IgGl，且其輕鏈為k型。經實驗驗證，抗Cyr61蛋白的單克隆抗體具有抑制細胞增殖、粘附和遷延的作用。圖1為表達人全長Cyr61的表達質粒pET28(a)_hCyr61構建示意圖；圖2A為pET28a-hCyr61重組質粒酶切鑒定；圖2B為pET28a-hCyr61重組質粒測序結果；其中A表示T7promoter引物測序結果，B表示T7terminator引物測序結果；圖上箭頭標識hCyr61上、下游引物所在位置；圖3A為His-hCyr6融合蛋白的表達鑒定；其中M表示低分子量蛋白Marker;圖3A左圖1、3、5和7表示4個不同克隆誘導前；2、4、6和8表示4個不同克隆誘導后；圖3A右圖Pre表示誘導前；IN表示誘導后；CL表示裂解上清；Pellet表示包涵體沉淀，箭頭所示為表達蛋白；圖3B為His-hCyr61融合蛋白序列測定；其中方框部分為去除的信號肽序列，下劃線部分為pET28a(+)載體上帶有組氨酸等序列；圖4A為His-hCyr61融合蛋白的割膠電洗脫純化與鑒定結果；其中M表示低分子量蛋白Marker,Pre表示誘導前；IN表示誘導后，Pellet表示包涵體裂解液，Elu表示過層析柱后的洗脫蛋白，Ele表示割膠電洗脫的純化蛋白；圖4B為WesternBlotting鑒定；其中M表示預染蛋白Marker,1表示pET28a-0VA66m菌體裂解液，2表示pET28a-hCyr61菌體裂解液，3表示割膠電洗脫純化的His-hCyr61重組蛋白；圖5為表達載體pET28(a)-hCyr61_XN構建示意圖；圖6為pET28a-hCyr61-XN重組質粒酶切鑒定結果其中Mark表示DNA標志，1表示pET28a-hCyr61-XN質粒，2表示pET28a-hCyr61-XN酶切片斷；圖7A為純化蛋白SDS-PAGE電泳結果；圖中M表示低分子量蛋白Marker,FL表示純化的His-hCyr61全長的融合蛋白，XN表示純化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；圖7B為及WesternBlotting鑒定重組His-hCyr61N末端片段；圖中M表示低分子量蛋白Marker,FL表示純化的His-hCyr61全長的融合蛋白，XN表示純化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；圖8A為9株抗人Cyr61單克隆抗體特異性鑒定；其中His-Cyr61代表以His-Cyr61融合蛋白包被孔測定雜交瘤培養(yǎng)上清的0D492nm值，His_0VA66代表以His-0VA66m融合蛋白包被孔測定雜交瘤培養(yǎng)上清的0D492nm值；圖8B為ELISA分析單克隆抗體的亞類及亞型；PAb:免疫小鼠血清作為陽性對照測定其抗體的亞類及亞型；CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300、CGMCC3351;圖8C為SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度與分子量；其中，M表示低分子量蛋白Marker;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號CGMCC3298、CGMCC3351、CGMCC3299和CGMCC3300相對應；圖9A為4株重鏈為IgGl型單克隆抗體的結合抗原位點的ELISA分析；其中，F(xiàn)L表示hCyr6126—訓全長蛋白包被孔的OD值，XN表示hCyr6126—267包被孔的0D值，XC表示hCyr611Q3—381包被孔的0D值；數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖9B為免疫印跡分析小鼠抗hCyr61單克隆抗體的特異性及對Cyr61不同片段的結合；其中，F(xiàn)L表示hCyr6126—381全長蛋白，XN表示hCyr6126—267，XC表示hCyr61103_381，hCyr61購自P印rotech公司的人Cyr61標準蛋白，0VA66m為人卵巢癌相關腫瘤抗原(作為陰性對照)；數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖10A為間接免疫熒光法檢測滑膜細胞表達Cyr61蛋白(X400);鼠抗人Cyr61單抗以單克隆抗體CGMCC3298及CGMCC3299為一抗檢測FLS細胞中Cyr61蛋白；DAPI表示用DAPI染料顯示細胞核，Merge表示Cyr61抗體測定的細胞圖片與DAPI染核的圖片的疊加；數(shù)字3298和3299分別與保藏號相對應；圖10B為抗Cyr61McAb與人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達)結合，而不與MCF-7(Cyr61低表達)結合天然的Cyr61蛋白特異性的結合；其中，A表示real-timePCR分析顯示人乳腺癌細胞株MDA-MB-231為Cyr61高表達，MCF-7為Cyr61低表達，B表示WesternBlotting顯示