專利名稱：：一種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒hiv疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及防御性和/或治療性HIV疫苗，特別涉及一種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：目前，據(jù)聯(lián)合國(guó)AIDS規(guī)劃署和WHO報(bào)告，全球大約有6千萬人感染人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)?，F(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入AIDS大流行的第3個(gè)十年，仍然沒有找到有效的HIV預(yù)防性疫苗，全球性HIV相關(guān)的疾病與死亡的負(fù)擔(dān)正在以其它任何病原體都無法相比的速率增加，大多數(shù)人沒有機(jī)會(huì)接受有效的抗病毒治療而死于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS),AIDS已經(jīng)成為人類前所未有的最具毀滅性的疾病。在我國(guó)HIV/AIDS的流行狀況也不容樂觀，已經(jīng)從局部流行進(jìn)入廣泛流行的快速增長(zhǎng)期，我國(guó)衛(wèi)生部公布的2005年全國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静∫咔椋瑪?shù)據(jù)中可以看出，艾滋病發(fā)病的死亡數(shù)，已占據(jù)甲、乙類傳染病發(fā)病報(bào)告死亡數(shù)的第三位，超過了乙型肝炎致死的人數(shù)。國(guó)際上HIV預(yù)防性疫苗的研制尚未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。越來越多的證據(jù)表明，在控制慢性、病毒性感染疾病中，細(xì)胞免疫尤其是以CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL)比抗體更為重要(SparacioS，ZeilfelderU，PfeifferT，etal.Membranefusionbetweenretroviralparticles:hostrangeextensionandvaccineprospects.Virology,2000，271(2):248-252.)。目前，也有很多的證據(jù)提示治療性疫苗誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)能夠比較有效地控制HIV-1感染(ShiverJW，F(xiàn)uTM，ChenL，etal.Replication—incompetentadenoviralvaccinevectorelicitseffectiveanti-immimodeficiency-virusimmunity.Nature,2002，415(6869):331-335.)。而不幸的是，Barouch等在另一項(xiàng)研究中提示HIV突變能夠逃避疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞性免疫應(yīng)答，進(jìn)而逃避CTL的識(shí)別，導(dǎo)致部分免疫保護(hù)失敗。研究中的一個(gè)被免疫動(dòng)物的免疫優(yōu)勢(shì)GagCTL表位的核苷酸突變引起了病毒逃避CTL的識(shí)別，從而不能抑制病毒的復(fù)制，導(dǎo)致疾病進(jìn)展加快，最后死于艾滋病相關(guān)合并癥(BarouchDH，KunstmanJ，KurodaMJ，etal.EventualAIDSvaccinefailureinarhesusmonkeybyviralesc即efromcytotoxicTlymphocytes.Nature,2002，415(6869):335-339.)。這提示HIV逃避CTL的識(shí)別將會(huì)成為誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的艾滋病疫苗的主要缺陷。人們應(yīng)該努力開發(fā)一種疫苗既能夠產(chǎn)生中和不同HIV-1毒株的抗體，又可以誘導(dǎo)更加有效的HIV-1特異性CTL反應(yīng)。人們期望這些疫苗能夠減輕HIV感染者的病情，通過早期免疫艾滋病疫苗延長(zhǎng)HIV感染者的壽命和改善他們的生活質(zhì)量也許是目前人們所能夠達(dá)到的目標(biāo)。目前，還沒有一種治療性疫苗或免疫治療制劑[如白細(xì)胞介素2(IL-2)]可被接受為感染者的標(biāo)準(zhǔn)治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的在于提供一種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗及其制備方法，該疫苗能夠激發(fā)多重免疫途徑，用于預(yù)防和治療HIV的感染。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的—種多串聯(lián)表位，為由Ala-Ala-Tyr連接多個(gè)HIV的HLA限制性CTL表位，其中，包括以下表位Tyr_Leu_Ala_Asn_Phe_Leu_Gly_Lys_Ile;Tyr_Leu_Asn_Asn_Pro_Pro_Ile_Pro_V￡il;Tyr-Leu-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu5Tyr_Leu_Ser_Leu_Ser_Phe_Pro_Gln_Ile;Tyr_Leu_Asp_Thr_Gly_Ala_Asp_Asp_Thr;Tyr-Leu-Ser-Gln-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu;Tyr_Leu_Gly_Glu_Arg_Ile_Val_Asp_Ile;Tyr-Leu-Gln-Lys-Glu-Thr-Trp-Glu-Ala。所述的多串聯(lián)表位，其具體的氨基酸連接順序如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明提供的多串聯(lián)表位，為了避免HIV的免疫優(yōu)勢(shì)表位突變而導(dǎo)致病毒逃避CTL的識(shí)別，選用更加保守的HIV的HLA低親和性的的表位；而且對(duì)所選擇的表位進(jìn)行修飾，使得低親和性表位改造為高親和力表位；這樣既保證了表位的保守性又使得表位能夠被遞呈；更進(jìn)一步將修飾后的多個(gè)HIV的HLA低親和性的CTL表位通過Ala-Ala-Ty(甘氨酸_甘氨酸_酪氨酸)間隔連接，以便于各表位保持獨(dú)立性和能夠有效呈遞，進(jìn)而剌激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)多重的免疫效果，從而起到加強(qiáng)免疫原性和抗病毒變異的目的，彌補(bǔ)HIV突變引起了病毒逃避CTL的識(shí)別所不能激發(fā)的機(jī)體免疫?