專利名稱：Cntf(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活物在治療肥胖癥上的用途的制作方法
CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活物在治療肥胖癥上的
用途 本申請是專利號為97180757. 4、發(fā)明名稱為"CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活 物在治療肥胖癥上的用途"、申請日為1997年11月18日的專利申請的分案申請。
本發(fā)明的主題是激活CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體的分子_例如hCNTF(人 CNTF)或hCNTF的突變體_作為有效成分在制備適于治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病之藥物 組合物上的用途。術(shù)語hCNTF突變體意指理論上可以從hCNTF經(jīng)一個或多個氨基酸取代衍 生的氨基酸序列。 在工業(yè)國家中影響成年人口 30%的肥胖癥，是一個主要的公共衛(wèi)生問題，因為它 與II型糖尿病、高血壓、血脂過多和增加的死亡率有關(guān)。肥胖癥是陽性能量平衡的結(jié)果，即 熱量攝入與能量消耗提高的比例的結(jié)果。由于在故意的和非故意的改變后恢復(fù)脂肪群的機 制的操作，治療一般是不成功的(1)。脂郁積(lipostasis)理論提出體脂肪貯存的多少由 反饋環(huán)調(diào)節(jié)，所說的反饋環(huán)由脂細胞來源的循環(huán)分子構(gòu)成，這些分子作用于下丘腦降低食 欲并增加能量消耗(2)。 最近鑒定的16-千道爾頓血漿蛋白質(zhì)l印tin滿足許多從這樣的脂郁積激素預(yù)期 的標(biāo)準(zhǔn)(3)。在嚙齒類和人類中，它在脂肪組織中表達，并且其血漿水平與體重指數(shù)密切相 關(guān)(4)。在肥胖(ob/ob)突變小鼠中缺乏l印tin導(dǎo)致體脂肪大量增加，這可以由全身施用 重組蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)(5，6，7)。然而，人肥胖癥似乎不是由于l印tin缺損的表達，因為相對于瘦 人而言，在胖人中顯示增加的l印tin信使核糖核酸和血漿蛋白質(zhì)水平(4)。這樣，胖人可 能對l印tin的脂郁積作用不靈敏，有可能是因為在l印tin轉(zhuǎn)運水平，l印tin受體活性，或 后_受體性信號機制上有缺陷(8)。 這樣，在這一特殊領(lǐng)域中需要一些在對l印tin具有抵抗力的人群中能夠治療肥 胖癥的新藥劑。 L印tin抗性是糖尿病(db/db)小鼠突變體的特征，該突變體表達缺乏大多數(shù)胞質(zhì) 內(nèi)結(jié)構(gòu)域的l印tin受體的截短的形式(9)。更密切類似人肥胖癥的動物模型是由飼喂高脂 肪食物產(chǎn)生的小鼠(DI0小鼠)的模型。類似于人肥胖癥患者，DIO小鼠具有提高的l印tin 的血漿水平(4)，說明它們對激素的體重減輕作用比較不靈敏。 本發(fā)明提供了生物活性的抗肥胖劑，其可以逆轉(zhuǎn)肥胖，以及與此相聯(lián)系的血糖過 多和血胰島素增多。 因此，本發(fā)明的主題是激活CNTF受體的物質(zhì)在制備適于治療肥胖癥和與其相關(guān) 的疾病之藥物上的用途。這些物質(zhì)可以是hCNTF(人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；SEQ ID N0:1)自身 或者其突變體(參見例如SEQ IDN0:2-28)。采用hCNTF突變體(Serl66Asp/Glnl67His)， 已經(jīng)獲得了良好的結(jié)果，該突變體在159位到178位，具有下列氨基酸序列(如所附序列 表中SEQID N0:5所示)丄eu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser IleHis Asp Leu Arg Phe [為簡便起見，這一 hCNTF突變體在下文也將稱為DH-CNTF]。為 簡便起見，在所附序列表中，僅標(biāo)明了突變體SEQID NO :2-22的159-位到178位的部分。
本發(fā)明的另一個主題是編碼hCNTF或其突變體的DNA在制備用于治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病的組合物上的用途。 本發(fā)明也具有作為其主題的用于治療肥胖癥和減輕體重的藥物，該藥物含有作為至少一種有效成分的hCNTF或其突變體，并且含有藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體指對患者不危險，不降解或不使有效成分失活或者不干擾有效成分的作用的載體。優(yōu)選的載體是生理鹽溶液，但是也可以施用其它藥學(xué)上可接受的載體，并且易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定。在已顯示出好的結(jié)果的實施方案中，hCNTF或其突變體可以用于與l印tin組合在這種情況下，野生型或突變型CNTF/l印tin的比率可以在1 : 500-1 : 5，優(yōu)選地
在i : ioo-i : 25的范圍內(nèi)選擇。 hCNTF或hCNTF變體可以以約1_10， 000 y g/kg體重范圍內(nèi)的劑量施用給需要治療的患者。優(yōu)選的劑量在10和1000 ii g/kg體重之間。成年人典型的日劑量在1和100mg之間。按照本發(fā)明的有效成分的必需量可以以每日一次用藥或全天多次用藥來施用。治療方案可以需要延長期的施用。所施用的劑量大小須由醫(yī)生確定，并且取決于一些因素，如疾病的性質(zhì)與特性，患者的年齡和健康狀況，患者對藥物自身的耐受性。 在特定的實施方案中，為了獲得快速體重的顯著的降低(5-10% )(使用適當(dāng)?shù)纳攀澈?或體育鍛煉可以持續(xù)保持這種狀態(tài))，可以借助短期(1-2周)每日施用hCNTF或其突變體來治療肥胖患者。 活性蛋白質(zhì)分子可以配制來供腸胃外，鼻，支氣管或眼施用。按照本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地是借助注射腸胃外施用。在優(yōu)選的實施方案中，腸胃外施用是皮下或肌內(nèi)施用。其它施用的有效方法是施用靜脈內(nèi)注射劑，緩釋腸胃外制劑，吸入霧劑，或栓劑。在緩釋制劑中，主要溶劑可以是含水或非水類型的。此外，載體可以含有保持或改變制劑的pH值，粘度，澄清度，顏色，無菌性，穩(wěn)定性，分解速度或氣味的其它藥理學(xué)上可接受的賦形劑。同樣，載體也可以含有改變或保持有效成分的穩(wěn)定性，分解速度，釋放，或吸收的其它藥理學(xué)上可接受的賦形劑。這些賦形劑是通常用來配制供腸胃外施用的藥劑(單劑形式和多劑形式)的物質(zhì)。 如上所提及的，按照本發(fā)明的制劑的優(yōu)選的腸胃外施用形式是皮下或肌內(nèi)。最優(yōu)選的腸胃外施用形式是皮下。為了獲得有效成分的所需日劑量，采取單次或重復(fù)皮下或肌內(nèi)注射是可能的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，有效成分的劑量在10和1000 ii g/kg/天之間。為了治療肥胖癥，周期性地施用有效成分可能是合乎需要的。周期性地施用可以采取每月，每一兩周，每周，每日或每小時施用一次的形式。施用所需的頻率對基于標(biāo)準(zhǔn)的觀測技術(shù)治療患者的醫(yī)生而言是顯而易見的。 考慮按照本發(fā)明的藥物制劑的口服也是可能的。在這種情況下，所施用的有效成分優(yōu)選地是膠囊化的?？梢阅z囊化的有效成分可以用或不用通常用于制備固體藥劑的載體配制。優(yōu)選地，當(dāng)生物利用度被最大化，同時前_系統(tǒng)降解被最小化時，膠囊以使得制劑的活性部分在胃腸道中釋放的方式制備。所說的制劑也可以包含以有利于有效成分的吸收為目的的其它賦形劑。使用稀釋劑，調(diào)味劑，低熔點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，膠囊分解劑和結(jié)合劑也是可能的。 特定的劑量按照患者的近似體重計算，而不依賴于施用方法。確定適當(dāng)?shù)闹委焺┝克璧挠嬎愕钠渌ぷ饔杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)進行，他們可以獲得這些結(jié)果而不需要過度的實驗，尤其是在本文所提供的試驗和用藥信息的教導(dǎo)下。
按照本發(fā)明，對肥胖患者施用治療有效量的有效成分。如上所提及的，所需的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定而無須過度的實驗。 〃 治療有效量〃 可以被定義為足以引起足夠的體重減輕并且導(dǎo)致代謝參數(shù)(如肥胖患者的血液葡萄糖水平)后續(xù)正?；挠行С煞值牧俊?到現(xiàn)在為止，已經(jīng)給出了本發(fā)明的一般性描述。借助于下列實施例，參照特定的實施方案，以下給出更詳細的說明，目的是為了更好地理解本發(fā)明的目的，特征，優(yōu)點和操作方法。然而，無意于將本發(fā)明的范圍限定在此范圍內(nèi)。
