專利名稱：殼聚糖-Math1基因納米微粒及其在治療耳聾的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及殼聚糖-Mathl基因納米微粒、其 制備方法及其在治療耳聾上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因的輸送通常需要載體來完成，理想的基因載體能把目的基因安全且高效地輸 送到特定的病變細(xì)胞或組織中，從而達(dá)到治療的目的。目前常用的基因載體主要有病毒和 脂質(zhì)體兩類。病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒和單純皰疹 病毒(HSV)等表達(dá)水平高，但沒有特異選擇性、副作用較多，如致癌性、體內(nèi)野生型病毒生 成、細(xì)胞病理改變等，并且能裝載的基因長度有限。脂質(zhì)體載體能運載更多數(shù)量的基因，但 其分子量較大、不穩(wěn)定、在體內(nèi)易被清除、組織特異性較差、且陽離子脂質(zhì)體達(dá)到一定濃度 時會產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，因而在體內(nèi)使用時具有局限性。近年來，以非病毒材料為基因載體的基因治療研究引起了廣泛的重視，其中用陽 離子聚合物和基因復(fù)合形成納米微粒來模擬類似病毒的結(jié)構(gòu)作為基因載體就是一個重要 方面。納米微粒(nan0partiCle，NP)基因載體是由高分子材料合成的一種固態(tài)膠體納米級 微粒載體，其能將DNA、RNA、PNA (肽核苷酸)、dsRNA (雙鏈RNA)等基因治療分子包裹在納 米微粒之中或吸附在納米微粒表面，通過細(xì)胞胞吞使納米微粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)高分子材料 的降解逐漸釋放出基因治療分子，從而發(fā)揮其基因治療的效能。與病毒載體和陽離子脂質(zhì)體相比，由于具有適宜特性的納米微?？梢赃M(jìn)入細(xì)胞， 所以將聚合物納米微粒用于基因載體以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一些顯著的優(yōu)點聚合物納米微 粒尺寸小、無毒、無抗原性、有生物相容性、表面能極高；納米微粒具有生物親和性，易于在 其表面耦聯(lián)特異性的靶向分子，實現(xiàn)基因治療的特異性；納米微粒能包裹、濃縮、保護(hù)核苷 酸，使其免遭機(jī)體血漿或組織細(xì)胞中各種補(bǔ)體以及各種酶的破壞；納米微粒使核苷酸緩慢 釋放，有效地延長作用時間，并維持有效的核苷酸濃度，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物的生物利 用度；納米微粒代謝產(chǎn)物少、副作用少、無免疫排斥反應(yīng)等；對特殊細(xì)胞受體的靶向性和副 反應(yīng)少；使外源基因在宿主細(xì)胞染色體DNA中整合，從而獲得長期穩(wěn)定的表達(dá)等。因此，納 米微?；蜉d體是一種比較理想的用于基因治療的載體(Lee，K. Y. ,Kwon, I. C. ,Kim, Y. H.， Jo, W. H. ,& Jeong,S. Y. Preparation ofchitosan self-aggregates as a gene delivery system. Journal of Controlled Release，1998. 25，340—341 ；Koki Wada，Hidetoshi Arima， Toshihito，“Improvement of genedelivery mediated by mannosylated dendrimer/a-cyclodextrin conjugates，，，Journalof Control led Release，2005， 104397-413 ；Joon Sig Choi，Kihoon Nam，Jong-yeunPark，"Enhanced transfection efficiency of PAMAM dendrimer by surfacemodification with L-arginine”， Journal of Controlled Release，2004，99445—456 ；Henryk，Bayele，T. sakthivel， Martino’ donell，Versatile Peptide Dendrimers forNucleic Acid Delivery ；Journal of Pharmaceutical Sciences，2005，94，446—457)。
大量研究表明，在一定條件下，聚陽離子可與基因在水溶液中復(fù)合形成納米微粒。 同時，可以在聚陽離子鏈上引入具有特殊功能的基團(tuán)(如半乳糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白)從而使聚陽離 子/基因納米微粒具有類似病毒的功能，如受體調(diào)節(jié)內(nèi)化、進(jìn)入細(xì)胞核等。聚陽離子作為基 因載體在血漿的電解質(zhì)環(huán)境中仍是穩(wěn)定的納米微粒，且在冷凍干燥儲存過程中并不失活。甲殼素(chitin)是地球上含量僅次于纖維素的天然聚合物，殼聚糖(chitosan) 作為甲殼素的部分脫乙酰化產(chǎn)物，是一種由β_(1，4)糖苷鍵連接的D-葡聚糖胺與含量不 等的N-乙酰葡聚糖無序排列的線性聚糖，它是自然界來源第二大豐富的親水性多糖，具 有生物可降解性、生物相容性、生物粘附性和促滲透作用，且?guī)缀鯚o毒副作用，其理化特性 和生物學(xué)性質(zhì)使它非常適合作為藥物控釋系統(tǒng)的載體材料(Calvo，P.