抗Cyr61McAb能與細胞所表達的Cyr61特異的結合，C表示免疫熒光顯示抗Cyr61單抗CGMCC3351能與細胞所表達的Cyr61特異的結合；圖11為細胞免疫化學染色法檢測人FLS及小鼠NIH3T3細胞表達Cyr61蛋白(X200);圖12小鼠抗人Cyr61單克隆抗體對滑膜細胞增殖的抑制作用，*p<0.05，**:p<0.01;*p<0.0001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應;圖13A為hCyr61促進滑膜細胞的粘附并成劑量依賴關系，*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001;圖13B為不同株單克隆抗體或不同濃度的肝素與hCyr61包被板預孵育后，檢測滑膜細胞的粘附能力的變化，與hCyr61包被孔相比具有顯著差異；其中，R78E4為CGMCC3298;R131E3為CGMCC3299;R220E5為CGMCC3300;R367E10為CGMCC3351*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001;圖14A為3H-TDR摻入法檢測細胞增殖，氺p<0.05，**p<0.001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖14B為MTT法檢測細胞增殖，計算抑制率X，*p<0.05，**p<0.001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖15為抗體抑制MDA-MB-231細胞的粘附，*:P<0.05;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖16為抗體抑制MDA-MB-231細胞的遷移，林P<0.01;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；圖17為抗體抑制MDA-MB-231細胞的遷移作用，**:P<0.01;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號相對應；具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪_奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1構建表達人Cyr61全長(26-381)蛋白質粒與蛋白表達根據引物設計原則及GeneBank(NMJ)01554)中公布的人Cyr61全長cDNA序列2295bp，利用引物設計軟件Primer5.0進行設計，去除信號肽部分，兩端各加相應的限制性酶切位點。Cyr61全長(26-381)蛋白的引物上游引物5'-TTGGATCCTGCCCCGCTGCCTGCCACT-3'(劃線處為BamHI酶切位點)；下游引物5'TTAAGCTTCTAGTCCCTAAATTTGTGAATGTCATT-3，(劃線處為HindIII酶切位點)。工程菌BL21(DE3)、表達載體pET28(a)。將質粒pET28(a)分別用限制性內切酶BamHI和Hind111共消化，根據常規(guī)連接方法將所擴增出的人全長Cyr61(hCyr61-FL)連接入pET28(a)載體，構建質粒pET28(a)-hCyr61(見圖1)采用酶切和測序方法對其進行鑒定，結果表明所構建重組質粒完全正確，與GenBank上所報道的序列NM_001554完全一致(見圖2A，酶切鑒定用箭頭標出；圖2B，測序鑒定)。表明所擴增片斷與PET28(a)連接正確，符合實驗設計，可用于后續(xù)質粒擴增與目的蛋白的表達。重組人Cyr61全長表達蛋白誘導表達按照常規(guī)分子克隆方法進行。簡述之挑取單克隆菌落振搖過夜后接種于5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C250rpm振搖至0D600至0.60.8時，加入終濃度lmmol/LIPTG誘導3h;SDS-PAGE檢測結果顯示，誘導后的菌液蛋白在45KDa處有明顯的條帶，而未誘導的菌液蛋白無相應條帶(見圖3A左，箭頭所示)。進一步收集表達菌經超聲碎菌及高速離心后收集沉淀物并用含有8M尿素的變性裂解液(DSB)徹底溶解后，SDS-PAGE電泳顯示在45KDa處有明顯的條帶表達(見圖3A右，箭頭所示)。而序列分析顯示，去除信號肽部分的hCyr61蛋白的分子量約為38.9KDa，而融合蛋白帶有的pET28a(+)載體組氨酸等序列，其分子量約為5.8KDa，故構建的His-hCyr61融合蛋白分子量約44.7KDa，與SDS-PAGE凝膠顯示的目的蛋白分子量一致(見圖3B)。重組人Cyr61表達蛋白純化與鑒定采用上述方法，進行大量誘導。收集菌液沉淀，提取包涵體蛋白的裂解上清用protin-2000鎳柱純化，加入不同濃度咪唑洗脫純化蛋白。為了進一步得到高純度的蛋白，將含有目的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE割膠純化。