專利名稱：一種哈氏弧菌分泌型疫苗及其構(gòu)建和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學及免疫學領域，具體的說是一種哈氏弧菌分泌型疫苗及其
構(gòu)建和應用。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物重要病原菌，能夠感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖 動物，包括魚、蝦、貝等。目前對于哈氏弧菌的防控依賴抗生素和免疫防治。由于抗生素對 環(huán)境以及人類健康的潛在危害性，其使用已逐漸在國際上受到限制。針對哈氏弧菌的疫苗 主要為簡單的滅活疫苗，分泌型疫苗的應用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種哈氏弧菌分泌型疫苗及其構(gòu)建和應用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 —種哈氏弧菌分泌型疫苗序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。
哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建 1)質(zhì)粒pBSVhPl的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用F11和R8為引物進行PCR擴 增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后在 含有安卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和異丙基_ 13 -D-硫代半乳糖苷 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為pBSVhPl ;
所述弓I物為Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，； 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建將質(zhì)粒pBSVhPl用Ndel/Xhol雙酶切回收1. 2kb， 同時將質(zhì)粒pBT3用Ndel/Xhol雙酶切回收4. 3kb片段，將這兩片段用T4DNA連接酶于室溫 連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小 時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，即為表達序列表SEQ ID No. l中的堿基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗 DH5 a /pTVPlM。 哈氏弧菌分泌型疫苗的應用將表達上述所得的序列表SEQ ID No. 1中的堿基序 列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 至0D6。。為0. 8-l，而后離心收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為4X 108cfu/ml，即為疫 苗菌懸液，所得疫苗菌懸液具有對哈氏弧菌免疫保護的作用。 所述質(zhì)粒DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6。。為 0. 8-1為首先將DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后取 0. 1ml過夜培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，將其加入10ml新鮮的含Ap的LB液體培養(yǎng)基中，于28。C搖動 培養(yǎng)至OD,為O. 8-1。 將所述疫苗菌懸液lOOul腹腔注射于牙鲆體內(nèi)，20天后再次將lOOul疫苗菌懸液 液腹腔注射于牙鲆。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點 1.高保護率。本發(fā)明的疫苗對哈氏弧菌的免疫保護效率達90%。 2.制備簡單。本發(fā)明的疫苗制備過程簡單，只需常規(guī)的細菌培養(yǎng)，無需滅活處理等步驟。 3.無需佐劑。本發(fā)明的疫苗應用時不需如弗氏佐劑等有副作用的免疫剌激劑。
4.本發(fā)明構(gòu)建的分泌型疫苗是將疫苗抗原基因通過一種載體菌表達并且以可溶 性重組蛋白的形式分泌至胞外，從而被免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生相應的保護性免疫應答。本發(fā) 明疫苗相對滅活疫苗而言，轉(zhuǎn)基因載體菌為基礎的分泌型疫苗具有免疫效應強、重復性好、 操作簡單、造價低廉。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進行限制。 在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法 1.質(zhì)粒提取、DNA(PGR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細菌基因組DNA提取皆
使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相應試劑盒。 2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell : Molecular Cloning :A Laboratory Man皿al. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001); 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司"。
實施例1 哈氏弧菌分泌型疫苗為序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。序列表SEQ ID Nol


