附圖描述 圖lhCNTF和l印tin在遺傳性肥胖小鼠(ob/ob和db/db)和患飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)的小鼠中對體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。在第0天開始，小鼠每日接受腹膜內(nèi)注射的載體或蛋白質(zhì)(數(shù)量以Pg/只小鼠表示)。體重以在-2天的原始體重的百分數(shù)表示，并表示為平均值± s. e. m(對ob/ob和db/db n = 3，對DI0小鼠n=5)。每一組載體處理的動物的基線重量(克)為ob/ob，49.3士0.3 ;db/db，39. 1±2.5 ;DIO， 42. 6±0. 8。由重復(fù)測量AN0VA確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。對于所有組，處理的作用，時間以及時間X處理的P-值分別是P < 0. 05， P < 0. 0001和P < 0. 01。 圖2在DI0小鼠中，單獨施用或組合施用hCNTF(2ii g/只小鼠)和l印tin (100 y g/
只小鼠)對體重減輕的作用。小鼠每日接受腹膜內(nèi)注射的所示的藥劑。 圖3在肥胖對瘦小小鼠中，DH-CNTF對體重和食物攝取的作用的持續(xù)時間。以5
只一組圈養(yǎng)的C57BL/KS db/db小鼠(圓圈)或年齡和性別搭配的C57BL/KS+/+小鼠(方
塊)，接受每日腹膜內(nèi)注射載體(空心符號)或10yg DH-CNTF(實心符號)，共25天。從
第26天起，所有小鼠用載體處理。食物攝取是每組所消耗的克數(shù)除以5。 圖4DH-CNTF處理肥胖小鼠對尸體組成的影響。小鼠每日腹膜內(nèi)注射載體或10 y g
DH-CNTF處理10天。結(jié)果為平均值±s. e. m. (n = 5) 。 *P < 0. 05 ;**P < 0. 01 (對載體，
由t-檢驗)。 圖51印tin和hCNTF在神經(jīng)元細胞系中對STAT因子活化的影響。人OB-Rb的表達載體轉(zhuǎn)染的GT-l-7和SN-56細胞在存在或不存在指示細胞因子(100ng/ml)下培養(yǎng)10分鐘。細胞STAT因子的活化由電遷移率變換測定法測定。箭頭指結(jié)合的STAT3同二聚體，STAT1:STAT3雜二聚物，以及STATI同二聚體遷移的位置。 圖6由原位雜交測定的l印tin(0B-Rb)和CNTF(CNTF受體-([CNTFRa和LIFR)的受體亞單位在小鼠下丘腦中的表達。A，弓狀核；P，副室核。(X100) 圖71印tin和hCNTF在小鼠下丘腦中對tis-ll表達的影響。接受腹膜內(nèi)注射載體，l印tin(100 ii g)或DH-hCNTF(10 y g)的三只ob/ob小鼠組在1小時后經(jīng)頸部脫位宰殺。采用對鼠tis-ll特異性的35S-標(biāo)記的cRNA探針，在載體或蛋白質(zhì)處理的小鼠的冰凍冠腦切片上完成原位雜交。 實施例lhCNTF和其突變體DH-CNTF的抗肥胖作用
方法 蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如以前的描述(11)在大腸桿菌BL21中產(chǎn)生重組人類CNTF和DH-CNTF。按照Stemmer等的方法(12)利用合成寡脫氧核糖核酸經(jīng)PCR裝配人l印tin的DNA編碼序列，并且亞克隆進細菌表達質(zhì)粒pRSET-5d(13)。利用與hCNTF相同的方案產(chǎn)生人l印tin。為了除去細菌酯多糖，經(jīng)反相HPLC(ll)純化所有的蛋白質(zhì)。當(dāng)用鱟屬阿米巴樣細胞測定(西格瑪)時，純化的制劑含有不到5毫微克內(nèi)毒素/mg蛋白質(zhì)。
動物研究。采用雄性10-11周齡C57BL/6J ob/ob和C57BL/KSdb/db小鼠，以及19周齡AKR/J小鼠進行實驗，所說AKR/J小鼠通過從12周開始進食高脂肪食物(14)表現(xiàn)出肥胖。除了以其它方式注明的外，在12小時光照-黑暗循環(huán)(7:30時開始光照，19:30時停止)下，將動物在單個籠子中圈養(yǎng)，隨時可得到水和標(biāo)準(zhǔn)的或高脂肪的(AKR小鼠)嚙齒動物食物。在開始用載體或細胞因子治療(0天)之前，對它們習(xí)慣性地每日(9:00)腹膜內(nèi)注射載體(0. 9%鹽水，0. 2mg/ml無內(nèi)毒素牛血清清蛋白)兩天。注射后稱量動物，通過記錄在食物盤子中余下的食物的量確定食物攝取量。
結(jié)果 人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子(hCNTF)，其突變體DH-CNTF (10) [ (Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF];對CNTF a -受體具有40-倍高的親和性的hCNTF的突變體)和人l印tin在遺傳性肥胖小鼠以及飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的小鼠(DIO)中試驗生物學(xué)活性。這些肥胖癥和糖尿病模型在本領(lǐng)域一般被接受為肥胖病態(tài)的指示。在這些模型中顯示抗肥胖作用的藥劑在其它哺乳動物(特別是人)中將顯示類似的作用。 如在以下將更清楚地看到的，本發(fā)明的化合物在以上所論及的所有生物學(xué)試驗中是活性的，并且也發(fā)現(xiàn)它們是抗肥胖劑。此外，它們在逆轉(zhuǎn)與肥胖癥相聯(lián)系的血糖過多與血胰島素增多中是活性的。因此認為這些化合物在人糖尿病的血糖過多的治療中也將有用。
依據(jù)以前的實驗和結(jié)果(6-8， 15)，發(fā)現(xiàn)對不表達功能性l印tin的突變ob/ob小鼠全身性施用l印tin逆轉(zhuǎn)與l印tin缺損有關(guān)的肥胖以及飲食過多。對ob/ob小鼠每日腹膜內(nèi)施用hCNTF(在2和50 ii g/只小鼠之間；相對于40-1000 y g/kg體重)也產(chǎn)生體重的逐步和劑量依賴性降低，并且產(chǎn)生食物攝取的迅速降低(圖l)。在實驗的最高劑量(50 ii g ;1000 ii g/kg)時，hCNTF在7天之后引起體重降低16% (與載體處理的對照中5%增加相比)，并引起食物攝取的5-倍降低。這些作用在大小上與100 yg(2000 yg/kg)劑量的l印tin的作用是可比較的(在體重和食物攝取上分別為13%和95%降低；t-檢驗P< 0. 0001)。在劑量低于hCNTF的約5倍時，hCNTF變體DH-CNTF在體重和食物攝取上產(chǎn)生類似的降低。這一結(jié)果與具有降低的受體相互作用(數(shù)據(jù)未顯示出)的hCNTF變體的活性缺乏(11) 一起表明，hCNTF的抗肥胖作用是由特異性CNTF受體的活化介導(dǎo)的。
db/db突變小鼠對l印tin不產(chǎn)生反應(yīng)(6-8， 15)，這是因為編碼l印tin受體0B-R的基因的突變，其導(dǎo)致產(chǎn)生具有截短的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的受體剪接變體(9，29)。相反以hCNTF治療db/db小鼠引起劑量和時間依賴性重量喪失和食物攝取抑制(

圖1)。超激動劑DH-CNTF在約hCNTF 1/5劑量時，引發(fā)可比較的作用。在ob/ob和db/db小鼠中獲得的結(jié)果顯示不是通過剌激l印tin釋放或通過直接激活l印tin受體起作用。 經(jīng)進食高脂肪食物患有肥胖癥的AKR小鼠(DI0小鼠)以前已報道對l印tin的重量和食欲降低作用不如ob/ob小鼠敏感(7)。這一發(fā)現(xiàn)以及在DI0小鼠中的l印tin血漿水平高于瘦弱小鼠中的觀察結(jié)果，導(dǎo)致提出這樣一種觀點食物誘導(dǎo)的肥胖與l印tin抗性相關(guān)(4， 17)。如圖1所示，用人l印tin (100 ii g， 2500 ii g/kg)處理DI0小鼠5天引起體重(7±l%;p <0.05，對載體)和食物攝取(27±2%;p < 0.05)中等程度的降低。相反，hCNTF(50ii g， 1250ii g/kg)和DH-CNTF(10 ii g， 250 ii g/kg)引起體重(分別為19±1%和24±1% ;p < 0. 0001)和食物攝取(分別為76±4% ;和73±7% ;p < 0. 0005)上更強烈的降低。在db/db和DIO小鼠兩者中hCNTF可以逆轉(zhuǎn)肥胖的發(fā)現(xiàn)對治療人肥胖癥具有重要意義，這種肥胖癥已被認為與l印tin的抗性相關(guān)(4， 18， 19)。 可以看到，肥胖小鼠每日接受腹膜內(nèi)施用hCNTF或突變DH-CNTF，劑量從2到50 ii g，相當(dāng)于50到1000 ii g/kg體重。在最高劑量時，在治療5天后，化合物引起體重10%以上的降低。因此，為誘導(dǎo)體重快速降低(5-10% )對患有肥胖癥的患者施用在1000 g/kg以下的hCNTF或DH-CNTF，優(yōu)選的劑量是約100 y g/kg。此外，在優(yōu)選的實施方案的這一形式中，每天施用hCNTF或DH-CNTF —次，連續(xù)處理幾天，直到獲得所需的體重減輕。