可見純化后獲得單個條帶，表明純度很高(圖4A，箭頭所示)。進一步采用SDS-PAGE電泳，經半干轉膜電泳將蛋白轉移至PVDF膜上，用商品化兔抗人hCyr61抗體作為一抗進行WesternBlotting檢測。結果顯示，pET28a-hCyr61菌體裂解液及純化后的目的蛋白在45kDa處均有結合條帶，而陰性對照的pET28a-0VA66m菌體裂解液無條帶顯示，表明重組蛋白為目的蛋白(圖4B)。實施例2構建表達人Cyr61全長(26-267)蛋白質粒與蛋白表達Cyr61蛋白N端片段的引物(Cyr61-XN-26-267aa)上游引物5'-TTGGATCCTGCCCCGCTGCCTGCCACT-3'(劃線處為BamHI酶切位點);下游引物5'-TTAAGCTTCTAACAAATCCGGGTTTCTTTCACA-3'(劃線處為HindIII酶切位點)；工程菌BL21(DE3)，表達載體pET28(a)。將質粒pET28(a)分別用限制性內切酶BamHI和HindIII共消化，根據常規(guī)連接方法將所擴增出的人Cyr61N端片斷(Cyr61-XN-26-267aa)插入pET28(a)載體中，獲得相應重組表達質粒pET28a-hCyr61-XN(見圖5)。His-Cyr61N末端片段重組質粒的鑒定抽提類風濕性關節(jié)炎病人滑膜細胞的總RNA，通過RT-RCR方法獲取cDNA，利用針對N末端及C末端的兩對引物PCR擴增得到Cyr61-XNDNA片段，分別與經BamHI和HindIII雙酶切回收的pET28(a)載體進行連接反應。構建的重組質粒經轉化擴增后，抽提陽性克隆質粒做酶切和測序鑒定，結果表明Cyr61-XN基因為728bp(圖6，箭頭所示)，而與GeneBank中序列比對，可見上述片斷分別位于Cyr61基因序列的282-1009nt，而且酶切結果表明與pET28(a)連接正確，符合預期實驗設計。His-Cyr61N末端融合蛋白片段的表達純化及鑒定采用與人全長Cyr61蛋白表達和純化的相同方法，誘導表達hCyr61-XN融合蛋白片段，并將純化的hCyr61-XN融合蛋白片段進行蛋白印跡分析。結果表明純化后的hCyr61-XN融合蛋白片段在35kDa處，hCyr61-FL(人Cyr61全長蛋白)條帶位于45kDa(圖7A);蛋白印跡分析表明該35kDa左右片段與hCyr61-FL(人Cyr61全長蛋白)相同，均能與市售抗Cyr61蛋白特異性結合(圖7B)，符合預期實驗目的。上述結果表明獲得了hCyr6126—267并誘導這個蛋白片段的表達，通過層析柱洗脫獲得純度相對高的目的蛋白，用于后續(xù)單克隆抗體表位的初步篩選。實施例3小鼠抗人Cyr61單克隆抗體的制備與結合部位分析BABC/c小鼠雌性，68周齡4只及810周齡以上50只，由中國科學院上海科學研究院動物中心提供。小鼠骨髓瘤細胞SP20/Ag-14，為傳代保存。按照常規(guī)單抗制備方法制備，用作鑒定用Cyr61蛋白為商品化重組人Cyr61蛋白(P印roTechInc.NewJersey,USA，Cat:120-25)。按照常規(guī)免疫方法，用自制人His-hCyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠并取小鼠脾細胞，按照經典方法進行細胞融合。經連續(xù)5次亞克隆和ELISA篩選，其中9株雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌特異性抗人Cyr61抗體(僅與純化或者His-hCyr61反應，而不結合His，也不與His-0VA66m結合)(見圖8A)。進一步鑒定其抗體的類型，其中5株亞型為IgM類k型，另外4株亞型為IgGl類k型(分別命名為CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300和CGMCC3351(見圖8B)。采用這4株單抗雜交瘤制備腹水(常規(guī)方法)，經ProteinA-S印harose親和層析后，進行SDS-page電泳，結果表明這4株單抗的重鏈均位于52kD左右，而輕鏈位于27kD左右，再次驗證這4株單克隆抗體的類型為IgGl類k型(圖8C)。單克隆抗體的結合表位分析用原核表達純化的His-hCyr61全長及其N末端hCyr6126—267、C末端片段hCyr611Q3—381包被ELISA板，分別測定4株IgGl類雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體與上述不同抗原的結合能力。進一步采用蛋白印跡法進行確定。結果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351僅結合hCyr61全長和N末端，而對C末端無結合能力，提示這兩株雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合表位位于hCyr61蛋白的N末端26103aa之間，故其不與C末端103267片段結合；單克隆抗體CGMCC3299和CGMCC3300對3種蛋白均有結合能力，提示這CGMCC3299和CGMCC3300的結合表位位于hCyr61蛋白N末端和C末端片段的重疊部位即103267aa之間，故其和N末端hCyr6126—267(XN)及C末端片段hCyr611Q3—381(XC)均具有很強的結合能力，而與陰性對照0VA66蛋白無結合。