專利名稱：一種超分子水凝膠基因載體材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域，特別涉及一種可用做基因載體的超分子水凝
膠及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是目前用于癌癥以及先天性免疫系統(tǒng)疾病治療的一種有效方法。該技 術(shù)實(shí)施的關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒ǎM(jìn)而使基因能夠在細(xì)胞中獲得安 全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)。水凝膠作為一類可用作藥物載體的生物醫(yī)用材料，具有負(fù)載 率高、可保護(hù)大分子藥物免受生物體的降解或清除、以及對藥物分子的可持續(xù)釋放等特性， 近年來已被研究用于基因的負(fù)載和控釋。例如，Park等以雙鍵修飾的聚乙二醇-聚丙二 醇-聚乙二醇(Pluronic)三嵌段聚合物和透明質(zhì)酸為原料，通過紫外光聚合將DNA原位包 埋于水凝膠基質(zhì)中，通過調(diào)節(jié)光照時間和透明質(zhì)酸的用量可調(diào)控凝膠的強(qiáng)度和DNA的釋放 速率(Biomaterials 2005,26:3319-3326)。 Kasper等以聚乙二醇修飾的延胡索酸酯為原 料、N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，通過自由基聚合制備得到一類化學(xué)凝膠，該類凝 膠通過溶脹作用負(fù)載基因，DNA的釋放速率可通過聚乙二醇分子量的改變來調(diào)節(jié)(Journal of Controlled Release2005， 104 :521-539) 。 Shea等則通過光聚合反應(yīng)，將DNA/PEI (聚 乙烯基亞胺)復(fù)合物包埋于由雙鍵修飾的聚乙二醇與透明質(zhì)酸形成的水凝膠基質(zhì)中，并通 過改變原料配比調(diào)節(jié)凝膠強(qiáng)度和DNA的釋放速率(Journal of ControlledRelease 2007， 120 :233-241)。然而，這些水凝膠基因載體的形成通常離不開高溫、化學(xué)交聯(lián)劑或光引發(fā)劑 的使用，不利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。因此，如何在溫和條件 下構(gòu)建生物兼容性良好的水凝膠基因載體材料，便成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域亟待解決的 重要課題。 迄今為止，通過聚合物與環(huán)糊精的主客體相互作用原位負(fù)載基因的超分子水凝膠 及其應(yīng)用尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種超分子水凝膠基因載體材料的制 備方法；本發(fā)明以環(huán)糊精為主體、通過主客體組裝作用制備可用做基因載體的超分子結(jié)構(gòu) 水凝膠；該凝膠制備條件溫和、對溫度和濃度要求較低、溶膠_凝膠可逆；凝膠強(qiáng)度可通過 聚合物濃度或者環(huán)糊精濃度來調(diào)節(jié)，操作方便，可作為一類新型的可注射凝膠應(yīng)用于大分 子藥物的負(fù)載和釋放。 本發(fā)明的另一 目的在于提供一種由上述方法制備的超分子水凝膠基因載體材料。
本發(fā)明的再一 目的在于提供上述超分子水凝膠基因載體材料在生物醫(yī)學(xué)材料工 程領(lǐng)域的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方 法，包括以下操作步驟
(1)聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物的 合成 a、將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(Pluronic)三嵌段共聚物溶于二氯甲烷與 吡啶的混合溶液中，加入對甲基苯磺酰氯，室溫條件下避光反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等 體積的氯化氫溶液進(jìn)行萃取，有機(jī)層用堿進(jìn)行中和、過濾；蒸發(fā)除去二氯甲烷后得到聚乙二 醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯； b、將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯的氨水溶液置于耐壓容器
中，于70 8(TC條件下進(jìn)行反應(yīng)，冷卻至室溫，用等體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，所得有機(jī)相 與等體積的氫氧化鈉溶液混合，攪拌，分離，將所得有機(jī)層洗至中性，蒸發(fā)除去二氯甲烷后 得到氨基修飾物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基聚合物； c、將NE-芐氧羰基L-賴氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反應(yīng)介質(zhì)；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基的四氫呋喃溶 液滴加到反應(yīng)介質(zhì)中，在38 45t:條件下反應(yīng)48 72小時，蒸干去除四氫呋喃，再用二氯 甲烷溶解，然后用乙醚沉淀，得到氨基被保護(hù)的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚賴 氨酸多嵌段聚合物； d、將聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氫 乙酸溶液中，得到質(zhì)量百分比濃度為10 20%的溶液，繼續(xù)攪拌至出現(xiàn)沉淀；靜置，將上 層清液倒去；將所得沉淀透析，冷凍干燥，得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸 (Pluronic-PLL)多嵌段聚合物； (2)將質(zhì)量體積比濃度為0. 5 ii g/ ii L的核酸溶液；加入到1. 0mL質(zhì)量百分比濃度 為8 20% (w/w)的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶液中，混 合均勻，室溫條件下靜置，得到核酸的質(zhì)量體積比濃度為5 50ii g/mL的聚合物/核酸復(fù) 合物溶液； (3)向步驟(2)所得的聚合物/核酸復(fù)合物溶液中加入1. 0mL質(zhì)量百分比濃度為 10 20%的a -環(huán)糊精溶液，攪拌混合均勻，室溫條件下靜置，得到超分子水凝膠基因載體 材料。 步驟a所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物的分子量為6000 15000，其中乙二醇單元占乙二醇單元和丙二醇單元總數(shù)的57% 85%。
