專利名稱：抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA及其抗宮頸癌用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，特別是涉及一種抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA及其 在抗宮頸癌藥物制備中的應用。
背景技術：
隨著經濟發(fā)展，人民生活水平的提高，在整個全球宮頸癌病人的死亡率逐年升高。 宮頸癌作為一個普遍性的惡性腫瘤，其高度致死性廣泛發(fā)生于全世界婦女中。因此，對宮頸 癌進行基因治療的研究具有非常重要的應用價值。宮頸癌是一個受多基因網絡調控的疾 病。AP-2作為一個重要的轉錄因子家族，研究表明AP-2在宮頸癌中起著重要的調控作用。 其中AP-2alpha在細胞生長和腫瘤發(fā)生中起著重要作用(Cancer Res， 2004， 64 :631-638)。 AP-2alpha的功能一部分是通過與AP-2alpha下游基因啟動子區(qū)域結合，促進其表達來實 現。癌基因ErbB2在宮頸癌中廣泛過表達，一直以來是研究治療的靶點。ErbB2在腫瘤細胞 中功能丟失將導致細胞生長抑制，并引起凋亡(Cancer Research, 1997， 57 :3804-3811)。最 新研究報道ErbB2基因的表達下調促進了宮頸癌細胞的凋亡，從而達到治療宮頸癌的目的 (Med 0nco1，2009)。有研究表明AP-2alpha與癌基因ErbB2基因啟動子結合，促進ErbB2基 因的轉錄和蛋白表達，從而顯示了 AP-2alpha在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的調控作用(Oncogene, 1996,13:1701-1707)。近20年來，RNAi (RNA interference)在腫瘤機制研究中顯示了強 大的功能，作為新型腫瘤治療策略也顯示了光明的前景。RNAi是高度特異的在mRNA水平上 的基因沉默機制，由內源性或外源性dsRNA(double-stranded RNA)誘發(fā)，在細胞內被切割 成21-25nt干擾性小RNA(small interfering RNA) ， siRNA介導識別并耙向切割同源性耙 mRNA分子，從而導致該基因不表達。siRNA由于強有力的特異性RNA干擾作用，現已成為一 種理想的細胞水平基因敲除手段。siRNA的出現在哺乳動物細胞中產生特異的基因表達抑 制，使得siRNA為人類疾病的治療開創(chuàng)了新的天地。 因此如何獲得一種抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA及其載體并將它們應用于 抗宮頸癌藥物制備中是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的一是提供一種抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA ;二是能產生上 述siRNA的表達載體；三是所述siRNA或siRNA的表達載體在抗宮頸癌藥物制備中的用途。
本發(fā)明提供的抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA，其堿基序列及其作用部位如 下 正義鏈5， CGAAGU CUU CUG UUC AGU U 3'
反義鏈5' AAC UGAACA GAA GAC UUC G 3'
作用于人AP-2alpha mRNA的第622-642位 所述的siRNA，可以通過人工合成，該siRNA在3'有2_6個dT修飾或2_6個U修飾。
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所述的siRNA的表達載體。 所述的siRNA在抗宮頸癌藥物制備中的應用。 所述siRNA的表達載體在抗宮頸癌藥物制備中的應用。 本發(fā)明以siRNA為耙向序列，以RNA干擾技術為基礎，從GenBank獲得人 AP-2alpha基因的cDNA序列，根據siRNA耙序列選擇的基本原則，針對AP-2alpha基因設計 了 21個核苷酸，在siRNA的3 '端添加兩個脫氧核糖核苷酸(dTdT)呈單鏈懸掛結構，以增 強此siRNA在體內和體外的穩(wěn)定性，防止降解。本發(fā)明中所使用的siRNA由本發(fā)明人自己 設計，委托上海吉瑪公司通過化學法合成。通過發(fā)明人的實驗證明該siRNA極大地降低了 轉錄因子AP-2alpha在宮頸癌細胞HeLa中對癌基因ErbB2的轉錄水平和蛋白水平的激活， 同時MTT分析表明AP-2alpha過表達促進了 HeLa宮頸癌細胞的生長，而AP_2alpha siRNA 則抑制了宮頸癌細胞的增殖。軟瓊脂克隆形成實驗結果也一致地顯示AP-2alphasiRNA加 入后宮頸癌細胞形成克隆的數目急劇下降。因此，本發(fā)明提供的AP-2alpha siRNA可以特 異性抑制AP-2alpha基因的表達，從而達到抑制宮頸癌的發(fā)生和生長的目的。該siRNA可 用于制備特異性強的抗宮頸癌藥物。


圖1是RT-PCR檢測AP-2alpha siRNA對AP-2alphal基因的mRNA水平的抑制。
圖2是Western Blotting檢測AP-2alpha siRNA對AP-2alpha蛋白水平的抑制。
