專利名稱：納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種具有近紅外吸收功能和光熱轉(zhuǎn)換性能
的、貴金屬納米材料及制備方法和利用光熱轉(zhuǎn)換性能在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用，具體地說 是提供了一種納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
幾十年來金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域研究的焦點是貴重金屬的納米材料由于在催 化，感光，光電子，信息存儲，生物傳感器，表面增強拉曼光譜(Raman)散射等領(lǐng)域具有現(xiàn)實 的和潛在的應用前景。金屬納米材料的基本物理性質(zhì)與其尺寸、形貌和結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。最 近幾年，空的納米金膠體由于其具有獨特的物理性質(zhì)和廣闊的應用前景引起了科學界的廣 泛關(guān)注?？盏募{米金結(jié)構(gòu)在近紅外區(qū)(800nm-1200nm人體組織的透射窗口 )的特殊吸收性 質(zhì)使其成為理想的光熱轉(zhuǎn)換的藥物載體，這在生物醫(yī)學上具有重要意義。有人提出，調(diào)整納 米金殼在紅外區(qū)的吸收，并將其注射到一定深度的生物組織當中去，用適當?shù)募t外光照射， 使其進行光熱轉(zhuǎn)換達到熱療目的。美國科學家正在嘗試將這種材料用于紅外熱療治療癌 癥。Y.Xia研究組在Science上報導了高質(zhì)量Au、Ag立方體納米顆粒的合成及結(jié)構(gòu)。他們 利用多羥基過程以乙二醇為還原劑，以PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)為分散劑和保護劑通過對 反應溫度、反應時間和化學配比的控制，制備了 Ag的球、線、立方晶并以其為模板分別制備 了空的Au球殼、管、盒子并對其吸收性質(zhì)進行了測試，發(fā)現(xiàn)了金納米球殼在近紅外區(qū)域具 有強的表面等離子體共振吸收特性。2003年，美國的Halas小組報導了將包覆在Si02球上 的Au殼(100nm)置于生物體中，成功殺死癌細胞的實驗結(jié)果，展示了金屬納米材料在癌癥 治療方面誘人的前景。納米球殼可與一定的抗體結(jié)合，該結(jié)合物在抗體的驅(qū)動下移向抗原， 從而準確的完成細胞的靶向定位。同時她們又提出許多新想法，她們認為，可以同時利用納 米球殼對近紅外光的吸收特性實現(xiàn)對腫瘤組織的殺傷，又可以利用其對光的散射作用進行 光學成像實現(xiàn)對病變部位的監(jiān)測。最近Y. Xia研究組將金納米盒子與與乳腺癌癥腫瘤細胞 靶向連接，在培養(yǎng)皿中通過紅外激光輻照取得了很好的療效[5]，更清晰地展示了金屬納米 材料在紅外治療方面的誘人前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種納米金球殼材料，具有可調(diào)制的近紅外吸收功能和優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn) 換性質(zhì)。 本發(fā)明進一步公開了上述納米金球殼材料的制備方法，具有操作簡單，重復性好， 制得的材料其物理性能穩(wěn)定的特點。 本發(fā)明還公開了該納米金球殼材料在制備抗癌藥物中的用途。
本發(fā)明的納米金球殼材料，其特征在于 為準球殼形，內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，球的直徑在20 100nm之間，球殼的厚度大約為 5nm，紅外吸收見圖2，光熱轉(zhuǎn)換特性見圖3。
本發(fā)明納米金球殼材料的制備方法，包括以下步驟 1、合成銀納米粒子，使其均勻分散于去離子水中，形成水溶膠在lOOmL去離子水中分別加入0. 2M硝酸銀水溶液和等量的0. 2M表面活性劑，攪
拌30min，使其混合均勻；然后一次性加入0. 01M還原劑溶液，攪拌60min后停止，制得的銀