步驟a所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物與對甲基苯磺酰氯的摩 爾比為l : 2;所述二氯甲烷與吡啶的體積比為2 : l，所述二氯甲烷與吡啶的混合溶液中 每100毫升混合溶液含有5 15克聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物；所述氯 化氫溶液的摩爾濃度為3mol/L ;所述堿為碳酸氫鈉，所述堿的用量為每100毫升有機(jī)相中 加入3 5克；所述避光反應(yīng)的時間為24 36小時。 步驟b所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯的氨水溶液是將聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯溶于濃氨水中形成質(zhì)量百分比濃度為5 20% 的溶液，所述濃氨水的質(zhì)量百分比濃度為25% ;所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為lmol/L ; 所述反應(yīng)的時間為16 24小時；所述攪拌為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600 1200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌 的時間為2 4h ;所述洗至中性是用水洗至中性。 步驟c所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基與『-芐氧羰基L-賴氨酸-N-羧酸酐的摩爾比為1 : 20 1 : 40 ;所述N，N-二甲基甲酰胺與四氫呋喃的體積比 為2 : 1 ;所述NE-芐氧羰基L-賴氨酸-N-羧酸酐溶解于N， N-二甲基甲酰胺形成質(zhì)量體 積比濃度為0. 05 0. lg/ml ;所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基的四氫呋喃溶液 的質(zhì)量體積比濃度為0. 05 0. lg/ml ;所述沉淀是用3 5倍二氯甲烷體積的乙醚進(jìn)行沉 淀。 步驟d所述攪拌為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600 1200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌的時間為30 60 分鐘；所述靜置的時間為20 60分鐘；所述透析的時間為3天；步驟(1) (3)所述室溫 為5 35°C。 步驟(2)所述核酸為核糖核酸或脫氧核糖核酸；所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙 二醇_聚賴氨酸多嵌段聚合物溶液是將聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物溶解 在水或磷酸鹽緩沖溶液中；所述靜置的時間為15 30分鐘。 步驟(3)所述a -環(huán)糊精溶液是將a -環(huán)糊精溶解在水或磷酸鹽緩沖溶液中；所 述靜置的時間為6 12小時。 —種根據(jù)上述方法制備的超分子水凝膠基因載體材料。 上述的超分子水凝膠基因載體材料應(yīng)用于制備可注射藥物載體或可注射基因載 體。 所述聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物可選用工業(yè)化的Pluronic系
列，常見的Pluronic型號包括F-68 (E076_P029-E076) 、 F-127 (EO^-PC^-EO,)等。 本發(fā)明的原理是聚合物Pluronic為一類聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌
段聚合物的商品名，具有良好的生物兼容性，是少數(shù)被美國FDA批準(zhǔn)可作為藥品和食品添
加劑的合成化合物之一。本發(fā)明首先利用開環(huán)聚合，合成出聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二
醇-聚賴氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段共聚物，此聚合物通過聚賴氨酸鏈段與核酸的靜電相
互作用，在溶劑中形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物；然后再通過Pluronic-PLL共聚物與a _環(huán)糊精
的主客體組裝相互作用，進(jìn)一步得到了原位包埋基因的超分子結(jié)構(gòu)水凝膠，聚合物在凝膠
體系中起著基因負(fù)載和作為凝膠基質(zhì)的雙重作用。水凝膠形成的主要作用力為環(huán)糊精組裝
之后的結(jié)晶作用和聚丙二醇鏈段的疏水作用力。 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果 (1)凝膠制備方便快捷，可在室溫下成型，條件溫和，對濃度及溫度要求較低；