圖3是Luciferase禾口 Western Blotting分析AP-2alpha siRNA對AP-2alpha下 游癌基因ErbB2的轉錄水平和蛋白水平的影響。 圖4是MTT分析AP-2alpha siRNA對宮頸癌細胞增殖的影響。 圖5是軟瓊脂克隆形成實驗分析AP-2alpha siRNA對宮頸癌細胞生長的影響。
具體實施例方式
實施例1 :siRNA靶序列的選擇 本發(fā)明所提供的AP-2alpha siRNA是根據發(fā)明人在GenBank中查到的人 AP-2alpha序列而得到，這些RNA序列基本符合以下原則從轉錄本(mRNA)的AUG起始密 碼開始，尋找"AA"二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。 在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合 區(qū)域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合 mRNA從而影響siRNA的效果。 一般21個核苷酸中的GC含量在30% _70%的范圍內，當GC 含量較低的片段中更容易找到有效片段。而且要避免siRNA靶序列形成二級結構和相同堿 基的連續(xù)重復，這些結構會影響siRNA的退火配對和耙點特異性。此外，將所選序列和相應 的基因組數據庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源 的序列。例如使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。最后還需參考Sfold推薦的 RNA空間構像。我們一般在正義鏈的3'末端加兩個dTdT的尾，指導siRNA形成RNAi沉默 復合物，也避免受核酸酶的降解。 發(fā)明人根據以上原則，設計合成了一對序列，其具體序列如下
正義鏈5， CGAAGU CUU CUG UUC AGU UdTdT 3'
反義鏈5' AAC UGAACA GAA GAC UUC GdTdT 3'
作用于人AP-2alpha mRNA的第622-642位 序列設計好后送上海吉瑪公司合成，本發(fā)明使用的siRNA雙鏈的純度大于99X，
用DEPC處理過的雙蒸水溶解，就可直接用于細胞轉染。 實施例2 :RT-PCR檢測AP-2alpha siRNA的基因沉默效果 HEK293FT細胞是本實驗室保存，用6孔板在37°C、5% 0)2、90%相對濕度培養(yǎng)箱 中用DMEM完全培養(yǎng)液(加10%新生牛血清、2慮L-谷氨酸、青霉素和鏈霉素)進行培養(yǎng)， 待細胞密度至70%。用脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑盒將AP-2alpha siRNA轉入 HEK293FT細胞中。脂質體法轉染方法是在轉染前將細胞換成1. 5mL無血清無抗生素的培養(yǎng) 液。每孔siRNA用量為100pM，用無血清無抗生素的培養(yǎng)液分別稀釋到250 y L，輕輕混勻， 室溫靜置5min。同時將脂質體稀釋到250 y L無血清無抗生素的培養(yǎng)液中含5 y L脂質體， 輕輕混勻，室溫靜置5min。將稀釋的脂質體加入等體積siRNA混勻，室溫靜置20min。將 500 ii L siRNA/脂質體復合物輕輕混勻，滴加入細胞中，輕輕混勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。讓DNA/ 脂質體復合物與細胞接觸6h后，換成有血清和抗生素的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)36h，收集細胞。
將細胞直接在培養(yǎng)板中加入500 ii L TRIzol裂解細胞，用移液器吸打幾次。在室溫 放置10min，使核酸蛋白復合物完全分離。然后加入100 ii L氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放 置3min。 4°C 10000 X g離心15min。樣品分為三層底層為黃色有機相，上層為無色水相和 一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60X。把水相轉移到新 管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。加入250iiL異丙醇，室溫放置10min。 4" 10000Xg離 心10min，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。用75% 乙醇洗滌RNA沉淀。每使用lmL TRIzol至少加lmL 75%乙醇。4"不超過7500Xg離心 5min，棄上清。室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10min即可。不要真空離心干 燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200 y L無RNase的水，用槍頭吸打幾 次，55-6(TC放置10min使RNA溶解。跑膠檢測mRNA的質量及用紫外分光光度計測定濃度。
