專利名稱：：一種促進(jìn)中樞系統(tǒng)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及醫(yī)用配制品，特別是含抗原的醫(yī)用配制品。
背景技術(shù)：
：中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem,CNS)損傷后的神經(jīng)再生修復(fù)是十分復(fù)雜的病理生理過程，涉及從分子、細(xì)胞、器官到整體的各個(gè)層次的變化。目前的研究表明，中樞神經(jīng)軸突并非缺乏再生能力，而是中樞內(nèi)環(huán)境不適合再生。CNS損傷早期，受損崩解的髓鞘(由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成)釋放大量的髓鞘相關(guān)軸突生長(zhǎng)抑制因子，如Nogo-A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelinglycoprotein，0Mgp)等。目前對(duì)抗軸突再生抑制性作用的方法有如下幾種1、利用單抗IN-1阻斷Nogo-A的抑制作用；在體外，IN-1能夠阻斷髓磷脂底物的軸突生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。分泌IN-1的雜交瘤細(xì)胞移植到脊髓背側(cè)半切損傷的大鼠大腦半球中，可獲得了長(zhǎng)距離的軸突再生，最長(zhǎng)可達(dá)20mm。盡管使用IN-1阻斷Nogo-A是一種誘人的方法，但是髓磷脂還存在其它眾多的抑制成分，IN-1無法阻斷其他眾多的抑制性分子；2、純化髓磷脂作為免疫原免疫；有學(xué)者使用純化的髓磷脂來免疫大鼠，成功阻斷了所有的抑制因素，然而該方法必須使用佛氏不完全佐劑，并不適用于人類，且有誘發(fā)廣泛自身免疫反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)；3、構(gòu)建針對(duì)NgR的DNA疫苗或者利用原核表達(dá)的NgR蛋白作為抗原，此方法雖是對(duì)抗抑制信號(hào)通路上關(guān)鍵性受體分子，但目前研究表明存在其他抑制性信號(hào)旁路，仍不盡人意。由此可見，目前對(duì)抗軸突再生抑制性作用的方法或疫苗多是針對(duì)單一抑制因子，難以達(dá)到理想的促進(jìn)中樞系統(tǒng)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種針對(duì)多種軸突再生抑制因子的DNA疫苗。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是—種促進(jìn)中樞系統(tǒng)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的DNA疫苗，該疫苗由抗原基因和真核表達(dá)載體構(gòu)成；所述的抗原基因是由編碼LING0-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段以及編碼neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段依次線性連接構(gòu)成的融合基因，各基因片段之間通過編碼三個(gè)丙氨酸的DNA序列連接(結(jié)構(gòu)如圖1所示)。本發(fā)明所述DNA疫苗的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)采用全基因合成的方法從含有LING0-1基因片段、TN-R基因片段和neurocan基因片段的載體中獲得編碼LING0-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段以及編碼neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段，并對(duì)這三個(gè)基因片段作以下改造①在編碼LING0-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段的5'端引入啟動(dòng)密碼子，②分別在編碼LING0-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段和TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段的3'端分別引入編碼三個(gè)丙氨酸的DNA序列，③在編碼neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段的3'端引入終止密碼子；(2)將LING0-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段、TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段以及neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段依次克隆到真核表達(dá)載體中。上述方法中，步驟(1)中PCR方法所用引物設(shè)計(jì)應(yīng)滿足以下要求可分別特異性擴(kuò)增LINGO-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段、TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段以及neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段；可在各片段上引入與所選克隆位點(diǎn)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)使所述片段可克隆到真核載體；可在LINGO-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段的5'端設(shè)置啟動(dòng)密碼子，在LINGO-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段的3'端設(shè)置終止密碼子以滿足所述DNA片段在真核宿主中表達(dá)的要求；在TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段以及neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段的5'端引入編碼三個(gè)丙氨酸的DNA序列。這些都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟識(shí)并可完成的技術(shù)。