專利名稱：具有特異結(jié)合性質(zhì)的β-折疊蛋白質(zhì)的設(shè)計的制作方法
具有特異結(jié)合性質(zhì)的P-折疊蛋白質(zhì)的設(shè)計 本申請是國際申請?zhí)?PCT/EP00/06698"，國際申請日2000年7月13日，中國申請?zhí)?00811969.4"，進(jìn)入中國國家階段日期2002年3月5日，發(fā)明名稱"具有特異結(jié)合性質(zhì)的e-折疊蛋白質(zhì)的設(shè)計"的分案申請。 本發(fā)明涉及具有新的或改變的特異結(jié)合性質(zhì)或者新的或改變的催化活性或者新的或改變的熒光性質(zhì)的新的P-折疊蛋白質(zhì)，并且還涉及以這樣一種方法改進(jìn)制備蛋白質(zhì)的方法。 在人和獸醫(yī)治療診斷和監(jiān)測的很多領(lǐng)域使用抗體及其衍生物。使用天然存在的抗體的一個問題是其制備。仍然在動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體，這是一個成本非常高的方法。在一些應(yīng)用中，例如，融合蛋白的制備或者要求快速血液清除率和好的組織穿透性的治療用途，天然存在的抗體分子的大小代表另一個問題(Colcher等，1998)。重組抗體分子例如scFvs (Bird等，1988)，小抗體(Pack和Pliickthun， 1992)或者雙特異性抗體(Holliger和Winter, 1993)主要只是由抗體的抗原結(jié)合區(qū)(VH和VL)組成。由于它們的長度顯著降低，它們表現(xiàn)出改善的組織穿透性，并且與完整的抗體相比它們更適合與其它蛋白質(zhì)融合。與后者相比，盡管重組抗體片段常常更不穩(wěn)定，但是由于形成二硫鍵，所以它們具有低的親合性并且難以以重組體形式制備。重組抗體片段的穩(wěn)定和改進(jìn)親和性的方法其中包括測試各種接頭多肽并且引入二硫鍵(Glockshuber等，1990，Cumber等，1992，Brinkmann， 1997)。
接頭肽的序列和長度能影響抗蛋白酶的穩(wěn)定性和抗體片段的親和性(Pantoliano等，1991)。向可變區(qū)的保守構(gòu)架區(qū)引入另外的二硫鍵能導(dǎo)致對熱(Yo皿g等，1995)和變性劑的提高的抗性并且導(dǎo)致異源表達(dá)產(chǎn)率提高。但是，一般情況下，很多scFvs表現(xiàn)出低穩(wěn)定性并且趨向于在37t:就已經(jīng)凝聚。通過使用常規(guī)的能夠?qū)胄碌牟环€(wěn)定突變的Fv-片段克隆引物也可能導(dǎo)致不穩(wěn)定性。通過輸出到壁膜間隙中主要在細(xì)菌體系中產(chǎn)生抗體片段，優(yōu)化確定的氧化還原態(tài)和同步表達(dá)折疊輔助因子在這里也是可能的。 本發(fā)明的一個目的是提供具有新的或改變的結(jié)合性質(zhì)例如抗體樣性質(zhì)，但是，同時，不表現(xiàn)出完整或重組抗體分子的上述缺點的新的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供表現(xiàn)出新的或改變的酶學(xué)性質(zhì)或催化性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個目的是形成上述蛋白質(zhì)的制備方法。 通過具有權(quán)利要求1特征的蛋白質(zhì)實現(xiàn)上述目的。制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法是權(quán)利要求21。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案見從屬權(quán)利要求和下面的說明書。
P-折疊蛋白質(zhì)的表面的改變產(chǎn)生以前蛋白質(zhì)中不存在的新的結(jié)合性質(zhì)。通過誘變P-折疊區(qū)產(chǎn)生這些結(jié)合性質(zhì)。除了從頭結(jié)合性質(zhì)外，該新的P-折疊蛋白質(zhì)就結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性來說類似于起始蛋白質(zhì)。用于設(shè)計新的結(jié)合分子的起始蛋白質(zhì)是具有優(yōu)勢P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，例如，Y-眼晶狀體蛋白，眼晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)，通過例如計算機(jī)方法，選擇暴露在表面上并且因此可接觸溶劑或可能的結(jié)合配偶體的該起始蛋白質(zhì)的e-折疊區(qū)和氨基酸。使用基因工程方法在編碼起始蛋白質(zhì)的基因中誘變這些區(qū)或氨基酸位置。因此，在DNA水平制備多種編碼不同的P-折疊蛋白質(zhì)突變體的突變基因(庫或文庫)。借助合適的篩選系統(tǒng)，例如噬菌體展示系統(tǒng)，分離具有新的期望的結(jié)合性質(zhì)的突變體。在噬菌體展示中，所有制備的蛋白質(zhì)突變體都暴露在噬菌體表面(噬菌體展示文庫)。對這些重組噬菌體研究它們與期望的靶分子的結(jié)合。通過反復(fù)篩選濃縮并分離與靶分子特異性結(jié)合的在它們的P-折疊突變體表面上暴露的噬菌體。從噬菌體獲得編碼結(jié)合P-折疊突變體的基因并且在合適的表達(dá)系統(tǒng)例如大腸桿菌中表達(dá)。使用描述的方法出人意料地可能從不具有特異性結(jié)合性質(zhì)的P _折疊蛋白質(zhì)制備特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，并且通過應(yīng)用合適的篩選方法從該文庫分離具有期望的特異性的突變體。根據(jù)起始蛋白質(zhì)的性質(zhì)，用所述系統(tǒng)產(chǎn)生的P-折疊突變體具有關(guān)于大小，穩(wěn)定性和在異源的優(yōu)選細(xì)菌系統(tǒng)中產(chǎn)生功能活性等方面與例如抗體和重組抗體片段相比有優(yōu)點。該新的P-折疊突變體的這些改進(jìn)的性質(zhì)使其可能代替例如抗體，催化抗體的重組抗體片段，并且開辟了完全新的應(yīng)用領(lǐng)域。
例如，通過設(shè)計蛋白質(zhì)能夠根據(jù)本發(fā)明解決如上所述使用抗體的問題，所述設(shè)計的蛋白質(zhì)各自具有特異結(jié)合性質(zhì)和抗低PH，變性劑和高溫度的高穩(wěn)定性，即其耐受抗體在那些條件下不穩(wěn)定的條件。但是，產(chǎn)生具有P-折疊結(jié)構(gòu)和抗體樣結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)只是本發(fā)明應(yīng)用領(lǐng)域的一種可能性。例如，通過產(chǎn)生具有新的催化性質(zhì)例如阻抗性質(zhì)和熒光性質(zhì)的P-折疊蛋白質(zhì)開放了另一種可能的應(yīng)用。熒光性質(zhì)能夠被改變的蛋白質(zhì)的一個例子是GFP。天然高度穩(wěn)定的小蛋白特別適合用于設(shè)計。根據(jù)本發(fā)明在保持其穩(wěn)定下產(chǎn)生其表面的改變，例如使蛋白質(zhì)有新的特異結(jié)合性質(zhì)。 舉例來說，根據(jù)本發(fā)明挑選的可能的一類穩(wěn)定的蛋白質(zhì)是眼晶狀體蛋白。屬于眼晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的眼晶狀體蛋白通常不經(jīng)細(xì)胞代謝，因此，也具有非常不一般的穩(wěn)定性(Mandal等，1987， Rudolph等，1990) 。 y _眼晶狀體蛋白，脊椎動物中的一類眼晶狀體蛋白，是分子量大約是22kDa的單體蛋白質(zhì)。y-眼晶狀體蛋白的主要結(jié)構(gòu)基元是反平行P-折疊(Hazes和Hol， 1992， Richardson等，1992， Hemmingsen等，1994) 。 y -眼晶狀體蛋白由兩個非常相似的球形區(qū)N-和C-末端區(qū)組成，這兩個區(qū)通過V-型接頭肽相互連接。y _眼晶狀體蛋白的折疊模式特征("greek-key"基元Slingsby， 1985，Wistow和Piatigorsky，1988)最可能是考慮熱穩(wěn)定性和抗變性劑穩(wěn)定性的原因(Mandal等，1987)。來自小牛眼的y-II-眼晶狀體蛋白是大小為21kDa蛋白質(zhì)，不尋常地具有若干(7)半胱氨酸，它們在生理條件下處于還原態(tài)。 在其正常折疊狀態(tài)下，凡是y-II-眼晶狀體蛋白都沒有結(jié)合性質(zhì)。本發(fā)明在由P-折疊結(jié)構(gòu)基元組成的該蛋白質(zhì)的選擇的溶劑暴露區(qū)進(jìn)行的改變(誘變)令人驚奇地導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)和電荷模式的變化，因此導(dǎo)致新的結(jié)合性質(zhì)的產(chǎn)生。與此相聯(lián)系，只在保持該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中作用不明顯的區(qū)或氨基酸位置進(jìn)行反應(yīng)。對小P-折疊蛋白質(zhì)的誘變(Riddle等，1997)已經(jīng)表明，高百分比的蛋白質(zhì)能正確形成天然P-折疊結(jié)構(gòu)，盡管在該序列中有相當(dāng)?shù)淖兓?對于重組抗體片段(Nissim等，1994， Kruif等，1995)，對于具有確定結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)(受體，抑制蛋白，DNA0結(jié)合蛋白)和對于肽庫(Cortese等，1995， Haaparanta和Huse 1995， McConell等，1996)已經(jīng)存在目的在于分離具有改進(jìn)的或新的結(jié)合性質(zhì)的分子的誘變特定蛋白質(zhì)區(qū)的努力。在抗體的情況下，只誘變作為環(huán)區(qū)存在的抗原結(jié)合區(qū)。在大多數(shù)其它蛋白質(zhì)例如tendamistat (McConell和Hoess， 1995)或細(xì)胞色素b562 (Ku和Schultz，1995)的情況下也是如此。這里還誘變環(huán)狀區(qū)。A-螺旋中誘變的例子是蛋白質(zhì)A的Z-區(qū)(Nord等，1997)和鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域CP-1 (Choo和Klug， 1995)。先前的誘變只是改變結(jié)合的特異性并且總是從具有已經(jīng)確定的結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)起始。從來不使用沒有結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)，也沒有使用特異改變的P-折疊結(jié)構(gòu)基元。