；谏鲜龆啻?lián)表位，本發(fā)明構(gòu)建了一種重組腺病毒HIV疫苗，該疫苗是將包含目的片段P24MEG的載體整合到腺病毒的基因組；所述含目的片段p24MEG是將HIV_1的p24基因部分序列與表達(dá)權(quán)利要求1所述的多串聯(lián)表位的核苷酸序列MEG連接。所述的MEG其具體的序列如SEQIDNO.2所示。所述的HIV的p24基因部分序列其具體的序列如SEQIDNO.3所示。所述的載體為腺病毒穿梭載體。所述的包含目的片段p24MEG的載體為，包含目的片段p24MEG和標(biāo)記片段GFP的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG。所述的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG通過多克隆位點(diǎn)將連接有GFP的目的片段p24MEG連接到pAdxsi載體上。本發(fā)明提供的重組腺病毒HIV疫苗，是以腺病毒作為具體的攜帶載體和佐劑，目的片段p24MEG被表達(dá)后，機(jī)體針對(duì)p24MEG蛋白所包含的表位被識(shí)別、遞呈之后能夠激發(fā)特異性的抗體，同時(shí)引起免疫細(xì)胞的剌激和免疫因子的誘生；由于p24作為載體支架分子使得多串聯(lián)的HIV表位能夠被有效的遞呈，進(jìn)而剌激機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)包括特異性抗體的體液免疫應(yīng)答；由于是HLA限制性的多表位的串聯(lián)，抗原遞呈之后，能夠激發(fā)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)；而且采用修飾后的低親和性表位在不改變表位肽和TCR結(jié)合的特異性的同時(shí)，增加"肽-MHC"的親和性卻可以激發(fā)針對(duì)天然低親和性表位的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高活性的CTL。該疫苗是一種既能夠產(chǎn)生中和不同HIV-l毒株的抗體，又可以誘導(dǎo)更加有效的HIV-1特異性CTL反應(yīng)的疫苗。本發(fā)明還公開了重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗的制備方法，包括以下步驟l)將SEQIDNO.2所示的MEG片段和SEQIDNO.3所示的p24基因部分序列連接后，通過KpnI/EcoRI雙酶切位點(diǎn)克隆入穿梭載體pShuttle-GFP-CMV，得到重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG;2)重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG被I-Ceul/I-Scel雙酶切后得到GFP-p24MEG片段，然后將其克隆入同樣被I-Ceul/I-Scel雙酶切的pAdxsi載體上，得到重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG;3)將PacI內(nèi)切酶線性化的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，得到重組腺病毒；4)包含重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的腺病毒大量擴(kuò)增后，細(xì)胞反復(fù)凍融后得到混懸液，離心收取包含重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的重組腺病毒的上清液；5)將上清液分別通過不連續(xù)密度梯度離心、連續(xù)密度梯度離心和透析分離純化，得到純化的重組腺病毒液，即為重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗。所述的MEG片段和p24基因部分序列連接為用包含Kpnl/BamHI雙酶切黏性末端的p24-651基因片段和包含BamHI/EcoRI雙酶切黏性末端的MEG片段，以及包含Kpnl/EcoRI雙酶切雙酶切黏性末端中間載體用T4DNA連接酶連接。本發(fā)明對(duì)于重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗的動(dòng)物免疫試驗(yàn)驗(yàn)證表明1、本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒HIV疫苗能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體；2、本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒HIV疫苗能夠顯著提高剌激特異性淋巴細(xì)胞增殖；3、本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒HIV疫苗能夠顯著誘導(dǎo)IL-2，IFN-r等細(xì)胞免疫因子的產(chǎn)生。4、本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒HIV疫苗能夠顯著誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，顯示較高的CTL活性。圖1為重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG的雙酶切鑒定電泳圖；圖2為pAdxsi載體的質(zhì)粒圖譜；圖3為重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的xhol酶切鑒定電泳圖，圖4為PCR法鑒定重組腺病毒中的p24MEG片段結(jié)果圖；圖5為ELISA法檢測(cè)重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG免疫小鼠后不同時(shí)間誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生的直方圖，橫坐標(biāo)免疫后周數(shù)，0-12周，縱坐標(biāo)0049。(波長(zhǎng))吸光度；圖6為pAdxsi-GFP-p24MEG特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，橫坐標(biāo)的各個(gè)免疫組分別為生理鹽水對(duì)照組，腺病毒空病毒對(duì)照組，重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG組，縱坐標(biāo)增殖剌激指數(shù)(stimulationindex,SI)=實(shí)驗(yàn)組0D/對(duì)照組0D表示；圖7為pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后細(xì)胞因子IFN-gamma誘生實(shí)驗(yàn)，橫坐標(biāo)pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后誘生細(xì)胞因子IFN-gamma的濃度，縱坐標(biāo)的各個(gè)免疫組分別為生理鹽水對(duì)照組，腺病毒空病毒對(duì)照組，重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG組；圖8為pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后細(xì)胞因子IL-2誘生實(shí)驗(yàn)，橫坐標(biāo)pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后誘生細(xì)胞因子IL_2的濃度；縱坐標(biāo)的各個(gè)免疫組分別為生理鹽水對(duì)照組，腺病毒空病毒對(duì)照組，重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG組；圖9為pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后特異性CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，橫坐標(biāo)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞數(shù)目的比值，縱坐標(biāo)不同效靶下的殺傷效率。