本發(fā)明DNA疫苗可表達(dá)LINGO-1的LRR結(jié)構(gòu)域、TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域和neurocan的第1011-1271個(gè)氨基酸的融合蛋白，其中，LRR(全稱為leucine-richr印eat)結(jié)構(gòu)域是LINGO—1(全稱為L(zhǎng)eucine—richrepeatandIgdomain-containingnogoreceptor-interactingprotein1)蛋白分子的膜外功能區(qū)的重要組成部分，是拮抗受體生理功能的最佳位點(diǎn)；EGFL(即表皮生長(zhǎng)因子樣序列)結(jié)構(gòu)域?yàn)門N-R(全稱為tenascin-R)蛋白分子起軸突抑制作用的功能區(qū)域。CSPGs(全稱為chondroitinsulphat印roteoglycans)也是膠質(zhì)瘢痕中有抑制軸突再生作用最重要的細(xì)胞外基質(zhì)之一，neurocan(即神經(jīng)粘蛋白)為CSPGs核心蛋白的一種，特異存在于CNS，對(duì)軸突再生有明顯抑制作用，本發(fā)明所選編碼neurocan第1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段是表達(dá)EGF、EGF_CA、CLECT_CSPGs和CCP結(jié)構(gòu)域的部分，該結(jié)構(gòu)域亦是neurocan蛋白分子軸突抑制作用的功能區(qū)域。本發(fā)明選擇編碼與抑制軸突再生相關(guān)蛋白質(zhì)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的DNA片段作為抗原基因，其表達(dá)產(chǎn)物不僅可達(dá)到理想的免疫效果，還可避免整個(gè)蛋白分子有可能產(chǎn)生的非特異性免疫反應(yīng)。將編碼上述結(jié)構(gòu)域的片段以融合基因的形式克隆到真核表達(dá)載體中，然后通過肌肉注射真核表達(dá)載體即可將所述融合基因轉(zhuǎn)染至宿主體細(xì)胞中；當(dāng)融合基因在宿主體內(nèi)成功表達(dá)后，其表達(dá)產(chǎn)物即為L(zhǎng)INGO-l、TN-R和CSPGs各相關(guān)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，可作為抗原剌激宿主產(chǎn)生相應(yīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子的抗體，這些抗體可對(duì)抗多種軸突生長(zhǎng)抑制因子的活性，為中樞系統(tǒng)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)提供良好的微環(huán)境。融合蛋白中各片段之間通過三個(gè)丙氨酸連接，保證了DNA疫苗表達(dá)融合蛋白的各個(gè)結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)不發(fā)生相互影響。圖1是本發(fā)明DNA疫苗結(jié)構(gòu)示意圖；其中，,表示啟動(dòng)密碼子，n表示編碼LINGO-1的LRR的基因片段，藝表示編碼TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段，歸表示編碼neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段，表示編碼三個(gè)丙氨酸的DNA序列，O表示終止密碼子。圖2為本發(fā)明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan的酶切鑒定結(jié)果的電泳圖，其中l(wèi)anel為DNAMarkerl，lane2為DNAMarker2，lane3為BamHI和XhoI的酶切產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot檢測(cè)結(jié)果電泳圖，其中l(wèi)anel為proteinMarker,lane2為陰性對(duì)照，lane3為本發(fā)明DNA疫苗的表達(dá)產(chǎn)物。圖4為檢測(cè)本發(fā)明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan在大鼠體內(nèi)表達(dá)情況的免疫組織化學(xué)染色照片，其中A為免疫小鼠中LING0-1的表達(dá)情況，C為免疫小鼠中neurocan的表達(dá)情況，B、D均為陰性對(duì)照。圖5為經(jīng)本發(fā)明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan免疫的小鼠血清削弱MAG-Fc對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的抑制作用的效果柱形圖，其中口表示PLL處理的陰性對(duì)照，図表示PLL+MAG-Fc處理，圓表示表示PLL+MAG-Fc+抗血清處理。圖6為本發(fā)明DNA疫苗對(duì)RhoA抑制信號(hào)影響的檢測(cè)結(jié)果的柱形圖。圖7為本發(fā)明DNA疫苗的神經(jīng)保護(hù)性作用的檢測(cè)結(jié)果的柱形圖。圖8為本發(fā)明DNA疫苗促進(jìn)大鼠SCI后軸突再生的統(tǒng)計(jì)圖。圖9為本發(fā)明DNA疫苗促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果曲線圖，其中i表示對(duì)照組，A表示實(shí)驗(yàn)組。圖10為本發(fā)明DNA疫苗促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果柱形圖，其中口表示對(duì)照組，B表示實(shí)驗(yàn)組。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的例子詳細(xì)介紹本發(fā)明DNA疫苗的制備過程及其所具有的技術(shù)效果。