實施例2在DIO小鼠中l(wèi)印tin與hCNTF協(xié)作增加抗肥胖作用
對肥胖DIO小鼠每日腹膜內(nèi)注射l印tin(100 iig;相當(dāng)于2500 ii g/kg)以及小劑量的(2y g相當(dāng)于50iig/kg)的hCNTF。兩種藥劑本身均不產(chǎn)生明顯的體重減輕。這一處理具有產(chǎn)生強的，協(xié)同的體重減輕的作用(圖2)。這一結(jié)果證明，小劑量的hCNTF可以用于在與l印tin抗性相關(guān)的肥胖模型中給出明顯增加的l印tin作用。
實施例3DH-CNTF的抗肥胖作用的持續(xù)時間和特異性
述 行為研究。通過記錄在3小時的黑暗的循環(huán)期間小鼠跨過其籠子中央的次數(shù)測定運動活性(21:00hr-24:00hr)。采用0到3級分類(O，沒有活性；1，弱；2，正常；3，超活)，通過在籠子中的集中觀察(在30分鐘光照循環(huán)期間各在1分鐘內(nèi)觀察5次)估價Grooming行為。采用具有作為新味道的O. 1%糖精的兩瓶樣品完成對調(diào)節(jié)的味道厭惡測定。
身體組成。將屠體勻漿，并將2-克等分試樣凍干，然后在9(TC下烘干直到重量恒定。然后以乙醚/乙醇(20 : 1，v/v)提取脂肪(21)。從脫水和脂肪提取后的重量差異分
別計算水和脂肪質(zhì)量，瘦肉質(zhì)量定義為剩下的屠體量。
題 以前報道hCNTF在正常的小鼠中引起瞬時的體重減輕和食物攝取降低(22)，此后，還沒有研究其對肥胖動物的作用。因此確定它對肥胖小鼠的作用是否敏感是重要的。如圖3所示，DH-hCNTF產(chǎn)品在肥胖小鼠中產(chǎn)生延長的作用。以DH-CNTF 25-天處理db/db小鼠導(dǎo)致體重逐漸和穩(wěn)步地減輕，至第8天達到相應(yīng)于年齡和性別相對的野生型小鼠的水平。平行地，DH-CNTF引起食物攝取約50X的降低，在整個處理期間均保持。在用hCNTF處理17天的ob/ob小鼠中獲得了類似的結(jié)果(未顯示數(shù)據(jù))。相反，在種系匹配的野生型小鼠中，DH-CNTF僅引起瞬時作用。這樣，在瘦弱小鼠中DH-CNTF迅速降低食物攝取和體重改變比率，但是這些作用在大約5和10天的處理后分別減弱(圖3)。 在肥胖和瘦弱動物之間所觀察到的區(qū)別的 一 種可能的解釋是hCNTF，類似于l印tin(5，6)，有效地耗盡脂肪組織群體，以便其作用的程度和期限依賴于脂肪沉積的大小。事實上，與載體處理的對照相比，DH-CNTF在ob/ob和db/db小鼠中特異性地降低身體脂肪的百分比，而增加身體的水和瘦肉(圖4)。由DH-CNTF誘導(dǎo)的絕對重量損失可以通過體脂肪的有效損失(伴隨著水質(zhì)量的小量減輕(參見圖4中的絕對重量))計量。在ob/ob小鼠中l(wèi)印tin產(chǎn)生類似的作用(5，6)。這樣，在肥胖小鼠中，hCNTF引起特異性抗脂肪作用。相反，已報道hCNTF在瘦弱小鼠中引起肌肉(23)和蛋白質(zhì)(24)重量的減輕。對這一明顯差異的一種似是而非的解釋是hCNTF的有效的脂肪-消耗作用導(dǎo)致瘦弱動物中體脂肪幾乎全部損失(參見(23)和我們未出版的結(jié)果)，這引起作為次要事件的蛋白質(zhì)損失。
hCNTF不產(chǎn)生毒性，不舒服或疾病。不可逆毒性由以下發(fā)現(xiàn)排除，在db/db(圖2G，H)和ob/ob小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)兩者中，在中斷蛋白質(zhì)施用后，體重和食物攝取迅速回到處理前的水平。與載體處理的對照比較，以DH-CNTF(10ii g)處理db/db小鼠3天不明顯改變運動活性(活性得分分別為43±6和49±6 ;n = 5)。同樣地，DH-CNTF處理不改變grooming行為(活性得分對DH-CNTF和載體處理的分別為1. 2±0. 6和1. 0±0. 4)。此夕卜，DH-CNTF不引起任何習(xí)慣性行為的形成。蛋白質(zhì)引起對味道厭惡的可能性采用兩瓶具有作為新味道的0. 1 %糖精的樣品在DIO小鼠中檢查。類似于l印tin(已報道其在ob/ob小鼠(5)中降低水?dāng)z取)，DH-CNTF(10iig)在調(diào)節(jié)2天后導(dǎo)致DI0小鼠水?dāng)z取的降低(1. 8±0. lml對在載體處理的對照中的2. 8±0. 2ml ;n = 9 ;P < 0. 001)。然而，DH-CNTF不引起對味道的討厭(糖精攝取為總液體的49±2%對對照的51±4%)。這些結(jié)果表明DH-CNTF的飽食作用不是因為細胞因子誘導(dǎo)的疾病行為。
實施例4hCNTF和DH-CNTF肥胖相關(guān)代謝缺陷的逆轉(zhuǎn)
方法 小鼠接受每日腹膜內(nèi)注射載體，l印tin(100ii g)， hCNTF(50iig)或DH-CNTF(10iig)。在配對飼喂實驗(2和4)中，在前面的24小時期間，載體處理的小鼠隨意飼喂或飼喂相同量的由DH-CNTF-處理的小鼠消耗的食物。在最后注射后的24小時(實驗1和3)，或在最后注射和移去食物后7小時(實驗2和4)取血樣。用葡糖氧化酶方法測定血清葡萄糖，并且利用大鼠胰島素作為標(biāo)準(zhǔn)，用放射免疫測定法(Amersham)測定血清胰島素。 題 除重量和食欲調(diào)節(jié)作用外，hCNTF和DH-CNTF能夠逆轉(zhuǎn)與ob和db突變相關(guān)的血糖過多與血胰島素增多。 攜帶有在C57BL/6背景上的ob突變的小鼠顯示出強的血胰島素增多(在2_3月齡時具有幾乎正常葡萄糖水平)(25)，這可以通過l印tin處理予以糾正(5，6， 15)。用hCNTF或DH-CNTF處理ob/ob小鼠也導(dǎo)致血清胰島素水平的大的降低(表1，實驗1和2)。在C57BL/KS背景上的db/db突變體以嚴(yán)重的血糖過多為特征(在2-3月齡時具有幾乎正常的胰島素水平)(26)。如以前所報道的(5， 6， 15) ， l印tin不能在db/db小鼠中逆轉(zhuǎn)血糖過多。相反hCNTF和DH-hCNTF導(dǎo)致添加的和耐久的血清葡萄糖水平兩者上2_3_倍的降低，而不影響已經(jīng)低水平的胰島素(表1，實驗3和4)。對細胞因子-處理的動物的食物攝取，DH-CNTF的體重減輕和抗糖尿病作用超過由配對飼喂ob/ob或db/db小鼠引起的那些(表1，實驗2和4)。這些結(jié)果顯示hCNTF的作用，類似于l印tin (6， 27， 28)，不單獨因為降低的食物攝取。 在肥胖小鼠中l(wèi)印tin， hCNTF和配對飼喂 對體重改變和血清胰島素和葡萄糖的影響
處理重量改變血清葡萄糖胰島素
—(g)(mM)(ng/ml)
實驗1
(ob/ob,7天)
栽體+ 1. 6±0. 1nd63. 3±12. 7
一6. 5±0. 4*本nd8. 1±9. 1 +
hCNTF一8. 2±0. 1+木nd4. 3±1. 0*
DH-C,_7. 7±0. 8*氺nd3， 2±2. 9*
實驗2
(ob/ob，4天)
栽體+0. 5±0. 5nd72. 5±25. 7
DH-C野一8- 4±0. 5*本§nd8. 1±0. 2*亇
配對_7. 0±0. 5"nd11. 1±0. 4氺
實驗3
(db/db,7天)
栽體+0. 2±0. 423. 3±0. 89. 1±4. 2
Leptin-O. 8±0.528. 7±0. 8*9. 7±2. 6
hCNTF一6. 8±0. 5木木8. 4±1. 7**8. 2±2. i
實驗4
(db/db，4天)
栽體0. 0±0. 330. 1±2. 0nd
DH-CNTF-6. 8±0.彬§12, 3±1-9*"nd
配對-5. 3±0. 4林24. 8±5. 4nd 數(shù)據(jù)是每個處理組3到6只動物的平均值±s. e. m. 。 nd，未測定。*P < 0. 05對載體**P < 0. 001對載體§ P < 0. 05對配對t P < 0. 001對配對(t-檢驗)
實施例5hCNTF和l印tin激活重迭神經(jīng)元信號系統(tǒng)