具體實(shí)施例方式為了克服HIV疫苗誘導(dǎo)CTL反應(yīng)時(shí)HIV逃避CTL的識(shí)別缺陷；本發(fā)明提供的疫苗是是一種重組腺病毒HIV疫苗，以腺病毒作為載體和佐劑，以多串聯(lián)的CTL表位作為目標(biāo)基因片段構(gòu)建重組載體作為轉(zhuǎn)染的外源性載體。該疫苗既能夠產(chǎn)生中和HIV-1毒株的抗體，又可以誘導(dǎo)更加有效的HIV-1特異性CTL反應(yīng)的HIV疫苗。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、多串聯(lián)的HIV的HLA限制性CTL表位1)采用超基序、蛋白酶解預(yù)測(cè)相結(jié)合的辦法篩選HIV的HLA_A*0201限制性、低親和性的CTL表位首先，進(jìn)入SYFPEITHI主頁(http:〃www.syfpeithi.de/scripts/MHCServer.dll/home.htm)，對(duì)HIV基因組的Gag和pol基因區(qū)(Gag和pol抗原是HIV病毒重要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白)的HLA-A柳201限制性表位進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，選出HIV-1(本發(fā)明在在進(jìn)行表位預(yù)測(cè)選用更為常見的HIV-1作為具體的分型)的Gag和pol抗原中預(yù)測(cè)評(píng)分小于18的表位肽；這是因?yàn)榈陀H和力表位多為保守序列，不易發(fā)生突變；其次，以HLA限制性CTL表位結(jié)合力預(yù)測(cè)軟件(http:〃www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla-bind/)作為工具，進(jìn)一步選擇親和力評(píng)分小于6的九肽進(jìn)入下一步篩選過程；然后，對(duì)Gag和po1抗原進(jìn)行蛋白酶體降解位點(diǎn)預(yù)測(cè)，具體以(http:〃www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP和http:〃www.paproc.de)作為檢測(cè)，以0.5切割可能性的閾值。以在上述預(yù)測(cè)結(jié)果中均出現(xiàn)的肽為最終候選的HLA限制性的CTL表位肽，所選擇的表位是保守性高的低親和性的表位。2)對(duì)候選表位肽的氨基酸修飾對(duì)最終候選表位肽進(jìn)行氨基酸修飾，修飾肽的方法是將表位肽的第一位氨基酸殘基改為酪氨酸殘基(Tyr)，第二位的氨基酸殘基改造為亮氨酸殘基(Leu);并對(duì)改造后的表位肽按照上述1)所述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行超基序分析(http:〃www.syfpeithi.de/scripts/MHCServer.dll/home.htm)禾口親禾口性i平分(http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind禾口http://www.immune印itope.org)。超基序分析顯示改造后表位的分值均高于改造前，且高于18分，絕大多數(shù)大于217分(21分為常規(guī)判斷高親和力表位的標(biāo)準(zhǔn))，兩種親和力評(píng)分軟件分析也顯示親和力比改造前有明顯升高。3)綜合預(yù)測(cè)和改造方法得出修飾后HIV-1的gag和pol抗原為如表1所示表1篩選的用于多串聯(lián)的HIV的HLA限制性CTL表位<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4)多個(gè)HIV的HLA限制性CTL表位的串聯(lián)連接氨基酸修飾后各表位間用丙氨酸_丙氨酸_酪氨酸(Ala-Ala-Tyr)分隔連接，以便于各表位保持獨(dú)立性和能夠有效呈遞；由于各個(gè)表位是能夠獨(dú)立遞呈，因此這8個(gè)表位的串聯(lián)連接不需要特定連接的順序。2、包含多串聯(lián)的HLA限制性CTL表位的重組載體的構(gòu)建1)多串聯(lián)CTL表位基因的合成本發(fā)明具體以下面所述的順序串聯(lián)表1所公開的8個(gè)氨基酸修飾的CTL表位，對(duì)于表位串聯(lián)的順序也可以是其他形式的；具體串聯(lián)順序?yàn)椴捎胓ag-pol的連接方式，即首先是來自gag的表位之后是來自pol的表位，本發(fā)明具體公開SEQIDNO.1所示的序列，并以此作為后續(xù)構(gòu)建重組疫苗的基礎(chǔ)；將上述多表位串聯(lián)轉(zhuǎn)化翻譯為核苷酸序列，并在其5'和3'端分別引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，靠近5'端引入linker序列Gly4Ser3(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser);總共361bp的序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；其中，第3_8bp為BamHI酶切位點(diǎn)，第354-359bp為EcoRI酶切位點(diǎn)；合成上述核苷酸序列后，通過BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)克隆入peEM-T-eaSy載體，將重組后的載體記作T-MEG;雙酶切-電泳鑒定，并送至上海生工公司測(cè)序，證明T-MEG載體中目標(biāo)片段MEG序列無誤，多表位串聯(lián)的片段MEG克隆成功。2)疫苗支架分子HIV-lp24的序列合成HIV的衣殼蛋白p24是高度保守的核心蛋白，存在大量T、B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，能誘導(dǎo)不同病毒株的交叉免疫應(yīng)答；同時(shí)，P24蛋白能夠獨(dú)立形成顆粒樣結(jié)構(gòu)，是進(jìn)行HIV疫苗設(shè)計(jì)的重要候選抗原。