專利名稱：：Mg53蛋白預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及MG53蛋白的新用途，尤其是在制備用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：缺血性心肌病是目前造成人類死亡的最主要的原因之一^冠狀動脈粥樣硬化或者血栓造成的血管堵塞，以及冠狀動脈手術(shù)都會造成心肌細(xì)胞的缺血死亡，而目前防止心肌細(xì)胞的缺血死亡的最佳辦法就是恢復(fù)血流。但是在血流恢復(fù)后的一小段時間內(nèi)，由于大量富含氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)的血流進入到缺血區(qū)，會引起缺血區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、鈣離子超載以及有害組分的激活，這些都會進一步加重心肌細(xì)胞的損傷，引起更多的心肌細(xì)胞的死亡，這就是心臟缺血/再灌注損傷。缺血/再灌損傷最常見的后果是引起“心力衰竭”。同時心肌細(xì)胞的死亡還可以引起“心律失常”，“心臟破裂”等并發(fā)癥。缺血預(yù)適應(yīng)是目前發(fā)現(xiàn)的對抗缺血損傷以及再灌注引起的損傷最強有效的心臟保護機制2。缺血預(yù)適應(yīng)是指在長時間的缺血以前，進行幾個短暫的心臟缺血和再灌注的循環(huán)，能夠保護心臟免受后面的長時間缺血和再灌注引起的損傷。除心臟以外，腦、肝臟、腎臟等其他器官中都有缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象3_5。目前已發(fā)現(xiàn)有很多的細(xì)胞信號分子都參與心臟缺血預(yù)適應(yīng)過程，包括促進細(xì)胞生存的激酶(PI3K，Akt以及GSK3i3)6_8以及細(xì)胞內(nèi)的“腳手架”蛋白，Caveolin3(CaV3)9。這些分子的缺失都能夠影響缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用，而它們的蛋白水平或者活性的增加都能夠產(chǎn)生類似于心臟缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用。尤其是其是CaV3這種“腳手架”蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)聚集生存相關(guān)的分子，從而促進其相互的活化。但是以上提到的這些分子都是相對獨立的信號體系，它們之間的聯(lián)系和相互作用，以及調(diào)節(jié)這些信號分子在細(xì)胞內(nèi)的空間和時間分布的因素，目前還沒有研究清楚，但這些因素對于人們了解缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象的機制，從而將其應(yīng)用到臨床卻具有非常重要的意義。MG53是最近發(fā)現(xiàn)的一種在心肌和骨骼肌中特異性表達的蛋白，其氨基酸序列如MG53蛋白氨基酸序列表中的SEQIDNO.1所示。MG53蛋白的制備方法如下先從心臟組織提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫，然后用MG53基因的特異引物進行PCR擴增，將擴增得到的特異條帶連接入測序載體，測序證實其序列的正確性。利用PCR擴增時引物兩端引入的酶切位點將擴增獲得的特異條帶構(gòu)建到真核表達載體pcDNA4/T0/MYCHisB中，用該載體轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，利用載體上的抗性基因Zeocin篩選出穩(wěn)定表達MG53蛋白的細(xì)胞。培養(yǎng)該細(xì)胞系大量擴增表達蛋白，破碎細(xì)胞之后，收集總蛋白，利用MG53的多抗親和純化MG53蛋白，蛋白純度通過PAGE檢測。已有的研究結(jié)果表明，在骨骼肌中MG53能夠作為一種結(jié)構(gòu)蛋白促進細(xì)胞膜損傷的修復(fù)1(1，同時也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)小泡的轉(zhuǎn)運和骨骼肌細(xì)胞再生"’12。目前，有關(guān)MG53的研究都是在骨骼肌內(nèi)進行的，包括細(xì)胞小泡的轉(zhuǎn)運，肌細(xì)胞的再生以及膜修復(fù)等。但是MG53是一種在骨骼肌和心肌內(nèi)特異性表達的蛋白，而且在心肌內(nèi)的表達量大于骨骼肌1CI，因此MG53蛋白很可能在心臟缺血預(yù)適應(yīng)保護作用中扮演著重要的角色。