，Remunan-Lopez, C. , Vila-JATO, J. L. , Alonso, M. J. Novel hydrophilic chitosan-polyethyIene oxide nanoparticles asprotein carriers. Journal ofApplied Polymer Science,1997,63, 125-132 ；Suh H, Hwang Y-S, Lee J-E, Han CD, Park J-C. Behavior of osteoblasts on a typeatelocollagen grafted ozone oxidized poly (L-lactic acid)membrane. Biomaterials,2001,22,219-230 ；Yan Wu, Wuli Yang, Changchun Wang, Jianhua Hu, ShoukuanFu, "Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammoniumgly cyrrhizinate" International Journal of pharmaceutics", 2005, 295, 235-245 ；Haliza Katas, H. Oya Alpar "Development and characterisation of chitosannanoparticles for siRNA delivery", Journal of Controlled Release,115(2006)216—225)。殼聚糖含有大量的陽離子，當(dāng)它與某些帶負(fù)電荷的陰離子化合物、生物大分子 等在水相條件下相遇時，殼聚糖分子壓縮并包裹帶負(fù)電荷的物質(zhì)，形成疏水顆粒并生成 納米微粒懸浮液(Aspden T J, Mason J D, Jones N S, et al. J PharmSci，1997，86 (4)， 509-513)；殼聚糖能特異性地黏附于黏膜表面，因而可用于靶向黏膜的藥物傳遞系統(tǒng)中，此 外，殼聚糖還能打開上皮細(xì)胞間緊密的連接，攜所運載的藥物穿過組織嚴(yán)密的上皮層(Mao Hai-quan, Krishnendu R, Troung V L 等人，J Control Rel，2001，399-421)。研究表明， 殼聚糖由于毒性較低且生物相容性良好，而逐漸被用作基因的非病毒載體。一方面，殼聚糖 與DNA間通過靜電作用等而復(fù)合，從而增加DNA的穩(wěn)定性；另一方面，殼聚糖在增強(qiáng)與細(xì)胞 膜的作用及保護(hù)DNA不被溶酶體降解等方面起著重要作用。殼聚糖作為基因載體材料的制 備比較方便，殼聚糖/基因納米微粒可以保護(hù)部分目的基因不被核酸酶降解，并可通過內(nèi) 吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞(Mohamed M. Issa,Magnus Koping-Hoggard, Kristoffer T0mmeraas ^Α "Targeted gene delivery withtrisaccharide-substituted chitosan oligomers in vitro and after lung administrationin vivo", Journal of Controlled Release 115(2006) 103-112 ；Mi-Kyung Lee, Soo-Kyung Chun, Woo-Jeong Choi, "The use of chitosan as a condensing agent toenhance emulsion mediated gene transfer", Biomaterials,2005,26,2147-2156 ；Tina Kiang,Jie Wen,Huay Wen Lim, "The effect of the degree of chitosandeacetylation on the efficiency of gene transfection，，， Biomaterials, 2004, 25, 5293-5301 ；Tae Hee Kima, Jong Eun Ihma, Yun Jaie Choia 等 Α "Efficient genedelivery by urocanic acid-modified chitosan", Journal of Controlled Release，2003，93，389-402)。在體內(nèi)生物酶的作用下，殼聚糖可降解為小分子 物質(zhì)，最后分解為水和二氧化碳，避免了載體材料的體內(nèi)蓄積。聚乳酸(PLA)、聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用作臨床藥物的輔助材料，它們作為化療和基因藥物 載體展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景。為了更好地提高轉(zhuǎn)染率，需要開發(fā)出殼聚糖/基因納米 微粒。季銨化的N-(2_羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖是殼聚糖的水溶性衍生物， 其陽離子化程度更強(qiáng)，與黏膜的黏附性更強(qiáng)，同時能更好地增強(qiáng)黏膜通透性(Kotze AF, Thanou MM, Lueben HL, Boer BG, Verhoef JC, Junginger HE. EuJ Pharm Biopharm, 1999, 47 269-274)。