我國(guó)研究人員使用P24抗原聯(lián)合若干HIV優(yōu)勢(shì)表位構(gòu)建的DNA疫苗，較好的誘導(dǎo)了小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答.(宋英今，金寧，張立樹，李子建，金洪濤，郎守民.治療性HIV-1重組DNA疫苗的構(gòu)建與免疫效果評(píng)價(jià).中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2005，18(2):126-128)為了選擇具有顆粒樣結(jié)構(gòu)HIVp24蛋白作為外源抗原表位的支架載體系統(tǒng)，以使所選抗原優(yōu)勢(shì)表位能夠充分展現(xiàn)在其表面，獲得更佳的免疫效果；本發(fā)明以HIV-lp24蛋白作為疫苗的支架分子，將HIV-lp24的部分基因序列整合到多表位連接片段MEG上。HIV-lp24基因的克隆具體為根據(jù)HIV-1標(biāo)準(zhǔn)株p24片段基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，正向引物引入KpnI酶切位點(diǎn)，反向引物引入BamHI酶切位點(diǎn)；其特異性的引物設(shè)計(jì)為正向弓I物P1:gcggtaccatgcctagaactttaaatgcatg31;反向弓l物P2:gcggatcccaagactcttgctttatgtc28;PCR模板為pucl9/HIV-l(HIV標(biāo)準(zhǔn)株)，以引物Pl、P2擴(kuò)增編碼HIV-1核心蛋白p24基因的序列，PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，94t:變性50sec，6(TC復(fù)性50sec，72°C延伸60sec，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72"C延伸10min;擴(kuò)增后的651bp序列如SEQIDNO.3所示；將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收，并將其記作p24-651;將p24_651基因通過KpnI酶切位點(diǎn)、BamHI酶切位點(diǎn)克隆入PeEM-T-eaSy載體，將重組后的載體記作T-p24;雙酶切_電泳鑒定，觀察有無目的片段，并送至上海生工公司測(cè)序，后證明T-p24載體中目標(biāo)片段p24-651序列無誤，疫苗支架分子的基因片段p24克隆成功。3)多串聯(lián)CTL表位基因與疫苗支架分子基因p24-651的拼接用Kpnl/BamHI雙酶切T-p24，獲得p24_651基因片段；以BamHI和EcoRI雙酶切T-MEG，獲得MEG片段，將p24-651、MEG和經(jīng)Kpnl和EcoRI雙酶切的真核載體pCDNA3.1(+)用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a;藍(lán)白篩選后挑取陽性克隆，將重組質(zhì)粒記作pcDNA3.1(+)/p24MEG;并對(duì)重組質(zhì)粒用雙酶切鑒定，將酶切鑒定得到的陽性克隆，送TaKaRa公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，后證明目標(biāo)片段p24MEG序列無誤，連接有支架分子基因p24的多串聯(lián)CTL表位基因片段克隆成功。4)包含p24MEG片段的重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG的構(gòu)建a、重組穿梭載體pShuttle-GFP-CMV酶切將pShuttle-GFP-CMV重組穿梭載體用Kpnl/EcoRI酶切，然后CIP(堿性磷酸酶)去磷酸化處理(酶切體系及反應(yīng)條件如表2所示)，然后加樣至1%的瓊脂糖凝膠，電泳(100V，45min)，在紫外燈下切下目的片段(5.lkb)，用DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)回收5.lkb的載體片段；表2Kpnl/EcoRI酶切體系及CIP反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>b、pcDNA3.1(+)/p24MEG載體酶切將pcDNA3.1(+)/p24MEG進(jìn)行Kpnl/EcoRI酶切處理(50iiL的酶切體系，其中10U/yL的Kpnl酶1iiL，10U/iiL的EcoRI酶1yL，37°C3-4小時(shí))，酶切結(jié)束后，用DNA純化試劑盒(柱離心型)回收1012bp的片段，得到含有相應(yīng)粘性末端(Kpnl/EcoRI)的p24MEG片段；c、酶切片段連接，構(gòu)建重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG將酶切處理好的pShuttle-GFP-CMV重組穿梭載體載體片段和插入片段p24MEG用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，取3iiL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株，涂布到卡那抗性固體培養(yǎng)基平皿篩選培養(yǎng)。挑取若干單克隆菌落，接種到LB培養(yǎng)基(卡那抗性液體培養(yǎng)基)中，37t:、搖床中300rpm振蕩培養(yǎng)過夜；然后提取質(zhì)粒，進(jìn)行重組穿梭載體質(zhì)粒酶切鑒定，50yL酶切鑒定體系及反應(yīng)條件如表3所示表3Kpnl/EcoRI雙酶切體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>酶切鑒定結(jié)果如圖1所示，其中，泳道M為Marker,從上到下依次為8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.6kb，lkb，517bp，396bp，230bp;在泳道14可以清楚看到分離到了lkb的目標(biāo)片段p24MEG;酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆將得到lkb的目標(biāo)片段p24MEG、5.lkb的pShuttle-GFP重組穿梭載體酶切片段；至此重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG構(gòu)建成功。5)將重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG轉(zhuǎn)移到pAdxsi載體上，構(gòu)建重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEGa、用I-Ceul/I-Scel雙酶切處理pAdxsi載體(pAdxsi載體的質(zhì)粒圖譜如圖2所示)，并做CIP去磷酸化處理，酶切及反應(yīng)條件如表4所示表4I-Ceul/I-Scel雙酶切及CIP體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>酶切反應(yīng)完成后，再加入10%SDS，75t:滅活10min后用乙醇沉淀法回收pAdxsi載體；b、I-Ceul/I-Scel雙酶切處理穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG(酶切反應(yīng)條件參照上述pAdxsi載體的酶切)，酶切反應(yīng)完成后，瓊脂糖凝膠電泳回收約3.8kb的GFP-p24MEG片段；c、pAdxsi-GFP-p24MEG載體的連接將雙酶切后回收的pAdxsi載體片段和插入片段GFP-p24MEG，在22C條件下用5Weissu/iiL的T4DNA連接酶進(jìn)行連接；然后取3yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株，涂布到氨卞抗性固體培養(yǎng)基平皿；挑取若干單克隆菌落，接種到氨卞抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并進(jìn)行Xhol酶切鑒定(20U/iiL的Xhol限制性酶37。