在這里描述的方法中，第一次在沒有任何結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)的剛性e-折疊區(qū)中進(jìn)行特異性誘變。這出人意料地導(dǎo)致與抗體分子相比具有相當(dāng)穩(wěn)定性和特異結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)。 用于分離具有從頭結(jié)合性質(zhì)的誘變的P-折疊蛋白質(zhì)的合適的系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)。該系統(tǒng)使得可能非常有效地對大量所有組成成分蛋白質(zhì)變體篩選特異結(jié)合性質(zhì)(Smith, 1985)。與此相關(guān)，蛋白質(zhì)變體在各種情況下存在于絲狀噬菌體的表面上并且能夠與固相上固定的靶分子相互作用。通過洗脫噬菌體能夠獲得結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)。分離噬菌體DNA之后，可以測定特異性結(jié)合蛋白質(zhì)變體的DNA序列。除了噬菌體展示系統(tǒng)外，也可以應(yīng)用其它篩選系統(tǒng)，例如細(xì)菌表面展示(Stahl和Uhlen，1997)或者核糖體展示(Hanes等，1997)。 應(yīng)用上述本發(fā)明，令人驚奇地通過在表面上P-折疊中定向定點誘變能改變例如非常穩(wěn)定的P-折疊蛋白Y-II-眼晶狀體蛋白，這樣從非結(jié)合蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有特異結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)。將八個氨基酸位置隨機(jī)化這樣第一次導(dǎo)致蛋白質(zhì)的相對剛性區(qū)內(nèi)支架分子中的誘變。這樣從P-折疊蛋白Y-II-眼晶狀體蛋白制備就其特異結(jié)合性質(zhì)來說是"抗體樣"的蛋白物質(zhì)。Y-II-眼晶狀體蛋白或者其它小的穩(wěn)定的P-折疊蛋白一般能在所述方法中用作用于設(shè)計新的結(jié)合性質(zhì)的新的支架分子。該模型化P-折疊蛋白質(zhì)在各種應(yīng)用中能代替例如重組抗體。由于它們的大小相對較小(20kDa)，它們適合作為其它功能蛋白質(zhì)的融合配偶體(多功能蛋白質(zhì)的制備)。進(jìn)一步可能的應(yīng)用是在基因治療中，其中它們可以被用作基因治療載體細(xì)胞特異性定向和細(xì)胞內(nèi)免疫的模型。此外，可以在酶應(yīng)用領(lǐng)域使用具有催化性質(zhì)的P-折疊突變體。該新的結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性使得可能有另外的現(xiàn)在使用重組抗體不能進(jìn)行的應(yīng)用，例如對人和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)診斷和治療中和在生物傳感器和生物分離方法中。其它應(yīng)用領(lǐng)域一般是制藥和化妝業(yè)以及有害物質(zhì)的分析和去除。
下文中，描述本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案。 根據(jù)本發(fā)明，篩選用來誘變的具有P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)即沒有結(jié)合性質(zhì)也沒有催化或酶活性或熒光性質(zhì)，或者它們的活性，熒光性質(zhì)或結(jié)合性質(zhì)是期望如此改變的，特別是改進(jìn)。 具有P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是已知的。 一類具有P-折疊的蛋白質(zhì)的例子是眼晶狀體蛋白，特別是a-， P-和Y-眼晶狀體蛋白。原則上能使用來自幾乎所有類型的動物的眼晶狀體蛋白，例如來自脊椎動物，嚙齒動物，鳥類和魚。具有P-折疊結(jié)構(gòu)并且根據(jù)本發(fā)明能被誘變的蛋白質(zhì)的其它例子是內(nèi)孢囊素，熱激蛋白，冷激蛋白，P-螺旋蛋白，lipocalins， certins或轉(zhuǎn)錄因子，纖連蛋白，GFP， NGF， tendamistat或溶菌酶。例如，根據(jù)本發(fā)明誘變具有P-折疊結(jié)構(gòu)的所述蛋白質(zhì)例如眼晶狀體蛋白的各亞基或區(qū)。
眼晶狀體蛋白中，特別優(yōu)選提到的必需由Y眼晶狀體蛋白組成，其能根據(jù)本發(fā)明以舉例的方式證明那個P-折疊結(jié)構(gòu)可以被修飾，即誘變，因此形成與例如抗體分子可比的新的特異結(jié)合性質(zhì)或者新的催化活性。Y-眼晶狀體蛋白的例子是Y-II-眼晶狀體蛋白。 其中在下面文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)P-螺旋蛋白質(zhì)的例子Jenkins J.等，結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志(J. Struct. Biol.) 1998， 122(1-2) :236-46， Pickersgill， R.等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 1998,273(38) ，24600-4和Raetz C. R.等，科學(xué)(Science) 1995， 270(5238)，997-1000。 P-折疊結(jié)構(gòu)定義為基本上折疊樣的和幾乎完全平面的。與多肽鏈的連續(xù)形成的 a-螺旋相反，P-折疊可以由多肽鏈的各個區(qū)組成。這使得在一級結(jié)構(gòu)中相對較遠(yuǎn)的區(qū)有 可能位置直接相鄰。P-鏈長度一般是5-10個氨基酸并且?guī)缀跬耆瞧矫娴?。P-鏈彼此 是如此之近，以至可在各條鏈的C二O和NH基團(tuán)之間形成氫鍵，反之亦然。P-折疊可以由 多條鏈組成并且具有折疊樣結(jié)構(gòu)。C-a原子交替位于該折疊樣平面之上或之下。氨基酸側(cè) 鏈也依此模式并且因此交替向上和向下。根據(jù)P-鏈的取向，平行和反平行折疊之間是截 然不同的。根據(jù)本發(fā)明，兩者都可以誘變并且用來制備權(quán)利要求的蛋白質(zhì)。
對于P-折疊結(jié)構(gòu)的誘變，選擇那些與該平面接近的該蛋白質(zhì)中的P-折疊區(qū)。在 可獲得的X-射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上可以鑒定表面上暴露的氨基酸。如果不可獲得結(jié)晶結(jié) 構(gòu)，利用計算機(jī)分析能試圖預(yù)測平面上暴露的P-折疊區(qū)，并且在可獲得的一級結(jié)構(gòu)的基 石出上(www. embl-heidelberg. de/predictprotein/predictprotein. html)或者在3D蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬的基礎(chǔ)上(www. expasy. ch/swissmo/SWISS-MODEL. html)預(yù)測各氨基酸位置的 可能性，從而獲得關(guān)于該表面上暴露的氨基酸的可能的信息。 但是，不經(jīng)費時地預(yù)選要誘變的氨基酸位置，也可能誘變13 _折疊。編碼13 -折疊 結(jié)構(gòu)的那些DNA區(qū)被從它們的DNA環(huán)境分離出來，對之進(jìn)行隨機(jī)誘變并且接著重新整合到 先前從中取出它們的編碼該蛋白質(zhì)的DNA中。這之后是篩選具有期望的結(jié)合性質(zhì)和/或催 化性質(zhì)和/或熒光性質(zhì)的突變體的方法。 在本發(fā)明的另一個實施方案中，正如上文已經(jīng)描述的，選擇接近表面的P-折疊 區(qū)，并且在這些選擇的區(qū)內(nèi)鑒定要誘變的氨基酸位置。然后在DNA水平上誘變用這種方法 選擇的這些氨基酸位置，或者通過定向，即編碼不同的預(yù)先選擇的特定氨基酸的密碼子置 換編碼特定氨基酸的密碼子，或者該變化在要改變的氨基酸位置被確定的隨機(jī)誘變的構(gòu)架 中進(jìn)行，而不是編碼該新的迄今為止沒有確定的氨基酸的密碼子。 該表面上暴露的氨基酸可接觸周圍的溶劑。如果蛋白質(zhì)中這種氨基酸可接觸性與
模型三肽Gly-X-Gly中氨基酸的可接觸性相比超過8 % ，這些氨基酸就稱為該表面上暴露
的氨基酸。這些蛋白質(zhì)區(qū)或各氨基酸位置也是優(yōu)選的要根據(jù)本發(fā)明篩選的可能的結(jié)合配偶
體的結(jié)合位點。所述結(jié)合配偶體可以是，例如，抗原或底物或底物過渡態(tài)類似物。 根據(jù)本發(fā)明，基本上能誘變所有的位于表面上展示P-折疊結(jié)構(gòu)并且可接觸溶劑
或結(jié)合配偶體的蛋白質(zhì)。結(jié)論是，合適的蛋白質(zhì)主要是特別穩(wěn)定的即例如有抗變性性或者
足夠"小"的那些。 根據(jù)本發(fā)明，"誘變"指改變具有13 -折疊結(jié)構(gòu)的多肽鏈中表面上暴露的一個或多 個氨基酸的改變。這包括，例如用具有不同性質(zhì)的氨基酸置換就其極性，電荷，溶解性，疏 水性或親水性來說具有特殊性質(zhì)的氨基酸的取代作用，例如極性氨基酸取代非極性疏水氨 基酸，帶正電荷氨基酸取代帶負(fù)電荷氨基酸等等。術(shù)語"誘變"也包括一個或多個氨基酸的 插入和缺失。條件是，所述突變體包括表面上暴露的至少一個P-折疊的表面上暴露的至 少兩個P-鏈中的表面上暴露的氨基酸。在該P-折疊中或者在該P-折疊的選擇的區(qū)中 的各氨基酸位置處優(yōu)選并且特異性導(dǎo)入突變。誘變作用可以發(fā)生在該P-折疊結(jié)構(gòu)的一個 區(qū)或多個區(qū)。改變可以包括相鄰氨基酸或相對遠(yuǎn)離P-折疊的氨基酸。改變還可以包括多種P-折疊即多于兩種的e-折疊中的氨基酸。表面上暴露的至少一個P-折疊的表面 上暴露的至少兩個e-鏈中有一個或多個氨基酸的插入，缺失或取代。與此相關(guān)，在該表面 上暴露的一條P _鏈中的一個或多個氨基酸有可能被取代，缺失或插入，即如果該表面上 暴露的至少兩條P-鏈被誘變，則在該表面上暴露的一條P-鏈能有多個突變體。在另一 個實施方案中，各種情況下誘變了該表面上暴露的至少兩個P-折疊的表面上暴露的一條 P _鏈，即各種情況下該表面上暴露的一條P _折疊至少具有一條在該表面上暴露的誘變 的P-鏈。在本發(fā)明另一個實施方案中，該表面上暴露的誘變的P-折疊被安排成彼此反 平行，并且優(yōu)選至少兩個反平行排列的P-折疊。 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選，例如，誘變該表面上暴露的兩條或三條13 -鏈。根據(jù)本發(fā)明，誘 變該表面上暴露的四條或多條P-鏈也是可能的。此外，能誘變至少兩個P-折疊中至少 兩條P-鏈，優(yōu)選誘變兩個反平行折疊中的三條P-鏈。 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過裝配具有氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸進(jìn) 行誘變。當(dāng)然也可以使用其它密碼子(三聯(lián)體)。 進(jìn)行誘變使得保持P-折疊結(jié)構(gòu)。 一般情況下，誘變發(fā)生在該蛋白質(zhì)表面上暴露 的穩(wěn)定P-折疊區(qū)之外。包括定點和隨機(jī)誘變兩者。利用購自Stratagene(QuickChange) 或Bio-Rad (Muta-Gene噬菌粒體外誘變試劑盒)的試劑盒能夠進(jìn)行包括一級結(jié)構(gòu)中相對小 的區(qū)(大約3-5個氨基酸)的定點誘變(參見US-A-5， 789， 166 ;US_A_4， 873， 192)。