鑒于心血管系統(tǒng)和人類的生命密切相關(guān)，心血管系統(tǒng)疾病又是危害人類健康，威脅人類生命的最主要的原因之一，因此，研究MG53蛋白在心臟缺血預(yù)適應(yīng)保護作用中所起的作用，對于充分開發(fā)其在缺血性心肌病方面的臨床應(yīng)用具有更加重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是公開MG53蛋白的新功能，提供MG53蛋白的一種新的用途，具體是在制備用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物中的用途。缺血/再灌損傷最常見的后果是引起“心力衰竭”。缺血/再灌損傷會引起心肌細(xì)胞的死亡，心肌細(xì)胞的死亡還可以引起“心律失?！?，“心臟破裂”等并發(fā)癥。因此預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷，也能預(yù)防和/或治療心力衰竭、心律失常、心臟破裂。本發(fā)明人經(jīng)過努力的研究證明了MG53蛋白能夠?qū)π呐K缺血/再灌損傷產(chǎn)生保護作用；MG53產(chǎn)生上述保護作用的機制是將兩條重要的IPC(缺血預(yù)適應(yīng))分子通路，即PI3K-Akt-GSK3β通路和CaV3通路，聯(lián)系起來，它通過促進CaV3和PI3K_p85的相互作用，進而活化Akt/GSK3i3通路，產(chǎn)生其保護作用，說明MG53蛋白是這兩條通路相互作用必需的中間分子。本發(fā)明的一個具體實施方案是應(yīng)用大鼠心臟冠狀動脈缺血/再灌(IR)以及缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)與IR結(jié)合的模型研究MG53蛋白與IR和IPC的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPC能夠減少IR引起的心臟損傷標(biāo)志物L(fēng)DH(乳酸脫氫酶)的釋放和心肌梗死的面積，而心肌中MG53的mRNA和蛋白水平隨著IR引起的心臟損傷而下降，這種下降能夠被IPC阻止。說明MG53的下降可能是導(dǎo)致IR損傷的因素，同時它也參與IPC的保護作用。本發(fā)明的另一個實施方案是在體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，利用模擬心臟缺血的缺氧刺激，研究MG53蛋白對心肌細(xì)胞的缺氧損傷產(chǎn)生保護作用。結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，和體內(nèi)的情況一樣，模擬心臟缺血的缺氧刺激也能夠引起心肌細(xì)胞的死亡，同時伴有MG53表達水平的下降；在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中利用腺病毒載體過表達連有綠色熒光蛋白的MG53(GFP-MG53融合蛋白)，可以劑量依賴性地提高細(xì)胞內(nèi)GFP-MG53的表達水平，同時高表達的GFP-MG53能夠?qū)π募〖?xì)胞的缺氧損傷產(chǎn)生保護作用；此外，利用RNA干擾技術(shù)特異性地降低MG53蛋白水平，可以抑制GFP-MG53過表達產(chǎn)生的保護作用。這些結(jié)果都說明MG53蛋白水平與心肌細(xì)胞的生存率成正比。本發(fā)明還有一個實施方案是利用MG53基因敲除的小鼠來進一步研究MG53對于心臟IPC的作用。該實施方案中所用的MG53基因敲除小鼠的心臟沒有MG53的表達1(1，所用的8周的小鼠心臟，無論是在形態(tài)學(xué)還是功能學(xué)方面，都和正常小鼠沒有明顯的差別。研究結(jié)果表明，體外灌流的正常小鼠心臟中，IPC能夠減小IR引起的心臟損傷標(biāo)志物L(fēng)DH的釋放和心肌梗死的面積；但是在MG53敲除的小鼠中，不但IR引起的損傷更加嚴(yán)重，而且IPC的這種保護作用也消失。已知MG53蛋白能夠幫助修復(fù)骨骼肌細(xì)胞的膜損傷1(1，但是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，IPC在正常小鼠心臟中減少了心肌細(xì)胞的凋亡，但在MG53敲除的小鼠中這種保護作用消失了，說明MG53蛋白還參與了IPC的抗凋亡保護作用。此外，過表達的MG53蛋白可以抑制缺氧引起的細(xì)胞凋亡，一種沒有膜損傷的細(xì)胞死亡，這就說明除了膜修復(fù)外，肯定還有其他機制參與MG53的心臟保護作用。本發(fā)明中，研究上述MG53保護心臟缺血/再灌損傷機制的一個實施方案是研究MG53與兩種重要的細(xì)胞生存分子Akt和其下游因子GSK30之間的相互關(guān)系。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中利用腺病毒載體過表達GFP-MG53，其結(jié)果表明，GFP-MG53的過表達可以增加Akt和其下游因子GSK30的活化；同時發(fā)現(xiàn)在正常的小鼠心臟中，IPC能夠增加Akt和GSK33的活性；而在MG53基因敲除的小鼠心臟中，Akt和GSK33的活性比正常小鼠要低，而且IPC也不能引起這兩個分子的活化。上述MG53活化Akt和GSK30的機制可通過本發(fā)明的另一個實施方案來闡明?