方法 STAT活化測定。將GT-l-7和SN-56細胞保持在完全培養(yǎng)基(Dulbecco' s改進的Eagle培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清，青霉素，谷酰胺；和(對SN-55細胞)丙酮酸鈉)中。將細胞平板接種在100mm平皿上，當(dāng)半?yún)R合時，24小時后使用。如以前的描述(30)制備含有人0B-R(29)的整個編碼區(qū)(核苷酸141-3770)的表達載體，并且按照制造者的說明經(jīng)Lipofectamine(Gibco BRL)將其轉(zhuǎn)染進細胞。24小時后，將細胞分布在60mm含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在另外的24小時后，如下詳細描述的用不同的效應(yīng)物處理10分鐘前，除去血清4小時。然后用含有50mM NaF的冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞，由離心收集，并且在液氮中凍結(jié)。如以前的描述(31)制備整個細胞抽提物。利用10i!g細胞抽提物，按照Sadowsky和Gilman的電遷移變換測定法(33)測定活化的STAT體內(nèi)對高親和性SIE m67寡核苷酸(32)的結(jié)合。通過在[a-32p]dATP和[a-32p]dCTP(3000Ci/mmo1)存在下用克列諾酶填補5'突出端來標(biāo)記寡核苷酸探針。將復(fù)合物在5%聚丙烯酰胺/2. 5%甘油/0. 5XTBE(45mM Tris-硼酸鹽)，O. 5mM乙二胺四乙酸，pH 7.8)凝膠上分離，將其干燥并進行放射自顯影。 原位雜交。在含有弓形和副室下丘腦核的區(qū)域制備系列冠腦段。利用"S-標(biāo)記的cRNA探針按照以前的描述(34)進行原位雜交。通過利用合適的寡核苷酸引物，經(jīng)RT-PCR擴增小鼠腦RNA獲得對小鼠0B-Rb， CNTFRa， LIFR和tis-l 1特異性的探針，相應(yīng)于各自編碼序列的核苷酸2850-3407， 246-856 (按照人序列編號)，2620-3217和1-950。
題 部分具有hCNTF和l印tin的生物活性說明這些蛋白質(zhì)通過類似的信號機制起作用。hCNTF與l印tin調(diào)節(jié)STAT轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性的能力在兩種神經(jīng)元細胞系，SN-56(35)和GT-l-7(36)中檢測，所說的細胞系分別衍生自小鼠間隔以及下丘腦神經(jīng)元。用人OB-Rb(OB-R的足夠產(chǎn)生信號的長形剪接變體(30， 37， 38))的表達載體轉(zhuǎn)染細胞。在兩種神經(jīng)元細胞系上，hCNTF和l印tin觸發(fā)STAT因子的類似模式的活化，具有STAT3同二聚體和較低程度的STAT1同二聚體和STAT1/STAT3雜二聚物的的有效的DNA結(jié)合(圖5)。這一模式是gP130-信號細胞因子的特征(39)，與序列相似性一致，包括存在JAK激酶的共有基元和STAT因子相互作用位點(在0B-Rb和gpl30家族受體之間(9))。
l印tin和hCNTF的重疊代謝作用的一種可能的解釋是這些蛋白質(zhì)剌激人腦區(qū)域中的普通效應(yīng)物途徑，其牽涉到能量攝取和消耗。長形OB-Rb剪接變體在這樣的區(qū)域有效地表達，包括弓形、腹內(nèi)側(cè)和副室下丘腦核(40,41)。為了確定下丘腦飽食中心是否也可以是hCNTF的耙，采用對鼠OB-Rb， CNTF a和LIFR特異性的cRNA探針進行原位雜交。如圖6所示，小鼠下丘腦弓形和副室核表達l印tin和CNTF受體亞單位的mRNA。初步的結(jié)果表明CNTFRa和LIFR在其它核(包括腹內(nèi)側(cè)下丘腦)中表達。 與存在對中央飽食中心的細胞因子信號途徑相一致，全身性施用l印tin在小鼠下丘腦中激活早期信號反應(yīng)(42， 43)。如果hCNTF的作用機理類似于l印tin，則下丘腦反應(yīng)的早期活化也應(yīng)該在外周施用hCNTF后可檢測。tis-ll原初應(yīng)答基因(44)(其由hCNTF和其它Stat3-依賴性細胞因子(45)迅速誘導(dǎo))被用作細胞活化的標(biāo)記。在腹膜內(nèi)注射l印tin或DH-CNTF之后1小時，與載體處理的對照比較，ob/ob小鼠的下丘腦tis-ll信使核糖核酸被發(fā)現(xiàn)明顯提高。原位雜交揭示弓形核是tis-ll被兩種細胞因子誘導(dǎo)的主要的位點(圖7)。 這一結(jié)果說明，全身性施用hCNTF和l印tin可以在已經(jīng)被認為是l印tin作用的重要的靶的腦區(qū)域中誘導(dǎo)早期信號反應(yīng)(15，41)。不排除細胞因子間接地激活下丘腦細胞，例如通過外周介導(dǎo)物或經(jīng)由傳入神經(jīng)。目前，這一作用的迅速性，以及在弓形核中hCNTF和l印tin的特異性受體的表達證明是細胞因子進入下丘腦的直接作用的結(jié)果。hCNTF(46)和l印tin(47)兩者可以橫越血腦屏障。經(jīng)由特異性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，細胞因子可以穿透人腦，如對l印tin所報道的(47)。通過位于血腦屏障外部的周圍器官(例如鄰近弓形核的中央隆起)(48)，它們也可以接近下丘腦神經(jīng)元。總之，現(xiàn)在結(jié)果與部分具有hCNTF和l印tin的生物學(xué)活性牽涉作用的相關(guān)機制的概念是一致的。
實施例6hCNTF和hCNTF變體的CNTFR a結(jié)合活性 如以前的描述(10)，通過固相結(jié)合測定法測定對hCNTF和不同hCNTF變體的CNTF受體-a (CNTFRa)的相對結(jié)合親和性。如表2所示， 一些hCNTF變體具有比野生型hCNTF對CNTFR a更大的親和性。這些變體，與DH-CNTF—樣，具有對治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病，如糖尿病的增加的實用性。 表2. hCNTF和hCNTF變體對CNTF受體a的結(jié)合
SEQ ID NO:名 稱縮寫/注相對結(jié)合(hCNTF二l)
1hCNTF野生型1. 1±0. 3
2(Glnl67Thr) hCNTF11. 8土0. 3
3(LysL60Gln/GirU67Thr)hCNTF3. 1±1. 0
4(Glnl67Tyr) hC,9. 6±2. 6
5(Serl66Asp/Glnl67His)hC證DH-CNTF22. 8±3. 5
6(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF4. 1±1. 1
(Glnl67Ala) hCNTF9. 0±0. 7
8(SerL66Ala/Glnl67Ala)hCNTF8. 1±2. 8
9(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF7. 5±2. 2
10(Serl66Asn/Glnl67Ala)hCNTF12. 4±1. 2
11(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF8. 8±2. 6
12(Serl66Asp/Glnl67Ala)hCNTF13. 5±1. 7
13(Vall61Lcju/Glnl67Ala)hCNTF8. 8±0. 4
14(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hC野11. 7±3, 2
15(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hC,3. 6±0. 8
16(GlrU67Ala/Argl77Leu)hCNTFU. 7±3. 3
17(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF6. 9±1. 3
18(GliU67Ala/Thrl6禮eu)hCNTF9. 6±2. 2
19(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phe1781le)hC8. 4±0. 4
20(Serl66Asp/Glnl67Ala/Thrl69Leu)fiC21. 0±1. 6
21(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe)hC13. 1±2. 0
22(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF3. 3±0. 4
23(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hC32±11
24(Lysl55Ala/Serl66Asp/Clnl67His) hC51±19
25(Gln63Arg) hCNTF2. 0±0. 3
26(Gln63Arg/Seri66Asp/Glnl67His)hCN66±16
27(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCN30±5
28(Thrl69Ue/Hisl74ALa)hCNTF0. 07±0. 01 參考文獻 1. Weigle， D. S. (1994)FASEB J. 8， 302—310。