此外，由于它是水溶性的殼聚糖，可以增強(qiáng)藥物的吸收率。耳蝸是人類感受外界聲音刺激的唯一器官，同時也是一種高度分化的功能特化 器官，其內(nèi)部的毛細(xì)胞是感受聲音振動的機(jī)械-電感受器，對維持聽覺及平衡覺有重要作 用。任何原因?qū)е碌膬?nèi)耳毛細(xì)胞的變性、壞死均可引起聽覺和平衡功能障礙。傳統(tǒng)觀點認(rèn) 為鳥類及哺乳類動物的耳蝸毛細(xì)胞在胚胎期完成分化，且不能自發(fā)再生，一旦發(fā)生由于耳 蝸毛細(xì)胞損失而導(dǎo)致的耳聾就很難自然恢復(fù)聽力，必須通過人為的治療才有可能恢復(fù)，而 這一直是個世界性的難題。近年來有研究表明，耳毒性藥物和噪聲損傷哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì) 胞后，毛細(xì)胞可以經(jīng)誘導(dǎo)再生。許多生長因子在毛細(xì)胞再生中起重要作用，如轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等等。Mathl (Mammalian atonal homolog 1)是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)基因， 其是果蠅Atohl基因的小鼠同源基因。Mathl基因全長1. 18kb，含一個外顯子，mRNA長 1065bp，編碼由354個氨基酸組成的蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子Mathl，分子量為38. 2kDa0Mathl基因 是毛細(xì)胞分化成熟的必需基因，在毛細(xì)胞再生過程中有重要作用(Bermingham NA, Hassan ΒΑ, Price SD 等人，Mathl :anessential gene for the generation of inner ear hair cells. Science, 1999，284 :1837_1841)。Gao等人發(fā)現(xiàn)Mathl基因過表達(dá)可以使大上皮嵴 區(qū)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有毛細(xì)胞表型的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)肌球蛋白VIIa(毛細(xì)胞的標(biāo)記抗 體)(Overexpression of Mathl induce robust production of extra hair cells in postnatalrat inner ears. Nat Neurosci，2000，3 :580_586)。最新的研究證明該基因的 過表達(dá)可使慶大霉素致聾的成年豚鼠毛細(xì)胞再生并伴有聽功能的部分恢復(fù)(Izumikawa Μ, Minoda R,Kawamoto K 等人，Auditory hair cell replacement andhearing improvement by Atohl gene therapy in deaf mammals. Nat Med,2005,11 :271_276)。目前，主要利用病毒載體在動物體內(nèi)進(jìn)行內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的研究，但由于病毒載 體的局限性，使得毛細(xì)胞再生無法應(yīng)用于臨床。納米微粒作為一種新型基因載體，以其無免 疫原性，低毒、裝載容量大、制備容易且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、利于改造和修飾等優(yōu)勢，更有利于毛細(xì)胞 再生的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用。目前，納米微粒基因載體的內(nèi)耳導(dǎo)入途徑主要是鼓階打孔和圓窗膜注射，通過直 接注射和微滲透泵將該載體導(dǎo)入外淋巴液。這兩種方式雖有效，但都是侵襲性操作，破壞耳 蝸鼓階，存在誘發(fā)炎癥、外淋巴漏、損壞聽力的危險。由于圓窗膜具有半透膜的特性分泌和 吸收功能，而納米微?；蜉d體具有靶向性和通透性，作為一種新技術(shù)，有望實現(xiàn)圓窗膜跨 膜導(dǎo)入。然而，至今未見殼聚糖-Mathl基因納米微粒的制備以及用殼聚糖-Mathl基因納 米微粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞并且表達(dá)Mathl基因的報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖-Mathl基因納米微粒，實現(xiàn)基因的遞送。根據(jù)本發(fā)明的一方面，該殼聚糖-Mathl基因納米微粒包括殼聚糖和如圖4所示 的質(zhì)粒，其粒徑為100-250nm,分散指數(shù)為0. 15-0. 26，zeta電位約為20_40mV，包封率為 90-95%。該殼聚糖-Mathl基因納米微粒的粒徑可控、尺寸均一、利于表面修飾、可提高 Mathl基因的表達(dá)和遞送能力。本發(fā)明的另一目的在于提供一種殼聚糖衍生物-Mathl基因納米微粒，實現(xiàn)基因 的遞送。根據(jù)本發(fā)明的一方面，該殼聚糖衍生物-Mathl基因納米微粒，包括殼聚糖衍 生物和如圖4所示的質(zhì)粒，其粒徑為100-250nm，分散指數(shù)為0. 15-0. 26，zeta電位約為 20-40mV，包封率為90-95%。