1、本發(fā)明DNA疫苗構(gòu)建及鑒定所需試劑LING0-1基因購自0penbiosystem公司(CatalogNumber:MHS1010-73556，載體為pCMV-SP0RT6);TN-R及neurocan各結(jié)構(gòu)域由上海invitrogen公司全基因合成并連接于pMD-18T載體，設(shè)計(jì)的特異性引物也由該公司合成(因各片段不長(zhǎng)，為了節(jié)約時(shí)間及防止常規(guī)釣取基因時(shí)不必要的堿基突變，我們采用全基因合成方法)；PCRAmplificationKit、DNAMarker(DL2000，DL15000)、蛋白Marker和DAB顯色底物購自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒、T4DNA連接酶及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Promega公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司，pcDNA3.1(+)、質(zhì)粒大量提取試劑盒ProFilterPlasmidMaxiPr印Kits、Lipofectamine2000、羊抗LING0-1多克隆抗體購自invitrogen公司；pMD-18T、EB、感受態(tài)細(xì)菌JM109及DH-5a源于本室保存；瓊脂糖購自Sigma公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白定量檢測(cè)試劑盒(BCAProteinAssayKit)購自Pierce公司；重組大鼠MAG-Fc蛋白購于R&D公司；Lewis大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。2、本發(fā)明DNA疫苗構(gòu)建(1)用序列為SEQNO.1和SEQNO.2的引物從含有LINGO-1基因的載體中擴(kuò)增LRR5結(jié)構(gòu)域的基因片段；PCR的反應(yīng)程序?yàn)橄壬郎刂?fC反應(yīng)5分鐘，然后在下述條件下反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94°C30秒，55t:30秒，72。C1分鐘；最后在72。C下保持10分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為763bp;用序列為SEQNO.3和SEQNO.4的引物從含有TN-R基因的載體中擴(kuò)增編碼TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段；PCR的反應(yīng)程序?yàn)橄壬郎刂?4t:反應(yīng)5分鐘，然后在下述條件下反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94。C30秒，59°C30秒，72°C1分鐘，最后在72。C下保持10分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為630bp;用序列為SEQNO.5和SEQNO.6的引物從含有neurocan基因的載體中擴(kuò)增編碼neurocan的1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段；PCR的反應(yīng)程序?yàn)橄壬郎刂?4。C反應(yīng)5分鐘，然后在下述條件下反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94°C30秒、53t:30秒、72。C1分鐘，最后在72。C下保持10分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為801bp。(2)將步驟(1)所得的三個(gè)基因片段分別克隆到pMD-18T載體中，得到pMD-18T-LING0-l載體、pMD-18T-TN-R載體和pMD-18T-neurocan載體。重組pMD-18T載體的鑒定用BamHI和SacII酶切pMD-18T-LING0-l，用SacII和Notl酶切pMD-18T-TN-R，用Notl和Xhol酶切pMD-18T-neurocan，所得酶切產(chǎn)物分別電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物的小片段大小為763bp、630bp和801bp，與預(yù)期結(jié)果相符。(3)用BamHI和SacII酶切pMD-18T-LING0-l獲得LING0-1的LRR基因片段，用SacII和Notl酶切pMD-18T-TN-R載體獲得TN-R的EGFL基因片段，混合后用T4DNALigase連接入預(yù)先用BamHI和Notl酶切過的pCDNA3.1載體中，獲得pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R載體；用Notl禾PXhol酶切pMD-18T-neurocan載體獲得neurocan片段，用T4DNALigase連接入預(yù)先用Notl和Xhol酶切過的pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R載體中，獲得pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan載體，即本發(fā)明DNA疫苗，該疫苗中的抗原基因序列如SEQNO.7所示，編碼序列如SEQNO.8所示的融合蛋白。3、本發(fā)明DNA疫苗的鑒定(1)酶切及測(cè)序鑒定用BamHI和XhoI酶切pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，顯示所得酶切產(chǎn)物大小分別為5.4kb和2181bp，與設(shè)計(jì)相符，如圖2所示。2181bp的DNA片段由SEQNO.7所示的2151個(gè)堿基和在SEQNO.7兩端增加的酶切識(shí)別序列的30個(gè)堿基(即在SEQNO.7的5端添加了如下序列——GGATCCAAGGAGATACTTAAC，在3'端添加了TGACTCGAG)組成，與設(shè)計(jì)相符。[OO41](2)Hela細(xì)胞系瞬時(shí)表達(dá)用Lipofectamine2000將pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞系進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，免疫沉淀法獲得重組蛋白，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示所得重組蛋白大小約為80kD(如圖3所示)，與設(shè)計(jì)相符。4、本發(fā)明DNA疫苗的效果實(shí)驗(yàn)(1)體內(nèi)驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)以Lewis大鼠為研究對(duì)象(n=3)，于脛骨前肌注射100ug本發(fā)明DNA疫苗，對(duì)照組注射等量的空質(zhì)粒。注射疫苗48小時(shí)后取脛骨肌肉注射部位肌肉組織行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)體內(nèi)重組蛋白表達(dá)情況。