專利名稱：文蛤鐵蛋白基因及編碼蛋白和其體外重組表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文蛤鐵蛋白基因克隆及體外重組表達(dá)技術(shù)，具體地說是從幼蟲cDNA 文庫中篩選獲得鐵蛋白基因的EST序列，設(shè)計(jì)引物，采用RACE技術(shù)克隆出文蛤鐵蛋白基因 的cDNA全序列，并對該序列進(jìn)行了原核重組表達(dá)，還涉及到該基因及其表達(dá)產(chǎn)物在文蛤苗 種繁育中幼蟲生長發(fā)育調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鐵蛋白是典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白(Tacchini et al.，1992)，鐵離子通過鐵吸收機(jī)制通 過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后就儲存在鐵蛋白中，當(dāng)機(jī)體需要鐵離子時(shí)再被釋放出來。鐵蛋白是由 M個(gè)結(jié)構(gòu)上等同的亞基組成的中空的球狀大分子，中空部分最多可容納4500個(gè)鐵原子。鐵 蛋白亞基分為2種類型，即H型亞基和L型亞基。H亞基和L亞基在結(jié)構(gòu)上是等同的，但是 在鐵的儲存與吸收方面這兩種亞基是功能互補(bǔ)的，H亞基上有一個(gè)鐵氧化酶位點(diǎn)，L亞基缺 乏這一位點(diǎn)，但是有一個(gè)在內(nèi)表面的附加的谷氨酰胺位點(diǎn)，這就可以產(chǎn)生一個(gè)有利于三價(jià) 鐵離子在H亞基的氧化酶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)和礦化的微環(huán)境。鐵蛋白在生物體內(nèi)有兩種主要作用， 其一為儲存鐵離子，為生物體提供必須的鐵離子；另外則是解毒作用，清除二價(jià)鐵帶給機(jī) 體的毒性作用。歸結(jié)起來，它涉及兩種生理功能(1)與機(jī)體的生長發(fā)育有關(guān)，Roskams等 (1994)發(fā)現(xiàn)鐵和鐵蛋白在大鼠出生后隨腦部發(fā)育表達(dá)上調(diào)，推測與腦部發(fā)育有很重要的 作用，^iang等報(bào)道鐵蛋白與牡蠣殼的形成有關(guān)。( 與動物的免疫相關(guān)，Beck等 (2002)認(rèn)為海膽鐵蛋白是一種應(yīng)激蛋白，在棘皮動物的免疫過程中起著重要作用，在對蝦 類的研究中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白基因在病原感染前后都有明顯的上調(diào)表達(dá)。文蛤是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類，肉味鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，在國內(nèi)外市場都受到廣泛歡 迎，因而文蛤養(yǎng)殖具有廣闊的發(fā)展前景。隨著我國人民生活水平的提高，貝類等海產(chǎn)品的消 費(fèi)需求日益增長。過去文蛤養(yǎng)殖所用苗種主要依賴自然采捕野生苗種，每年苗量的豐欠嚴(yán) 重影響著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前全國文蛤養(yǎng)殖面積約50萬畝，年需苗種100億粒，由于養(yǎng) 殖業(yè)戶對苗種的需求很大，對自然苗種的高強(qiáng)度采捕對文蛤資源造成了很大破壞。文蛤苗 種的穩(wěn)定高效生產(chǎn)，是制約文蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的瓶頸。在苗種繁育過程中，通過人工調(diào)控幼蟲的 發(fā)育和生長，對于提高育苗的成功率具有重要的價(jià)值。鐵蛋白對文蛤等幼蟲的發(fā)育調(diào)節(jié)和 免疫增強(qiáng)作用，為應(yīng)用于苗種生產(chǎn)提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種文蛤鐵蛋白基因及編碼蛋白和其體外重組表達(dá)產(chǎn)物的 應(yīng)用，從文蛤中克隆到鐵蛋白的cDNA序列，并對其實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)及重組產(chǎn)物的活性鑒定， 為進(jìn)一步研究文蛤幼蟲發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為文蛤苗種繁育生產(chǎn)中幼蟲發(fā)育調(diào)控和免疫 調(diào)節(jié)提供技術(shù)手段。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種文蛤鐵蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO. 1中堿基序列。其是從文蛤中克隆到鐵蛋白的cDNA序列，該序列全長798bp，包括51!3bp的開放閱讀框，編碼171個(gè)氨基酸， 5’非編碼區(qū)長119bp，3’非編碼區(qū)長154bp，有一個(gè)加尾信號，該基因在文蛤幼蟲發(fā)育中貝 殼形成方面發(fā)揮著重要作用。利用PGEX-4T-1表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE!3)中重組表達(dá) 了該蛋白，表達(dá)產(chǎn)物具有將1 2+氧化為1 3+的蛋白活性。其編碼蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，分子量為19. 9kDa，等電點(diǎn)為 5.四。重組鐵蛋白具有脊椎動物H型鐵蛋白的典型結(jié)構(gòu)，不同亞基通過非共價(jià)鍵結(jié)和在一 起，包含有一個(gè)氧化狗2+的氧化中心，7個(gè)氨基酸殘基分別是Glu25、Tyr30、Glu59、Glu60、 His63、Glul05和Glnl39。該蛋白可以參與鐵離子的氧化和儲運(yùn)，調(diào)控文蛤等貝類幼蟲貝殼 的形成和生長，可應(yīng)用于貝類苗種繁育的人工調(diào)控。本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)、cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從文蛤中 克隆到鐵蛋白基因cDNA全長序列，通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增編碼鐵蛋白成熟肽的基因片斷并將 其克隆到PGEX-4T-1表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了原核體外重組表達(dá)。重 組產(chǎn)物經(jīng)GSTrap affinity columns純化，并進(jìn)一步將GST切去后對1 2+有氧化作用。本 發(fā)明可為進(jìn)一步研究文蛤幼蟲發(fā)育機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并為文蛤苗種繁育生產(chǎn)中幼蟲發(fā)育 調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)提供技術(shù)手段。