納米水溶膠為淺黃色； 2 、還原氯金酸形成金殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取10mL由步驟1制得的納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL，充分攪拌；置 于IO(TC回流10分鐘，逐滴滴入0. OOIM氯金酸(HAuCl4)水溶液，充分反應，使含銀納米顆 粒模板在回流狀態(tài)下還原氯金酸(HAuCl》，形成殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料； 所述的表面活性劑選自檸檬酸或十六烷基_3-甲基溴化銨或聚乙烯吡咯烷酮； 所述的還原劑包括硼氫化納(NaBH4)或抗壞血酸； 反應式如下BH4—+2H20+8Ag+ — 8Ag+B02—+8H+ 3Ag (s) +AuCl4— (aq) — Au (s) +3Ag+ (aq) +4C1— (aq) 本發(fā)明納米金球殼材料為空的納米結(jié)構(gòu)，呈球形，通過控制實驗條件，球的直徑可 以控制在20 100nm之間；球殼的厚度大約為5nm(見圖1)，可以分散在水溶液中，形成一 種穩(wěn)定的水溶膠，水溶膠為深藍色。 發(fā)明具有良好的水溶性、熱穩(wěn)定性以及對光有強的紅外吸收(見圖2)，隨著滴入 氯金酸(HAuCl4)體積的增加吸收峰位發(fā)生紅移，在(700-lOOOnm)的波長范圍內(nèi)，并可移至 近紅外區(qū)吸收進紅外光。 本發(fā)明的光熱轉(zhuǎn)換特性見圖3，當按體積比稀釋不同濃度的樣品經(jīng)波長為 808-nm(功率密度5W/cm2)近紅外激光照射后，溫度迅速升高。
以下實驗表明本發(fā)明在抑制腫瘤生長中的作用
試驗例1 圖3為加入不同濃度金納米球殼細胞經(jīng)2W/cm2激光照射不同時間的抑制率曲線。 納米球殼的初始濃度約為5ii g/mL，分別按體積比的60%、80%、100%加入到細胞中。如圖 所示，對細胞的抑制率隨樣品濃度的增大和照射時間的延長而升高，照射30min后最高的 抑制率為60%，與對照組比較(P < 0. 05)，重復實驗結(jié)果相似。 按體積比將樣品稀釋為不同濃度(25-100% )，經(jīng)波長為808-nm(功率密度5W/ cm2)的近紅外激光照射后，溫度迅速升高。在10min內(nèi)溫度最高可升高3(TC。見圖4。
試驗例2
體外細胞試驗
(1)小牛血清制備 冷凍的小牛血清置于4°C的冰箱融化后，56t:水浴30min滅活補體，分裝于10mL的
小瓶內(nèi)，-2(TC保存，用前融化。 (2)胰酶配制 配制濃度為25%的胰蛋白酶。稱取胰蛋白酶O. 25g，溶于100mL生理鹽水中，加 NaHC(^調(diào)pH 7. 2，充分溶解后，G6漏斗過濾除菌，10mL小瓶分裝后保存與_20°C ，用前融化。
(3)細胞培養(yǎng)
細胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清的全營養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于37°C ， 5% C02， 95%空氣和
100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞每兩天傳代換液一次。 (4)細胞凍存用0. 25%的胰酶消化收集生長狀態(tài)良好的細胞，1500rpm離心5min，棄上清，加入 細胞冷凍液(含20%小牛血清，10% DMS0， 70%培養(yǎng)基)，混勻，細胞濃度為0. 5 1 X 107/ mL，4t:放兩小時，-2(TC過夜，于_701:放置兩個小時，置于液氮中長期保存。
(5)細胞存活試驗 3-(4， 5- 二甲基噻唑-2?；?_2， 5 二苯基四氮唑溴鹽，簡稱MTT或噻唑藍。 根據(jù)細胞代謝活動與活細胞數(shù)直接成比例的原理，通過測定靶細胞代謝活性的減
少來反映實驗藥物所致靶細胞的死亡。氧化型MTT進入細胞后被線粒體脫氫酶還原生成紫
色formazan顆粒，經(jīng)溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細胞數(shù)有關(guān)，與靶細胞對
照孔比較可計算效應細胞殺傷靶細胞百分率。 采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活性。 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，用0. 25%的胰酶消化，調(diào)細胞濃度為4X10VmL，接種 于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)16h，待細胞完全貼壁后，每孔加入樣品(樣品在加入前經(jīng)過離心分 離、水洗，并高壓滅菌處理)，終體積為100 ii L，設三個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用808nm的激 光輻照后，每孔加入MTT (5mg/mL) 10 y L，繼續(xù)培養(yǎng)至少4h，小心吸棄上清液，加二甲基亞砜 (100 y L/孔)，輕微震蕩，檢測A492光密度值。 抑瘤率(IR) % = (l-實驗組平均光密度值/對照組平均光密度值)％