該殼聚糖的衍生物是殼聚糖季銨鹽、羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽 酸鹽，優(yōu)選殼聚糖季銨鹽，更優(yōu)選季銨化的N- (2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖。本發(fā)明的又一目的在于提供一種殼聚糖-Mathl基因納米微粒和/或殼聚糖衍生 物-Mathl基因納米微粒的制備方法。該方法簡單易行，原料易得，無須使用有機(jī)溶劑和醛 類作為交聯(lián)劑，反應(yīng)迅速，反應(yīng)條件溫和，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，實用性強(qiáng)，具有廣泛的應(yīng)用 性。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述殼聚糖-Mathl基因納米微粒通過將殼聚糖與如圖4所 示的含Mathl基因的質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)凝聚而制備。其在室溫下，將殼聚糖以濃度比為50 1至 1 2加入到含硫酸鈉的含Mathl基因的質(zhì)粒中，在硫酸鈉對殼聚糖的脫水作用和殼聚糖與 含Mathl基因的質(zhì)粒的靜電作用下，殼聚糖分子包裹含Mathl基因的質(zhì)粒而生成納米微粒 混懸液。具體地，該方法包括下述步驟(1)制備濃度為100-500 μ g/ml, pH = 5. 5的殼聚糖的醋酸鈉緩沖溶液；(2)制備濃度為10-200 μ g/ml的含Mathl基因的質(zhì)粒的Na2SO4溶液；(3)等體積混合步驟(1)、(2)的溶液以進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)得到殼聚糖-Mathl基因 納米微?；鞈乙?。其中，殼聚糖的分子量是IOOOODa 300000Da。其中，殼聚糖的脫乙酰度是80% 95%。其中，Na2SO4的含量是 5_50mM。其中，含Mathl基因的質(zhì)粒是如圖4所示的質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，以與制備殼聚糖-Mathl基因納米微粒類似的方法制備 殼聚糖衍生物-Mathl基因納米微粒，只是在步驟(1)中制備濃度為100-500 μ g/ml的殼聚 糖衍生物的PBS緩沖溶液。其中，殼聚糖的衍生物是殼聚糖季銨鹽、羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽，優(yōu)選殼聚 糖季銨鹽，更優(yōu)選季銨化的N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的殼聚糖(衍生物)_Mathl納米微粒至少具有以下 特點(1)選用天然可生物降解的原料，制得的納米微粒生物相容性好，無毒副作用。(2)制得微粒的粒徑大小可以調(diào)節(jié)，尺寸較均一。(3)制得微粒的表面帶有正電荷，利于進(jìn)行表面修飾。
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(4)殼聚糖或其衍生物與含Mathl基因的質(zhì)粒通過靜電作用復(fù)合制備納米微粒， 一方面能增加Mathl基因的穩(wěn)定性，使Mathl基因最終被遞送到細(xì)胞內(nèi)，另一方面，增強(qiáng)與 細(xì)胞膜的作用及保護(hù)Mathl基因免遭核酸酶的降解破壞。(5)通過調(diào)節(jié)各種成分的比例很容易實現(xiàn)對基因傳遞的控制。本發(fā)明的又一目的在于提供殼聚糖-Mathl基因納米微粒和/或殼聚糖衍生 物-Mathl基因納米微粒在轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供殼聚糖-Mathl基因納米微粒和/或殼聚糖衍生 物-Mathl基因納米微粒在轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的耳蝸組織中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供殼聚糖-Mathl基因納米微粒和/或殼聚糖衍生 物-Mathl基因納米微粒在轉(zhuǎn)染在體耳蝸中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供殼聚糖-Mathl基因納米微粒和/或殼聚糖衍生 物-Mathl基因納米微粒在耳聾方面的應(yīng)用，該納米微粒可以用于由于噪聲、藥物中毒等原 因引起的毛細(xì)胞缺失而導(dǎo)致的感音神經(jīng)性耳聾。


圖1示出殼聚糖-Mathl納米微粒的形成示意圖；圖2示出殼聚糖-Mathl納米微粒的透射電鏡圖；圖3示出殼聚糖納米顆粒的粒徑分布；圖4示出質(zhì)粒PRK5_MathI-EGFP的圖譜；圖5示出Mathl基因的核苷酸序列；圖6示出電泳圖譜，其中泳道1 標(biāo)記；1 未經(jīng)轉(zhuǎn)染對照組；2 利用根據(jù)實施例9 的轉(zhuǎn)染組；3 利用根據(jù)實施例10的轉(zhuǎn)染組；4 利用根據(jù)實施例4的轉(zhuǎn)染組；圖7示出EGFP在轉(zhuǎn)染有殼聚糖-Mathl納米顆粒的293T細(xì)胞中的表達(dá)；圖8示出耳后入路圓窗膜顯微注射導(dǎo)入，a 耳后入路尋找聽泡的解剖標(biāo)志，黑箭 頭示面神經(jīng)、藍(lán)星示胸鎖乳突??