試驗(yàn)方法如下(1)4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液(4°C)中過夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5minX3后；(2)加入配好的O.3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30X過氧化氫)30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5minX3;(3)加入配好的O.3%TritonX100(30%TritonXlOO+0.OIMKPBS100ml)30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.OIMKPBS清洗5minX3;(4)加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白1.00g+0.OIMPBS100ml+疊氮納0.08g)稀釋的一抗(LINGO-1多抗)，4。C存放24-48h;吸去抗體，O.OIMKPBS洗5minX3;(5)加入0.OIMKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.OIMKPBS洗5minX3;(6)加入ABC復(fù)合物的二抗，室溫孵育2h，0.OIMKPBS洗5minX3;蒸餾水迅速?zèng)_三次；(7)加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過30min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.OIMKPBS終止反應(yīng)；(8)梯度酒精脫水之后，封片，拍照。結(jié)果接種DNA疫苗的大鼠脛骨前肌可檢測(cè)出重組蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組(空載體組)的大鼠結(jié)果為陰性(如圖4所示)。證明重組質(zhì)粒可在體內(nèi)正確表達(dá)重組蛋白，為剌激機(jī)體的后續(xù)免疫反應(yīng)提供了必要條件。(2)抗體檢測(cè)LING01、TN-R和neurocan的蛋白的制備方法如下按本例DNA疫苗制備方法中步驟(1)所述的反轉(zhuǎn)錄PCR方法獲得獲得編碼LINGO-1的LRR結(jié)構(gòu)域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結(jié)構(gòu)域的基因片段和編碼neurocan的第1011-1271個(gè)氨基酸的基因片段，然后將所得的三個(gè)片段分別pET30a(+)表達(dá)載體連接，連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，用化學(xué)裂解法提取包涵體，獲得His-LINGO-l、His-TN-R和His-CSPGs的融合蛋白，以備檢測(cè)用。以Lewis大鼠為研究對(duì)象(n=7)，其中6只每周于脛骨前肌注射100ug本發(fā)明DNA疫苗。分別標(biāo)記為Rati6，另一只正常飼養(yǎng)，作為陰性對(duì)照，記為Rat7。第6周抽血，取血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)各Lewis大鼠的抗體水平。ELISA檢測(cè)其抗體水平的方法如下1)包被抗原將純化的His-LINGO-l蛋白(或者His-TNR、His-neurocan)用碳酸_碳酸鈉緩沖液稀釋至1Pg/ml，每孔加入10037°C環(huán)境孵育2小時(shí)。2)洗板倒掉包被液，用PBST液洗孔3次，拍干。3)封閉酶標(biāo)板每孔加入5X脫脂奶/PBS200iil，37t:封閉1小時(shí)。也可4。C封閉過夜。4)洗板倒掉封閉液，用PBST洗液洗孔3次，拍干。5)每孔加100ii1抗體稀釋液，加入待測(cè)樣品(對(duì)照血清及抗血清)，做倍比稀釋為i:50、i:ioo、i:200及i:400，37t:環(huán)境孵育i小時(shí)。6)洗板在洗板機(jī)上，用PBST洗液洗孔6次。7)加入酶結(jié)合物拍干洗液，每孔加入稀釋的HRP標(biāo)記的羊二抗100iU，37t:環(huán)境孵育1小時(shí)。8)洗板在洗板機(jī)上，用PBST洗液洗孔6次。9)加顯色液拍干洗液，每孔加入100iU顯色液，置37t:避光顯色15-30分鐘。10)終止反應(yīng)當(dāng)陽性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色變化后而陰性孔沒有顏色反應(yīng)時(shí)，每孔加入終止液50iU，20分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。11)酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果讀0D490nm。12)結(jié)果判斷以陰性孔OD值為標(biāo)準(zhǔn)，若抗血清樣品的OD值比陰性孔相應(yīng)稀釋度OD值的比值大于2.1時(shí)，即定為陽性反應(yīng)。結(jié)果如表1所示，第6周時(shí)，接種DNA疫苗的大鼠體內(nèi)均可檢測(cè)出針對(duì)不同靶滴度不一的相應(yīng)抗體。表1Elisa法檢測(cè)大鼠血清抗體滴度的結(jié)果LINGO-1TN-RNeurocan<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫后動(dòng)物血清生物學(xué)效用以出生后7-9天大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元為軸突再生評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。采用100iig/ml多聚賴氨酸(PLL)包被24孔板，清洗后備用。PBS或者100ngMAG-Fc涂布于孔板中。分離出的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在添加或者未添加抗血清的培養(yǎng)基重懸后，以105細(xì)胞/ml的密度接種于已包被PLL或者PLL+MAG-Fc的24孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，4%多聚甲醛固定，使用Neulucida系統(tǒng)測(cè)量不同干預(yù)條件下100個(gè)神經(jīng)元的再生軸突的長(zhǎng)度。該體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)干預(yù)條件設(shè)立2復(fù)孔。上述實(shí)驗(yàn)中，所述抗血清是指經(jīng)本發(fā)明DNA疫苗免疫過的小鼠的血清。