C反應(yīng)1-2小時(shí))20U/yL，根據(jù)重組后腺病毒載體的序列分析攜帶目的基因表達(dá)框的陽性克隆被XhoI酶切后電泳圖譜如圖3所示，其中，泳道M為Marker,從上到下依次為14.5K/11.7K/3.6kb/2.66K/2.47K/1.45K/0.6K;泳道14為陽性克隆，其片段依次為14.5K/11.7K/3.6kb/2.66K/2.47K/1.45K/0.6K，其中，目的片段GFP-p24MEG為2.2K，這表明陽性克隆已經(jīng)表達(dá)了轉(zhuǎn)入的重組腺病毒載體。3、包含p24MEG目的片段的重組腺病毒的構(gòu)建、培養(yǎng)及純化1)大量制備重組質(zhì)粒pAdxsi-GFP-p24MEG將重組菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LB培養(yǎng)液2ml加入100mL含100ug/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37t:、300rpm震蕩搖菌過夜；大提質(zhì)粒試劑盒提取pAdxsi-GFP-p24MEG質(zhì)粒。2)重組腺病毒載體的包裝，收毒及擴(kuò)增a、鋪細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，將人胚腎293細(xì)胞接種于六孔板中，每孔5X105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM+10%Hyclone胎牛血清，置37。C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；b、重組腺病毒載體病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-p24MEG的線性化轉(zhuǎn)染前，將鑒定正確的攜帶目的基因的腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-p24MEG用PacI內(nèi)切酶線性化，酶切反應(yīng)體系及條件如表5所示表5PacI酶切體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>C、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，將293細(xì)胞接種于六孔板中，每孔5X105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM+10%Hyclon胎牛血清，置37。C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的80-90%時(shí)，取重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-GFP-p24MEG，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體按其所附說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟為每個(gè)轉(zhuǎn)染孔加入線性化的重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-p24MEG5ug，用300iU的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min;取10ul的脂質(zhì)體用300ii1的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min;將兩者混和，室溫避光放置30min，然后將混合物加入到細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞出毒跡象；d、第一代毒種收毒每天觀察細(xì)胞出毒跡象，出毒現(xiàn)象為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑；待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒，即收取重組腺病毒；將六孔板中兩個(gè)孔的所有細(xì)胞及培養(yǎng)液收于15ml離心管中，放入-8(TC冰箱保存；e、凍融取一個(gè)能夠容納離心管架子的冰盒，放入干冰和酒精的混合物，打開恒溫水浴鍋至37°C，在干冰酒精及37t:水浴反復(fù)凍融三次后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集含腺病毒的上清液，棄沉淀；該上清即為pAdxsi-p24MEG第一代毒種(Pl)，作為隨后大量病毒擴(kuò)增的毒種；f、擴(kuò)增從第一代毒種(Pl)重組腺病毒上清(約3ml)中取2ml感染一個(gè)75cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶的人腎293細(xì)胞(細(xì)胞密度保證90%以上)；余下的重組腺病毒上清放入外旋的凍存管中-S(TC保留，做為毒種保留；g、第二代毒種收毒重組腺病毒擴(kuò)增兩天后，待所有細(xì)胞脫落底面即可進(jìn)行收毒，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一同收入15ml離心管中，2000轉(zhuǎn)離心5分鐘棄掉上清，加入lmlSTbuffer(培養(yǎng)液+10%血清+2.5%甘油)，震蕩混勻后-S(TC保存待用；依據(jù)前面的凍融方法，凍融三次，取上清進(jìn)行下一代擴(kuò)增或于-8(TC保存。h、腺病毒大量擴(kuò)增按每個(gè)75cm2方瓶中接種4X106的人腎293細(xì)胞，接種6個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)滿至90X時(shí)，將P2代病毒(除取少量留毒種外)全部接種培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，M小時(shí)后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有60%細(xì)胞病變，46小時(shí)后細(xì)胞完全病變；收獲病變細(xì)胞混懸液后，2000rpm離心5分鐘，離心，棄上清，加入6mlSTbuffer(培養(yǎng)液+10%血清+2.5%甘油)，震蕩混勻，于-80。