；b 將胸鎖乳突肌向上分離牽開，可見聽泡后壁(藍(lán)色箭 頭)及二腹肌后腹(藍(lán)星)；c 二腹肌后腹(藍(lán)星)向后分離后暴露聽泡后上骨壁(黑箭 頭指示方向)；d 磨除此處聽泡后上、面神經(jīng)入聽泡處后方骨壁；e 打開聽泡后可見圓窗龕 (黑箭頭示)、鐙骨動脈(藍(lán)箭頭示)；f:刺破圓窗膜顯微注射(黑箭頭示針頭)；以及圖9示出表達(dá)了 Mathl-EGFP蛋白的內(nèi)耳組織，1 內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域；2 柱細(xì)胞區(qū)域； 3 外毛細(xì)胞區(qū)域。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)闡述。除非特別指出，否則下面實例中的試劑藥品材料均為市售可得，方法參考《分子克 隆實驗指南》(Sambrook 和 Russell，2001)。實施例1 :PRK5_Mathl質(zhì)粒的構(gòu)建 用Trizol法提取胚胎小鼠16天腦組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用PCR法合成 含有E盒的Mathl基因，且5’和3’末端加入ECORl和BamHl酶切位點。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng)ECORl和BamHl酶切，純化后與經(jīng)ECORl和BamHl酶切的PRK5質(zhì)粒(Clontech公司)連接，構(gòu)建PRK5-Mathl質(zhì)粒。其中的Mathl基因具有圖5所示序列。擴(kuò)增引物如下F5 ’ -GGAATTAAAATAGTTGGGGGACC-3’，R 5，-TGGACAGCTTCTTGTTGGCTT-3，，擴(kuò)增條件為94°C5min ；94°C Imin ；58°C 40sec ；72°C 40sec ；35 個循環(huán)，72°C延伸 5min。實施例2 :PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建用Hpal和Xball酶對含有EGFP基因的質(zhì)粒pEGFP_C2 (Invitrogen公司) 和實施例1的PRK5-Mathl質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，純化回收，經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建 PRK5-Math I-EGFP 質(zhì)粒。實施例3 :PRK5-MathI-EGFP的擴(kuò)增和純化取5μ 1質(zhì)粒PRK5-Mathl_EGFP，加入100μ 1感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)菌，混勻，冰 浴30分鐘，42°C熱休克1分鐘，冰浴2分鐘，加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)1小時。取 100 μ 1菌液涂布于含有氨芐青霉素的平板，37°C倒置培養(yǎng)16小時。挑取平板中的單菌落， 接種于5ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫振蕩過夜，使細(xì)菌生長至對數(shù)晚 期。按照質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)說明書提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒0. 5 1 μ g，加入內(nèi)切酶5U (不超過總反應(yīng)體積1/10)，反應(yīng)體積20 μ 1，適 溫水浴2h，取少量樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。實施例4:將lOOyg/ml，pH = 5.5的殼聚糖(分子量為30000Da，脫乙酰度95 % )的醋 酸鈉緩沖溶液和10μ g/ml的PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分 鐘。配制100 μ 1含有5mM硫酸鈉的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒，向其中加入100 μ 1上述殼聚 糖的醋酸鈉溶液，迅速在旋渦混合器上混合30秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到殼聚 糖-PRK5-MathI-EGFP的納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為250nm，分散指數(shù)為0. 15 ； zeta電位分析儀測定其zeta電位為29. 01 士 1. 26 (mV)，包封率為91. 6%0實施例5 將500 μ g/ml，pH = 5. 5的殼聚糖(分子量為24000Da，脫乙酰度80% )的醋酸鈉 緩沖溶液和200 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配 制100 μ 1含有50mM硫酸鈉的PRK5_MathI-EGFP質(zhì)粒溶液，向其中加入100 μ 1上述殼聚糖 的醋酸鈉溶液，迅速混合60秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP 納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為146nm，分散指數(shù)為0. 21 ；zeta電位分析儀測定其 zeta 電位為 23. 23 士 1. 66 (mV)；包封率為 90. 1%0實施例6 將300 μ g/ml，pH = 5. 5的殼聚糖(分子量為lOOOODa，脫乙酰度85% )的醋酸鈉 緩沖溶液和50 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配 制200 μ 1含有5mM硫酸鈉的PRK5_MathI-EGFP質(zhì)粒溶液，向其中加入200 μ 1上述殼聚糖 的醋酸鈉溶液，迅速混合40秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP 質(zhì)粒的納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為116nm，分散指數(shù)為0. 16 ；zeta電位分析儀 測定其zeta電位為23. 36 士 2. 34 (mV)，包封率為92.5%。