結(jié)果如圖5所示，與接種于多聚賴氨酸基質(zhì)(PLL)相比較，接種于MAG-Fc的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)被顯著抑制(12.64±1.28iimVS28.53±1.53ym，P<0.01)，而培養(yǎng)基中添加抗血清可部分削弱MAG-Fc對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的抑制作用(18.32±1.14iimVS28.53±1.53iim，P<0.05)。此結(jié)果證明，表明經(jīng)本發(fā)明DNA疫苗免疫過的小鼠的血清中含有抗體，能有效阻斷外源性抑制因素對(duì)軸突再生的影響。(4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DNA疫苗的生物效用a.大鼠背側(cè)脊髓半橫斷模型的制作動(dòng)物選擇體重約200250g的成年雌性Lewis大鼠，分為正常組、對(duì)照組(空載體接種6w)及實(shí)驗(yàn)組(DNA疫苗接種6w)，正常組不做任何處理，其余兩組均行脊髓半橫斷。操作過程如下4%水合氯醛(lml/100g)腹腔麻醉后，在大鼠背部捫及T8-10段脊椎，縱行切開背部皮膚，鈍性分離背部皮下組織，暴露骶棘肌后向兩側(cè)牽開，施行椎板切除術(shù)充分顯露TIOTll段脊髓。Tll處背側(cè)半橫切深度大于1.8mm，確保皮質(zhì)脊髓束的主要部分完全離斷。逐層縫合各層組織。術(shù)后8小時(shí)內(nèi)肌注甲基強(qiáng)的松龍40mg，青霉素(16萬單位/天)一周，脊髓半橫斷大鼠每天兩次按摩恥骨聯(lián)合區(qū)以幫助排尿。b.活化RhoA信號(hào)檢測(cè)采用南京凱基生物技術(shù)有限公司的組織蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白組織勻漿器、BufferA、BufferB及0.1MPBS冰上預(yù)冷。4%水合氯醛麻醉大鼠，切開背部皮膚，在體式顯微鏡下，常規(guī)分離并提取對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的SCI處頭尾各5mm的組織，預(yù)冷的PBS迅速?zèng)_洗，去除血凝塊。于電子天平稱量。將沖洗干凈的組織塊轉(zhuǎn)移至干凈的組織勻漿器中，按lml/100mg的比例加入BufferA于冰上充分勻槳。移至1.5ml離心管，4°C，500rpm離心5min。棄上清，沉淀置于冰上，每管加入用適量的BufferB重懸，冰上孵育2h后分裝至EP管，10000rpm離心，4t:離心30min。收集上清至干凈離心管，BCA法對(duì)蛋白定量后至-8(TC貯存。按照Cytoskeleto公司出品的RhoA活性分析試劑盒的說明書操作，實(shí)現(xiàn)活化RhoA(RhoA-GTP)的分離取各組含量為20yg蛋白溶液至1.5mlEP管，每管加入包被GST-RBD的瓊脂糖微球20yg，4。C條件下孵育45min。棄去上清液，WashBuffer洗滌瓊脂糖小球4次，每次10min。收集各管瓊脂糖小球置-8(TC貯存。取各組20yg組織總蛋白及上述等量總蛋白提取的活化RhoA，以5X上樣緩沖液與樣品混合，于IO(TC水浴中煮5min以變性蛋白質(zhì)，離心12000rpm離心2min，吸取上清逐孔加樣行PAGE凝膠電泳后，westernblot方法檢測(cè)RhoA。ECL顯影后，Image-ProPlus軟件分析獲得各蛋白條帶累計(jì)光密度值(IntegratedopticalDensity,IOD)，各組以RhoA總蛋白為校正標(biāo)準(zhǔn)，獲取活化RhoA蛋白光密度指數(shù)K(Densitometrylndex)為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)證明，在軸突生長(zhǎng)抑制因子的作用下，Rho明顯激活；脊髓損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在損傷區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞突起有大量的Rho激活。激活的RhoA引起一系列的反應(yīng)，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的潰變和(或)細(xì)胞凋亡。造模術(shù)后3d，以各組大鼠SCI處組織提取的蛋白為抗原，按常規(guī)方法電轉(zhuǎn)印后，與RhoA(分子量為24kD)單抗進(jìn)行Westernblot反應(yīng)。各組上樣的20g總蛋白中RhoA蛋白免疫印跡ECL結(jié)果如圖14A所示，在相對(duì)分子量約24kD處出現(xiàn)陽性條帶，各蛋白條帶大小均一，提示RhoA蛋白表達(dá)量無差異，與文獻(xiàn)結(jié)果相符；利用GST-RBD蛋白對(duì)活化的RhoA蛋白(GTP-RhoA)具有高度的親和力這一特性，將活化RhoA蛋白從各組等量組織蛋白中分離出，再行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示各組在相對(duì)分子量約24kD處出現(xiàn)陽性條帶，但條帶顯色強(qiáng)度不均一，對(duì)照組尤為濃染，實(shí)驗(yàn)組次之，正常組最淡。各組以RhoA總蛋白為校正標(biāo)準(zhǔn)，獲取活化RhoA蛋白光密度指數(shù)"DensitometryIndex)為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)ANOVA分析，結(jié)果顯示K值組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=686.711，P=0.000)，再經(jīng)LSD多重比較，結(jié)果顯示組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P二0.000)，如圖6所示。該結(jié)果表明DNA疫苗可有效抑制RhoA信號(hào)的激活，對(duì)損傷軸突的生長(zhǎng)發(fā)揮促進(jìn)作用。c.組織學(xué)分析神經(jīng)元凋亡情況術(shù)后3d，取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各3只大鼠，行心內(nèi)灌注固定，操作同第二部分。30%蔗糖脫水后，用包埋劑包埋組織塊，_20°。恒冷切片，片厚20ym連續(xù)橫斷面切片，室溫晾干后置于-S(TC冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ庖邿晒怆p標(biāo)法染色步驟如下切片標(biāo)本以PBS洗3次，每次3min;0.3%11202在37。C下作用10min;蒸餾水洗3min，TBS5min;用含5%羊血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100的TBS在37。