C和37°C間凍融三次，3000rpm離心5min取上清，按同樣方法接種于另外40個(gè)75cm2方瓶中，46小時(shí)完全病變；細(xì)胞和STbuffer(DMEM培養(yǎng)液+10X血清+2.5%甘油)3次凍融后即成為混懸液，將混懸液3000rpm離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用STbuffer重懸，經(jīng)反復(fù)凍融后保存于_80°〇保13存待用；3)腺病毒的純化a、不連續(xù)密度梯度離心將離心機(jī)預(yù)冷到4°C，慢慢將8mlCsCll.4(秤取53gCsCl加87mllOmmol/LTris*Cl(pH8.0)溶解后過濾，4。C保存)加入離心管中，繼續(xù)緩慢加入10mlCsCll.2(秤取26.8gCsCl加92mllOmmol/LTris*C1(pH8.0)溶解后過濾，4。C保存)，在其上部緩慢加入約20ml的重組腺病毒重懸溶液(不夠20ml用10mMTris補(bǔ)齊)；將離心管配平之后，100000Xg(24000rpminSW31)離心90分鐘，4°C，減速度為0;離心結(jié)束后，吸棄離心管上部的廢液，并用75%酒精擦拭離心管的管壁，用膠布貼住將要穿剌的部位(防止穿剌時(shí)管裂)，用5ml針管配1.22(18G)的針頭在藍(lán)白色條帶下方穿剌吸出重組腺病毒溶液(針頭開口向上)用至少一倍體積的TE(100mlTrisCI(lmol/L，pH8.0)和10mllmol/LEDTA(pH8.0)加水定容至1L)稀釋所收集的重組病毒溶液b、連續(xù)密度梯度離心慢慢將12mlCsCll.4加入離心管中，繼續(xù)緩慢加入14mlCsCll.2，在其上部非常緩慢的加入8-10ml稀釋好的重組病毒溶液，將離心管配平，100000Xg(24000rpminSW31)16-20小時(shí)，4°C，減速度為0;離心結(jié)束后，吸棄離心管上部的廢液并用75%酒精擦拭離心管的管壁，用膠布貼住將要穿剌的部位(防止穿剌時(shí)管裂)，用5ml針管配0.8(20G)的針頭吸出藍(lán)白條帶(方法同上)或在離心管下部扎孔使液體自然流下來，收集藍(lán)白色條帶即可(可以減少CsCl混入)。c、透析將所吸出的重組腺病毒液注射入PIERCE透析卡(Pirpce公司)中進(jìn)行透析，每次用200X體積的透析buffer,透析三次，間隔一小時(shí)換一次液，透析結(jié)束后，將重組腺病毒分裝，-8(TC保存病毒。4)純化病毒的滴度測(cè)定及檢測(cè)a、重組腺病毒的0D260測(cè)定，并按照VP/ml=0D260XI.1X1012，計(jì)算得到每ml制品中的病毒顆粒數(shù)為0.3X1012VP/ml;b、測(cè)定重組腺病毒的0D260/0D280比值，反應(yīng)制備的重組腺病毒的純度，正常范圍為1.21.3之間；c、提取重組腺病毒的基因組，以Pl、P2作為引物對(duì)用PCR法鑒定重組腺病毒是否攜帶目的基因P24MEG;結(jié)果如圖4所示，其中，M為Marker,泳道1檢測(cè)到了p24片段，說明重組腺病毒是否攜帶目的基因p24MEG。d、用經(jīng)典方法測(cè)定重組腺病毒制品的TCID50值為TCID50=10—65/100y1。5)純化得到的整合了目的片段p24MEG基因的重組腺病毒，稱為重組腺病毒pAdxsi-p24MEG，即為本發(fā)明所提供的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗。4、對(duì)于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗的效果驗(yàn)證1)重組腺病毒pAdxsi-p24MEG免疫HHD-2小鼠疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平檢測(cè)[OWO]a、動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)共分3組，每組5只HHD-2小鼠第一組用重組腺病毒pAdxsi-p24MEG免疫，劑量為108pfu/0.2mL/只，肌肉接種，3周后加強(qiáng)一次；第二組和第三組分別為普通腺病毒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，免疫方式均同重組腺病毒免疫組；免疫前尾部取血分離血清，第一次免疫后兩周開始尾部取血分離血清，間隔兩周取一次，_201:凍存?zhèn)錂z；末次免疫結(jié)束8周后，測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖剌激指數(shù)、CTL效應(yīng)以及IFN-Y禾PIL-2水平。b、免疫小鼠一般狀況各組免疫小鼠均存活到處死前，小鼠沒有出現(xiàn)其他明顯異常，生長(zhǎng)良好。c、免疫小鼠體液免疫檢測(cè)l)ELISA法檢測(cè)血清中融合蛋白p24MEG的特異性抗體測(cè)定用純化的p24MEG融合蛋白作為包被抗原，0.liig(100iU每孔)，4。C過夜；用含0.05%Tween20的PBS洗5次，1%BSA封閉4。C過夜；PBS洗5次后，待檢血清用含0.05%Tween20的PBS做1:100稀釋，每孔100yl，37。C放置lh;PBS洗5次，加入1:10000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37。C放置lh;PBS洗5次，加入TMB顯色，0D49。處測(cè)吸光度；結(jié)果如圖5所示免疫重組腺病毒pAdxsi-p24MEG后，小鼠特異性抗體抗p24MEG產(chǎn)生，在68周時(shí)達(dá)到高峰，然后迅速下降，抗體水平較腺病毒載體對(duì)照和生理鹽水對(duì)照有顯著差異(P<0.05;P<0.01);說明本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒HIV疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體(抗p24MEG即對(duì)HIV產(chǎn)生比較有效的保護(hù)作用)；腺病毒載體免疫組以及生理鹽水對(duì)照組均未能誘生特異性抗體產(chǎn)生。d、免疫小鼠的細(xì)胞免疫檢測(cè)1)特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)免疫小鼠后第12周，取小鼠脾臟置鋼網(wǎng)上研磨成單細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106個(gè)/mL，置96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔200iiL，同時(shí)每孔加入p24MEG純化蛋白(25mg/L溶于PBS)，對(duì)照組不加蛋白，調(diào)零孔不加脾細(xì)胞；置5%0)2孵箱中37。