實施例7 將300 μ g/ml，pH = 5. 5的殼聚糖(分子量為20000Da，脫乙酰度90% )的醋酸鈉 緩沖溶液和100 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配 制100 μ 1含有30mM硫酸鈉的PRK5_MathI-EGFP質(zhì)粒溶液，向其中加入100 μ 1上述殼聚糖 的醋酸鈉溶液，迅速混合50秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP 質(zhì)粒納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為120nm，分散指數(shù)為0. 25 ；zeta電位分析儀測 定其zeta電位為19. 6 士 0. 83 (mV)，包封率為95. 1%0實施例8 將300 μ g/ml，pH= 5. 5的殼聚糖(分子量為21000Da，脫乙酰度90% )的醋酸鈉 緩沖溶液和150 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配 制200 μ 1含有30mM硫酸鈉的PRK5_MathI-EGFP質(zhì)粒，向其中加入200 μ 1上述殼聚糖的醋 酸鈉溶液，迅速混合60秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒 的納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為210nm，分散指數(shù)為0. 21 ；zeta電位分析儀測定 其 zeta 電位為 20. 01 士 1. 46 (mV)，包封率為 92. 7 %。實施例9:將400 μ g/ml的N-(2-羥基)丙基_3_三甲基氯化銨殼聚糖PBS緩沖溶液和 100 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配制200 μ 1 含有30mM硫酸鈉的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒，并向其中加入200 μ 1的上述N- (2-羥基) 丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖PBS溶液，迅速混合60秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得 到N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒的納米混懸液。動 態(tài)光散色測定其粒徑為123nm，分散指數(shù)為0. 18 ；zeta電位分析儀測定其zeta電位為 22. 15士 1. 32(mV)，包封率為 93. 4% 實施例10 將300 μ g/ml的N_(2_羥基)丙基_3_三甲基氯化銨殼聚糖PBS緩沖水溶液和 100 μ g/ml的PRK5-MathI-EGFP質(zhì)粒溶液分別置于37°C水浴恒溫20分鐘。配制200 μ 1含有 5mM硫酸鈉的PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒，并向其中加入200μ 1的上述Ν_(2_羥基)丙基-3-三 甲基氯化銨殼聚糖PBS溶液，迅速混合60秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到N- (2-羥基) 丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒的納米混懸液。動態(tài)光散色測定其 粒徑為165nm,分散指數(shù)為0. 16 ；zeta電位分析儀測定其zeta電位為21. 31 士 1. 46 (mV)，包 封率為94. 1% ο實施例11 將400 μ g/ml的殼聚糖鹽酸鹽溶液和100 μ g/ml的PRK5_Mathl-EGFP質(zhì)粒分別置 于37 °C水浴恒溫20分鐘。配制200 μ 1含有30mM硫酸鈉的PRK5_Math I-EGFP質(zhì)粒溶液，并向 其中加入200 μ 1上述殼聚糖鹽酸鹽溶液，迅速混合60秒后，室溫下繼續(xù)孵育0. 5小時得到 殼聚糖鹽酸鹽-PRK5-Mathl-EGFP質(zhì)粒的納米混懸液。動態(tài)光散色測定其粒徑為142nm，分 散指數(shù)為0. 15 ；zeta電位分析儀測定其zeta電位為30. 12士 1. 32(mV)，包封率為92. 1%.實施例12 殼聚糖-PRK5_MathI-EGFP納米微粒在體外培養(yǎng)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及 Mathl蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染前一天將HEK 293T細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞達(dá)80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)