以總RNA為模板，用AMV反轉錄酶和隨機引物進行反轉錄，合成cDNA的第一鏈。反 轉錄體系為20 ii L，其中含有1 y g總RNA，反轉錄緩沖液，5mMMgCl2， lmM dNTP， 200pM的3'端 隨機引物，AMV反轉錄酶(Promega) ，RNA酶抑制劑。反轉錄程序42°C 5min， 37"C溫育50min 反轉錄，75t: 5min滅活反轉錄酶。所得cDNA于_201:儲存?zhèn)溆没蛄⒓催M行PCR反應。其 反應總體積均為20 ii L的條件下，其中反應體系中均含有2 ii L反應緩沖液，1U exT叫DNA 聚合酶，1 y L模板cDNA，AP-2alpha和-actin引物各加1 y L。反應程序首先94。C預變性 3min，后進行30個循環(huán)94。C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸lmin ;最后72。C延伸 5min，4t:終止。反應完成后將產物進行瓊脂糖電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析 結果。結果顯示AP-2alphasiRNAl能有效地降低AP-2alpha基因的mRNA水平，而陰性對照 的siRNA對AP-2alpha基因的mRNA水平沒有影響(圖1)。 實施例3 :Western Blotting檢測AP-2alpha siRNA對AP-2alpha蛋白水平的影 響。 pCMV-Myc-AP-2alpha質粒由實驗室構建并測序證明其序列的正確性。HEK293FT 細胞的培養(yǎng)和轉染同前面所述，每孔加入2iig DNA和50pM siRNA。轉染完成后吸去培養(yǎng) 液，PBS漂洗細胞，吸凈PBS，再加入100 ii L的1 X裂解緩沖液(50mM Tris—HCl (pH 7. 2)，
5150mM NaCl，l% (v/v) Triton X_100，l% (w/v) sodium deoxycholate， 0. 1% (w/v) SDS)搖 勻。-80°〇冰箱內放置15!11111，371:培養(yǎng)箱內溫育5111111，重復凍溶一次，使細胞充分裂解。用 細胞刮將細胞從小孔上刮下，將細胞裂解液及細胞用移液槍轉入1. 5mL的離心管，置于冰 上。旋渦震蕩10-15sec，12000Xg于4。C離心2min。取上清液轉移至干凈的離心管中。將 蛋白樣品首先用15X的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。通過電轉移的方法(恒壓 100v，4t:電轉移1. 5h)將蛋白質轉印至PVDF膜，然后將膜表面的蛋白質再用抗原抗體反應 進行特異性檢測。將轉印好的尼龍膜用含10X脫脂奶粉的TBS緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 7. 4) ，0. 9% NaCl)作為封閉劑封閉60min。膜浸沒加入按1 : 1000用封閉劑稀釋的小鼠單 克隆抗體Myc，于搖床中搖lh讓稀釋的抗體與PVDF膜充分結合。用TBS緩沖液洗膜4次， 每次10min。將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(稀釋2000倍)作為第二抗體加入封閉 劑，使膜浸沒其中于搖床中繼續(xù)搖lh。用TBS緩沖液洗膜4次。最后用DAB溶液顯色。結 果顯示AP-2alpha siRNA能抑制AP-2alpha蛋白在細胞中的表達，而陰性對照的siRNA對 AP-2alpha蛋白水平沒有影響，提示AP-2alphal siRNAl特異性抑制AP-2alpha的表達； GAPDH作為上樣對照，以保證各組的總蛋白的上樣量是一致的(圖2)。
實施例4 :Luciferase禾口 Western Blotting分析AP-2alpha siRNA對AP-2alpha 下游癌基因ErbB2的轉錄水平和蛋白水平的影響。 HeLa細胞為本實驗室保存。用含5 y g/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24孔板的細 胞被培養(yǎng)和轉染，收獲后加入100ii L的IX裂解緩沖液(Promega試劑盒提供)搖勻。-8(TC 冰箱內放置15min，37t:培養(yǎng)箱內溫育5min，重復凍溶一次，使細胞充分裂解。用移液槍移 取20 ii L細胞提取液進行13 -半乳糖苷酶檢測分析，加入180 ii L分析緩沖液，在37t:溫育 10min ，有適量黃色物質出現。因為轉染同時加入了 LacZ的表達載體，而LacZ是一個通常在 細胞轉染實驗中使用的報告基因，它編碼P-半乳糖苷酶蛋白，該蛋白的表達水平是非常 穩(wěn)定和容易檢測，可通過與敏感的底物ONPG快速反應成黃色產物，記錄時間，用100 iiL 1M 碳酸鈉終止反應。用紫外分光光度計在420nm處測OD值，根據OD值進行定量，確定細胞提 取液的濃度。使用螢光素酶檢測試劑盒(Promega)，每管樣品取20 y L加入100 y L螢光素 酶底物于TD-20/20L咖inometer (Turner Designs)下測量熒光強度，記錄實驗數據。結果 發(fā)現，結果發(fā)現，轉錄因子AP-2激活了下游基因ErbB2的轉錄活性，但加入AP_2 siRNAl后 其激活作用基本上解除，而陰性對照的siRNA對AP-2的啟動子活性沒有影響；而Western Blotting結果也一致地顯示了 ErbB2蛋白水平的變化(圖3)。
實施例5 :MTT分析AP-2alpha siRNA對宮頸癌細胞生長的影響。
HeLa細胞同樣接種于24孔板中，進行細胞轉染，之后置37°C，5% C02條件下培 養(yǎng)24 72h，于結束前4h加入MTT10 y L/孔(濃度為5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液， 加入二甲基亞砜(匿S0)100iiL/孔，于振蕩器上振蕩10min左右，置酶標儀上進行吸光值 檢測，波長為570nm。如圖4所示，當AP-2alpha過表達促進了宮頸癌細胞的增長；而加入 AP-2alpha siRNAl宮頸癌細胞基本上沒有增殖，提示AP-2alpha siRNA可抑制宮頸癌細胞 的生長。 實施例6 :軟瓊脂克隆形成實驗分析AP-2alpha siRNA對宮頸癌細胞生長的影響。