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)一種重要的“腳手架”分子CaV3能夠把很多分子聚集到其周圍，介導(dǎo)其相互作用9’13，特別是能夠和Akt/GSK30的上游分子PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85相互作用，從而活化整個信號通路13，本實施方案表明，MG53也能夠和CaV3相互作用；而在MG53基因敲除的小鼠的心臟中，CaV3卻不能再和PI3K-p85相互作用。另一方面，利用RNA干擾技術(shù)降低CaV3的表達，不但可以抑制MG53的保護作用，而且可以抑制MG53過表達引起的Akt/GSK30的活化。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，也發(fā)現(xiàn)CaV3主要分布在正常心肌細(xì)胞膜周圍，少量的PI3K-p85在細(xì)胞膜周圍和CaV3共定位，而IPC可以促使更多的PI3K_p85到細(xì)胞膜周圍和CaV3共定位進而增加PI3K的活性；然而，在MG53基因敲除的小鼠心臟中，無論有無IPC，PI3K-p85都不能和CaV3在膜周圍共定位，同時PI3K的活性也比正常小鼠的心臟中低。通過westernblot方法測得正常小鼠心臟中的PI3K_p85和CaV3蛋白水平與MG53基因敲除小鼠心臟中的PI3K-p85和CaV3蛋白水平?jīng)]有差異，在此前題下，本實施方案的上述實驗結(jié)果清楚地顯示了CaV3通過MG53蛋白的介導(dǎo)而使Akt/GSK3^活化的機制，也充分說明了MG53蛋在保護心臟免受缺血/再灌損傷的過程中所起的重要作用。以上所述證明了在心肌中表達的MG53蛋白具有一種新的功能，即MG53蛋白參與了IPC的過程，從而對心臟缺血/再灌損傷產(chǎn)生保護作用，該功能為制備一種心臟的保護藥物提供了新的支持證據(jù)，MG53蛋白在進行某些改造使其能夠進到細(xì)胞內(nèi)以后，就能夠保護缺血/再灌等因素造成的心臟損傷，從而成為一個藥物設(shè)計的潛在靶點。作為目前最強大而有效的心肌缺血/再灌損傷的保護手段，缺血預(yù)適應(yīng)具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景，而本發(fā)明大大加深了人們對于缺血預(yù)適應(yīng)的機制的認(rèn)識，尤其是MG53蛋白不僅本身具有參與缺血預(yù)適應(yīng)過程的功能，而且是聯(lián)系其他IPC分子通路使其相互作用所必需的中間分子，從而為臨床上更好的應(yīng)用缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象提供了可能。因此，本發(fā)明的一個方面涉及MG53蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物中的用途。其中所說的疾病包括心力衰竭和心律失常、心臟破裂等并發(fā)癥。本發(fā)明另一方面涉及用于預(yù)防和/或治療心臟缺血損傷的藥物，它包括作為活性成分的經(jīng)修飾的MG53蛋白以及藥用的賦型劑或載體。作為一種預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷的藥物，MG53蛋白可以從兩個方面應(yīng)用于臨床。一個方面是通過對MG53蛋白添加某些能夠使其進入細(xì)胞的標(biāo)簽(如TAT)，或者構(gòu)建能夠過表達MG53蛋白的載體(如缺陷型腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒)，然后利用常規(guī)的藥物制備方法，采用藥用的賦型劑或載體將其制成針劑，而后注射到心臟局部或冠狀動脈中，可以提高心肌細(xì)胞內(nèi)MG53的水平，激活其下游的生存信號，對心臟缺血產(chǎn)生保護作用。另一個方面是根據(jù)本發(fā)明所證實的MG53蛋白所具有的新功能，對新型化合物進行篩選，選擇能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MG53表達的化合物作為藥物，也可以起到保護心臟缺血的作用。