加入金納米球殼的細胞經(jīng)不同功率的激光照射后抑制率隨激光功率的升高而升 高。提高激光照射功率對于抑制率的提高有著明顯的作用，在加金納米球殼的實驗孔中抑 制率接近90%，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。見圖4。 取傳代的H印-A-22細胞進行培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并攝影，結(jié) 果如圖5所示。接種24h后，H印-A-22細胞亮度較高，折光性好，細胞緊密相靠，連接成片， 細胞形狀不規(guī)則，有梭形細胞存在，這說明此時的細胞處于分裂期，具有較高的活性。接種 后加入金納米球殼并經(jīng)激光輻照，培養(yǎng)24h后，細胞呈球形彼此重疊堆積在一起，亮度低， 表明細胞的狀態(tài)較差，活性降低，處于凋亡期。
試驗例3 體內(nèi)測溫將0. lmL樣品注射到小鼠右后腿部(距體表約2mm) ， 20min后將測溫儀
的溫度探頭用套管針深入到小鼠右后腿注射過樣品的部位，用除毛膏除去小鼠腿部的毛，
用功率密度為1. 5W/cm2的激光照射小鼠腿部，同時在測溫裝置上監(jiān)測溫度變化。 由圖7可以看出，注射了本發(fā)明樣品的小鼠腿部經(jīng)激光照射后溫度升高較快，持
續(xù)照射6min后，溫度升高到4(TC以上，并且在激光的照射下繼續(xù)升高。因此，我們可以通過
調(diào)節(jié)激光器的輸出功率來控制溫度使其恒定在40-45t:之間，通過熱作用殺死腫瘤細胞，抑
制腫瘤生長。 本發(fā)明的積極效果在于 本發(fā)明納米金球殼材料經(jīng)近紅外激光照射后，將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，使局域 范圍內(nèi)的溫度升高，以殺死腫瘤細胞(腫瘤細胞在42t:左右可被殺死)，抑制腫瘤組織的生 長或與抗腫瘤藥物一起使用，提高藥效，達到治療目的。
5
納米金球殼狀材料具有可調(diào)制的近紅外吸收特性和優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn)換性質(zhì)。在生物 醫(yī)學、生物探測等微觀技術(shù)領(lǐng)域里極具實用性，即可作為顯影劑應用在紅外斷層成像技術(shù) 中，又可作為熱敏劑用于紅外熱療中治療腫瘤等疾病和促進藥效。本發(fā)明作為顯影劑比臨 床上使用的有機染料具有更好的穩(wěn)定性，不易分解，光穩(wěn)定性好；比放射性元素更安全；作 為熱敏劑，它可以吸收紅外光，可減少對人體的傷害。


圖1本發(fā)明納米金球殼材料的形貌和中空殼狀結(jié)構(gòu)圖。
圖2本發(fā)明納米金球殼材料的吸收光譜圖。 圖3本發(fā)明納米金殼材料的細胞的抑制率隨照射時間的變化曲線圖。
圖4本發(fā)明納米金球殼材料的光熱轉(zhuǎn)換性質(zhì)圖。
圖5本發(fā)明納米金球殼材料癌細胞抑制率。 圖6本發(fā)明納米金球殼材料接種入細胞后，用808nm激光輻照前后細胞形態(tài)變化
(左處于分裂期的活細胞；右輻照后凋亡的細胞)。 圖7本發(fā)明金納米殼材料注入小鼠體內(nèi)后的測溫曲線。
具體實施方式

實施例1 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M檸檬酸，充分攪 拌；性加入濃度為10mM lmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出銀納米水 溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
實施例2 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M Ag冊3水溶液；加入lmL 0. 2M十六烷基-3-甲 基溴化銨溶液，充分攪拌；加入濃度為10mM lmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停 止，制得出銀納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
實施例3 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M聚乙烯吡咯烷 酮水溶液，充分攪拌；加入濃度為lOmMlmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停止，制 得出銀納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至lOOmL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于100°C回流10分鐘，再逐滴滴入3mL ImM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