圖1 :BCA蛋白檢測試劑盒檢測文蛤重組鐵蛋白濃度，圖中1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；2 BSA (0. 5mg/ml) ；3 重組鐵蛋白。圖2 重組鐵蛋白MmeFer-GST凝血酶切GST圖譜，圖中1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量2.鐵 蛋白 3. GST。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)施例1.一種克隆得到的文蛤鐵蛋白基因，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本發(fā)明中的文蛤鐵蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步驟a)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；b)文蛤cDNA文庫構(gòu)建；c)文蛤cDNA文庫EST序列的測定；d)文蛤EST序列的同源性分析及鐵蛋白基因片段的篩選；e)RACE技術(shù)獲得鐵蛋白基因的全序列。具體操作如下a)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化利用hvitrogen公司的Trizol試劑從文 蛤幼蟲中提取總RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒純化mRNA。b)文蛤 cDNA 文庫構(gòu)建利用 Stratagene 公司 cDNA Synthesis Kit 和 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)進(jìn)行cDNA的合成，雙鏈cDNA經(jīng)末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Β ο I內(nèi)切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，與hvitrogen公司Uni-ZAP XRvector 載體連接，利用 Stratagene 公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進(jìn)行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript成為質(zhì)粒文庫。c)文蛤cDNA文庫EST序列的規(guī)模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物 T3在MegaBACElOOO測序儀上進(jìn)行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abi，abd文件) 數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq)和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件 提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù)據(jù)中 的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準(zhǔn)確率大于95% )且長度大于 IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體參見《基因表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年 著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。d)文蛤EST序列的同源性分析及鐵蛋白基因片段的篩選將獲得的全部有效的 EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與Singletons 在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx分析，顯示其中的EST序列與珍珠貝鐵蛋白相似性達(dá)78%，與長牡 蠣中兩種鐵蛋白亞基GFl和GF2分別是78%和77%，根據(jù)該相似性分析結(jié)果確定了文蛤鐵 蛋白的EST序列。e)文蛤鐵蛋白基因cDNA全長序列的克隆根據(jù)與鐵蛋白基因同源的EST序列設(shè) 計(jì)一對特異性引物，F(xiàn)l :5’ -GCAAACATCGCACAAAA-3’ 和 Rl :5’ -CCATCATCTGGGCATC-3，。利 用引物Fl和接頭引物AP (5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3，)進(jìn)行3，末端的擴(kuò)增；引物Rl和 T3(5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’ )進(jìn)行5’末端的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳進(jìn)行檢測，用膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和純化，再與pMD-18T(大 連寶生物工程有限公司)連接，參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯，科學(xué)出版社，2002年) 的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR檢測，確認(rèn)插入片段大小后 進(jìn)行序列測定，測得的序列經(jīng)CLUSTER分析和拼接后得到全長序列，見SEQ ID N0. 1。3，RACE 擴(kuò)增25 μ 1反應(yīng)體系滅菌超純水17.25 μ cDNA模板1 μ IOxbuffer2.5 μ MgCl2 (25 mM)1.5 μ dNTP (IOmM)0.5 μ Fl (10 μΜ)1 μ AP (10 μΜ)1 μ Taq DNA Polymerase (5 u/μ )0.25 μ 擴(kuò)增所用PCR反應(yīng)程序94°C變性％iin，1個(gè)循環(huán)；94°C變性50s，50°C退火50s， 72°C延伸lmin,30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin, 1個(gè)循環(huán)；4°C保溫。