C封閉30min;按1:300稀釋度配制小鼠抗Caspase3和兔抗NeuN—抗混合液(1:1)，4t:過夜；TBS洗3次，每次5min;加入用封閉液稀釋的AlexaFluor555標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)抗體和AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體的二抗混合液，稀釋度為1:200，室溫暗盒中作用24h，TBS洗3次，每次5min;50%甘油封片，立即置熒光顯微鏡下觀察、掃描，激發(fā)光波長(zhǎng)分別為488nm、555nm，保存掃描照片。利用Photoshop將各組同視野下照片進(jìn)行merge處理；計(jì)數(shù)每切片上免疫熒光雙標(biāo)的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)6個(gè)切片。結(jié)果NeuN是神經(jīng)元的特征性蛋白，Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡途徑上關(guān)鍵分子，因此運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)法可以檢測(cè)出脊髓損傷后凋亡神經(jīng)元。因正常組脊髓組織中無神經(jīng)元凋亡，在此僅盲法計(jì)數(shù)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每個(gè)樣本6張切片的凋亡神經(jīng)元數(shù)目，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖7。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.395，P=0.022)，證明實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組。d.BDA示蹤軸突傳導(dǎo)束背側(cè)半橫斷術(shù)后2周，模型動(dòng)物4%水合氯醛麻醉(lml/100g)，頭部皮膚縱行切開，切口周緣利多卡因浸潤(rùn)麻醉。顱骨切除術(shù)暴露左側(cè)感覺_運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)，10%BDA71通過立體定向方法注射入運(yùn)動(dòng)區(qū)中預(yù)定的12個(gè)點(diǎn)——前囟點(diǎn)后0-3mm，正中線外側(cè)0-3mm，皮質(zhì)下lmm。第一個(gè)注射點(diǎn)為前囟水平正中線旁開lmm，隨后注射點(diǎn)定位依次向外側(cè)及后面各移動(dòng)lmm，形成一12點(diǎn)的網(wǎng)格(3X4行)。注射使用與微量輸入泵(WorldPrecisionInstruments)相連接的纟內(nèi)升注射器(WorldPrecisionInstruments)完成。BDA以5nl/s，650nl/site的速率輸入。微量加樣器滯留于注射點(diǎn)2min后再行下一點(diǎn)操作。全部注射完成后，骨窗使用凝膠海綿覆蓋并嚴(yán)密縫合切口。某些動(dòng)物模型，雙側(cè)均行BDA示蹤。常規(guī)多聚甲醛組織固定，30%蔗糖脫水后，脊髓組織行50i！M連續(xù)冰凍切片。檢測(cè)方法如下1、速凍組織將組織塊平放于軟塑料蓋或特制小盒內(nèi)(直徑2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮內(nèi)，大約10-20秒組織即迅速冰凍成塊。取出組織冰塊立即置入-8(TC冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，或置于恒冷切片機(jī)冰凍切片；2、切片后，室溫放置30分鐘后風(fēng)干；3、PBS洗，5分鐘X3;4、用3%過氧化氫孵育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。5、PBS洗，5分鐘X3;6、5%TritonX-100的PBS在37t:孵育30min;7、PBS沖洗，2分鐘X3次；8、按0.5yg/ml終濃度配制Avidin-HRP工作液，室溫下孵育3h;9、PBS沖洗，2分鐘X3次；10、按0.05%濃度配制DAB工作液，使用前加入終濃度0.003%H202，室溫下反應(yīng)10min。顯微鏡下密切觀察，出現(xiàn)清晰的特異性染色后立刻中止反應(yīng)。11、脫水后樹膠封片，置顯微鏡下觀察、采集圖像。結(jié)果選用脊髓背側(cè)半橫斷模型評(píng)價(jià)LING0-1抗血清是否能促進(jìn)損傷軸突的再生。造模后14d，利用BDA順行示蹤劑追蹤對(duì)照組(n=15)和實(shí)驗(yàn)組(n=16)大鼠CST的再生軸突。BDA注射后14d，收集各樣本按前述方法行橫切及縱切，BDA免疫組化染色。鏡下對(duì)各樣本連續(xù)切片進(jìn)行判讀，評(píng)價(jià)跨過SCI處再生軸突的最大長(zhǎng)度。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組頭端距SCIll16mm處組織的橫切面結(jié)果顯示，兩組CST軸突纖維均特異性著色。而尾端距SCI1116mm處組織的橫切面結(jié)果顯示，對(duì)照組CST軸突纖維未見著色，實(shí)驗(yàn)組有25%(4/16)可見CST軸突纖維著色。各組縱切切片中，對(duì)照組標(biāo)記的CST軸突纖維均在脊髓背側(cè)損傷處上游或者損傷處中止，損傷尾側(cè)未見陽性標(biāo)記的CST軸突纖維；相反，實(shí)驗(yàn)組75%的大鼠損傷尾側(cè)可見陽性標(biāo)記的CST軸突再生纖維，采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)比較，兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P=0.000)，實(shí)驗(yàn)組再生軸突跨過SCI處最大長(zhǎng)度為6.9±1.2mm，Md為7.9mm，詳細(xì)結(jié)果如圖8所示。e.功能恢復(fù)評(píng)定使用開放框架BBB評(píng)分系統(tǒng)對(duì)各組行功能恢復(fù)評(píng)定。大鼠模型制作后第二天第一次評(píng)定，每周定時(shí)盲法評(píng)價(jià)一次，共持續(xù)4周。結(jié)果脊髓背側(cè)半橫斷損傷后，大鼠的背側(cè)及背外側(cè)CST軸突被離斷，僅脊髓腹側(cè)少量CST軸突纖維殘留。術(shù)后，各組大鼠雙側(cè)下肢完全癱瘓，肌張力低。