(a)序列特征 參長度1593bp 參類型堿基序列 參鏈型單鏈 參拓撲結(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型雙鏈DNA (C)假設否 (d)反義否 (e)最初來源哈氏弧菌T4 (f)特異性名稱Vhpl 哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建 1)質(zhì)粒pBSVhPl的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用F11和R8為引物進行PCR擴 增，PCR條件為94°C 60s預變性模板DNA，然后94°C 40s，51。C 60s，72。C 60s，5個循環(huán)后 改為94°C 40s，62°C 60s，72°C 60s，25個循環(huán)后再在72"C延伸反應10min。 PCR產(chǎn)物用天 根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北 京)于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后在含有100ug/ml安卡青霉素 (Ap) 、40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P _D_乳糖苷)和24ug/ml異丙基-P _D_硫代 半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pBSVhPl ; 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建將質(zhì)粒pBSVhPl用Ndel/Xhol雙酶切回收 1. 2kb片段，同時將質(zhì)粒pBT3(可按照此文獻進行構(gòu)建，Zhang W， Sun K， Cheng S， Sun L Characterization of DegQvh，a serine protease and a protective immimogenfrom a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ;74 :6254 62.并也 可由公眾在市面購得)用Ndel/XhoI雙酶切回收4. 3kb片段，將這兩片段用T4DNA連接酶于 室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Ap (100ug/ml)的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)24小時，挑取1個轉(zhuǎn)化子，命名為DH5 a /pTVPlM。將DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ ml Ap的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用引物BRF2(5 '-ATAGGGGTTCCGCGCACA-3')測 序，測序結(jié)果證明DH5 a /pTVPlM確實含有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97.5%蒸餾水；其中所述菌株T4保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 1985，分類命名為哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
所述弓I物為Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，。
實施例2 疫苗菌懸液將上述所得的表達序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的哈氏弧菌分
5泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取0. 1ml過 夜后的培養(yǎng)液，將其加入10ml新鮮的含Ap(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于28。C下轉(zhuǎn)速 160rpm搖動培養(yǎng)至0D6。。為0. 8_1，而后將細菌培養(yǎng)液離心(5000g， 4°C ， 10min)，收集菌體， 將其懸浮于PBS中至終濃度為4X 108cfu/ml，即為疫苗制備液。 疫苗對照液將質(zhì)粒pBT3用Hanahan方法轉(zhuǎn)化入DH5 a ，得轉(zhuǎn)化子DH5 a /pBT3。 將DH5 a /pBT3在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取0. 1ml過夜后的培養(yǎng) 液，將其加入10ml新鮮的含Ap(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于28。C下轉(zhuǎn)速160rpm搖動 培養(yǎng)至0D6。。為0. 8-1，而后將細菌培養(yǎng)液離心(同上)，收集菌體，將其懸浮于PBS中至終 濃度為4X 108cfu/ml，即為疫苗對照液。 所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl，O. 02 % KCl，O. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04。
實施例3 將上述疫苗菌懸液免疫注射將80條牙鲆(每條重約10g)隨機分為2組，每組
40條。將這2組分別命名為A和B。將A組的每條魚分別腹腔注射100ul疫苗菌懸液，將
B組的每條魚分別腹腔注射lOOul疫苗對照液。20天后，再次將A組的每條魚分別腹腔注
射lOOul疫苗菌懸液，將B組的每條魚分別腹腔注射lOOul疫苗對照液。 哈氏弧菌懸液的制備在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)哈氏弧菌T4至0D6。。為0. 6，然后離
心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為8X 107cfu/ml，即為哈氏
弧菌懸液。 疫苗的免疫保護效應檢測將上述免疫注射后的牙鲆第35天，用上述的哈氏弧菌 懸液腹腔注射于上述的A和B組魚，每條魚的注射量為100ul。在以后的20天中，每天觀察 并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，3條；B組，30條。利 用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS): RPS = 100X (l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)故DH5 a / pTVPlM針對哈氏弧菌的免疫保護效率為90%。 由此得出DH5 a /pTVPlM能夠高效地保護牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。 序列表 SEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學院海洋研究所 〈120〉 一種哈氏弧菌分泌型疫苗及其構(gòu)建和應用 〈130〉 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211>1593 〈212>DNA 〈213〉哈氏弧菌T4 〈220〉 〈221>CDS