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于治療肥胖和與其相關(guān)的疾病的藥物上的用途(iii)序列數(shù)28(iv)郵寄地址:(A)收信人Societa' Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra，39(C)城市羅馬(D)國家意大利(E)郵區(qū)代碼:1-00186(V)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5"軟盤1.44兆(B)計算機:IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-D0S/MS-D0S Riv. 5. 0(D)軟件微軟Word 6.0(viii)代理人信息(A)姓名DI CERB0 Mario (Dr.)(B)證書號RM/X88924/PC-DC(ix)電訊信息






































(A)電話
06/6785941
(B) 傳真06/6794692
(C) 電傳:612287 ROPAT (l)SEQ ID NO :1的信息:
(i) 序列特征
(A) 長度200個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii) 分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征:
(A) 名稱hCNTF野生型
(B) 其它信息hCNTF序列從1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :1 :
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu
1
Leu Cys Ser Arg
Leu Thr Ala Leu
Lys Asn lie Asn
Thr Asp Gin Trp
Asn Leu Gin Ala
Leu Glu Asp Gin
His Gin Ala lie
Tyr Gin lie Glu
Arg Asn Glu Ala
Leu Phe Glu Lys
Ser Gin Trp Thr
Ser His Gin Thr
5
Ser
20
Thr
35
Leu
50
Ser
65
Tyr
80
Gin
95
His
110
Glu
125
Asp
140
Lys
155
Val
170
Gly
lie Trp Leu Ala
Glu Ser Tyr Val
Asp Ser Ala Asp
Glu Leu Thr Glu
Arg Thr Phe His
Val His Phe Thr
Thr Leu Leu Leu
Leu Met lie Leu
Gly Met Pro lie
Leu Trp Gly Leu
Arg Ser lie His
lie Pro Ala Arg
Thr
10
Arg
25
Lys
40
Gly
55
Ala
70
Val
85
Pro
100
Gin
115
Leu
130
Asn
145
Lys
160
Asp
175
Gly
Pro Lys His Met Glu Leu Thr Val Glu Val Val Leu Ser
His Arg lie Arg Gin Gly Pro Val Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ala Ala Tyr Lys Gly Asp Leu Gin Arg Phe His Tyr
Arg Asp 15
Ser Asp
30 Leu Asn
45 Ala Ser
60 Gin Glu
75 Arg Leu
90 Asp Phe
105 Phe Ala
120 lie Pro
135 Gly Gly
150 Glu Leu
165 lie Ser
180 lie Ala:0181] 185 190 195
:0182] Asn Asn Lys Lys Met
:0183] 200
:0184] (2)SEQ ID NO :2的信息
:0185] (i)序列特征
:0186] (A)長度20個氨基酸
:0187] (B)類型氨基酸
:0188] (C)鏈型單鏈
:0189] (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知
:0190] (ii)分子類型蛋白質(zhì)
:0191] (ix)牛寺征
:0192] (A)名稱(Glnl67Thr)hCNTF
:0193] (B)其它信息(Glnl67Thr)hCNTF序列從159位到178位
:0194] (xi)序列描述SEQ ID NO :2 :
:0195] Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser lie
:0196] 15 10 15
:0197] His Asp Leu Arg Phe :0198] 20
:0199] (3)SEQ ID NO :的信息:3 :
:0200] (i)序列特征
:0201] (A)長度20個氨基酸
:0202] (B)類型氨基酸
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:02(H] (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知
:0205] (ii)分子類型蛋白質(zhì)
:0206] (ix)特征
:0207] (A)名稱(Lysl60Gln/Glnl67Thr)hCNTF
:0208] (B)其它信息(Lysl60Gln/Glnl67Thr)hCNTF序列從159位到178位
:0209] (xi)序列描述SEQ ID NO :3 :
:0210] Leu Gin Val Leu Gin Glu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser lie
:0211] 15 10 15
:0212] His Asp Leu Arg Phe
:0213] 20
:0214] (4)SEQ ID NO :4的信息
:0215] (i)序列特征
:0216] (A)長度20個氨基酸
:0217] (B)類型氨基酸
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:0219] (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Tyr)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Tyr)hCNTF序列從159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :4 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Tyr Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (5)SEQ ID NO :5的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :5 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (6)SEQ ID NO :6的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :6 : Leu Lys Val Leu Ser Glu Leu Ser His Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15

(7)SEQ ID NO :7的信息 (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala)hCNTF序列從159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :7 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (8)SEQ ID NO :8的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Serl66Ala/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Ala/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :8 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (9)SEQ ID NO :9的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)牛寺征 (A)名稱(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :9 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Gly Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (IO)SEQ ID NO :10的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)牛寺征 (A)名稱(Serl66Asn/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asn/Glnl67Ala) hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :10 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asn Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (ll)SEQ ID NO :11的信息 (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征: (A)名稱(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :11 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu His Ala Trp Thr Val Arg Ser lie


