專利名稱：一種硫酸化絲素蛋白的新制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在不使用有機溶劑的條件下制備硫酸化絲素蛋白的新方法。
背景技術(shù)：
血栓疾病是最常見的心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅人類的的健康。我國資料表明，腦血 管病是心臟病的第一大死因，每15秒鐘就一個人被心腦血管病奪去生命。因此我們應(yīng)對血 栓疾病有足夠的重視。目前血栓疾病的治療主要是抗血小板治療(阿司匹林、ADP受體拮 抗體)和抗凝治療(普通肝素、低分子肝素)。 抗凝血藥是一類干擾抗凝因子藥物，可以阻止血液凝固。肝素是一類天然的抗凝 血物質(zhì)，大量存在于動物器官和組織(如小腸和肝臟)，具有起效迅速，在體內(nèi)外均有抗凝 的作用，但是長期使用會引起出血、導(dǎo)致血小板減少或骨質(zhì)疏松并發(fā)癥。而且肝素類藥物價 格昂貴，從而限制了它的應(yīng)用。 絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然的蛋白質(zhì)。通過生物體整體、細(xì)胞和分子生物學(xué)3 個水平的實驗研究結(jié)果表明它應(yīng)用在人體是安全的。另外，絲素蛋白具有良好的生物相容 性，而且原料來源很豐富，在濕態(tài)下力學(xué)性能良好、體內(nèi)容易降解、降解產(chǎn)物無毒。同時絲素 蛋白還具有良好的透氧、透氣等許多獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，易應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域?，F(xiàn)已廣 泛應(yīng)用于藥物緩釋載體，人造皮膚，抗凝血物質(zhì)等生物材料上。 絲素蛋白中含有許多由6種氨基酸殘基交替排列的結(jié)構(gòu) (Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)，其中Ser之間的距離，與肝磷脂中有抗凝血作用的重要基 團硫酸基的距離十分相近，故若能在Ser中引入硫酸基，也能制造出類似肝磷脂的結(jié)構(gòu)，則 可賦予絲素以抗凝血作用。硫酸化絲素蛋白除了有抗凝血作用外還有抗艾滋病作用。由日 本農(nóng)業(yè)生物資源研究所的昆蟲新素材開發(fā)研究室玉田靖等的研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化絲素蛋白具 有阻止病毒與免疫細(xì)胞表面蛋白質(zhì)相結(jié)合的功能。用絲素制備的硫酸化絲素蛋白具有成本 低，安全性高的特點，是一種很有前途的抗凝血藥和抗艾滋病藥劑。 關(guān)于制備硫酸化絲素蛋白，國內(nèi)報道的有蘇州大學(xué)的尹桂波從蠶絲中經(jīng)脫膠提取 絲素蛋白，用氯磺酸在吡啶中加熱反應(yīng)，得到硫酸化的絲素蛋白。(國外絲綢，2004， (2); 16)。這種方法由于用到了有機溶劑吡啶，而殘留的吡啶等有機溶劑將會對其在食品或藥 品中的應(yīng)用產(chǎn)生不利影響。還有浙江中醫(yī)藥大學(xué)的樓蘭花等申請的中國專利(公開號CN 101029079A)提出了用氯磺酸-惰性溶劑的方法來制備硫酸化絲素蛋白，此方法用到了有 機強酸氯磺酸，反應(yīng)比較劇烈；該反應(yīng)中使用了二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、 二甲亞砜等惰性溶劑中的一種或幾種，這樣反應(yīng)產(chǎn)物中殘留的有機溶劑會影響硫酸化絲素 蛋白安全性；另外此反應(yīng)是在氮氣或干燥劑保護條件下發(fā)生的，反應(yīng)條件比較苛刻。
國外有關(guān)絲素蛋白制備硫酸化絲素蛋白抗凝血的研究，Yasushi Tamada等從 蠶絲或蠶繭中經(jīng)脫膠提取絲素蛋白，用硫酸來進行硫酸化反應(yīng)，得到硫酸化的絲素蛋白。 (Sulfation of silk fibroin by sulfuric acid and anticoagulantactivity. [J]， Journal of Applied Polymer Science, 2003， 2377-2382) 。YasushiTamada還有從蠶絲或蠶
3繭中經(jīng)脫膠提取絲素蛋白，用氯磺酸在吡啶中加熱反應(yīng)，得到硫酸化絲素蛋白。(Sulfation of silk fibroin by chlorosulfonic acid andthe anticoagulant activity. [J]， Biomaterials 25，2004，377—383)。 總之，當(dāng)前硫酸化絲素蛋白的制備過程中，普遍使用吡啶等有毒有機溶劑，這樣殘 留的試劑可能會影響其應(yīng)用。此外，使用氯磺酸，濃硫酸等強酸使反應(yīng)激烈，不易控制，而且 會對環(huán)境造成影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前國內(nèi)存在的問題和不足，利用原料豐富的蠶絲或蠶繭， 提出了一種在完全不使用有機溶劑的條件下制備硫酸化絲素蛋白的新方法。該方法工藝流 程簡單、生產(chǎn)成本低、容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、無環(huán)境污染。與其他硫酸化方法不同，在此制備 技術(shù)中，一個最具吸引力的特點就是采用干燥加熱的方式來實現(xiàn)絲素蛋白的硫酸化。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的硫酸化絲素蛋白的制備方法，主要包括以下內(nèi)容
(1)蠶繭殼或廢蠶絲用濃度為0. 5%的脫膠劑進行脫膠處理，得到絲素蛋白。
(2)絲素蛋白經(jīng)過鹽處理得到水溶性絲素蛋白。