6
〈22:》(1〕..(1593)〈223〉〈400>13tgtta朋getaetaElgttgttgtateacc tcg gca etc tgtttc48MetLeuLysLysLeuLeuSerCysCyslieThr Ser Ala Leu CysPhe151015cattcttctetcgetttttcgc朋tcgg朋etc CC3朋t gatgcg96HisSerSerLeuAlaPheSerGinSerThrGlu Leu Pro Asn AspAla202530gatttagcgCElgcctgcgteactgEltgctt gcg cct gaa gacgtc144AspLeuAlaGinThrProAlaSerLeuMetLeu Ala Pro Glu AspVal354045gccategetgatcgttatategttgt￡ltttcat caa cct caa atgEltg192AlalieAlaAspArgTyrlieValValPheHis Gin Pro Gin MetMet505560Eltg朋t朋tteacttg朋ttaCElgCElgttcc朋c朋tct gtgg￡lC240MetAsnAsnSerLeuGluLeuGinGinPheThr Gin Gin Ser ValAsp65707580Cg￡lEltgtctggtttgtacteaateg朋gtgg朋tea gte ttc gac朋t288ArgMetSerGlyLeuTyrSerlieGluValGlu Ser Val Phe AspAsh859095tcgateageggtttcgttgcg3CgttagetCCt g朋C3g Ctg 333gcg336SerlieSerGlyPheValAlaThrLeuAlaPro Glu Gin Leu LysAla100105110ttacgtgetgatCC3cgtgttg朋tacategag g3C 3g3 attctt384LeuArgAlaAspProArgValGluTyrlieGlu Gin Asp Arg lieLeu115120125etag￡lCCC3ategtctcggCElg朋gteaac c朋agt朋t gca att432ThrLeuAspProlieValSerAlaGluValAsn Gin Ser Asn Alalie130135140tgggggetag￡lCCg￡lattgatc朋cgtElgtctg cct etc aat aac aat480TrpGlyLeuAsp Arg lie Asp Gin Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asn Asn145150155160tacagegcc朋ctttgat3Cgggcgtcacg get tec gtt ate gat528TyrSerAlaAsn Phe Asp Gly Thr Gly ValThr Ala Tyr Val lie Asp1651701753Cgggtgtg朋c朋ctcgC3Cgttg朋tttgcc gga cgc tec att tcg576ThrGlyValAsn Asn Ser His Val Glu Phe Ala Gly Arg Ser lieSer180185190tatg￡lCtttgtcg￡lC朋tgatgcg gat gcc agt gac tgt aat gga624GlyTyrAspPheValAspAsnAspAla Asp Ala Ser Asp Cys Asn Gly195200205C3CggcC3Cgtegcgggc3Cgate ggc gga tct ttg tat ggc gtg672HisGlyThrHisValAlaGlyThrlie Gly Gly Ser Leu Tyr Gly Val210215220gCEl朋g朋cgtgageattgttggtgtc aga gtg ctt age tgt tct ggc720AlaLysAsnValSerlieValGlyVal Arg Val Leu Ser Cys Ser Gly225230235 240teaggttea3Cgtecggcgttattgcg ggt gtt gat tgg gte get gcc768SerGlySerThrSerGlyVallieAla Gly Val Asp Trp Val Ala Ala245250 255朋tgettctggtcctteggttgccaac atg agt tta ggt ggt ggg caa816AsnAlaSerGlyProSerValAlaAsn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gin260265 270tctgttgetcttgatagegCElgtgcaa age gca gtt cag tec ggc gtt864SerValAlaLeuAspSerAlaValGin Ser Ala Val Gin Ser Gly Val275280285agetttEltgcttgCElgetggt朋ctec aat get gat gcc tgt aac tac912SerPheMetLeuAlaAlaGlyAsnSer Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr290295300teacctgcgcgtgtttcttctggtgtt act gtc ggc teg acg acg age960SerProAlaArgValSerSerGlyVal Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser305310315 320tctg￡lCgCElcgttctElgttttteaaac tgg ggt age tgt gtc gat gtt1008SerAspAlaArgSerSerPheSerAsn Trp Gly Ser Cys Val Asp Val325330 335tttgetCC3teac朋ate朋gtct get tgg tat gat ggc ggt tat1056PheAlaProGlySerGinlieLysSer Ala Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr340345 350朋g3CgateElgtggcactteaEltggca acc cca cat gtt get ggt gtt1104LysThrlieSerGlyThrSerMetAla Thr Pro His Val Ala Gly Val355360365getgcgctttatetcc朋g朋朋cagt gca ctt tea cca age caa gtg1152AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSer Ala Leu Ser Pro Ser Gin Val370375380g朋gcgctgategttgagcgcgCEl3CC 3gt ggC朋3 gtC 3Cg g3t1200GluAlaLeulieValGluArgAlaThr Ser Gly Lys Val Thr Asp Thr385390395 400