如果對較大的區(qū)進(jìn)行定點誘變，則一定要制備DNA盒，通過裝配包含突變的和沒 有改變的位置的寡核苷酸獲得要誘變的區(qū)(Nord等，1997 ;McConell和Hoess， 1995)。通過 在增變株中增殖所述DNA或者通過PCR擴(kuò)增(易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))(例如Pannekoek等， 1993)能夠?qū)腚S機(jī)誘變。在這種情況下，使用具有提高的易錯率的聚合酶。為了提高導(dǎo)入 的誘變的程度或者組合不同的突變，能夠利用DNA改組(Stemmer， 1994)組合PCR片段中的 突變。Kuchner和Arnold (1997)的綜述提供了對于酶的這些誘變策略的綜述。為了在選擇 的區(qū)進(jìn)行所述所述隨機(jī)誘變，這里也構(gòu)建了用于誘變的DNA盒。 在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)在該誘變步驟中獲得的DNA分子。優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是有
利于接著的具有期望的結(jié)合性質(zhì)和/或期望的催化或酶活性的突變體的篩選和分離的那
些表達(dá)系統(tǒng)。這樣的表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)是技術(shù)人員公知的，并且上文已經(jīng)更詳細(xì)地描述
過。當(dāng)然，也可以使用對突變體篩選具有特異性質(zhì)或活性的其它表達(dá)系統(tǒng)。 優(yōu)選使用這樣的表達(dá)和篩選系統(tǒng)，其中DNA水平產(chǎn)生的所有的突變體被克隆到噬
菌粒中并且在噬菌體表面表達(dá)。在包含還原的半胱氨酸蛋白質(zhì)的情況下，在本發(fā)明特別優(yōu)
選的實施方案中，為了改善突變體的暴露性和篩選性，有可能加入GSH。 本發(fā)明包括誘變的蛋白質(zhì)，編碼具有誘變的P-折疊結(jié)構(gòu)并且能以新的或改變的
方式結(jié)合期望的結(jié)合配偶體或者能具有對于底物的新的或改變的催化活性或新的或改變
的熒光性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA分子，其衍生的RNA分子及其功能部分。術(shù)語"功能部分"涉及
具有P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的亞基，區(qū)和表位，其已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行了誘變并且具有期
望的結(jié)合性質(zhì)和活性或者為此是部分原因。 以本身已知的方法篩選和分離具有期望的結(jié)合性質(zhì)和/或期望的催化活性和/或 熒光性質(zhì)的突變體。具有新的或改變的結(jié)合性質(zhì)和新的或改變的催化活性的突變體的篩選 方法和分離方法的例子如下所述
當(dāng)篩選期望的結(jié)合性質(zhì)時，使誘變的蛋白質(zhì)或者其功能部分與它們的結(jié)合配偶體 接觸。合適的檢測方法篩選具有期望的結(jié)合性質(zhì)的突變體。 當(dāng)篩選催化活性時，使誘變的蛋白質(zhì)或者其功能部分與底物連接，然后通過合適
的檢測方法篩選期望的酶活性。 用幾種方法能篩選催化活性 1.噬菌體展示 過渡態(tài)類似物與固相偶聯(lián)并且對所述類似物篩選突變體庫。這些物質(zhì)是底物過渡 態(tài)的類似物，其一般在底物向產(chǎn)物的酶促轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生(底物-過渡態(tài)產(chǎn)物)。但是，為 此，該底物的過渡態(tài)必須是已知的。也可以對底物結(jié)合進(jìn)行篩選。
2.無噬菌體展示 將突變體克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中并且平板接種該重組細(xì)菌以形成各菌落。通過向 營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物(例如IPTG)能夠在細(xì)菌中表達(dá)突變蛋白。該營養(yǎng)培養(yǎng)基還必須 含有其轉(zhuǎn)化要被篩選的底物。該底物在轉(zhuǎn)化過程中必須形成一個可鑒定的例如有色的產(chǎn) 物。在營養(yǎng)培養(yǎng)基中表達(dá)轉(zhuǎn)化底物的突變體的那些細(xì)菌需要不同的顏色。 一個例子是篩選 P _半乳糖苷酶活性和X-Gal的轉(zhuǎn)化(藍(lán)色染色)(Zhang等，1997)。
3.技術(shù)人員知道的其它檢測方法 除了形成顏色的變體，也能篩選，例如，介導(dǎo)新的抗性(向營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入抗生 素)或者使得在"正常"細(xì)菌在其上不生長的基本營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長成為可能的蛋白質(zhì)突 變體。這里能利用包含新的蛋白質(zhì)突變體的選擇性生長的優(yōu)點(Crameri等，1997)。
4.突變蛋白的表達(dá)和分泌 例如在細(xì)菌中，獲得上清液，并且測定要篩選的期望的酶活性(You和Arnold, 1996)。因此本發(fā)明解決了通過誘變在其結(jié)構(gòu)基序中具有P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有 新的結(jié)合性質(zhì)或新的催化性質(zhì)的蛋白質(zhì)的問題。篩選這些蛋白質(zhì)使其具有期望的新的或改 變的優(yōu)選改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)或者期望的新的或改變的優(yōu)選改進(jìn)的酶活性或催化活性。本發(fā)明 的系統(tǒng)甚至可能在P-折疊誘變之后改變不具有結(jié)合性質(zhì)或者不具有酶學(xué)性質(zhì)的P-折疊 蛋白，使其獲得結(jié)合性質(zhì)或催化性質(zhì)。 根據(jù)本發(fā)明，"結(jié)合性質(zhì)"指，例如，抗原對抗體的特異親和性。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行誘 變之后，該e-折疊蛋白具有抗體樣性質(zhì)，并且集和了抗體的高結(jié)合特異性的優(yōu)點和P-折 疊蛋白穩(wěn)定性質(zhì)的優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明制備的具有抗體樣性質(zhì)的P-折疊蛋白也具有催化功 能。 但是，根據(jù)本發(fā)明的解決方案也使得可能產(chǎn)生具有新的或改變的催化活性的具有 P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。其它蛋白質(zhì)的性質(zhì)例如GFP的熒光性質(zhì)的改變也是可能的。
根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合性質(zhì)、催化活性或熒光性質(zhì)的改變指所述性質(zhì)的退化或改進(jìn)，優(yōu) 選改進(jìn)。 根據(jù)本發(fā)明，"具有新的特異性質(zhì)的蛋白質(zhì)"或者"具有新的催化活性的蛋白質(zhì)"指 先前不具有任何特異結(jié)合性質(zhì)或催化活性，而現(xiàn)在由于該表面上暴露的至少一個P-折疊 的表面上暴露的至少兩條13 _鏈中表面上暴露的氨基酸的特異誘變而具有特異結(jié)合性質(zhì) 或催化活性或者兩者的組合。但是，也包括在誘變之前已經(jīng)具有特異結(jié)合性質(zhì)或催化活性， 并且在e-折疊中誘變之后具有另一種特異結(jié)合性質(zhì)和/或催化活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)然，具有特異結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在具有催化活性也是可能的，反之亦然。 本發(fā)明進(jìn)一步包括在誘變之前已經(jīng)具有特異結(jié)合性質(zhì)和/或酶促或催化活性和/ 或熒光性質(zhì)，并且在該表面上暴露的一個或多個P-折疊的表面上暴露的至少兩條P-鏈 中表面上暴露的氨基酸的誘變之后，獲得改進(jìn)的、或者更一般的術(shù)語，它們的特異結(jié)合性質(zhì) 和/或它們的催化活性和/或它們的熒光性質(zhì)的改變的蛋白質(zhì)。 在這方面，本發(fā)明的方法和通過該方法制備的蛋白質(zhì)不同于現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)和 方法，其中通過隨機(jī)誘變改變P-折疊結(jié)構(gòu)，所述隨機(jī)誘變不指向P-折疊結(jié)構(gòu)而是指向整 個蛋白質(zhì)，并且其特別不指向在該表面上暴露的至少一個13 -折疊的表面上暴露的至少兩 條P _鏈中表面上暴露的氨基酸或者其涉及該表面上暴露的這樣的氨基酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，下面將舉例描述，作為具有P-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì) 的例子，Y-眼晶狀體蛋白，被選作誘變的起始點。向該末端，通過結(jié)構(gòu)研究選擇表面上暴 露的第一個氨基酸的位置，并且通過本身已知的誘變方法誘變。獲得的突變體在合適的也 是已知的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。這項篩選朝著表現(xiàn)出其Y-眼晶狀體蛋白的P-折疊中表面上 暴露的氨基酸對抗原BSA-雌二醇17-半琥珀酸酯的特異結(jié)合的那些突變體。盡管分離出 多種具有期望的結(jié)合性質(zhì)的突變體，但是只有一個攜帶預(yù)期的氨基酸改變。因此，獲得抗體 樣非免疫球蛋白分子，其以起始蛋白Y-眼晶狀體蛋白為基礎(chǔ)。 本發(fā)明的方法使得有可能制備大量的突變體。僅八個氨基酸位置的誘變就可能形