9染。轉(zhuǎn)染時使用無血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗兩遍，每皿加入37°C預(yù)熱的2ml無血清的DMEM 培養(yǎng)基。將按上述實施例制備的納米混懸液輕輕晃動以充分混勻(殼聚糖納米濃度為4ng/ μ 1)，然后向每培養(yǎng)皿加入300 μ 1納米溶液，輕輕晃動培養(yǎng)皿以充分混勻，于37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時。更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)染24-48小時。收集于36. 5°C 士0. 5°C培養(yǎng)72小時的293T細(xì)胞(約IO7個)，用Trizol法提取 RNA。加入30 μ 1 DEPC水溶解RNA，取2 μ 1用紫外分光光度計測定RNA含量后，于_80°C的 冰箱中凍存RNA。PCR 擴(kuò)增模板變性于65°C將上述步驟中制備的RNA加熱5min以熔化二級結(jié)構(gòu)，然后在冰 上立即冷卻。模板變性反應(yīng)體系 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 充分混勻后進(jìn)行下述反應(yīng)501反應(yīng)601^11，71反應(yīng)5min，加入1 μ 1的RNase H， 于37。C反應(yīng)20min。將獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者于-20°C 凍存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)，95 °C變性45sec，58°C復(fù)性45sec， 72°C延伸lmin，共40個循環(huán)，然后72°C延伸5min，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行下一步反應(yīng)或者 于-20°C凍存。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如圖6可見，Math 1基因能夠在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行翻譯，產(chǎn)生Math 1蛋白。進(jìn)一步地，如圖7可見，經(jīng)過殼聚糖-PRK5_MathI-EGFP納米顆粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞 能夠表達(dá)Mathl-EGFP基因，表明殼聚糖_PRK5_MathI-EGFP納米顆粒能夠把目的基因運送 到活細(xì)胞中去并獲得表達(dá)。實施例13 殼聚糖-Mathl基因納米微粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的wistar大鼠耳蝸組織將出生后3天的Wistar大鼠迅速浸過酒精，斷頭，取出聽泡；將取下的耳蝸組織迅 速放入4°C Hank' s緩沖液中；分離耳蝸組織，去除螺旋韌帶及血管紋；將基底膜分為基層、 中層及頂層三段；24孔培養(yǎng)板上加入含10% FBS的DMEM ；小心將基底膜組織平鋪于培養(yǎng)板 上；小心放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中；隔日換液；培養(yǎng)6天后，基底膜組織貼壁良好，轉(zhuǎn)染時用無血清的DMEM洗兩遍，每皿加入37 °C 預(yù)熱的3ml無血清的DMEM ；將實施例制備的殼聚糖納米溶液充分輕輕混勻(殼聚糖納米濃 度為4ng/y 1)；每培養(yǎng)皿加入300 μ 1納米溶液輕輕晃動培養(yǎng)皿使充分混勻；37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6小時后更換3ml含10% FBS的DMEM ；繼續(xù)轉(zhuǎn)染24-48小時觀察結(jié)果。實施例14 殼聚糖-Mathl基因納米微粒經(jīng)圓窗膜穿刺纖維注射轉(zhuǎn)染在體的C57 小鼠耳蝸組織取健康的3周齡黑色C57小鼠，雌雄不限，體重25g 30g，耳廓反射靈敏，雙耳鼓 膜正常，無感染。使用動物用速眠新(846)(長春)按0.3ml/kg體重對小鼠進(jìn)行麻醉，于 37°C保溫袋保溫。麻醉后，在嚴(yán)格無菌條件下，左側(cè)耳經(jīng)背側(cè)進(jìn)路顯露聽泡，在手術(shù)顯微鏡 下用電鉆打開聽泡，暴露圓窗龕。根據(jù)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染水平的實驗優(yōu)化條件，制定活體轉(zhuǎn)染最 佳濃度；稀釋液為人工外淋巴液；將1. 5μ 1殼聚糖-PRK5-Mathl-EGFP基因納米微粒溶液 經(jīng)圓窗膜穿刺緩慢(約5分鐘)注入，然后取一小塊肌肉填塞封閉聽泡打孔處，分層縫合切 口。經(jīng)圓窗膜穿刺纖維注射給藥，給藥方法簡便易行、轉(zhuǎn)染可靠、高效、對內(nèi)耳騷擾比較小。實施例15 殼聚糖-PRK5_MathI-EGFP基因納米微粒轉(zhuǎn)染C57小鼠內(nèi)耳組織的