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AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSerAlaLeuSerProSerGinVal370375380GluAlaLeulieValGluArgAlaThrSerGlyLysValThrAspThr385390395400ArgGlySerValAsnLysLeuLeuTyrSerLeuThrAspAlaAspCys405410415GlyGinAspCysGlyGlyProAspProThrProAspProGluGlyLys420425430LeuThrSerGlyValProValSerGlyLeuSerGlySerThrGlyGin435440445ValAlaTyrTyrTyrValAspValGluAlaGlyGinArgLeuThrVal450455460GinMetTyrGlyGlySerGlyAspAlaAspLeuTyrLeuArgPheGly465470475■SerLysProThrlieAsnAlaTrpAspCysArgProPheArgTyrGly485490495AsnSerGluThrCysThrValAsnAlaThrGinSerGlyArgTyrHis500505510ValMetlieGinGlyTyrSerSerTyrAsnGlyValSerlieGinAla515520525SerTyr530
1權(quán)利要求
一種哈氏弧菌分泌型疫苗，其特征在于序列表SEQ ID No.1中的堿基序列所示。
2. —種按權(quán)利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建，其特征在于1) 質(zhì)粒pBSVhPl的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用F11和R8為引物進行PCR擴增，PCR 產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后在含有安 卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和異丙基-13 -D-硫代半乳糖苷的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為pBSVhP 1 ;所述引物為F115' -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGATATCA CTGGTTGCGCGCT-3，；2) 哈氏弧菌分泌型疫苗的構(gòu)建將質(zhì)粒pBSVhPl用Ndel/Xhol雙酶切回收1. 2kb，同時 將質(zhì)粒pBT3用Ndel/Xhol雙酶切回收4. 3kb片段，將這兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接 2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，篩選 出白色轉(zhuǎn)化子，即為表達序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗DH5 a / pTVPlM。
3. —種按權(quán)利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的應用，其特征在于將表達上述所 得的序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5/pTVPlM在含有 50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6。。為0. 8_1，而后離心收集菌體，將其懸浮于PBS 中至終濃度為4xl08cfU/ml，即為疫苗菌懸液，所得疫苗菌懸液具有對哈氏弧菌免疫保護的 作用。
4. 按權(quán)利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的應用，其特征在于所述質(zhì)粒DH5 a / pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,為O. 8-1為首先將DH5 a /pTVPlM 在含有50ug/ml Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后取0. 1ml過夜培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，將其 加入10ml新鮮的含Ap的LB液體培養(yǎng)基中，于28t:搖動培養(yǎng)至0D6。。為0. 8-1。
5. 按權(quán)利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的應用，其特征在于將所述疫苗菌懸液 lOOul腹腔注射于牙鲆體內(nèi)，20天后再次將lOOul疫苗菌懸液液腹腔注射于牙鲆。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學及免疫學領域，具體的說是一種哈氏弧菌分泌型疫苗及其制備和應用。具體為分泌型疫苗為序列表SEQ ID No.1中的堿基序列，其構(gòu)建為以哈氏弧菌T4為模板，用F11和R8為引物進行PCR擴增，產(chǎn)物與pBS-T于室溫連接，將質(zhì)粒pBSVhP1用NdeI/XhoI雙酶切回收1.2kb，同時將質(zhì)粒pBT3用NdeI/XhoI雙酶切回收4.3kb片段，將這兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，即為表達序列表SEQ ID No.1中的堿基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗。所得疫苗菌具有對哈氏弧菌免疫保護的作用。本發(fā)明的疫苗對哈氏弧菌的免疫保護效率達90％。制備過程簡單，無需滅活處理等步驟，且不需任何佐劑。
文檔編號A61P31/04GK101780273SQ20091022980
公開日2010年7月21日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者孫黎, 張衛(wèi)衛(wèi), 程爽 申請人:中國科學院海洋研究所