(2)凝膠的形成過程不存在化學(xué)反應(yīng)，有效地避免了化學(xué)反應(yīng)及反應(yīng)副產(chǎn)物對 DNA活性的影響； (3)凝膠的強(qiáng)度和凝膠化時間可通過聚合物濃度、環(huán)糊精濃度來調(diào)控，隨著聚合物 或者環(huán)糊精濃度的增加，凝膠的彈性模量增加，凝膠化時間縮短； (4)聚合物在體系中起著DNA載體和凝膠基質(zhì)的雙重作用，可簡化凝膠配方，節(jié)省 成本； (5)物理凝膠隨著生物體中液體介質(zhì)的不斷沖刷溶蝕，會逐漸松散直至完全溶解， 可以達(dá)到對DNA的100%的釋放率； (6)作為凝膠基質(zhì)的Pluronic-PLL聚合物與DNA存在靜電相互作用，有利于凝膠 對DNA的控釋進(jìn)行調(diào)節(jié)； (7)超分子凝膠存在溫度敏感性，在32C左右(體溫以下)實(shí)現(xiàn)模量突變，有利于其作為可注射基因載體。 (8)本發(fā)明水凝膠成分簡單，生物兼容性好，轉(zhuǎn)染效果明顯，具備良好的剪切變稀 的特性，應(yīng)用方便快捷，有望作為可注射的藥物載體廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域。
圖l為聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物的核磁氫譜譜圖。
圖2為超分子凝膠的廣角X射線衍射圖譜圖，其中曲線1為a -環(huán)糊精，曲線2為 多嵌段聚合物A，曲線3為超分子水凝膠基因載體材料C
圖3為超分子凝膠的模量隨溫度變化曲線圖。 圖4為DNA瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中1為超分子水凝膠基因載體材料B， 2為超分子水凝膠基因載體材料C， 3為超分子水凝膠基因載體材料D， 4為質(zhì)粒pEGFP。
圖5為超分子凝膠對大鼠成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)圖，其中1為陽性對照組，2 為新配置的聚合物/pEGFP復(fù)合物，3為超分子水凝膠基因載體材料C在第12小時的釋放 物，4為超分子水凝膠基因載體材料C在第24小時的釋放物，5為超分子水凝膠基因載體材 料C在第48小時的釋放物。 圖6為超分子水凝膠基因載體材料C在第24小時的釋放液實(shí)施轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的 熒光照片圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。 實(shí)施例1 a、將干燥好的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物Pluronic F-127溶 于二氯甲烷與吡啶的混合溶液中，然后加入對甲基苯磺酰氯，35t:室溫條件下避光反應(yīng)24 小時；所述的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物與對甲基苯磺酰氯的摩爾比為 1 : 2，溶劑二氯甲烷與吡啶的體積比為2 : 1，每100毫升混合溶液中含有15克Pluronic F-127 ;反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積的3mol/L氯化氫溶液萃取，有機(jī)層用碳酸氫鈉(碳酸 氫鈉的加入量以每100毫升有機(jī)相中加入3克)洗滌、過濾；蒸發(fā)除去二氯甲烷，得到聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯； b、將上述產(chǎn)物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯的氨水溶液(聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯溶于濃氨水中形成質(zhì)量百分比濃度為5%的溶 液，所述濃氨水的質(zhì)量百分比濃度為25% )置于耐壓容器中，于7(TC條件下反應(yīng)24小時， 冷卻至室溫25t:，用等體積的二氯甲烷萃取，有機(jī)相溶液與等體積lmol/L氫氧化鈉溶液磁 力攪拌(轉(zhuǎn)速為600轉(zhuǎn)/分鐘)2h，有機(jī)層用水洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修 飾物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基； c、將NE-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反應(yīng)介質(zhì)；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將溶有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-NH2的四氫呋喃 溶液滴加到反應(yīng)介質(zhì)中，在4(TC條件下反應(yīng)72小時；所述的聚合物與單體Lys(Z)-NCA的 摩爾比為l : 20， N， N-二甲基甲酰胺與四氫呋喃的體積比為2 : 1，每100毫升溶劑中含
7有10克原料；反應(yīng)結(jié)束后，蒸干去除四氫呋喃，產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，然后用3倍二氯甲烷 體積的乙醚沉淀，得到氨基被保護(hù)的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌 段聚合物； 所述NE -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐按以下步驟制備得到將NE -芐氧羰 基-L-賴氨酸(購自GL生化(上海)有限公司，純度> 98% )在攪拌條件下加到四氫呋喃 中，在氬氣保護(hù)下加熱至40°C ，得到質(zhì)量體積比為0. 06g/mL的NE -芐氧羰基_L_賴氨酸分 散液；將固體光氣(購自GL生化(上海)有限公司，純度>99%)溶解于四氫呋喃中配成 質(zhì)量濃度為6%的溶液后，逐滴加入到NE -芐氧羰基-L-賴氨酸分散液中，所述NE -芐氧羰 基-L-賴氨酸與固體光氣的摩爾比為2.5 : 1 ;當(dāng)反應(yīng)體系開始透明時，用干燥的氬氣將反 應(yīng)生成的氯化氫氣體鼓出，30分鐘后反應(yīng)結(jié)束，蒸發(fā)除去四氫呋喃，得到無色油狀物質(zhì)；將 所述無色油狀物質(zhì)用四氫呋喃溶解，得到溶液(質(zhì)量濃度為10% -20% )，然后加入3倍溶 液體積的石油醚進(jìn)行沉淀，過濾，室溫下真空干燥，得到NE -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸 酐； d、將聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氫乙 酸溶液中，得到質(zhì)量百分比濃度為10%的溶液，繼續(xù)磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為600轉(zhuǎn)/分鐘)60分 鐘出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；靜置20分鐘后，將上層清液倒去；將所得沉淀透析3天，冷凍干燥，得到 聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物。