成2. 6X l(T種不同的蛋白質(zhì)物質(zhì)，對它們可以分析期望的結(jié)合性質(zhì)和催化活性。 根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步證明通過該表面上暴露的氨基酸的誘變能改變具有|3-折疊
結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的熒光性質(zhì)。 獲得的突變基因能夠在合適的系統(tǒng)中增殖并且能表達(dá)該蛋白質(zhì)。合適的表達(dá)系統(tǒng) 是原核生物系統(tǒng)或真核生物系統(tǒng)。將編碼突變蛋白的DNA轉(zhuǎn)移到，例如合適的載體中，例如 表達(dá)載體中，并且通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。當(dāng)然，與特異性控制異源突變DNA 表達(dá)的調(diào)控序列連接是有利的。 可以使用的宿主細(xì)胞是高級真核生物的宿主細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞，或者低級
真核生物的宿主細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，或者原核生物細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。可能的細(xì)菌宿主
細(xì)胞的例子是大腸桿菌或枯草芽胞桿菌。通過使用從本發(fā)明的DNA衍生的RNA制備蛋白質(zhì)
的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也是可能的。合適的克隆和表達(dá)系統(tǒng)描述于分子生物學(xué)，生物技術(shù)和基
因技術(shù)的各種教科書中。例子包括Sambrook等，1989和Ausubel等，1994。 下面以例示的實施方案和附圖為基礎(chǔ)更詳細(xì)地說明上面一般術(shù)語描述的本發(fā)明。
該實施例要理解為是本發(fā)明的一種可能形式，并且本發(fā)明不局限于該特定的實施方案。


fil :用于裝配Y-眼晶狀體蛋白突變體的寡核苷酸。 Ml :在鏈霉抗生物素負(fù)載的磁珠(MB)上裝配寡核苷酸和接著PCR的示意圖。X 標(biāo)記的位置指示隨機(jī)氨基酸位置。 Ml: Y-II-眼晶狀體蛋白的非誘變區(qū)擴(kuò)增的示意圖。 MA^用于擴(kuò)增的非誘變區(qū)的寡核苷酸。 圖5 :pCANTAB 5E_ Y眼晶狀體蛋白表達(dá)盒的示意圖。g3-SS :噬菌體蛋白質(zhì)G3的信號肽序列G3 ;E-tag :用于免疫檢測的11個氨基酸；fd Gen 3 :絲狀噬菌體M13的小 包被蛋白3。 M^三次淘選之后使用濃縮噬菌體的多克隆噬菌體ELISA。用BSA-P -雌二醇 17-半琥珀酸酯偶聯(lián)物包被微量滴定板或者只用BSA包被作為對照。接下來給出的另一個 是Y-II-眼晶狀體蛋白野生型噬菌體(GC-WT)與特定抗原的結(jié)合，來自起始文庫的噬菌體 (GCUC-1)與特定抗原的結(jié)合和通過反復(fù)淘選濃縮的噬菌體(E-17噬菌體)與特定抗原的結(jié) 合。 M1:分別是噬菌粒PGCKT 8-3中BSA-P-雌二醇17-半琥珀酸酯-結(jié)合Y-II-眼 晶狀體蛋白突變體12A(Mu 12A)的部分DNA序列和pCANTAB 5E中Y-II-眼晶狀體蛋白 野生型(WT)的部分DNA序列。用斜體和下劃線指示導(dǎo)入的切割位點Sfil(5')和Bst EII(3')。隨機(jī)化氨基酸位置的密碼子用黑體表示。 1§ :在噬菌粒中表達(dá)并且去除信號肽之后BSA-P -雌二醇17-半琥珀酸酯_結(jié) 合Y-II-眼晶狀體蛋白突變體12A(Mu 12A)的衍生的氨基酸序列和Y-II-眼晶狀體蛋白 野生型(WT)的衍生的氨基酸序列。隨機(jī)化氨基酸位置用黑體表示。用黑體和下劃線指示 實際上已經(jīng)改變的氨基酸。通過Sfi I切割位點在N-末端另外導(dǎo)入氨基酸，并且用斜體和
下劃線給出c-末端融合體。 Ml:用于將Mu 12A和Y-II-眼晶狀體蛋白克隆到載體pET-20b中的引物的序 列。 圖10 :在pET-20b中表達(dá)之后BSA-P -雌二醇-17-半琥珀酸酯_結(jié)合Y -II-眼 晶狀體蛋白突變體12A的衍生的蛋白質(zhì)序列和Y-II-眼晶狀體蛋白的衍生的蛋白質(zhì)序列。 隨機(jī)化氨基酸位置用黑體表示。用黑體和下劃線指示實際上已經(jīng)改變的氨基酸。通過克隆 另外導(dǎo)入C-末端氨基酸，包括用斜體和下劃線給出的6組氨酸。 SI!:分析突變體12A與BSA- P -雌二醇17-半琥珀酸酯偶聯(lián)物的濃度_依賴性 結(jié)合。突變體(12A)與偶聯(lián)物(BSA-Estr. 17)的結(jié)合和Y-II-眼晶狀體蛋白(WT)與偶聯(lián) 物的結(jié)合，以及作為對照，與BSA的結(jié)合 Mil :突變體12A抗變性劑胍的穩(wěn)定性。該圖表示純化的突變體12A和Y -II-眼 晶狀體蛋白蛋白與各種濃度的胍溫育不同時間之后的最大發(fā)射。 圖13 :50mM磷酸鈉，pH 6. 5中野生型Y_II-眼晶狀體蛋白和突變體12A的熒光 發(fā)射光譜。在激發(fā)波長280nm下測定熒光信號(圖13A)。蛋白質(zhì)濃度是100 y g/ml，圖13B 給出用于熒光測定的蛋白質(zhì)樣品的吸收光譜。用l厘米通徑長度測定吸收度。
實施例 制備與雌二醇激素特異性結(jié)合的Y _眼晶狀體蛋白突變體 在分離特異性結(jié)合雌二醇激素的牛Y-B-眼晶狀體蛋白(Y-II)的基礎(chǔ)上給出了 具有抗原-結(jié)合性質(zhì)的新的P-折疊蛋白的設(shè)計。該表面上暴露的e-折疊的選擇的氨基 酸位置的特異改變產(chǎn)生了具有e-折疊結(jié)構(gòu)和特異結(jié)合性質(zhì)的新的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。選擇了適 合誘變的氨基酸P-折疊區(qū)之后，在DNA水平進(jìn)行定點誘變，并且在噬菌粒中制備|3-折 疊突變體文庫，其使得在噬菌體展示系統(tǒng)中表達(dá)和接著篩選突變體的新的結(jié)合性質(zhì)成為可 能。關(guān)于其新的性質(zhì)方面，將分離的突變體與起始蛋白Y-II-眼晶狀體蛋白相比較。
選擇合適的區(qū)用于Y-眼晶狀體蛋白中的誘變 以Y-II-眼晶狀體蛋白的X-射線結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)(Wistow等，1983)，選擇Y-II-眼 晶狀體蛋白的N-末端區(qū)(Acc.M16894)進(jìn)行誘變。在那里鑒定了形成表面片段的總共8個 氨基酸。該選擇的氨基酸是e-折疊的一部分并且基本上對保存該結(jié)構(gòu)沒有貢獻(xiàn)。它們是 可接觸溶劑并因此也可接觸可能的結(jié)合配偶體的氨基酸位置。這8個氨基酸Lys 2，Thr 4， Tyr 6， Cys 15， Glu 17， Ser 19， Arg 36和Asp 38包括該蛋白質(zhì)總表面面積的大約6. 1% 的面積。 制備誘變的Y-II-眼晶狀體蛋白基因的庫 通過定點誘變將這8個氨基酸的位置隨機(jī)化。這使可能產(chǎn)生2.6X10"種不同的 蛋白質(zhì)物質(zhì)。通過裝配各寡核苷酸在DNA水平獲得要誘變的區(qū)。接著克隆到構(gòu)建用于在噬 菌體展示系統(tǒng)中篩選的噬菌粒中。
寡核苷酸裝配 對于誘變，在固相上裝配具有8個隨機(jī)的氨基酸位置還有合適的限制性酶切位點 的包含Y-眼晶狀體蛋白突變體的5'區(qū)的227bp?？偣矠榇耸褂昧?IO個單獨的寡核苷酸， 其中三個包含隨機(jī)的氨基酸位置(圖1)。在引物合成中，在要誘變的8個位置處使用核苷酸 混合物NN(T/G)，理論上在每個位置得到32種不同的密碼子(參見Nord等，1997)。在裝配 開始時，使生物素化寡核苷酸接觸購自Dynal(M-280)的鏈霉抗生物素負(fù)載的磁珠(MBs)。 幾次接觸、連接和聚合步驟之后，通過PCR有可能擴(kuò)增在固相上裝配的Y-眼晶狀體蛋白的 誘變區(qū)的庫。長度大約250bp的PCR產(chǎn)物包含Sf i I切割位點5'和Bst EII切割位點3'。
將用于裝配的所有的寡核苷酸調(diào)節(jié)至100pmol/iU的濃度。首先，裝配引物 GCLIElB和GCLIE2P。為此，每次向4iil引物加入36iil洗滌和緩沖液(WB緩沖液:1M NaCl， 10mM Tris-HCl pH 7. 5， lmM EDTA)，并且將該混合物在70。C下溫育5分鐘。裝配兩個引 物之后進(jìn)一步在7(TC下溫育5分鐘，將該引物混合物緩慢冷卻到室溫。4iU的GCLIE1B/ GCLIE2P引物雜合物與56 iU的WB緩沖液混合，并且加載到事先用洗滌和結(jié)合緩沖液洗滌 過的300 ii g鏈霉抗生物素負(fù)載的磁珠(MB)上。在室溫下溫育15分鐘之后用WB緩沖液 和TE緩沖液(10mM Tris-HCl pH 7. 5， lmM EDTA)洗滌MB。將一引物接頭片段加給偶聯(lián)了 第一引物雜合物的MB，該片段如下制備4iU引物GCLIB4P或GCLI5P與36iU購自GIBCO 服L的IX連接緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7. 6， 10mM MgCl2， lmM ATP， lmM DTT，5% (w/v) 聚乙二醇-8000)混合。在70°溫育5分鐘之后，合并兩種混合物，在7(TC又溫育5分鐘并 且冷卻到室溫。加入12單位的T4DNA連接酶(GIBCO BRL)禾P 8 yl of IX連接緩沖液之 后，該反應(yīng)混合物在室溫下溫育1小時。12 ii 1的該GCLIE3P/GCLIB4P/GCLI5P橋接片段與 54iU的IX連接酶緩沖液和6單位的連接酶混合，并且將該混合物加給含有第一引物雜 合物的洗滌過的MB并且在室溫下溫育1小時。連接反應(yīng)之后，用TE緩沖液洗滌MB兩次， 并且溶解于64 ii 1的含有8微升連接酶的1 X連接緩沖液中。然后向MB加入8 iU的裝配 的引物混合物GCLI6P/GCLIB7P，其引物事先已經(jīng)類似于GCLIB4P/GCLI5P進(jìn)行了裝配。將 該連接反應(yīng)在室溫下又進(jìn)行1小時。在TE緩沖液中洗滌MBs兩次之后，加入12 iU 二次 橋接片段GCLIB8P/GCLIE9P/GCLIE10，并且該混合物被連接1小時。類似于第一橋接片段 制備第二橋接片段，首先裝配GCLIE9P和GCLIEIO，然后在第二步驟中與GCLI8P連接。然 后再次用TE緩沖液洗滌帶有固定化引物的MB。接著DNA-聚合酶和連接酶填補(bǔ)第二條鏈中的缺口。該MB在37。C下在下面的緩沖混合物中溫育30分鐘52. 5iU的1120，6111購 自Boehringer的緩沖液L(100mM Tris-HCl pH 7. 5， 100mM MgCl2， 10mM 二硫赤蘚糖醇)， 0. 5 ii 1的dNTPs (25mM各dNTP)禾P 1 ii 1 (2單位)的Klenow片段(Boehringer)。用TE緩 沖液洗滌MB兩次，接著在室溫下進(jìn)行連接反應(yīng)1小時。100 ii 1混合物含有10單位的連接 酶。用TE緩沖液洗滌兩次步驟之后，通過用40 ill of 0. l麗aOH處理30秒去除與MB非 共價鍵結(jié)合的DNA鏈，并且將MB重新懸浮于60 的TE中。使用MB作為模板進(jìn)行擴(kuò)增 該文庫的PCR。如下制備PCR反應(yīng)混合物(50iU) :6iU的MB，5iU購自Stratagene的 10XPCR反應(yīng)緩沖液(lOOmM KCl， 100mM(NH4)2S04， 200mM Tris-HCl pH 8.75，20mM MgS04， 1 % TritonX-lOO， lmg/ml BSA) ， 1 ii 1 (2， 5單位)的Pfu DNA聚合酶(Stratagene) ， 0. 5 ii 1 的dNTPs (25mM的各dNTP) ， 0. 35 ii 1的GCLIEIB， 0. 35 ii 1的GCLIA11B和36. 8 ii 1的H20。將 PCR進(jìn)行下面35次循環(huán)使用引物在55t:退火1分鐘，聚合酶反應(yīng)在72t:進(jìn)行1. 5分鐘， 95t:下變性1分鐘，最后聚合酶反應(yīng)在72t:進(jìn)行5分鐘。