免疫組化殼聚糖-PRK5-Mathl_EGFP基因納米微粒轉(zhuǎn)染7天后，對小鼠斷頭處理，然后迅速 取出聽泡，用4%的多聚甲醛固定lh，進(jìn)行耳蝸基底膜鋪片；免疫組化染色后于共聚焦熒光 顯微鏡下觀察結(jié)果，激發(fā)光488nm ；表達(dá)Mathl-EGFP的內(nèi)外毛細(xì)胞為綠色熒光。如圖9所 示，內(nèi)外毛細(xì)胞表達(dá)Mathl-EGFP，顯示綠色熒光，因此，殼聚糖_PRK5_MathI-EGFP基因納米 微粒可以有效的轉(zhuǎn)染內(nèi)耳包括內(nèi)外毛細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞并表達(dá)，促進(jìn)毛細(xì)胞再生，可以 用于感音神經(jīng)性耳聾的治療。本發(fā)明不限于以上實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以做出多種改變和變形，在不 脫離本發(fā)明精神的前提下，它們均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種殼聚糖 Math1基因納米微粒，包括殼聚糖和圖4所示的質(zhì)粒，其粒徑為100 250nm，分散指數(shù)為0.15 0.26，zeta電位約為20 40mV，包封率為90 95％。
2.一種殼聚糖衍生物-Mathl基因納米微粒，包括殼聚糖衍生物和圖4所示的質(zhì)粒，其 粒徑為100-250nm，分散指數(shù)為0. 15-0. 26，zeta電位約為20_40mV，包封率為90-95%，該 殼聚糖的衍生物選自殼聚糖季銨鹽、羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽，優(yōu)選殼聚糖季銨鹽，更 優(yōu)選季銨化的N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖。
3.一種殼聚糖-Mathl基因納米微?；驓ぞ厶茄苌?Mathl基因納米微粒的制備方 法，其通過在室溫下將殼聚糖的醋酸鈉溶液或殼聚糖衍生物的PBS溶液與含Mathl基因的 質(zhì)粒的硫酸鈉溶液以濃度比為50 1至1 2進(jìn)行復(fù)凝聚而獲得納米微?；鞈乙?，該含 Mathl基因的質(zhì)粒為圖4所示的質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，包括(1)制備濃度為100-500yg/ml，pH= 5. 5的殼聚糖的醋酸鈉緩沖溶液或濃度為 100-500 μ g/ml的殼聚糖衍生物的PBS緩沖溶液；(2)制備濃度為10-200μ g/ml的含Mathl基因的質(zhì)粒的Na2SO4溶液；(3)等體積混合步驟(1)、(2)的溶液以進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)得到殼聚糖-Mathl基因納米 微?；鞈乙?。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于，所述殼聚糖的分子量是IOOOODa 300000Da,所述殼聚糖的脫乙酰度是80 % 95 %，所述Na2SO4的含量是5_50mM，所述含 Mathl基因的質(zhì)粒為圖4所示的質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于，所述殼聚糖的衍生物是殼聚糖季銨鹽、羧 甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽，優(yōu)選殼聚糖季銨鹽，更優(yōu)選季銨化的N- (2-羥基)丙基-3-三 甲基氯化銨殼聚糖。
7.權(quán)利要求3的方法制備的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為 100-250nm，分散指數(shù)為0. 15-0. 26，zeta電位約為20_40mV，包封率為90-95 %。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或7的納米顆粒在轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞、轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的 耳蝸組織、轉(zhuǎn)染在體耳蝸中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2或7的納米顆粒在感音神經(jīng)性耳聾中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖和/或殼聚糖衍生物-Math1基因納米微粒、其制備方法及其應(yīng)用，該基因納米微粒通過將殼聚糖與含Math1基因的質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)凝聚而制備。該基因納米微粒的粒徑可控、尺寸均一、利于表面修飾、可提高M(jìn)ath1基因的表達(dá)和遞送能力，可以用于由于噪聲、藥物中毒等原因引起的毛細(xì)胞缺失而導(dǎo)致的感音神經(jīng)性耳聾。
文檔編號A61K47/36GK101897975SQ20091023730
公開日2010年12月1日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者任麗麗, 吳雁, 孫建和, 李興啟, 楊仕明, 楊偉炎, 翟所強(qiáng), 胡吟燕, 趙立東, 郭維維, 韓東, 韓東一, 高維強(qiáng) 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院;國家納米科學(xué)中心