實(shí)施例2 a、將干燥好的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物Pluronic F-68溶 于二氯甲烷與吡啶的混合溶液中，然后加入對甲基苯磺酰氯，15t:室溫條件下避光反應(yīng)36 小時；所述的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物與對甲基苯磺酰氯的摩爾比為 1 : 2，溶劑二氯甲烷與吡啶的體積比為2 : 1，每100毫升混合溶液中含有5克Pluronic F-68 ;反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積的3mol/L氯化氫溶液萃取，有機(jī)層用碳酸氫鈉(碳酸氫 鈉的加入量以每100毫升有機(jī)相中加入5克)洗滌、過濾；蒸發(fā)除去二氯甲烷，得到聚乙二 醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯； b、將上述產(chǎn)物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯的氨水溶液(聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯溶于濃氨水中形成質(zhì)量百分比濃度為20 %的溶 液，所述濃氨水的質(zhì)量百分比濃度為25% )置于耐壓容器中，于8(TC條件下反應(yīng)16小時， 冷卻至室溫35t:，用等體積的二氯甲烷萃取，有機(jī)相溶液與等體積lmol/L氫氧化鈉溶液磁 力攪拌(轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘)4h，有機(jī)層用水洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修 飾物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基； c、將NE-芐氧羰基L-賴氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反應(yīng)介質(zhì)；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將溶有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-NH2的四氫呋喃 溶液滴加到反應(yīng)介質(zhì)中，在45t:條件下反應(yīng)48小時；所述的聚合物與單體Lys(Z)-NCA的 摩爾比為l : 40， N， N-二甲基甲酰胺與四氫呋喃的體積比為2 : 1，每100毫升溶劑中含 有5克原料；反應(yīng)結(jié)束后，蒸干去除四氫呋喃，產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，然后用5倍二氯甲烷體 積的乙醚沉淀，得到氨基被保護(hù)的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段 聚合物； 所述NE -芐氧羰基L-賴氨酸-N-羧酸酐按以下步驟制備得到將NE -芐氧羰基L-賴氨酸(購自GL生化(上海)有限公司，純度>98%)在攪拌條件下加到四氫呋喃中， 在氬氣保護(hù)下加熱至40°C ，得到質(zhì)量體積比為0. 02g/mL的NE -芐氧羰基L_賴氨酸分散液； 將固體光氣(購自GL生化(上海)有限公司，純度>99%)溶解于四氫呋喃中配成質(zhì)量濃 度為15 %的溶液后，逐滴加入到NE -芐氧羰基L-賴氨酸分散液中，所述NE -芐氧羰基L-賴 氨酸與固體光氣的摩爾比為2.5 : 1 ;當(dāng)反應(yīng)體系開始透明時，用干燥的氬氣將反應(yīng)生成的 氯化氫氣體鼓出，60分鐘后反應(yīng)結(jié)束，蒸發(fā)除去四氫呋喃，得到無色油狀物質(zhì)；將所述無色 油狀物質(zhì)用四氫呋喃溶解，得到溶液(質(zhì)量濃度為10% -20% )，然后加入3倍溶液體積的 石油醚進(jìn)行沉淀，過濾，室溫下真空干燥，得到NE -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐；
d、將聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氫乙 酸溶液中，得到質(zhì)量百分比濃度為20 %的溶液，繼續(xù)磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為600轉(zhuǎn)/分鐘)30分 鐘出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象；靜置60分鐘后，將上層清液倒去；將所得沉淀透析3天，冷凍干燥，得到 聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物A。