噬菌粒pGCKT 8-3的制備 從噬菌粒pCANTAB 5E (購自Pharmacia Biotech的PRAS試劑盒)起始，這樣構(gòu)建 用于克隆y-II-眼晶狀體蛋白突變體帶的噬菌粒衍生物。利用PCR使用質(zhì)粒pGII(Mayr 等，1994)作為模板和使用引物GCF0RN0T和GCBACKSf iBst (圖 3， 4)擴(kuò)增y -II-眼晶狀體 蛋白(C-末端結(jié)構(gòu)域)的整個3'和沒有誘變的5'區(qū)。 通過引物導(dǎo)入Sfi I (GCBACKSf iBst)和Not I (GCF0RN0T)切割位點使得將該PCR 產(chǎn)物插入噬菌粒(GCF0RN0T) pCANTAB 5E成為可能。和GCBACKSf iBst引物一起，Bst EII切 割位點另外整合到y(tǒng)-眼晶狀體蛋白基因中，這使得克隆誘變的y-眼晶狀體蛋白DNA片 段。從頭導(dǎo)入切割位點不改變y-II-眼晶狀體蛋白中的氨基酸序列。測序之后，將PCR產(chǎn) 物克隆為進(jìn)入用pCANTAB 5E切割的噬菌粒Sfi I/Not I中的Sfi I/Not I片段。用這種 方法構(gòu)建的噬菌粒pGCKT8-3是用于制備y-II-眼晶狀體蛋白噬菌體展示文庫的起始點。
y-II-眼晶狀體蛋白突變體文庫的制備和野生型y-II-眼晶狀體蛋白的克隆
用Bst EII和Sf i I限制酶切割噬菌粒pGCKT 8-3，并且進(jìn)行磷酸酶處理(購自 USB的shrimps磷酸酶)。各自切割之后，通過凝膠電泳將DNA分級分離，切下切割的載體級 分并且利用電洗脫從瓊脂糖分離。通過苯酚/氯仿萃取和用糖原沉淀DNA進(jìn)行任何進(jìn)一步 的酶處理。用Sfi I和Bst EII限制酶切割利用PCR擴(kuò)增的并且包含y-II-眼晶狀體蛋 白的突變區(qū)的DNA片段集合。總共使用440ng噬菌粒和llOmg的PCR產(chǎn)物用來使PCR產(chǎn)物 與制備的pGCKT 8-3噬菌粒連接。用總共44單位的T4DNA連接酶(GIBC0BRL)在20微升 混合物中在16t:下進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。7(TC下使連接酶滅活20分鐘之后，通過點滴透析1 小時將連接反應(yīng)脫鹽。在各種情況下，用各15微升透析過的連接液轉(zhuǎn)化30微升電感受態(tài)大 腸桿菌TG l細(xì)胞。根據(jù)PRAS-試劑盒手冊的描述制備和轉(zhuǎn)化電感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞制 備成含有葡萄糖_和氨芐青霉素_ (100 y g/ml)的S0BAG板(參見購自Pharmacia-Biotech 的PRAS-試劑盒手冊)，并且在3(TC培養(yǎng)過夜。制備包括250000個原始克隆的GCUC-1庫。 用含有1%葡萄糖和20X甘油的2XYT培養(yǎng)基(參見PRAS-試劑盒手冊)洗滌這些克隆， 分成等份并且在-8(TC下貯存。測定該庫的擴(kuò)增系數(shù)達(dá)到7X106。 GCUC-1庫中重組克隆的 比例是97%。對隨機(jī)選擇的克隆的測序表明使用的密碼子就是隨機(jī)化氨基酸位置處的期望 的突變體。利用Western-印跡分析測得該庫中表達(dá)率是30-60%。
在對照實驗中，使用下面的引物擴(kuò)增y-II-眼晶狀體蛋白DNA :GCF0RN0T(5'GAGT CATTCTGCGGCCGCATAAAAATCCATCACCCGTCTTAAAGAACC 3，)和GCBACKSFI (5，CATGCCATGACTCGC GGCCCAGCCGGCCATGGGGAAGATCACTTTTTACGAGGAC 3')，使用質(zhì)粒pGII (Mayr等，1994)作為模 板。用Not I和Sfi I限制性內(nèi)切酶切割之后，將測過序的PCR產(chǎn)物克隆到同樣用pCANTAB 5E切割過的Sfi I/Not I噬菌粒中。
噬菌體展示設(shè)計和對新的結(jié)合性質(zhì)的篩選 使用購自Pharmacia-Biotech的商售噬菌體展示系統(tǒng)PRAS來對y -II-眼晶狀 體蛋白篩選結(jié)合性質(zhì)。在使用的pCANTAB 5E(野生型y-II-眼晶狀體蛋白)和pGCKT 8-3(y-眼晶狀體蛋白突變體)噬菌粒中，y-眼晶狀體蛋白N-末端融合G3信號肽并且 C-末端融合E-tag，這使得對該蛋白質(zhì)的免疫檢測成為可能(圖5)。根據(jù)使用的細(xì)菌株， E-tag之后的琥珀(amber)中止密碼子也被識別(大腸桿菌HB 2151)，切割信號肽之后是 大腸桿菌細(xì)胞的分泌或超閱讀。加入輔助噬菌體之后，能形成重組噬菌體，其在它們的表面 上暴露y-II-眼晶狀體蛋白突變體。 對GCUC-1和y -II-眼晶狀體蛋白野生型噬菌體進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化
在PRAS手冊描述的培養(yǎng)條件下，利用Westerb-印跡分析不可能檢測任何重組噬 菌體期望的融合蛋白(y-II-眼晶狀體蛋白/蛋白質(zhì)3)。只有在噬菌體形成期間加入還 原的谷胱甘肽(GSG)會改變細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)中的氧化還原態(tài)，并且因此提供更有利的噬菌 體裝配條件。當(dāng)使用y-II-眼晶狀體蛋白克隆時，只加入GSH能檢測攜帶融合蛋白的重組 噬菌體。提高GSH濃度也提高y-II-眼晶狀體蛋白噬菌體的比例。測得最佳GSH濃度是 8mM。不存在GSH下，噬菌體表面上y _眼晶狀體蛋白表達(dá)不好的一個原因可能是y-目艮晶 狀體蛋白中高的還原的半胱氨酸(7)的濃度。當(dāng)部分未折疊的y-眼晶狀體蛋白進(jìn)入周質(zhì) 時，在那里占優(yōu)勢的氧化條件下，可能會由于形成二硫橋而錯折疊并形成凝集物。這可能抑 制噬菌體裝配。當(dāng)在噬菌體展示系統(tǒng)中使用帶有還原的半胱氨酸的蛋白質(zhì)時，一般通過加 入GSH可能會增加重組噬菌體的形成。
使用GCUC1噬菌體展示庫的篩選方法 為了篩選GCUC-1庫，在22(TC下將使用的所有的玻璃裝置滅菌4小時并且用 Helipur將塑料材料滅菌1小時。使用BSA-P -雌二醇17-半琥珀酸酯(Sigma)作為抗原 并且微量滴定板(Maxisorp，購自NUNC)作為固相，進(jìn)行GCUC-1庫淘選。在3輪淘選中，洗 滌步驟的嚴(yán)格性增加。對于第一次培養(yǎng)，用50iU的GCUC-1庫接種含有2X葡萄糖和氨芐 青霉素(100ii g/ml)的100ml的2XYT培養(yǎng)基。細(xì)菌在37。C和300rpm下生長至0D6。。為 0. 4。向10毫升該細(xì)菌培養(yǎng)物加入800ii 1 M13K07輔助噬菌體(1 X 10"pfu/ml，GIBC0BRL)。 之后，在37t:培養(yǎng)30分鐘，沒有或者有進(jìn)一步的30分鐘的輕微攪動(50rpm)。通過室溫下 和1500rpm(Sorva11 SS 34 Rotor)離心20分鐘獲得細(xì)菌沉積物，并且溶于含有8mM GSH， 100ii g/ml氨節(jié)青霉素和50ii g/ml卡那霉素的100ml的2XYT培養(yǎng)基中。通過在3(TC和 300rpm下培養(yǎng)過夜產(chǎn)生重組噬菌體。通過兩次10800g離心，每次15分鐘，并且接著過濾 (孔徑0. 45 ii m)，獲得含有重組噬菌體的上清液。通過向該上清液加入1/5的PEG/NaCl溶 液(20% PEG-8000，2. 5M NaCl)，在冰上孵育1小時，并且在4。C和3300g兩次離心，每次30 分鐘，來濃縮噬菌體。將獲得的噬菌體沉積物懸浮于4ml的PBS pH 7.2中，并且通過離心 (10分鐘，11600g，室溫)去除殘留的細(xì)胞成分。對于篩選過程(淘選)，將lml濃縮的噬菌體與1ml的6%強(qiáng)度BSA溶液(6% BSA于PBS中，pH 7. 2)混合并且在室溫下溫育10分 鐘。在各種情況下，向如下制備的包被抗原的微量滴定板孔加入用該方法處理的100 噬 菌體。用抗原BSA-13 -雌二醇17-半琥珀酸酯包被NUNC-Maxisorp微量滴定板。各種情況 下向10個孔共加入100 ii 1抗原溶液(100 ii g/ml于PBS pH 7. 6)。室溫下包被過夜的孔 用PBS，pH 7. 6洗滌三次。通過在室溫下用3%強(qiáng)度BSA/PBS溶液，pH 7. 2裝入孔中2小時 將自由的結(jié)合位點飽和。加入BSA-處理過的噬菌體之前，用PBS溶液(pH 7. 2)洗滌孔兩 次。通過輕輕攪動(20rpm)微量滴定板30分鐘，接著不搖動下在室溫下孵育90分鐘進(jìn)行 淘選。通過用PBS， pH 7. 2/0. 1% Tween-20洗滌10次并且用PBS， pH 7. 2洗滌10次來去 除非特異性結(jié)合的噬菌體。通過每次每孔加入100 iU的IOO慮三乙胺(新鮮制備)并且 在室溫下溫育10分鐘來洗脫結(jié)合的噬菌體。通過加入500 iil的1M Tris-HCl pH 7. 4中 和堿洗脫的噬菌體(lml)。用750 iU這樣的噬菌體感染在基本培養(yǎng)基板上培養(yǎng)的并且具有 0. 4-0. 50D6。。的9ml TG-l細(xì)胞。為此，37"下細(xì)菌與噬菌體培養(yǎng)30分鐘。通過三乙胺處理 通過TG-1細(xì)胞的定向感染，有可能獲得與微量滴定板特定地緊密結(jié)合并且沒有從微量滴 定板去除的噬菌體。為此，向孔中各加入100 ii 1培養(yǎng)的TG-1細(xì)胞。37t:下溫育30分鐘之 后，去除感染的TG-1細(xì)胞并且與來自用洗脫的噬菌體感染的那些細(xì)胞合并。將感染的細(xì)菌 制成16X 16cmS0BAG板并且3(TC培養(yǎng)過夜。每次用1 y 1的濃縮的洗脫的噬菌體測定滴度。 用12.5ml的2XYT，20X甘油從S0BAG板洗下獲得的細(xì)菌克隆。類似于第一次淘選進(jìn)行第 二次和第三次淘選，有下面的變化。在20毫升培養(yǎng)基中用20微升洗出庫反復(fù)進(jìn)行噬菌體 培養(yǎng)。2ml培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物被用于用輔助噬菌體的感染(細(xì)菌/噬菌體重量比1/20)。 在第二次淘選中，首先用PBS/Tween-20洗滌15次，然后用PBS洗滌10次洗滌微量滴定板， 在第三次淘選中，首先用PBS/Tween-20洗滌20次，然后用PBS洗滌10次。