實施例4 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M檸檬酸，充分攪 拌；加入濃度為10mM lmL抗壞血酸溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出銀納米水溶膠；
2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
實施例5 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M Ag冊3水溶液，加入lmL 0. 2M十六烷基-3-甲 基溴化銨溶液，充分攪拌；加入濃度為10mM lmL抗壞血酸溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出 銀納米水溶膠。 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取10mL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
實施例6 納米金球殼狀材料制備過程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M聚乙烯吡咯烷 酮水溶液，充分攪拌；加入濃度為10mM lmL抗壞血酸溶液。攪拌60分鐘后停止，制得出銀 納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分攪拌，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應30分鐘，至反應液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍色。
權(quán)利要求
一種納米金球殼材料，其特征在于為準球殼形，內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，球的直徑在20～100nm之間，球殼的厚度大約為5nm，紅外吸收光普見圖2，光熱轉(zhuǎn)換特性見圖3。
2. 權(quán)利要求1所述納米金球材料的制備方法，包括以下步驟1) 合成銀納米粒子，使其均勻分散于去離子水中，形成水溶膠在100mL去離子水中分別加入0. 2M硝酸銀水溶液和等量的0. 2M表面活性劑，攪拌30min，使其混合均勻；然后一次性加入0. 01M還原劑溶液，攪拌60min后停止，制得的銀納米水溶膠為淺黃色；2) 還原氯金酸形成金殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取10mL由步驟1制得的納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL，充分攪拌；置于IO(TC回流10分鐘，逐滴滴入0. 001M氯金酸(HAuCl4)水溶液，充分反應，使含銀納米顆粒模板在回流狀態(tài)下還原氯金酸(HAuCl》，形成殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料；所述的表面活性劑選自檸檬酸或十六烷基_3-甲基溴化銨或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇；所述的還原劑包括硼氫化納(NaBH4)或抗壞血酸。
3. 權(quán)利要求1所述的納米金球殼材料在制備抗癌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應用，屬于金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域。利用濕化學法，選擇金為研究內(nèi)容，通過有機和無機溶液的界面進行反應制得。本發(fā)明納米金球殼材料經(jīng)近紅外激光照射后，將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，使局域范圍內(nèi)的溫度升高，以殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤組織的生長或與抗腫瘤藥物一起使用，提高藥效，達到治療目的。還可作為顯影劑應用在紅外斷層成像技術(shù)中，又可作為熱敏劑用于紅外熱療中治療腫瘤等疾病和促進藥效。本發(fā)明作為顯影劑比臨床上使用的有機染料具有更好的穩(wěn)定性，不易分解，光穩(wěn)定性好；比放射性元素更安全；作為熱敏劑，它可以吸收紅外光，可減少對人體的傷害。
文檔編號A61K47/32GK101711872SQ200910217880
公開日2010年5月26日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者宋宏偉, 王宇, 白雪, 董彪 申請人:吉林大學