C培養(yǎng)68h后，每孔加入20iiLMTT(5mg/mL，溶于PBS，pH7.2，過濾處菌)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，棄盡上清，每孔加入匿SO150iiL，震蕩10分鐘，測(cè)0D49Qnm值，結(jié)果用增殖剌激指數(shù)(stimulationindex,SI)=實(shí)驗(yàn)組0D/對(duì)照組0D表示；結(jié)果如圖6所示，重組腺病毒免疫小鼠的特異性淋巴細(xì)胞增值指數(shù)為2.6，該指數(shù)表示淋巴細(xì)胞免疫后再次接觸免疫原的剌激后增殖情況；腺病毒免疫小鼠的特異性淋巴細(xì)胞增值指數(shù)為1.2，生理鹽水對(duì)照組淋巴細(xì)胞的增殖剌激指數(shù)為0.8;分析表明重組腺病毒顯著高于腺病毒免疫組和生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)，另外，腺病毒免疫組較生理鹽水對(duì)照組有顯著差異(P〈0.01)，也說明腺病毒自身作為一種佐劑，能引起淋巴細(xì)胞增殖。2)細(xì)胞因子的誘生及其測(cè)定用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將各組免疫小鼠脾細(xì)胞調(diào)整至5X106/mL，加入24孔板中培養(yǎng)，800iiL/孔，分別加入p24MEG純化蛋白10yg/孔，對(duì)照組不加蛋白;置5%0)2孵箱中37t:培養(yǎng)42h，收集培養(yǎng)液，5，000rpm離心5min，取上清，_20°C15凍存?zhèn)錂z；IFN-y及IL-2含量的測(cè)定，參照試劑盒說明書進(jìn)行(夾心ELISA法)。(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將IFN-y及IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2，000.00pg/L、l，OOOpg/L、500pg/L、250pg/L、125pg/L、62.5pg/L的濃度梯度，加入96孔板中，lOOyL/孔。設(shè)空白對(duì)照，37t:孵育60min，洗滌液洗滌3次后，加生物素化抗小鼠IFN-y或IL_2抗體抗體，100iiL/孔，空白對(duì)照除外，37t:孵育60min。洗滌液洗滌3次后，加入OPD底物100yL/孔，避光15min，加入終止液100yL/孔，于450nm測(cè)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品檢測(cè)取上述誘導(dǎo)的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清加入微板中，100iiL/孔，與上述相同的方法進(jìn)行檢測(cè)，并利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中所含IFN-y及IL-2濃度。(3)結(jié)果檢測(cè)如圖7、8所示，分析表明，重組腺病毒組和普通腺病毒對(duì)照組IFN-y和IL-2水平均高于對(duì)照組(P<0.01)，且重組腺病毒免疫組高于普通腺病毒組(P<0.05);提示重組腺病毒pAdxsi-p24MEG疫苗能夠誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。f、免疫小鼠的特異性CTL殺傷實(shí)驗(yàn)免疫小鼠后第12周分離免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1Xl(f個(gè)/mL，置于96孔培養(yǎng)板中用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入p24MEG純化蛋白至終濃度為10iimol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2d，作為效應(yīng)細(xì)胞；C1R-AD細(xì)胞作為耙細(xì)胞。按不同的效靶比進(jìn)行CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTL的細(xì)胞毒活性，并按下面的公式計(jì)算殺傷率細(xì)胞殺傷率=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-自然釋放對(duì)照組平均A值)/(最大釋放對(duì)照組平均A值-自然釋放對(duì)照組平均A值)X100%。CTL活性檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，重組腺病毒組的平均殺傷活性達(dá)到48X，普通腺病毒組和生理鹽水組分別為17.6%和9.0%。重組腺病毒誘導(dǎo)的CTL活性在效靶比為100:1時(shí)達(dá)到最高，為65.3%，顯著高于生理鹽水組(10.1%)和普通腺病毒組(22.8%)。核苷酸序列表〈110〉中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)〈120〉一種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗及其制備方法〈160>3〈210>1〈211>96〈212>PRT〈213>人工合成〈400>1Tyr_Leu_Ala_Asn_Phe_Leu_Gly_Lys_Ile_Ala_Ala_Tyr_Ala_Ala_Tyr_Tyr_Leu_Asn_Asn_Pro15101520Pro_Ile_Pro_Val_Ala_Ala_Tyr_Tyr_Leu_Tyr_Lys_Arg_Trp_Ile_Ile_Leu_Ala_Ala-Tyr-Tyr25303540Leu-Ser-Leu-Ser-Phe-Pro-Gln-Ile-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-Gly--Ala-Asp_Asp_Thr45505560Ala—Ala—Tyr—Tyr—Leu—Ser—Gln—Ile_Ile_Glu_Gln_Leu_Ala_Ala_Tyr_Tyr--Leu-Gly_Glu_Arg65707580Ile-Val-Asp-Ile-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu_Gln_Lys_Glu_Thr_Trp_Glu_Ala859095〈210>2〈211>361〈212>DNA〈213〉人工合成的MEG片段〈400>2gcggatccggcgg郷cggt解tgggggtggtggctctgggggcggcggtagcgctgcct60actetctagcaaacttcctgggte卿ttgccgcgtettecctgaacaatccgccgatcc120ctgttgcggcatettecctetateaacgttggatcatcctcgctgcctettetctgtcct180tgctgtttccacagattgctgcgtectetctetcacagattettgaacaactggcagcct240attetctgcatggg皿gragctgcctectetcttgacaccggagcggatg300atactgcggcctetteccteggcgagcgrattgtggatetagcggcgtecteactcgagg360c361〈210>3〈211>651〈212>DNA〈213>HIV的p24基因〈400>2atgccteg朋cttteaatgcgtegteg皿gag皿ggctttC3gCCC3g皿60gteatecccatgttttcagcggagccaccccacaagattt120cteaacacagtgggggg織tcaggcagccatgca^tgtte皿3g3gac180gaagctgcag朋tggg3tegattgcatccagtgc郷ragggcctgttgc3CC3ggCC3g2403tg3g3g朋Cc朋gggg朋gtgacategcagg皿ctectegtecccttca300gg￡ltgg￡ltg￡lacctetcccagteggag^atctetea皿gatggateatc360ctgggatteaatea^tegtagcccttccagcattttgga420gg3CC3朋ggaaccctttegagactetgtegaccggttct皿gagccgag■caagcttcaca^ttggatgtgttggtcca540ccagattgtegg紅郷agctecactega6003C3gcatgtcagggagtggg3ggacccgg3cate朋gc朋gagtcttgtea65權(quán)利要求一種多串聯(lián)表位，其特征在于，該多串聯(lián)表位由Ala-Ala-Tyr連接多個(gè)HIV的HLA限制性CTL表位，其中，包括以下表位Tyr-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys-Ile；Tyr-Leu-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val；Tyr-Leu-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu；Tyr-Leu-Ser-Leu-Ser-Phe-Pro-Gln-Ile；Tyr-Leu-Asp-Thr-Gly-Ala-Asp-Asp-Thr；Tyr-Leu-Ser-Gln-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu；Tyr-Leu-Gly-Glu-Arg-Ile-Val-Asp-Ile；Tyr-Leu-Gln-Lys-Glu-Thr-Trp-Glu-Ala。2.如權(quán)利要求l所述的多串聯(lián)表位，其特征在于，其具體的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.—種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，該疫苗是將包含目的片段p24MEG的載體整合到腺病毒的基因組；所述目的片段P24MEG是將HIV-1的p24基因部分序列與表達(dá)權(quán)利要求1所述的多串聯(lián)表位的核苷酸序列MEG連接。4.如權(quán)利要求3所述的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述MEG的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.如權(quán)利要求3所述的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述HIV的p24基因部分序列如SEQIDNO.3所示。6.如權(quán)利要求3所述的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述的載體是腺病毒穿梭載體。7.如權(quán)利要求3所述的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述包含目的片段P24MEG的載體是，包含目的片段p24MEG和標(biāo)記片段GFP的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG。8.如權(quán)利要求7所述的基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG通過多克隆位點(diǎn)將連接有GFP的目的片段p24MEG連接至ljpAdxsi載體上。9.一種包含權(quán)利要求8所述的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的重組腺病毒HIV疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)將SEQIDNO.2所示的MEG片段和SEQIDNO.3所示的p24基因部分序列連接后，通過KpnI/EcoRI雙酶切位點(diǎn)克隆入穿梭載體pShuttle-GFP-CMV，得到重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG;2)重組穿梭載體pShuttle-GFP-p24MEG被I-Ceul/I-Scel雙酶切后得到GFP-p24MEG片段，然后將其克隆入同樣被I-Ceul/I-Scel雙酶切的pAdxsi載體上，得到重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG;3)將PacI內(nèi)切酶線性化的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，得到重組腺病毒；4)包含重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的腺病毒大量擴(kuò)增后，細(xì)胞反復(fù)凍融后得到混懸液，離心收取包含重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的重組腺病毒的上清液；5)將上清液分別通過不連續(xù)密度梯度離心、連續(xù)密度梯度離心和透析分離純化，得到純化的重組腺病毒液，即為重組腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗。10.如權(quán)利要求9所述的包含重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-p24MEG的重組腺病毒HIV疫苗的制備方法，其特征在于，MEG片段和p24基因部分序列連接為用包含Kpnl/BamHI雙酶切黏性末端的p24-651基因片段和包含BamHI/EcoRI雙酶切黏性末端的MEG片段，以及包含Kpnl/EcoRI雙酶切雙酶切黏性末端中間載體用T4DNA連接酶連接。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于多串聯(lián)表位的重組腺病毒HIV疫苗及其制備方法，該疫苗是一種重組腺病毒HIV疫苗，以腺病毒作為載體，以改造隱性表位為基礎(chǔ)的多串聯(lián)的CTL表位基因作為目標(biāo)基因片段構(gòu)建重組腺病毒載體作為轉(zhuǎn)染的外源性載體。本發(fā)明提供的疫苗克服HIV疫苗誘導(dǎo)CTL反應(yīng)時(shí)HIV逃避CTL的識(shí)別缺陷，既能夠產(chǎn)生中和HIV-1毒株的抗體，又可以誘導(dǎo)更加有效的HIV-1特異性CTL反應(yīng)的HIV疫苗。文檔編號(hào)A61K39/21GK101792491SQ200910221358公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2009年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日發(fā)明者劉忠湘,張寧,李英輝,趙亞申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)