實(shí)施例3 (1)在室溫25t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為8X (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混 合均勻后靜置20分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為 15%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠基因載體 材料B。 實(shí)施例4 (1)在室溫25t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混 合均勻后靜置20分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為 15%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠基因載體 材料C。 實(shí)施例5 (1)在室溫25t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為20X (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混 合均勻后靜置20分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為 15%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠基因載體 材料D。 實(shí)施例6 (1)在室溫l(TC下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為8X (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置15分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為20%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。 實(shí)施例7 (1)在室溫35t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置15分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為10%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。 實(shí)施例8 (1)在室溫35t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為100 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置30分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為15%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。 實(shí)施例9 (1)在室溫35t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入濃度為10 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置20分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為15%的a -環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。 實(shí)施例10 (1)在室溫35t:下，將實(shí)施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為12% (w/w)的磷酸鹽緩沖溶液，然后向其中加入濃度為20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置15分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為15%的a -環(huán)糊精的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。
實(shí)施例11 (1)在室溫35t:下，將實(shí)施例1得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨
10酸多嵌段聚合物配制成lmL質(zhì)量百分濃度為10% (w/w)的磷酸鹽緩沖溶液，然后向其中加入濃度為20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的質(zhì)粒pEGFP溶液(購自Invitrogen公司并用大腸桿菌擴(kuò)增獲得)，混合均勻后靜置15分鐘，得到聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液； (2)向步驟(1)所得的聚合物/pEGFP復(fù)合物溶液中加入1. OmL質(zhì)量百分濃度為15%的a -環(huán)糊精的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠基因載體材料。
實(shí)施例12 將實(shí)施例2得到的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_聚賴氨酸多嵌段聚合物(Pluronic-PLL)溶于重水中，進(jìn)行氫譜核磁表征，結(jié)果如圖1所示，化學(xué)位移出現(xiàn)在4. 22、2. 92、 1. 63和1. 36處的峰對應(yīng)的是聚賴氨酸上的質(zhì)子峰；1. 08和3. 62處的質(zhì)子峰為Pluronic F_68鏈段上的質(zhì)子峰。
實(shí)施例13 將實(shí)施例4得到的超分子水凝膠基因載體材料C進(jìn)行廣角X射線衍射測定，結(jié)果如圖2所示，曲線1為a _環(huán)糊精，曲線2為多嵌段聚合物A，曲線3為超分子水凝膠基因載體材料C。從圖2可見，超分子水凝膠基因載體材料C在2e =19.8度處存在明
顯的結(jié)晶峰，此結(jié)晶峰對應(yīng)于a-環(huán)糊精穿到聚合物鏈上形成的"準(zhǔn)多輪烷"的結(jié)晶峰(Macromolecules，1990， 23 :2821-2823)。
實(shí)施例14 將實(shí)施例4得到的超分子水凝膠基因載體材料C進(jìn)行流變表征，跟蹤其模量隨溫度的變化曲線，并與實(shí)施例2得到的多嵌段聚合物A的質(zhì)量百分濃度為12%的水溶液相對比，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)量百分濃度為12X的多嵌段聚合物A水溶液在43t:左右才開始出現(xiàn)相轉(zhuǎn)變，而且體系的模量很小，不足以達(dá)到凝膠敷料的力學(xué)強(qiáng)度。而組裝成凝膠之后的超分子水凝膠基因載體材料C的相轉(zhuǎn)變溫度約為32t:，而且模量顯著提高，有利于其作為可