(12)SEQ ID NO :12的信息 (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Serl6 GAsp/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :12 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (13)SEQ ID NO :13的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Vall61Leu/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Vall61Leu/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :13 : Leu Lys Leu Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (14)SEQ ID NO :14的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)牛寺征 (A)名稱(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :14 : Leu Gin Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (15)SEQ ID NO :15的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)牛寺征 (A)名稱(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :15 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 Ala Asp Leu Arg Phe 20 (16)SEQ ID NO :16的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Ala/Argl77Leu)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Argl77Leu)hCNTF序列從159 位到178位
(xi)序列描述SEQ ID NO :16 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Leu Phe 20 (17)SEQ ID NO :17的信息 (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF序列從 159位到178 (xi)序列描述SEQ ID NO :17 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Ser Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (18)SEQ ID NO :18的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF序列從159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :18 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe
20 (19)SEQ ID NO :19的信息: (i)序列特征[O454] (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phel78Ile)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phel78Ile)hCNTF 序列從159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :19 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg lie 20 (20)SEQ ID NO :20的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Serl66Asp/Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67AIa/Thrl69Leu)hCNTF 序列從159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :20 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (21)SEQ ID NO :21的信息: (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe)hCNTF
(B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe) hCNTF序列從159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :21 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Phe Phe 20 (22)SEQ ID NO :22的信息 (i)序列特征 (A)長度20個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF (B)其它信息(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF序列從 159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :22 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Gin Trp Thr Arg Arg Ser lie 15 10 15 Ala Asp Leu Arg Phe 20 (23)SEQ ID NO :的信息23 : (i)序列特征 (A)長度200個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列從1位到200 (xi)序列描述SEQ ID NO :23 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
20 25 30
LeuThrAlaLeuThrGluSerTyr ValLysHisGin Gly Leu Asn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAla Asp GlyMetPro Val Ala Ser505560ThrAspGinTrpSerGluLeuThr GluAlaGluArg Leu Gin Glu657075AsnLeuGinAlaTyrArgThrPhe HisValLeuLeu Ala Arg Leu808590LeuGluAspGinGinValHisPhe ThrProThrGlu Gly Asp Phe95100105HisGinAlalieHisThrLeuLeu LeuGinValAla Ala Phe Ala110115120TyrGinlieGluGluLeuMetlie LeuLeuGluTyr Lys lie Pro125130135ArgAsnGluAlaAspGly MetPro lieAsnValGly Asp Gly Gly140145150LeuAlaGluLysLysLeu TrpGly Leu GinValLeu Gin Glu Leu155160165AspHisTrpThrValArgSerlie His AspLeuArg Phe lie Ser170175180SerHisThrThrGlylieProAla ArgGlySerHis Tyr lie Ala185190195AsnAsnLysLysMet200 (24)SEQ ID NO :24的信息: (i)序列特征 (A)長度200個氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Lysl55Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Lysl55Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列從1位到200位 (xi)序列描述SEQ ID NO :24 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