ELISA檢測結果見圖9A，蛋白印跡結果見圖9B。4株抗體效價與親和力測定分別采用商業(yè)化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4株雜交瘤，收集上清，用Bethyl抗體定量法和ELISA法測定了抗體的濃度與效價。采用Biocore方法分析了這4株抗體的親和力。結果見表l。表14株IgGl雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中抗人Cyr61抗體濃度、效價和親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4抗人Cyr61單克隆抗體功能類風關滑膜細胞來自于關節(jié)置換手術的廢棄滑膜(病人均經過知情同意與醫(yī)院倫理委員會通過)。BALB/c小鼠成纖維細胞株NIH3T3、人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231，均為傳代保存。細胞培養(yǎng)等方法見結果中簡述。與人細胞中Cyr61蛋白結合能力以純化的4株小鼠抗人Cyr61單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300、CGMCC3351)作為一抗，通過間接免疫熒光法測定制備的單克隆抗體與胞漿Cyr61的結合能力，結果證實該抗體能與類風濕性關節(jié)炎病人滑膜細胞胞漿的Cyr61蛋白結合，細胞核無熒光顯示。圖10A顯示CGMCC3298、CGMCC3299的熒光檢測結果。該結果進一步證實了制備單克隆抗體的特異性，同時也證實了RA病人滑膜細胞高表達Cyr61蛋白，與既往的RealtimePCR及WesternBlotting測定結果相符。同樣，4株單抗均能與人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達)結合，而不與MCF-7(Cyr61低表達)結合。圖10B顯示CGMCC3351與人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達)結合，而不與MCF-7(Cyr61低表達)結合的熒光檢測結果。與小鼠3T3細胞胞內Cyr61蛋白結合能力由于人Cyr61蛋白與小鼠Cyr61同源性高達93%。由此，本發(fā)明中制備CGMCC3298單克隆抗體作為一抗，通過間接法檢測，同時測定人滑膜成纖維細胞和小鼠3T3細胞胞內Cyr61蛋白。如圖11所示，兩種細胞顯色均呈陽性，而無關抗體作為一抗的細胞不顯色，提示該抗體即可特異性結合人Cyr61蛋白又與小鼠的Cyr61蛋白具有交叉反應性。這一方面顯示制備抗Cyr61單抗的難度，另一方面表明在后續(xù)的動物模型實驗中，抗人Cyr61抗體阻斷小鼠的腫瘤和關節(jié)炎發(fā)病具有可行性和理論依據。對類風關滑膜細胞的作用(1)、抑制類風關滑膜細胞增殖在正常血清培養(yǎng)的類風關滑膜細胞中，分別加入不同濃度的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，3H-TdR摻入方法檢測這4株單抗對于其增殖的作用。結果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351對于滑膜細胞增殖有抑制作用，而且呈典型的濃度依賴性。而CGMCC3299及CGMCC3300無此作用(見圖12)。(2)、抑制類風關滑膜細胞粘附Cyr61作為一種基質蛋白，能促進多種細胞的粘附，并因此而參與腫瘤細胞的轉移及損傷修復等病理生理過程。但是對于Cyr61促進滑膜細胞的粘附尚未見報道。本發(fā)明中測定了所制備4株單抗對于人類風關滑膜細胞粘附的作用。首先采用不同濃度的人Cyr61標準蛋白包板，通過粘附實驗證實Cyr61能促進滑膜細胞的粘附并成劑量依賴關系(見圖13A)。然后用所制備的4株小鼠抗人Cyr61蛋白與包被Cyr61蛋白預孵育，再加入類風關滑膜細胞檢測其黏附作用的改變。結果顯示，單克隆抗體CGMCC3299及CGMCC3300具有明顯抑制類風關滑膜細胞粘附的作用，并以CGMCC3299的抑制效果更明顯，而單克隆抗體CGMCC3298及CGMCC3351的抑制作用不顯著(見圖14B)。因為Cyr61是一種肝素結合蛋白，其促進細胞粘附的作用有賴于其肝素結合位點。因此，采用低分子量肝素與Cyr61蛋白預作用作為陽性對照，可見肝素顯著抑制Cyr61促滑膜細胞的粘附作用，并成劑量依賴關系(見圖13B)。