檢驗濃度和特異結(jié)合的ELISA 利用多克隆噬菌體ELISA測定與抗原特異性結(jié)合的噬菌體的濃度。除了洗脫噬菌 體之外，比較分析起始庫GCUC-1的噬菌體和野生型Y-II-眼晶狀體蛋白的噬菌體。室溫下 用100 iil的BSA-雌二醇17-半琥珀酸酯或BSA的2 y g/ml濃度的PBS pH 7. 6溶液包被 NUNC-Maxisorp板過夜。用PBS， pH 7. 6將孔洗滌三次，接著用3%干奶粉(Gliicksklee)/ PBS， pH 7. 2在37"封閉2小時，再用PBS， pH 7. 6洗滌三次。首先室溫下將噬菌體培養(yǎng)后 分離的沒有濃縮的重組噬菌體封閉1小時(與6%強(qiáng)度干奶粉(Marvel)/PBS pH 7. 6的 1 : 1的混合物)。每孔加入100 1封閉的噬菌體并且在37t:培養(yǎng)1小時。各自用PBS/ Tween-20和PBS將孔洗滌三次，接著與抗_M13抗體-POD偶聯(lián)物(Pharmacia-Biotech,在 3% Gliicksklee/PB中稀釋1 : 5000)在37°孵育1小時。洗滌板之后，使用100 免疫 純TMB底物(Pierce)檢測酶-結(jié)合的抗體。通過加入100 的2M H2S04中止顯色反應(yīng)， 并且在450nm測定吸光度。圖6給出了第三次淘選之后與BSA-雌二醇偶聯(lián)物結(jié)合的噬菌 體的濃度的結(jié)果。 與偶聯(lián)物特異結(jié)合的各噬菌體的分離和表征 從第三次淘選之后獲得的細(xì)菌克隆篩選80個克隆。從克隆中分離噬菌體并且在 單克隆噬菌體ELISA中分別測定其抗原結(jié)合。在聚丙烯微量滴定板(NUNC)中在含有2%葡 萄糖和100 ii g/ml氨節(jié)青霉素的100 ill的2XYT培養(yǎng)基中在輕微攪動(lOOrpm)下將各細(xì) 菌克隆培養(yǎng)過夜。在相同的培養(yǎng)基中將這樣的細(xì)菌培養(yǎng)物2iU稀釋l : 100并且以100rpm在37t:下培養(yǎng)至0D6。。為0. 4。將所述獲得的噬菌體用于篩選過程。使用購自TECAN的深孔 聚丙烯板來進(jìn)行噬菌體培養(yǎng)。對于ELISA，室溫下用40iU的6XPBS/18X將離心(沒有濃 縮)之后獲得的200ia噬菌體上清液封閉l小時。測定80個克隆，其中30個表明重組噬菌 體與BSA-雌二醇-17明顯結(jié)合但是與平行測定的BSA不結(jié)合。在對照實驗中，具有野生型 y-II-眼晶狀體蛋白的噬菌體表明與BSA-雌二醇-17不結(jié)合。使用IRD 800-標(biāo)記的引物p CANR1LAB(5'CCATGATTACGCC-AAGCTTTGGAGCC 3，)and GCLISEQ(5'CTGAAAGTGCCGGTGTGTTGC 3')對14個選擇的結(jié)合噬菌體測序。只有在一例中，測序揭示了在8個隨機(jī)化氨基酸位置 專有突變的y-眼晶狀體蛋白突變體(Mu 12A)。很多克隆表現(xiàn)出可讀框中的移位，盡管理 論上編碼一種功能蛋白，但是它們的改變在期望的y-眼晶狀體蛋白區(qū)中不是專有性的。 沒有進(jìn)一步研究這些讀框移位。
|3 -折疊突變體12A的特征 通過Western-印跡分析，分別使用抗_G3P和抗-E-Tag抗體 (Pharmacia-Biotech)，檢測重組噬菌體的表面上融合蛋白Mu 12A-小包被蛋白3的表達(dá)和 Mu 12A在大腸桿菌菌株HB 2151中的表達(dá)。圖7給出了噬菌粒pGCKT 8_3中突變體12A的 DNA序列和y -II-眼晶狀體蛋白野生型的DNA序列。DNA序列在起始噬菌粒pCANTAB 5E 中已經(jīng)存在的Sf i I切割位點處起始，在pGCKT 8-3情況下，在第一次被導(dǎo)入y -II-眼晶 狀體蛋白野生型基因中的Bst EII位點中止，并且在y-II-眼晶狀體蛋白野生型基因情況 下，在起始序列處中止。圖8給出了從其衍生的氨基酸序列。氨基酸位置36處的密碼子隨 機(jī)化作用不改變該位置處的精氨酸。突變體12A的計算機(jī)模擬表明氨基酸改變不引起蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)與起始蛋白相比的大的改變。但是，靜電荷變得更偏向正值。
pET-20b中Mu 12A的表達(dá) 為了詳細(xì)描述突變體12A的特征，將DNA再次克隆到質(zhì)粒pET-20b (Novagen)中。 該質(zhì)粒使得重組DNA在大腸桿菌菌株BL 21中的高效表達(dá)和外源蛋白質(zhì)的簡單純化成為可 能。在沒有信號肽和有6個組氨酸殘基的C-末端融合下表達(dá)基因。利用PCR使用合適的噬 菌粒DNA和引物擴(kuò)增突變體12A的DNA和y -II-眼晶狀體蛋白野生型的DNA，對于20b對 于突變體12A使用引物GC 20bbackl2A/GC，對于20b對于野生型使用引物(圖9)。用限制 性內(nèi)切酶Nde I和Bam HI切割PCR片段，并且克隆到用Nde I/Bam HI切割的載體pET 20b 中。圖10分別給出了在pET-20b中表達(dá)之后突變體12A的理論氨基酸序列和y-II-眼晶 狀體蛋白的理論氨基酸序列。通過N-末端蛋白質(zhì)測序證實突變體12A的頭10個N-末端 氨基酸。 pET-20b中突變體和野生型的培養(yǎng)和純化 為了詳細(xì)研究該突變體的結(jié)合性質(zhì)和穩(wěn)定性，制備大量的突變體12A和野生型蛋 白質(zhì)。分別用質(zhì)粒pET-20b/Mu 12A和pET-20b/y-II-眼晶狀體蛋白轉(zhuǎn)化BL 21細(xì)胞。通 過用LB培養(yǎng)基/100 ii g/ml氨芐青霉素將預(yù)培養(yǎng)物稀釋1 : 100并且以200rpm和在37° 下攪動培養(yǎng)物將克隆培養(yǎng)至0D6。。為0. 5。通過加入IPTG(終濃度ImM)誘導(dǎo)y_眼晶狀 體蛋白的表達(dá)。在30。C和在200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)過夜。通過4°C，60000rpm(Sorva11 GS3 轉(zhuǎn)子)離心10分鐘收獲細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)胞沉積物懸浮于30ml的2XPBS，加入150 的 200mM PMSF和10 ii 1的DNAse (Boehringer)。然后用Gaul in壓碎器以800-1000PSIG破碎 細(xì)胞兩次。該細(xì)胞懸浮液在4t:和20000rpm(Sorva11 SS 34轉(zhuǎn)子)離心1小時之后獲得含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液。通過4t:下親和層析純化與6個組氨酸殘基融合的Y-眼晶狀 體蛋白。用50ml的2XPBS/10mM咪唑平衡8ml的Ni-NTA。然后在間歇式方法中在轉(zhuǎn)動搖
瓶機(jī)上將含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液與平衡過的柱材料緩慢攪動過夜。將該懸浮液加給層 析柱之后用2XPBS/10mM咪唑/300mM NaCl沖洗。用2XPBS/250mM咪唑洗脫結(jié)合的蛋白 質(zhì)。DTT(終濃度10mM)被加給洗脫的蛋白質(zhì)。接著是兩次4。C下的透析步驟，每次8小時 第一次用lOOmM磷酸鈉緩沖液p朋.0/1 mM EDTA/lmM DTT，第二次用lOmM磷酸鈉緩沖液pH 6.0/1 mMEDTA。最后離心(4°C ， 30分鐘，20000rpm， Sorvall SS 34轉(zhuǎn)子)之后獲得的上清 液含有純化的蛋白質(zhì)(Mu 12A或Y-II-眼晶狀體蛋白)，其被用于結(jié)合研究和穩(wěn)定性研究。
通過進(jìn)行ELISA測定突變體12A對BSA-雌二醇_17_半琥珀酸酯偶聯(lián)物的特異性 結(jié)合，使用漸增的純化突變體12A-His-Tag蛋白質(zhì)濃度。使用漸增量的Y-II-眼晶狀體蛋 白野生型(同樣有His-Tag)作為對照，測試兩種純化的蛋白質(zhì)對BSA的結(jié)合。使用NUNC-Tm 板進(jìn)行濃度-依賴性ELISA。室溫下用BSA-雌二醇-17-半琥珀酸酯偶聯(lián)物或BSA對抗原包 被過夜。在各種情況下用濃度為20 ii g/ml的PBS pH 7. 6的100微升抗原進(jìn)行包被。洗滌 (2XPBS pH 7.6)和封閉平板之后(3% Marvel/PBS，37°C，2小時)，在各種情況下，向總共 IOO微升的反應(yīng)溶液(PBS，3% Marvel, X y 1的蛋白質(zhì))中加入1-13 yl的純化的Mu 12A 或Y-II-眼晶狀體蛋白的蛋白質(zhì)貯液(濃度0.63mg/ml)，并且在孔中在37t:培養(yǎng)2小時。 使用的二抗是購自Qiagen的1 : 3000稀釋的四-His抗體和1 : 2000稀釋的抗小鼠POD 抗體(Sigma)。用3%強(qiáng)度Marvel/PBS溶液稀釋該抗體并且向孔中加入100微升，并且在 37t:各溫育1小時。如對多克隆噬菌體ELISA的描述進(jìn)行底物反應(yīng)。圖11中該項ELISA 的結(jié)果清楚地表明只有用漸增濃度的突變體12A才測得漸增的消光度。使用Y-II-眼晶 狀體蛋白沒有測得增加。同樣，沒有觀察到與BSA的反應(yīng)。這表明與起始蛋白質(zhì)相比突變 體12A的特異性結(jié)合。通過記錄由于突變體12A和由于Y-II-眼晶狀體蛋白的胍變性來 研究穩(wěn)定性。為此目的，以20 i！ g/ml的終濃度使純化的蛋白質(zhì)與漸增濃度的胍在2(TC下孵 育一天和三天。將總共15個胍鹽濃度在lmM DTT/0. lM磷酸鈉緩沖液p朋.0溶液中調(diào)節(jié)在 0-5. 5M的范圍內(nèi)。 一天和三天之后，分別記錄各混合物的300-400nm熒光發(fā)射光譜。激發(fā) 波長是280nm。圖12給出測定的最大發(fā)射對胍鹽濃度的函數(shù)。 一天和三天之后Y-II-眼 晶狀體蛋白的穩(wěn)定性比突變體12A的穩(wěn)定性高。但是，與抗體分子相比，突變體12A的穩(wěn)定 性高得多。 突變體12A的熒光性質(zhì)的變化 為了測定突變體12A的熒光性質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比是否有了改變，記錄熒光光 譜。為此目的，在280nm激發(fā)各100iig/ml的野生型蛋白質(zhì)或者突變體12A(于50mM磷酸 鈉中，pH 6. 0)，并且在1厘米通徑長度的小池中在300至400nm波長范圍內(nèi)測定熒光。激 發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度都是5nm。 對于野生型和突變體12A，檢測的熒光信號都具有最大329nm值。但是，只有86% 信號強(qiáng)度的突變體12A的熒光強(qiáng)度比Y-眼晶狀體蛋白野生型(100%)低得多(參見圖 13A)。 突變體12A和野生型具有相同數(shù)目的熒光團(tuán)。但是，突變體中序列的改變(8位處 Y-〉K和15位處C-〉Y)引起熒光信號的改變。不同的熒光強(qiáng)度可能歸因于8位和15位 的酪氨酸殘基分別具有不同的熒光性質(zhì)的事實。
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210163]〈223〉人工序列的描述寡核苷酸
0164]<400>1
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0171]〈223>人工序列的描述寡核苷酸
0172]<400>2
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0179]〈223>人工序列的描述寡核苷酸
0180]<400>3
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〈220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400>6catgccatga ctcgcggccc agccggccatggggs卿tcactttttacgaggac 55<210>7〈211〉26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的描述寡核苷酸〈400〉7ccatgattac gccaagcttt ggagcc26〈210>8〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400>8ctgaaagtgc cggtgtgttg c21<210>9〈211〉176〈212>DNA〈213>Bos sp.〈400>9ggcccagccg gccatgggga ggatcaagttcggggcttcc 3gggccactei GO
ttacagttgc aatagcgact gccccaacctgcagccctatttcagccgctgtaactccat 120cagggtgctg agcggctgct ggatgctgtatgagcgcccc■cteccagggtcacc 176〈210>10〈211>176〈212>DNA<213>Bos sp.〈400〉10ggcccagccg gccatgggga agatcactttttecgaggaccggggcttccagggccactg 60ctacgagtgc agcagcgact gccccaacctgcagccctatttcagccgctgtaactccat 120ccgcgtggac agcggctgct ggatgctgtatgagcgccccgccacc 176


〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉人工序列的描述寡核苷酸
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ccccatggcc ggctgggccg cgagtcatgg catgtatctt tgtgagacgc gcgcg 〈210>12 〈211>36 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220> <223>人工序列的描述寡核苷酸 〈400>12 ggccatgggg皿katc皿kt ttrmkgagga ccgggg 36 〈210>13 〈211>24 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉人工序列的描述寡核苷酸 〈400>13 gtggccctgg aagccccggt cctc 24 〈210>14 〈211>44 〈212〉DNA 〈213>人工序列 <220> 〈223〉人工序列的描述寡核苷酸 〈400>14 cttccagggc cac皿ktecn nktgc皿kag cgactgcccc aacc 44 〈210>15 〈211>20 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉人工序列的描述寡核苷酸 〈400>15 tgcagcccta tttcagccgc 20 〈210>16 〈211〉4722/25頁
〈212〉腦A〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400>16gatggagtta cagcggctga Euatagggctg caggttgggg c;agtcgc47〈210>17〈211>45〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400>17tgtaactcca tc皿kgtgnn kagcggctgc tggatgctgt atgag45〈210>18〈211>37〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述寡核苷酸〈400>18cgccccaact accagggtca ccagtacttc ctgcggc37〈210>19〈211>198〈212>PRT<213>Bos sp.〈400>19Ala Ala Gin ProAla Met Gly Arg lie Lys Phe LysGlu Asp Arg Gly15 1015Phe Gin Gly HisTyr Tyr Ser Cys Asn Ser Asp CysPro Asn Leu Gin202530Pro Tyr Phe SerArg Cys Asn Ser lie Arg Val LeuSer Gly Cys Trp354045Met Leu Tyr GluArg Pro Asn Tyr Gin Gly His GinTyr Phe Leu Arg5055 60Arg Gly Asp TyrPro Asp Tyr Gin Gin Trp Met GlyPhe Asn Asp Ser6570 7580lie Arg Ser CysArg Leu lie Pro Gin His Thr GlyThr Phe Arg Met85 9095
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ArglieTyrGluArgAspAspPheArgGlyGinMetSerGlulieThr100105110AspAspCysProSerLeuGinAspArgPheHisLeuThrGluValHis115120125SerLeuAsnValLeuGluGlySerTrpValLeuTyrGluMetProSer130135140TyrArgGlyArgGinTyrLeuLeuArgProGlyGluTyrArgArgTyr145150155160LeuAspTrpGlyAlaMetAsnAlaLysValGlySerLeuArgArgVal165170175MetAspPheTyrAlaAlaAlaGlyAlaProValProTyrProAspPro180185190LeuGluProArgAlaAla195〈210>20〈211>198〈212>PRT〈213>Bos sp.〈400>20AlaAlaGinProAlaMetGlyLyslieThrPheTyrGluAspArgGly151015PheGinGlyHisCysTyrGluCysSerSerAspCysProAsnLeuGin202530ProTyrPheSerArgCysAsnSerlieArgValAspSerGlyCysTrp354045MetLeuTyrGluArgProAsnTyrGinGlyHisGinTyrPheLeuArg505560ArgGlyAspTyrProAspTyrGinGinTrpMetGlyPheAsnAspSer65707580lieArgSerCysArgLeulieProGinHisThrGlyThrPheArgMet859095ArglieTyrGluArgAspAspPheArgGlyGinMetSerGlulieThr100105110AspAspCysProSerLeuGinAspArgPheHisLeuThrGluValHis115120125SerLeuAsnValLeuGluGlySerTrpValLeuTyrGluMetProSer130135140TyrArgGlyArgGinTyrLeuLeuArgProGlyGluTyrArgArgTyr145150155160
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LeuAspTrpGlyAlaMetAsnAlaLysValGlySerLeuArgArgVal165170175MetAspPheTyrAlaAlaAlaGlyAlaProValProTyrProAspPro180185190LeuGluProArgAlaAla195〈210>21〈211>197〈212>PRT〈213>Bos sp.〈400>21MetGlyArglieLysPheLysGluAspArgGlyPheGinGlyHisTyr151015TyrSerCysAsnSerAspCysProAsnLeuGinProTyrPheSerArg202530CysAsnSerlieArgValLeuSerGlyCysTrpMetLeuTyrGluArg354045ProAsnTyrGinGlyHisGinTyrPheLeuArgArgGlyAspTyrPro505560AspTyrGinGinTrpMetGlyPheAsnAspSerlieArgSerCysArg65707580LeulieProGinHisThrGlyThrPheArgMetArglieTyrGluArg859095AspAspPheArgGlyGinMetSerGlulieThrAspAspCysProSer100105110LeuGinAspArgPheHisLeuThrGluValHisSerLeuAsnValLeu115120125GluGlySerTrpValLeuTyrGluMetProSerTyrArgGlyArgGin130135140TyrLeuLeuArgProGlyGluTyrArgArgTyrLeuAspTrpGlyAla145150155160MetAsnAlaLysValGlySerLeuArgArgValMetAspPheTyrSer165170175AspProAsnSerSerSerValAspLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHis180185190HisHisHisHisHis195〈210>22〈211>197