202530LeuThrAlaLeuThrGluSerTyr ValLysHisGin Gly Leu Asn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAla Asp GlyMetPro Val Ala Ser505560ThrAspGinTrpSerGluLeuThr GluAlaGluArg Leu Gin Glu657075AsnLeuGinAlaTyrArgThrPhe HisValLeuLeu Ala Arg Leu808590LeuGluAspGinGinValHisPhe ThrProThrGlu Gly Asp Phe95100105HisGinAlalieHisThrLeuLeu LeuGinValAla Ala Phe Ala110115120TyrGinlieGluGluLeuMetlie LeuLeuGluTyr Lys lie Pro125130135ArgAsnGluAlaAspGly MetPro lieAsnValGly Asp Gly Gly140145150LeuPheGluLysAlaLeu TrpGly Leu LysValLeu Gin Glu Leu155160165AspHisTrpThrValArgSerlie His AspLeuArg Phe lie Ser170175180SerHisGinThrGlylieProAla ArgGlySerHis Tyr lie Ala185190195AsnAsnLysLysMet200(25) SEQID NO :25的{認 (i)序列特征 (A)長度200個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結(jié)構(gòu)未知 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征 (A)名稱(Q63R)hCNTF (B)其它信息(Q63R) hCNTF序列從1位到200位 (xi)序列描述SEQ ID NO :25 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp20 Leu Thr
35 Asn Leu
50 Trp Ser
65 Ala Tyr
80 Gin Gin
95 lie His 110 Glu Glu 125 Ala Asp 140 Lys Lys 155 Thr Val 170 Thr Gly 185 Lys Met 200
(26)SEQ ID NO :26的信息
(i) 序列特征
(A) 長度:200個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii) 分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征:
(A) 名稱(Gln63Arg/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF
(B) 其它信息(Gln63Arg/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列從1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :26
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg 1 5 10
Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Arg Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Ser Gin Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
25
Glu Ser Tyr Val Lys 40
Asp Ser Ala Asp Gly 55
Glu Leu Thr Glu Ala 70
Arg Thr Phe His Val 85
Val His Phe Thr Pro 100
Thr Leu Leu Leu Gin 115
Leu Met lie Leu Leu 130
Gly Met Pro lie Asn 145
Leu Trp Gly Leu Lys 160
Arg Ser lie His Asp 175
lie Pro Ala Arg Gly 190
His Met Glu Leu Thr Val Glu Val Val Leu Ser
Gin Gly Pro Val Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ala Ala Tyr Lys Gly Asp Leu Gin Arg Phe His Tyr
30 Leu Asn
45 Ala Ser
60 Gin Glu
75 Arg Leu
90 Asp Phe
105 Phe Ala
120 lie Pro
135 Gly Gly
150 Glu Leu
165 lie Ser
180 lie Ala
195
Arg Asp 15






































Ser 20 Thr 35 Leu 50 Ser 65 Tyr 80 Gin 95 His 110 Glu 125 Asp 140 Lys 155 Val 170 Gly 185 Met 200
(27)SEQ ID NO :27的信息
(i) 序列特征
(A) 長度:200個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii) 分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征:
(A) 名稱(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF
(B) 其它信息(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列從1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :27 :
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp
Leu Cys Ser Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Arg Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Asp His Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
Arg Leu Asn Trp Ala Gin lie Glu Ala Lys Thr Thr Lys
lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
25 30 Glu Ser Tyr Val Lys His Gin Gly Leu Asn
40 45 Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser
55 60 Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gin Glu
70 75 Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu
85 90 Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe
100 105 Thr Leu Leu Leu Gin Val Ala Ala Phe Ala
115 120 Leu Met lie Leu Leu Glu Tyr Lys lie Pro
130 135 Gly Met Pro lie Asn Val Gly Asp Gly Gly
145 150 Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu
160 165 Arg Ser lie His Asp Leu Arg Phe lie Ser
175 180 lie Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr lie Ala
190 195Leu Cys Ser Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Gin Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Asp His Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