注射基因載體得到應(yīng)用。
實(shí)施例15 將實(shí)例3、4、5所得的超分子水凝膠基因載體材料B、C、D以及質(zhì)粒pEGFP進(jìn)行DNA凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。在實(shí)驗(yàn)條件的濃度范圍內(nèi)，超分子水凝膠基因載體材料都能與PEGFP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，pEGFP不會從電場中遷出(見圖4中的1_3);而質(zhì)粒pEGFP則在電場作用下遷出(見圖4中的4)。
實(shí)施例16 將實(shí)施例4所得的超分子水凝膠基因載體材料C在磷酸鹽緩沖溶液PBS環(huán)境下進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，其在第12、24和48小時釋放出的聚合物/pEGFP復(fù)合物的粒徑分別為181. 9nm、188. 2nm和177. 2nm。
實(shí)施例17 將實(shí)施例4所得的超分子水凝膠基因載體材料C在磷酸鹽緩沖溶液PBS環(huán)境下進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，釋放出的聚合物/pEGFP復(fù)合物定量后用于對大鼠成纖維細(xì)胞(MC3T3)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率結(jié)果如圖5所示，而超分子水凝膠基因載體材料C在第24小時的釋放液實(shí)施轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的熒光照片如圖6所示。陽性對照組Lipofectamin-2000/pEGFP表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，達(dá)到約39% ;而陰性對照裸DNA的轉(zhuǎn)染效率近乎為0% ;超分子水凝膠
11基因載體材料C在第12、24和48小時釋放出的聚合物/pEGFP復(fù)合物樣品的轉(zhuǎn)染效率分別為14%、15%和12%，表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效果。通過與新制備的聚合物/pEGFP復(fù)合物膠束的轉(zhuǎn)染效率(18%)比較，可以確定在凝膠的制備、保存以及釋放過程中，凝膠以及聚合物對pEGFP的活性起到了良好的保護(hù)作用，pEGFP結(jié)構(gòu)的完整性和膠體穩(wěn)定性得到了較好地保持。 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物的合成a、將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物溶于二氯甲烷與吡啶的混合溶液中，加入對甲基苯磺酰氯，室溫條件下避光反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積的氯化氫溶液進(jìn)行萃取，有機(jī)層用堿進(jìn)行中和、過濾；蒸發(fā)除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯；b、將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯的氨水溶液置于耐壓容器中，于70～80℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，冷卻至室溫，用等體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，所得有機(jī)相與等體積的氫氧化鈉溶液混合，攪拌，分離，將所得有機(jī)層洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修飾物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基；c、將Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺，形成反應(yīng)介質(zhì)；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基的四氫呋喃溶液滴加到反應(yīng)介質(zhì)中，在38～45℃條件下反應(yīng)48～72小時，蒸干去除四氫呋喃，再用二氯甲烷溶解，然后用乙醚沉淀，得到氨基被保護(hù)的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段聚合物；d、將聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氫乙酸溶液中，得到質(zhì)量百分比濃度為10～20％的溶液，繼續(xù)攪拌至出現(xiàn)沉淀；靜置，將上層清液倒去；將所得沉淀透析，冷凍干燥，得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物；(2)將質(zhì)量體積比濃度為0.5μG/μL的核酸溶液加入到1.0mL質(zhì)量百分比濃度為8～20％的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚賴氨酸多嵌段聚合物溶液中，混合均勻，室溫條件下靜置，得到核酸的質(zhì)量體積比濃度為5～50μg/mL的聚合物/核酸復(fù)合物溶液；(3)向步驟(2)所得的聚合物/核酸序列復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分比濃度為10～20％的α-環(huán)糊精溶液，攪拌混合均勻，室溫條件下靜置，得到超分子水凝膠基因載體材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟a所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物的分子量為6000 15000，其中 乙二醇單元占乙二醇單元和丙二醇單元總數(shù)的57% 85%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟a所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物與對甲基苯磺酰氯的摩爾比為 