取對數生長期HeLa細胞，用0. 25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞， 作活細胞計數，用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)液調整細胞密度至實驗要求。用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在4(TC中不會凝固。 按l : 1比例使1.2X的瓊脂糖和2X1640培養(yǎng)基(含有2X抗生素和20%的小牛血清) 混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中，冷卻凝固，可作底層瓊脂置(A溫箱中備用。 按l : 1比例讓0.7X的瓊脂糖和2X1640培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入 0. 2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1. 2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層 瓊脂凝固后，置入37°C 5% C02溫箱中培養(yǎng)10 14天。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察 細胞克隆數，計算形成率。如圖5所示，AP-2alpha過表達有效地促進了宮頸癌細胞系細胞 克隆的形成，而將AP-2alpha干擾后細胞克隆數目急劇下降。
實施例7 :AP-2alpha siRNA在制備抗宮頸癌藥物中的應用。 所有的實驗均表明，發(fā)明人設計的AP-2alpha siRNA能有效地抑制AP-2alpha的 mRNA和蛋白質水平的表達，進一步的實驗證明該siRNA可以抑制宮頸癌細胞的生長。說明 該小雙鏈RNA可用于制備與轉錄因子AP-2alpha表達相關的宮頸癌治療藥物。用于人類體 內給藥，可單獨使用或與其它藥物聯(lián)合使用。 而該siRNA也特異性地降低了轉錄因子AP-2對下游基因ErbB2啟動子的轉錄 激活，同時MTT分析表明AP-2alpha過表達促進了 HeLa宮頸癌細胞的生長，而AP-2alpha siRNA則抑制了宮頸癌細胞的增殖。軟瓊脂克隆形成實驗結果也一致地顯示AP-2alpha siRNA加入后宮頸癌細胞形成克隆的數目急劇下降。SEQUENCE LISTING〈110〉湖南師范大學〈120〉抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA及其抗宮頸癌用途〈130〉生物領域〈160>2〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>19〈212>RNA〈213>Homo sapiens〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA〈400>1cg朋guc皿c ug皿cag皿19〈210>2〈211>19〈212>RNA〈213>Homo sapiens〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA〈400>2朋cug朋c3g朋gac皿cg 19
權利要求
一種抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA，其堿基序列及其作用部位如下正義鏈5’CGA AGU CUU CUG UUC AGU U 3’；反義鏈5’AAC UGA ACA GAA GAC UUC G 3’；作用于人AP-2alpha mRNA的第622-642位。
2. 根據權利要求1中所述的siRNA，可以通過人工合成，其特征在于該siRNA在3'有 2-6個dT修飾或2-6個U修飾。
3. —種如權利要求1或2所述的siRNA的表達載體。
4. 一種如權利要求1或2中所述的siRNA在抗宮頸癌藥物制備中的應用。
5. —種如權利要求3所述siRNA的表達載體在抗宮頸癌藥物制備中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制人AP-2alpha基因表達的siRNA及其在治療宮頸癌中的用途。本發(fā)明利用生物數據庫獲得人AP-2alpha基因序列，設計一組能誘發(fā)人AP-2alpha的RNA干擾的siRNA，通過化學法合成一定量的siRNA，從而特異性降低人AP-2alpha基因的mRNA水平和蛋白表達水平，同時該siRNA極大地降低了轉錄因子AP-2alpha在宮頸癌細胞HeLa中對癌基因ErbB2的轉錄水平和蛋白水平的激活，從而抑制了腫瘤細胞的增殖。因此，AP-2alpha siRNA有望發(fā)展為一種治療宮頸癌的新型高效藥物。
文檔編號A61K48/00GK101705227SQ200910227188
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2009年12月11日
發(fā)明者丁小鳳, 向雙林, 周建林, 周暢, 張健, 胡翔, 韓梅 申請人:湖南師范大學