10
lie Trp Leu Ala Arg 25
Glu Ser Tyr Val Lys 40
Asp Ser Ala Asp Gly 55
Glu Leu Thr Glu Ala 70
Arg Thr Phe His Val 85
Val His Phe Thr Pro 100
Thr Leu Leu Leu Gin 115
Leu Met lie Leu Leu 130
Gly Met Pro lie Asn 145
Leu Trp Gly Leu Lys 160
Arg Ser lie His Asp 175
lie Pro Ala Arg Gly 190
Lys
His
lie Gin
Met Pro
Glu Arg
Leu Leu
1 5
Arg Ser
20 Leu Thr
35 Asn Leu
50 Trp Ser
65 Ala Tyr
80 Gin Gin
95 lie His 110 Glu Glu 125 Ala Asp 140 Lys Lys 155 Thr Val 170 Thr Gly 185 Lys Met 200
(28)SEQ ID NO :28的信息
(i) 序列特征
(A) 長度:200個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)未知
(ii) 分子類型蛋白質(zhì) (ix)特征:
(A) 名稱:(Thrl69Ile/Hisl74Ala)hCNTF
(B) 其它信息(Thrl69Ile/Hisl74Ala)hCNTF序列從1 位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :28 :
Thr Val Glu Val Val
Glu Ala Tyr Gly Leu
Leu Arg
Ser His
15
Arg Ser Gin 30
Gly Leu Asn 45
Val Ala Ser 60
Leu Gin Glu 75
Ala Arg Leu 90
Gly Asp Phe 105
Ala Phe Ala 120
Lys lie Pro 135
Asp Gly Gly 150
Gin Glu Leu 165
Phe lie Ser 180
Tyr lie Ala 195
Met1
LeuLeuLysThrAsnLeuHisTyrArgLeuSerSerAsn
AlaCysThrAsnAspLeuGluGinGinAsnPheGinHisAsn
PheSerAlalieGinGinAspAlalieGluGluTrpGinLys
ThrArgLeuAsnTrpAlaGinlieGluAlaLyslieThrLys
Glu5
Ser
20
Thr
35
Leu
50
Ser
65
Tyr
80
Gin
95
His
110
Glu
125
Asp
140
Lys
155
Val
170
Gly
185
Met
200
HislieGluAspGluArgValThrLeuGlyLeuArglie
Ser ProTrp LeuSer TyrSer AlaLeu ThrThr PheHis PheLeu LeuMet lieMet ProTrp GlySer liePro Ala
LeuAlaValAspGluHisThrLeuLeulieLeuAlaArg
Thr
10
Arg
25
Lys
40
Gly
55
Ala
70
Val
85
Pro
100
Gin
115
Leu
130
Asn
145
Lys
160
Asp
175
Gly
190
ProLysHisMetGluLeuThrValGluValValLeuSer
HislieGinProArgLeuGluAlaTyrGlyLeuArgHis
ArgArgGlyValLeuAlaGlyAlaLysAspGinPheTyr
ArgSerLeuAlaGinArgAspPhelieGlyGlulielie
Asp
15
Asp
30
Asn
45
Ser
60
Glu
75
Leu
90
Phe
105
Ala
120
Pro
135
Gly
150
Leu
165
Ser
180
Ala
19權(quán)利要求
激活CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體的物質(zhì)在制備用于減輕體重之藥物組合物上的用途。
2. 按照權(quán)利要求1的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的藥物組合物適于肥胖癥 的治療。
3. 按照權(quán)利要求2的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的組合物適于治療與肥胖 癥相關(guān)的疾病。
4. 按照權(quán)利要求3的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的與肥胖癥相關(guān)的疾病是 血糖過多或血胰島素增多。
5. 按照權(quán)利要求3的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的與肥胖癥相關(guān)的疾病是 糖尿病。
6. 按照權(quán)利要求1到5之任一的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的物質(zhì)是 hCNTF的突變體。
7. 編碼激活CNTF受體的物質(zhì)的DNA分子在制備用于基因治療肥胖癥的藥物組合物上 的用途，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)如權(quán)利要求1-6中任一項所定義。
8. 按照權(quán)利要求7的DNA分子的用途，其中所說的藥物組合物適于治療與肥胖癥相關(guān) 的疾病。
9. 按照權(quán)利要求8的DNA分子的用途，其中所說的與肥胖癥相關(guān)的疾病是血糖過多或 血胰島素增多。
10. 按照權(quán)利要求8的DNA分子的用途，其中所說的與肥胖癥相關(guān)的疾病是糖尿病。
11. 按照權(quán)利要求1到IO之任一的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所說的藥物組合 物以膠囊的形式制備。
12. —種用于基因治療肥胖癥的藥物組合物，該組合物包含至少一種作為有效成分的 DNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述DNA如權(quán)利要求7中所定義。
13. —種用于減輕體重的藥物組合物，該組合物包含至少一種作為有效成分的激活 CNTF受體的物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)如權(quán)利要求1_6中 任一項所定義。
14. 按照權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所說的有效成分是hCNTF的突變體。
15. 按照權(quán)利要求13-14之任一的藥物組合物，其中所說的藥物組合物還包含有效成 分l印tin或類l印tin分子。
16. 按照權(quán)利要求15的藥物組合物，其中hCNTF和/或至少一種其突變體與l印tin的 比率是1 : 500-1 : 5。
17. 按照權(quán)利要求15的藥物組合物，其中hCNTF和/或至少一種其突變體與l印tin的比率是i : ioo-i : 25。
18. 按照權(quán)利要求12到17之任一的藥物組合物，其中所說的藥物組合物還含有藥學(xué)上 可接受的賦形劑。
19. 按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所說的賦形劑有利于有效成分的吸收。
全文摘要
本發(fā)明涉及CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活物在治療肥胖癥上的用途，具體而言涉及hCNTF(人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)，其突變體或激活CNTF受體的其它分子在制備用于治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病(例如血糖過多)之藥物上的用途。圖1顯示hCNTF和leptin在遺傳性肥胖小鼠和患飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)的小鼠中對體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。
文檔編號A61K48/00GK101703761SQ20091022106
公開日2010年5月12日 申請日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者A·德馬提斯, A·迪馬科, D·拉扎羅, G·帕恩薩, G·西里伯特, I·格洛格恩, P·科斯塔, R·勞弗, R·科特斯 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所