1 : 2;所述二氯甲烷與吡啶的體積比為2 : 1，所述二氯甲烷與吡啶的混合溶液中每100毫 升混合溶液含有5 15克聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物；所述氯化氫溶液 的摩爾濃度為3mol/L ;所述堿為碳酸氫鈉，所述堿的用量為每100毫升有機(jī)相中加入3 5 克；所述避光反應(yīng)的時間為24 36小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟b所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_對甲苯磺酸酯的氨水溶液是將聚乙二醇_聚 丙二醇-聚乙二醇-對甲苯磺酸酯溶于濃氨水中形成質(zhì)量百分比濃度為5 20%的溶液， 所述濃氨水的質(zhì)量百分比濃度為25% ;所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為lmol/L ;所述反應(yīng) 的時間為16 24小時；所述攪拌為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600 1200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌的時間為2 4h ;所述洗至中性是用水洗至中性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于步驟c所述將NE-芐氧羰基-L-賴氨酸在攪拌條件下加到四氫呋喃中，在氬氣保護(hù)下加 熱至4(TC，得到質(zhì)量體積比為0. 02 0. 06g/mL的NE-芐氧羰基-L-賴氨酸分散液；將固 體光氣溶解于四氫呋喃中配成質(zhì)量濃度為6% 15%的溶液后，逐滴加入到『-芐氧羰 基-L-賴氨酸分散液中，所述NE-芐氧羰基-L-賴氨酸與固體光氣的摩爾比為2.5 : 1; 當(dāng)反應(yīng)體系開始透明時，用干燥的氬氣將反應(yīng)生成的氯化氫氣體鼓出，30 60分鐘后反應(yīng) 結(jié)束，蒸發(fā)除去四氫呋喃，得到無色油狀物質(zhì)；將所述無色油狀物質(zhì)用四氫呋喃溶解，得到 溶液，然后加入3倍溶液體積的石油醚進(jìn)行沉淀，過濾，室溫下真空干燥，得到NE -芐氧羰 基-L-賴氨酸-N-羧酸酐；聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基與NE -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐的摩爾比為i : 20 i : 40 ;所述N，N-二甲基甲酰胺與四氫呋喃的體積比為2 : i ;所述『-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐溶解于N， N- 二甲基甲酰胺形成質(zhì)量體積比濃度為0. 05 0. lg/ml ;所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基的四氫呋喃溶液的質(zhì)量體積比濃度為 0. 05 0. lg/ml ;所述沉淀是用3 5倍二氯甲烷體積的乙醚進(jìn)行沉淀。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟d所述攪拌為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600 1200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌的時間為30 60分鐘；所 述靜置的時間為20 60分鐘；所述透析的時間為3天；步驟(1) (3)所述室溫為5 35°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟(2)所述核酸為核糖核酸或脫氧核糖核酸；所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚 賴氨酸多嵌段聚合物溶液是將聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物溶解在水或磷 酸鹽緩沖溶液中；所述靜置的時間為15 30分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠基因載體材料的制備方法，其特征在于 步驟(3)所述a-環(huán)糊精溶液是將a-環(huán)糊精溶解在水或磷酸鹽緩沖溶液中；所述靜置的 時間為6 12小時。
9. 一種根據(jù)權(quán)利要求1 8所述方法制備的超分子水凝膠基因載體材料。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的超分子水凝膠基因載體材料應(yīng)用于制備可注射藥物載體或 可注射基因載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超分子結(jié)構(gòu)水凝膠基因載體材料及其制備方法和應(yīng)用。該方法包括以下操作步驟通過對聚賴氨酸修飾聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物端基的修飾，合成出含有陽離子鏈段的多嵌段聚合物，然后將此聚合物與DNA溶液混合，得到DNA復(fù)合物膠束；進(jìn)一步將此膠束溶液與α-環(huán)糊精溶液混合后攪拌，室溫下靜置，得到水凝膠。該水凝膠可用于制備可注射基因載體。本發(fā)明具有操作簡單、凝膠強(qiáng)度和凝膠化時間可調(diào)、室溫成型、不涉及化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)以及有機(jī)溶劑的使用、獲得的凝膠具備溫度敏感性、良好的生物相容性和明顯的轉(zhuǎn)染效果等優(yōu)勢，有望在生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號A61K47/34GK101716346SQ200910213939
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者嚴(yán)勵, 張宏斌, 張黎明, 李娜, 楊川, 馬棟 申請人:中山大學(xué)