(3)把絲素蛋白溶解于水中，加入硫酸氫鹽，調(diào)節(jié)pH后定容。 (4)冷凍干燥上述溶液后，得到的絲素蛋白-硫酸氫鹽混合粉末在50-ll(TC的干 燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1-5天。 (5)產(chǎn)物經(jīng)過透析，冷凍干燥最后得到硫酸化絲素蛋白。 第(1)步所示的絲素是從廢蠶繭或廢蠶絲中提取的，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2% (2%最 佳)的蠶絲放入在0. 5% Na2C03煮至沸騰30min，精煉2次，用蒸餾水充分洗滌3次，然后在 8(TC下干燥得到絲素蛋白。 第(2)步制備水溶性絲素蛋白是將脫膠的絲素蛋白投入煮沸的CaCl2溶液中處理 10min。 40% CaCl2的質(zhì)量濃度為0. 5g/mL，浴比為1 : 20。將處理后得到的溶液灌入最低截 留分子量分別為10kDa的透析袋中，流水透析3d，然后冷凍干燥，可得到水溶性絲素蛋白。
第(3)步-第(4)步將水溶性溶性的絲素蛋白溶解于水中，攪拌30-60min，并在此 溶液中加入硫酸氫鹽，調(diào)節(jié)PH后定容，冷凍干燥上述溶液后，在50-110°C的干燥加熱條件 下進行硫酸化反應(yīng)1-5天。 第(5)步在蒸餾水中透析2-4天，再將透析液冷凍干燥。 上述制備方法中所述的硫酸氫鹽為硫酸氫鈉，也可以是硫酸氫鉀等類似物。 上述制備方法中所述的干燥技術(shù)除冷凍干燥之外，如果制備量大時還可用設(shè)備是
常規(guī)的，技術(shù)上眾所周知的噴霧干燥等干燥技術(shù)。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點如下 1、無污染。本發(fā)明中不使用任何有機溶劑，不會對環(huán)境造成污染。 2、本發(fā)明硫酸酯化試劑是硫酸氫鈉，而非以前報道的氯磺酸、濃硫酸等強酸，對環(huán)
境危害小。 3、本發(fā)明以廢蠶絲(落綿)或下腳蠶繭為原料制備硫酸化絲素蛋白，一方面可以 充分利用紡織工業(yè)中的廢絲下腳料，另一方面可以降低生產(chǎn)成本。此外，該硫酸化絲素蛋白 制備所用的試劑均為常見試劑，價格低廉，操作簡單，對生產(chǎn)設(shè)備要求不高，生產(chǎn)成本低，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 4、反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度、pH、加熱時間)可控。 5、意義深遠。本發(fā)明中的硫酸化絲素蛋白除了有很好的抗凝血活性，另外對開發(fā) 抗癌、抗艾滋病、抗血栓等藥物具有深遠的意義。


圖1是絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白的紅外光譜比較圖。a，絲素蛋白；b，硫酸化絲 素蛋白。
具體實施例方式
下面結(jié)合實例，對本發(fā)明進行進一步的闡述。
實施例1 硫酸化絲素蛋白的制備0. 5g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 50°C的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與水 中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。所 得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測定 硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為2. 90%。
實施例2 硫酸化絲素蛋白的制備0. 5g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 80°C的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與水 中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。所 得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測定 硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為2. 60%。
實施例3 硫酸化絲素蛋白的制備0. 5g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 IO(TC的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與 水中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。 所得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測 定硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為6. 90%。
實施例4 硫酸化絲素蛋白的制備1. 0g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。 透析完畢后，加入KHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在IO(TC的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與 水中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。 所得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測 定硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為7. 10%。