5，RACE 擴(kuò)增25 μ 1反應(yīng)體系:滅菌超純水 cDNA模板 IOxbuffer MgCl2 (25 mM) dNTP (IOmM) Rl (10 μΜ) Τ3 (ΙΟμΜ)Taq DNA Polymerase (5 u/μ )17.25 μ 1 μ 2.5 μ 1.5 μ 0.5 μ 1 μ 1 μ 0.25 μ 擴(kuò)增所用PCR反應(yīng)程序94°C變性5min，1個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，59°C退火30s， 72°C延伸50s, 34個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin, 1個(gè)循環(huán)。實(shí)施例2.根據(jù)SEQ ID NO. 1的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物。利用引物F2 =GCC GGATCCATGGCAGATTCAAGACC 和 R2 :CGCGTCGAC TTAGGATTGCAGTTCTCTGTC,通過 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 編碼鐵蛋白成熟肽的基因片段，反應(yīng)在MJ Research PTC-100型中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先 94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸40s，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。按照《分子克隆第三版》的方法將其克隆到pGEX_4T_l表 達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)測序確認(rèn)表達(dá)框與SEQ ID NO. 1的序列一致。接種 陽性克隆到LB.培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD600O. 6-0. 8，加入ImM的IPTG誘導(dǎo)3h，離心 保存菌體沉淀。菌體以lmg/mL雞蛋清溶菌酶處理30min后超聲破碎500W，超聲30min， 每次ls，間隔k。離心收集上清和沉淀，從包涵體中純化目的蛋白參照Kuhelj等(Kuhelj et al. 1995)方法進(jìn)行，主要步驟包括離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀加入PBS懸浮細(xì)胞，并加 入Triton X-100至終濃度為1%。超聲波破碎細(xì)胞，收集沉淀。用Bufer A(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),0. 1% Triton X-100，pH 8.0)洗滌沉淀 2 次， 再用 Bufer B(50mmol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA，2mol/L urea, pH 8.0)洗滌 2 次，將洗 滌后的沉淀溶于 5mL Bufer C(0. lmol/L Tris-HCl，10mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，8mol/L urea, pH 8.0)中，37°C快搖40min，用BuferC將樣品稀釋到500 μ g/mL，在10倍體積透析 液(0. lmol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA,5mmol/L Cysteine,pH 8.0)中透析使蛋白復(fù)性，中 間換2次透析液。上述復(fù)性后的樣品經(jīng)過離心，用GSTrap affinity columns純化，獲得純 化的GST-MmeFer融合蛋白(圖1)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，三段序列(-RVGAGHGEWHYDRE-，-RVVLQNI QKPDRD-，-KTVNQSLLDLHKI_)與文蛤鐵蛋白氨基酸序列一致，因此該重組蛋白為重組文蛤鐵 蛋白(GST-Mmei^er)，用凝血酶直接在柱子上酶切掉GST 裂解過夜)，獲得文蛤重組鐵蛋 白(圖2)，用于活性驗(yàn)證。透析復(fù)性后的重組產(chǎn)物體外活性驗(yàn)證根據(jù)Kim的方法(Kim et al.，2002)，將 鐵蛋白在含巰基乙酸的0. IM乙酸鈉的溶液(PH5. 5)中孵育18h，除去鐵蛋白中的鐵離 子。過量的2，2-聯(lián)吡啶添加到該溶液中將鐵離子螯合掉，并將該溶液在0. IM Hepes (pH 7. 0)溶液中透析，然后將20 μ g/mL鐵蛋白和對照蛋白(BSA)在含有ImM硫酸亞鐵銨的0. IM Hepes中室溫孵育lOmin，于310nm檢測，鐵蛋白(20 μ g/ml)活性達(dá)到0. 476，見表1。表1重組鐵蛋白吸收鐵離子的活性在310nm下的吸收值，BSA為對照
權(quán)利要求
1.文蛤鐵蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQID No 1中堿基序列。
2.—種權(quán)利要求1所述文蛤鐵蛋白基因編碼蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No 2中氨基酸序列。
3.—種權(quán)利要求1所述文蛤鐵蛋白基因體外重組表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于文蛤 鐵蛋白基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可將狗2+氧化為狗3+，具有鐵蛋白活性，可進(jìn)
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中文蛤鐵蛋白基因克隆及體外重組表達(dá)技術(shù)。本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)、3’和5’末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)從文蛤幼蟲中克隆到鐵蛋白基因cDNA全長798bp，包括513bp的開放閱讀框，編碼171個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)長119bp，3’非編碼區(qū)長154bp，有一個(gè)加尾信號，該基因在文蛤幼蟲發(fā)育中貝殼形成方面發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明利用體外原核重組表達(dá)技術(shù)獲得了重組的文蛤鐵蛋白，該蛋白具有氧化活性，可以參與調(diào)控文蛤等貝類幼蟲貝殼的形成和生長，可應(yīng)用于貝類苗種生產(chǎn)中發(fā)育調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)。
文檔編號A61P43/00GK102051363SQ20091022980
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者劉保忠, 姚學(xué)良, 張繼泉, 王曉梅, 相建海 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所