〈212>PRT〈213>Bos sp.〈400>22MetGlyLyslieThrPheTyrGluAspArgGlyPheGinGlyHisCys151015TyrGluCysSerSerAspCysProAsnLeuGinProTyrPheSerArg202530CysAsnSerlieArgValAspSerGlyCysTrpMetLeuTyrGluArg354045ProAsnTyrGinGlyHisGinTyrPheLeuArgArgGlyAspTyrPro505560AspTyrGinGinTrpMetGlyPheAsnAspSerlieArgSerCysArg65707580LeulieProGinHisThrGlyThrPheArgMetArglieTyrGluArg859095AspAspPheArgGlyGinMetSerGlulieThrAspAspCysProSer100105110LeuGinAspArgPheHisLeuThrGluValHisSerLeuAsnValLeu115120125GluGlySerTrpValLeuTyrGluMetProSerTyrArgGlyArgGin130135140TyrLeuLeuArgProGlyGluTyrArgArgTyrLeuAspTrpGlyAla145150155160MetAsnAlaLysValGlySerLeuArgArgValMetAspPheTyrSer165170175AspProAsnSerSerSerValAspLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHis180185190HisHisHisHisHis19權(quán)利要求
制備具有β-折疊結(jié)構(gòu)和對結(jié)合配偶體的類似抗體的結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的方法，包括下面步驟(a).從眼晶狀體蛋白，內(nèi)孢囊素，熱激蛋白，冷激蛋白，β螺旋蛋白和纖連蛋白組成的組中選擇蛋白；(b).選擇所述蛋白的結(jié)合配偶體；(c).將編碼位于具有β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的至少一個β-折疊的兩條、三條或四條β鏈中的蛋白質(zhì)表面的氨基酸的核酸分子進(jìn)行誘變，其中所述誘變選自由插入，缺失，替換及其組合組成的組；(d).表達(dá)步驟(c)中獲得的誘變的核酸分子，以產(chǎn)生誘變的蛋白質(zhì)；(e)將誘變的蛋白質(zhì)與步驟(b)的所述結(jié)合配偶體接觸；和(f).篩選和分離對步驟(b)的結(jié)合配偶體具有新的或改善的類似抗體的結(jié)合活性的誘變的蛋白質(zhì)，條件是(i)無替換、缺失或插入的蛋白質(zhì)在其中氨基酸被誘變的β-折疊結(jié)構(gòu)表面不具有結(jié)合活性，在β-折疊結(jié)構(gòu)表面替換、缺失或插入后，所述蛋白質(zhì)具有新的抗原結(jié)合特異性，或(ii)蛋白質(zhì)在替換、缺失或插入前具有結(jié)合活性，在β-折疊結(jié)構(gòu)表面替換、缺失或插入后，所述蛋白質(zhì)具有另外新的或改善的結(jié)合活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在e-折疊中的位點特異性缺失。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在e-折疊中的位點特異性替換。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在e-折疊中的位點特異性插入
5. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在P-折疊中的隨機(jī)替換。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在P-折疊中的隨機(jī)缺失。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述誘變包括在e-折疊中的隨機(jī)插入。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)在選自由原核細(xì)胞，真核細(xì)胞，和無細(xì)胞系統(tǒng)組成 的組的系統(tǒng)中進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)在選自由植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，噬 菌體，病毒和細(xì)菌組成的組的實體的表面上進(jìn)行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括純化由表達(dá)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中在至少兩條或三條表面暴露的e-鏈中的表面暴露氨 基酸被誘變。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中四條或更多條表面暴露的P-鏈被誘變。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中在一條表面暴露的e-鏈中的一個或多個氨基酸被誘變。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在多于1個e-折疊中的氨基酸被誘變。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中位于兩個反向平行的表面暴露的P-折疊中的三條表 面暴露的e-鏈中的表面暴露的氨基酸被誘變。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述眼晶狀體蛋白是脊椎動物眼晶狀體蛋白。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述脊椎動物眼晶狀體蛋白選自由牛，嚙齒動物，鳥 類和魚組成的組。
18. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述眼晶狀體蛋白選自由a-， P-或Y-眼晶狀體 蛋白組成的組。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述眼晶狀體蛋白是Y-II-眼晶狀體蛋白。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)在可接觸溶劑或可接觸結(jié)合配偶體或其 組合的P-折疊區(qū)中進(jìn)行誘變。
21. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域或亞基的P-折疊結(jié)構(gòu) 中進(jìn)行誘變。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中在所述Y-II-眼晶狀體蛋白中的氨基酸Lys2， Thr4， Tyr6， Cysl5， Glul7， Serl9， Arg36和Asp38的至少一個被通過替換，缺失或插入或其 組合進(jìn)行誘變。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述誘變的Y-II-眼晶狀體蛋白具有對雌二醇或者 其BSA-P -雌二醇-17-半琥珀酸酯偶聯(lián)物具有結(jié)合特異性。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述誘變的Y-II-眼晶狀體蛋白具有的氨基酸序列 為SEQ ID NO :19禾P SEQ ID NO :21之一的序列。
25. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中將所述誘變的編碼步驟(f)篩選和分離的誘變的蛋白 質(zhì)的核酸分子增殖，并表達(dá)所述蛋白質(zhì)。
26. 制備組合物的方法，所述組合物用于選自由診斷，治療，化妝品，生物分離，生物傳 感器和減少有害物質(zhì)組成的組的應(yīng)用，所述方法包括(a) 提供根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的蛋白質(zhì)；禾口(b) 通過向其中結(jié)合入根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的蛋白質(zhì)來制備組合物，所述組合 物用于選自由診斷，治療，化妝品，生物分離，生物傳感器和減少有害物質(zhì)組成的組的應(yīng)用。
27. 誘變的Y-II-眼晶狀體蛋白，其具有新的類似抗體的對結(jié)合配偶體的結(jié)合活性， 其中所述Y-II-眼晶狀體蛋白表面的氨基酸被誘變，并且，其中；-所述被誘變的氨基酸選自對應(yīng)于所述Y-II-眼晶狀體蛋白的Lys2， Thr4， Tyr6， Cysl5， Glul7， Serl9， Arg36和Asp38氨基酸位置的氨基酸中的一種或多種； -所述13 _折疊結(jié)構(gòu)在所述修飾之后保持；_所述誘變選自由下列組成的組插入，缺失，替換及其組合。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)，特征在于其對雌二醇或者其偶聯(lián)物，BSA-P-雌二 醇-17-半琥珀酸酯具有結(jié)合特異性。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的蛋白質(zhì)，特征在于其對雌二醇或者其偶聯(lián)物，BSA-P-雌二 醇-17-半琥珀酸酯具有結(jié)合特異性，并且其具有氨基酸序列SEQ ID NO. 19或SEQ ID NO. 21。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)，特征在于其與另外的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)物質(zhì)組合。
31. 編碼根據(jù)權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)的DNA。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的DNA衍生的RNA。
33. 包含根據(jù)權(quán)利要求31或32的DNA或RNA或者其編碼該蛋白質(zhì)功能區(qū)的部分的原 核或真核載體或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了具有特異結(jié)合性質(zhì)和催化性質(zhì)的新的β-折疊蛋白質(zhì)，也描述了這些蛋白質(zhì)的制備方法。
文檔編號A61K38/17GK101693889SQ200910204219
公開日2010年4月14日 申請日期2000年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月13日
發(fā)明者烏爾麗克·菲德勒, 卡蘿拉·賴曼, 杰拉爾德·伯姆, 賴納·魯?shù)婪?申請人:希爾蛋白質(zhì)有限公司;