對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的作用(1)抑制人乳腺癌細胞株MDA-MB-231體外增殖在正常血清培養(yǎng)的人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞中，分別加入不同濃度的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，3H_TdR摻入法和MTT法檢測這4株單抗對于其增殖的作用。結果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351對于人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞增殖有抑制作用，而且呈典型的濃度依賴性。而CGMCC3299及CGMCC3300無此作用(見圖14)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)、抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231粘附作用將Cyr61蛋白以4ug/ml，100ul/well包板，4。過夜。經1%BSA封閉2h，PBS洗滌后加入lug/孔的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，37°孵育lh后，加入5Xl(^的細胞/孔，37。孵育lh后結晶紫染色、2XSDS溶解結晶，0D550檢測。結果顯示抗體CGMCC3299有抑制細胞粘附的作用，而其他3株(CGMCC3298、CGMCC3300及CGMCC3351)無明顯作用(見圖15)。(3)、抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231遷移采用Transwell實驗觀察抗體對MDA-MB-231細胞遷移的影響。在Transwell下室里加入條件培養(yǎng)液(MDA-MB-231細胞培養(yǎng)液)O.8ml，同時分別加入4株單抗(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)和對照IgGl單抗(濃度為10ug/ml);在培養(yǎng)上層加入2XIOV孔的MDA-MB-231細胞。于孵育4h后吸棄上層液體，4%多聚甲醛固定15min，棉簽拭去膜上層細胞，結晶紫染色20分鐘。鏡下觀察，拍照，計數(shù)。結果顯示4株單抗中，只有CGMCC3351具有明顯抑制MDA-MB-231細胞遷移的作用(見圖16)。(3)、抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231侵襲生長在Transwell的上層小室里鋪膠100ul、下室仍加入條件培養(yǎng)液(MDA_MB_231細胞培養(yǎng)液)0.8ml和4株單抗及對照IgGl單抗(濃度均為10ug/ml)。將MDA-MB-231細胞加入上層(5XIOV孔)，26h后吸棄上層液體，4%多聚甲醛固定15min，棉簽拭去膜上層細胞，結晶紫染色20分鐘。鏡下觀察，拍照，計數(shù)。結果顯示4株單抗中，只有CGMCC3351具有明顯抑制MDA-MB-231細胞遷移的作用(見圖17)。綜上實驗結果，本發(fā)明篩選得到的抗人Cyr61單克隆抗體生物學特性見表2表24株抗人Cyr61單克隆抗體生物學特性10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表<110>上海免疫學研究所<120>抗Cyr61蛋白的單克隆抗體及其應用<130>LBJ．HF．9011<160>2<170>PatentInveysion3．3<210>SEQ工DNol<211>142(213>Cyr61蛋白N端126—267序列<400>lGlyAlaValGlyCysIleProLeuCysProGinGhLeuSerLeuProAsnLeuGlyCysProAsnl5lo1520ProArgLeuValLysVal／hrGlyGinCysCysGhGh／rpValCysAspGhAspSetIleLysAsp2530354045ProMetGhAspGinAspGlyLeuLeuGlyLysGhLeuGlyPheAspAlaSetGhValGhLeu50556065／hrArgAsnAsnGhLeuIleAlaValGlyLysGlySetSerLeuLysArgLeuProValPheGlyMet65GluSer85CysPro110GinCys130TrpSer95100105GinCysSerLysThrCysGlyThrGlylieSerThrArgValThrAsnAspAsnCysArgLeu115120125135ValLysGluThrArglieCys140〈210>SEQIDNo2<211>356〈212>PRT<213>人Cyr61蛋白26-381序列〈400>2AlaAlaCysHisCysProLeuGluAlaProLysCysAlaProGlyValCysVal1AspGinAspCysAlaPheAsnGinLeuCysProArgGlyProHisArgGinGinCysGluSerGluCysGlyCys2545ThrLysTrpVal51015CysCysLysValCysAlaLysGinLeuAsnGluAspCysSer3035GlyLeuGluCysAsnPheGlyAlaSerSerThrAlaLeuLys505560GlyArgProCysGluTyrAsnSerArglieTyrGinAsnGly7580GinCysThrCyslieAspGlyAlaValGlyCyslieProLeu95100105LeuProAsnLeuGlyCysProAsnProArgLeuValLysValThrGlyGlu115120125135CysAspGluAspSerlieLysAspProMetGluAspGinAspGlyLeuSerGluPro7090LysHisLeuGlyLysGlu140145150155LeuGlyPheAspAlaSerGluValGluLeuThrArgAsnAsnGluLeulieAlaValGlyLysGlySer160165170175180SerLeuLysArgLeuProValPheGlyMetGluProArglieLeuTyrAsnProLeuGinGlyGin185190195200LysCyslieValGinThrThrSerTrpSerGinCysSerLysThrCysGlyThrGlylieSerThrArg205210215220225ValThrAsnAspAsnProGluCysArgLeuValLysGluThrArglieCysGluValArgProCys230235240245GlyGinProValTyrSerSerLeuLysLysGlyLysLysCysSerLysThrLysLysSerProGluPro250255260265270ValArgPheThrTyrAlaGlyCysLeuSerValLysLysTyrArgProLysTyrCysGlySerCys275280285290ValAspGlyArgCysCysThrProGinLeuThrArgThrValLysMetArgPheArgCysGluAspGly295300305310315GluThrPheSerLysAsnValMetMetlieGinSerCysLysCysAsnTyrAsnCysProHisAla320325330335AsnGluAlaAlaPheProPheTyrArgLeuPheAsnAsplieHisLysPheArgAsp34034535035權利要求一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體與Cyr61蛋白SEQIDNo1特異結合。2.根據權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株CGMCC3298或CGMCC3351制得。3.根據權利要求2所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細胞株CGMCC3298制得的腹水型抗Cyr61蛋白的單克隆抗體的效價可達1X108。4.根據權利要求2所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細胞株CGMCC3351制得的腹水型抗Cyr61蛋白的單克隆抗體的效價可達1X107。5.根據權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體為IgGl。6.根據權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體輕鏈為k型。7.根據權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在抑制類風關滑膜細胞以及惡性腫瘤細胞增殖、黏附和遷延中的應用。8.根據權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在Cyr61蛋白體外檢測中應用9.根據權利要求8所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在ELISA體外檢測Cyr61蛋白中的應用。10.—種Cyr61蛋白的ELISA檢測方法，包括權利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體。全文摘要一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，由雜交瘤細胞株CGMCC3298或CGMCC3351制得，能與Cyr61蛋白N端SEQIDNo1特異結合。該抗Cyr61蛋白單克隆抗體可用于抑制細胞增殖、粘附和遷延，還可用于Cyr61蛋白的體外檢測。文檔編號A61P19/04GK101709088SQ20091019993公開日2010年5月19日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權日2009年12月4日發(fā)明者李寧麗,林錦驃,沈佰華,王利申請人:上海市免疫學研究所