實施例5 硫酸化絲素蛋白的制備1. 0g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 IO(TC的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)2天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與 水中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。 所得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測 定硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為8. 10%。
實施例6 硫酸化絲素蛋白的制備1. 0g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 IO(TC的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)3天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與 水中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。 所得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測 定硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為6. 50%。
實施例7 硫酸化絲素蛋白的制備1. 0g的絲素蛋白加入沸騰的40%的CaCl2溶液中，加熱 2-5min至絲素蛋白溶解。迅速冷卻，進行離心，除去不溶物。上清液在流水中進行透析。透 析完畢后，加入NaHS04，用NaOH調(diào)節(jié)pH ;冷凍干燥上述絲素蛋白_硫酸氫納混合溶液；在 IO(TC的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)5天，反應(yīng)結(jié)束后，把絲素蛋白-硫酸氫納溶解與 水中并在流水中透析2天以除去未反應(yīng)的硫酸氫鹽，最后冷凍干燥得到硫酸化絲素蛋白。 所得的硫酸化絲素蛋白經(jīng)紅外光譜(IR)分析，在618cm—工處可觀察到SS03振動峰；通過測 定硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為4. 30%。 最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限 于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接 導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種硫酸化絲素蛋白的新制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將廢蠶繭和廢蠶絲經(jīng)過脫膠劑進行脫膠得到絲素蛋白；(2)絲素蛋白經(jīng)過鹽處理得到水溶性絲蛋白；(3)將水溶性絲素蛋白溶解于水中，攪拌30-60min，并在此溶液中加入硫酸氫鹽溶液，調(diào)節(jié)pH后定容；(4)冷凍干燥上述溶液后，在50-110℃的干燥加熱條件下進行硫酸化反應(yīng)1-5天；(5)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過透析、冷凍干燥后得到硫酸化絲素蛋白。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，脫膠劑為N C(V
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(2)中，用CaC^來進行鹽處理。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，絲素蛋白的硫酸化反應(yīng)是在硫酸氫鈉或其類似物存在時發(fā)生。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，絲素蛋白的硫酸化反應(yīng)是在干燥加熱的條件下發(fā)生。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，絲素蛋白的硫酸化反應(yīng)溫度是50-1 l(TC
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中，絲素蛋白的硫酸化反應(yīng)時間是1-5天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硫酸化絲素蛋白的新制備方法。具體就是包括將絲素蛋白溶于含有硫酸氫鹽的溶液；調(diào)節(jié)pH后冷凍干燥；把冷凍干燥后的硫酸氫鹽-絲素蛋白混合物在干燥條件下加熱1-5天進行硫酸化反應(yīng)；透析、冷凍干燥后得到硫酸化絲素蛋白等步驟。本發(fā)明的優(yōu)點為制備過程中完全不使用有機溶劑，硫酸化產(chǎn)物安全且可避免環(huán)境污染；工藝流程簡單，條件可控，生產(chǎn)成本低，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明中的硫酸化絲素蛋白可應(yīng)用在抗凝血藥物上，具有顯著的抗凝血、抗血栓活性。在抗凝血、抗癌活性，對開發(fā)抗凝血材料等生物材料有重要的意義。
文檔編號A61K38/16GK101704876SQ20091021824
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者張媛圓, 成偉華, 李燦鵬, 趙卉 申請人:云南大學(xué)