后肢運(yùn)動(dòng)功能采用BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)估。脊髓損傷后，對(duì)照組大鼠鞘內(nèi)持續(xù)4w給予對(duì)照血清后，BBB評(píng)分為12.2士1.5，實(shí)驗(yàn)組大鼠鞘內(nèi)持續(xù)4w給予對(duì)照血清后，BBB評(píng)分為14.4±1.4。BBB評(píng)分大于14分時(shí)，動(dòng)物前后肢體間的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)頻繁存在，是后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)良好一個(gè)的重要征象(見圖9)。3W時(shí)，BBB評(píng)分高于14分的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的比率高于對(duì)照組(37.5%VS13.3%)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P=1.000);4w時(shí)，BBB評(píng)分高于14分的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的比率高于對(duì)照組(75.0%VS20.0%)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P=0.003)，如圖10所示。以上結(jié)果表明，LING0-1抗血清鞘內(nèi)給藥后能促進(jìn)SCT后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。(5)DNA疫苗的安全性軸突髓鞘形態(tài)學(xué)觀察疫苗注射12周后，采用透射電鏡對(duì)各組大鼠脊髓采樣白質(zhì)進(jìn)行盲法觀察，比較各組間大鼠軸突髓鞘形態(tài)學(xué)上是否存在異常。實(shí)驗(yàn)步驟如下大鼠灌注(4%多聚甲醛+2.5%戊二醛+15%飽和苦味酸)30分鐘后取材。2.5%戊二醛后固定2小時(shí)。震動(dòng)切片。0.1MPB洗5-6次。1%鋨酸固定1H0URS。0.1MPB洗5-6次。乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷+包埋劑(1:1)浸透1小時(shí)30分鐘。包埋劑室溫過夜。聚合后，光鏡下取材，粘貼在組織塊上。超薄切片，鉛鈾染色后上機(jī)采集圖像。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組(DNA疫苗接種組)大鼠脊髓超微結(jié)構(gòu)并無類似實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎的改變，初步認(rèn)定其無誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的重大副作用。序列表〈110〉南方醫(yī)科大學(xué)〈120〉一種促進(jìn)中樞系統(tǒng)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的DNA疫苗〈160>8〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>45〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1cgggatcc朋ggagatectt朋catgctggaccteggc朋g朋cc〈210>2〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tccccgcggccaccagctggatctcctgc〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tccccgcggcatgtccatgtgccagttea<210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ttgcggccgctggaggggcaactgctga28〈210>5〈211〉31〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ttgcggccgcaccctgtgagaacaacccttg31〈210>6<211>32〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gcctcgagtcagcagacaatttggggcctgtc32〈210>7〈211>2151〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222>(1)..(2151)〈400>7atgctggacetaggcaagaaccgcateaaaacgetcaaccaggacgag48MetLeuAspLeuGlyLysAsnArglieLysThrLeuAsnGinAspGlu151015ttcgccagettcccgC3Cctggaggagctggagetc朋cgag朋cate96PheAlaSerPheProHisLeuGluGluLeuGluLeuAsnGluAsnlie202530gtgagegccgtggagcccggcgccttcetcttcaacetcegg144ValSerAlaValGluProGlyAlaPheAsnAsnLeuPheAsnLeuArg354045acgctgggtetccgcage朋ccgcctgaagetcateccgcteggcgtc192ThrLeuGlyLeuArgSerAsnArgLeuLysLeulieProLeuGlyVal505560ttcactggcetcage朋cctg3CC朋gctggacateagegag朋c朋g240Phe／hrGlyLeuSetAShLeu／hrLysLeuAspIleSetGluAShLysatCgttatCCtactggactaCatgtttcaggacctgtaCaaCCtCaag288IleValIleLeuLeuAsp／yrMetPheGlnAspLeu／yrAShLeuLys859095tCactggaggttggcgacaatgacCtCgtctaCatCtCtCaCcgcgcc336SetLeuGluValGlyAspAShAspLeuVal／yrIleSetHiSArgAla100105110ttCagcggcCtCaaCagcctggagcagctgacgctggagaaatgcaaC384PheSetGlyLeuAShSetLeuGluGlnLeu／hrLeuGluLysCysASh115120125Leu／hrSetIlePro／hrGluAlaLeuSetHiSLeuHiSGlyLeuIle130135140gtcctgaggCtCcggCaCCtCaaCatCaatgccatCcgggactaCtCC480ValLeuArgLeuArgHiSLeuAShIleAShAlaIleArgAsp／yrSet145150155160ttCaagaggctgtaCcgaCtCaaggtcttggagatCtCCCaCtggCCC528PheLysArgLeu／yrArgLeuLysValLeuGluIleSetHiS／rioPro165170175taCttggacaCCatgaCaCCCaaCtgcCtCtaCggcCtCaaCctgacg576180185190tCCctgtCCatCaCaCaCtgcaatctgaCCgctgtgCCCtaCctggcc624SetLeuSetIle／hrHiSCysAShLeu／hrAlaValPro／yrLeuAla195200205gtccgcCaCCtagtctatCtCcgcttCCtCaaCCtCtCCtaCaaCCCC672ValArgHiSLeuVal／yrLeuArgPheLeuAShLeuSet／yrAShPro2lo215220atCagcaCCattgagggctCCatgttgCatgagctgCtCcggctgcag720IleSet／hrIleGluGlySetMetLeuHiSGluLeuLeuArgLeuGlngagatCcagctggtggccgcggcatgtCCatgtgccagttCagcccag768GluIleGlnLeuValAlaAlaAlaCysProCysAlaSetSetAlaGln245250255gtgctgcaggagctgctgagccggatCgagatgctggagagggaggtg816ValLeuGlnGluLeuLeuSetArgIleGluMetLeuGluArgGluVal260265270tcggtgctgcgagaccagtgcaaCgccaaCtgctgcCaagaaagtgct864SerValLeuArgAspGinCysAsnAlaAsnCysCysGinGluSerAla275280285gccc朋ctgg￡lCtatatecctcactgcagtggccacggcaac912AlaThrGlyGinLeuAspTyrlieProHisCysSerGlyHisGlyAsn290295300tttagetttgagtectgtggctgcatetgcaacgaaggctggtttggc960PheSerPheGluSerCysGlyCyslieCysAsnGluGlyTrpPheGly305310315320朋g朋ttgctcggagccctactgcccgctgggttgctecageeggggg1008LysAsnCysSerGluProTyrCysProLeuGlyCysSerSerArgGly325330335gtgtgtgtggatggcCElgtgcatetgtgacagegaatecageggggat1056ValCysValAspGlyGinCyslieCysAspSerGluTyrSerGlyAsp340345350g￡lCtgttecg朋etceggtgcCC3acagactgcagetecegggggetc1104AspCysSerGluLeuArgCysProThrAspCysSerSerArgGlyLeu355360365tgcgtgg￡lCggggagtgtgtctgtgaagagccctecactggcgaggac1152CysValAspGlyGluCysValCysGluGluProTyrThrGlyGluAsp370375380tgc￡lggg朋ctg￡iggtgccctggggactgttcggggaagggg卿tgt1200CysArgGluLeuArgCysProGlyAspCysSerGlyLysGlyArgCys385390395400gcc朋cggt3CCtgtttatgcgaggagggctecgttggtgaggactgc1248AlaAsnGlyThrCysLeuCysGluGluGlyTyrValGlyGluAspCys405410415ggcCElgeggCElgtgtctg朋tgcctgCElgtgggCg￡lgg￡lC￡l￡ltgtg￡lg1296GlyGinArgGinCysLeuAsnAlaCysSerGlyArgGlyGinCysGlu420425430gaggggetctgcgtctgtg朋gagggctaccagggccctgactgctea1344GluGlyLeuCysValCysGluGluGlyTyrGinGlyProAspCysSer435440445gCElgttgcccctCC3gcggccgCElccctgtgagaacaacccttgtctt1392AlaValAlaProProAlaAlaAlaProCysGluAsnAsnProCysLeu450455460catgggtgt朋tgcc朋tggcaccatgtatggctgtagetgt1440HisGlyGlyThrCysAsnAlaAsnGlyThrMetTyrGlyCysSerCys465470475■gatCElgggcttcgccggggag朋ctgtgagattgacattgatgactgc14881AspGinGlyPheAlaGlyGluAsnCysGlulieAsplieAspAspCys485490495etctgcageccctgtgag朋tggcacctgtattgatgaggtcaat1536LeuCysSerProCysGluAsnGlyGlyThrCyslieAspGluValAsn500505510ggctttgtctgcctttgcetccccagetatgggggcagettttgtgag1584GlyPheValCysLeuCysLeuProSerTyrGlyGlySerPheCysGlu515520525g￡lC3CCgagggctgtg￡lCcgcggctggcataagttccagggccac1632LysAspThrGluGlyCysAspArgGlyTrpHisLysPheGinGlyHis530535540tgttaccgctattttgccC3Cegg3gggCEltggg朋gatgccgag朋g1680CysTyrArgTyrPheAlaHisArgArgAlaTrpGluAspAlaGluLys545550555560g￡lCtgccgccgccgctecggcC3Cctgaccagegtccacteaccggag1728AspCysArgArgArgSerGlyHisLeuThrSerValHisSerProGlu565570575g朋C3Cagettcatt朋tagetttgggcatgaaaacacgtggateggc1776GluHisSerPhelieAsnSerPheGlyHisGluAsnThrTrplieGly580585590ctg朋cg￡lC￡lggategtgga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