圖1大鼠心臟缺血/再灌(IR)和缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)結(jié)合IR的模型示意圖(a)，以及大鼠心臟IR、IPC結(jié)合IR與其血液中LDH濃度(b)、心肌梗死面積(c)、MG53的mRNA(d)和蛋白水平(e)的關(guān)系；圖2體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中缺氧與MG53蛋白表達(a)、心肌細(xì)胞死亡(b)的關(guān)系，以及GFP-MG53過表達(c)對心肌細(xì)胞的保護作用(d、e、f)；圖3正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟中MG53蛋白的表達(a)、心臟形態(tài)(b)、IR損傷以及IPC保護作用(c、d、e)的比較；圖4用westernblot方法檢測的在體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中，GFP-MG53過表達對細(xì)胞內(nèi)Akt(a)和GSK33分子(b)的活化作用，以及在正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟中，IPC對Akt(c)和GSK33分子(d)活化的影響；圖5體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中，MG53蛋白與CaV3蛋白的免疫組織化學(xué)染色(a)和免疫共沉淀(b)結(jié)果；正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟中，PI3K-p85與CaV3的免疫共沉淀的結(jié)果(c)；體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中，CaV3蛋白的水平與GFP-MG53過表達對心肌細(xì)胞的保護作用(d)，以及與GFP-MG53過表達引起的Akt和GSK33的活化的關(guān)系(e)；正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟中，PI3K-p85與CaV3的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果(f)，以及IPC對該結(jié)果的影響(g)；圖6用westernblot方法檢測的正常小鼠和MG53基因敲除小鼠心臟中PI3K-p85(左圖)和CaV3(右圖)的蛋白水平。具體實施例方式實施例1MG53蛋白對心臟缺血/再灌損傷的保護作用目的利用大鼠的心臟缺血/再灌(IR)和缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)結(jié)合IR的模型研究MG53蛋白表達的變化在該兩個過程中的作用。材料和方法每個模型的實驗選用兩組各為8只一組的SD大鼠(200_250g)分別作為實驗組和對照組。實驗組的大鼠用戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉以后，正中開胸，結(jié)扎冠狀動脈前降支45分鐘后松開，制作心臟缺血/再灌模型。缺血預(yù)適應(yīng)模型是在45分鐘的冠狀動脈結(jié)扎以前，進行5分鐘的冠狀動脈結(jié)扎和5分鐘的冠狀動脈再灌的短周期，共重復(fù)4次短周期。對照組(Sham)的大鼠除了不進行冠狀動脈結(jié)扎以外，其余操作同實驗組。血清中乳酸脫氫酶(LDH)的濃度利用Sigma公司的試劑盒進行測量，心臟梗死面積的測量是利用Alcian染料結(jié)合TTC染色進行測量，MG53的mRNA和蛋白的含量分別采用實時定量PCR和免疫印跡進行測量。結(jié)果和討論圖1的a是大鼠心臟缺血/再灌(IR)和缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)結(jié)合IR的模型示意圖。圖1的b、c、d、e中，IR代表心臟缺血/再灌模型，IPC+IR代表缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)結(jié)合IR的模型，3-tubulin(日-微管蛋白)代表內(nèi)參照物，圖中所示的結(jié)果是由每組8只動物所得的平均數(shù)據(jù)。由圖的b、c可以看出大鼠缺血/再灌可以引起血清內(nèi)心肌損傷的標(biāo)志物乳酸脫氫酶(LDH)濃度和心臟的梗死面積增加，通過缺血預(yù)適應(yīng)可以抑制血清乳酸脫氫酶濃度的增加和減少心臟的梗死面積；而圖1的d和e分別從mRNA和蛋白水平表明在缺血/再灌損傷的心肌組織中，MG53的表達和含量下降，而受到缺血預(yù)適應(yīng)保護的缺血/再灌損傷的心肌組織中，MG53的下降受到了阻止。以上實驗結(jié)果證明了MG53的下降可能是導(dǎo)致缺血/再灌損傷的因素，并且證明了MG53參與了缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用。實施例2MG53蛋白對心肌細(xì)胞的缺氧損傷的保護作用目的在細(xì)胞水平探討MG53表達的增加與心肌細(xì)胞缺氧損傷的之間的關(guān)系。材料和方法選用SD大鼠的1天齡幼鼠，采取酶消化的方式由其心臟獲得大鼠心肌細(xì)胞，然后利用能夠過表達MG53的缺陷腺病毒感染該心肌細(xì)胞以提高MG53的水平；同時還利用RNA干擾技術(shù)來降低MG53蛋白的水平。細(xì)胞的死亡采取DNA梯度和細(xì)胞ATP含量的方法進行檢測。結(jié)果和討論圖2b顯示缺氧能夠引起心肌細(xì)胞的死亡，而且隨著缺氧時間的延長，死亡的心肌細(xì)胞逐漸增多；而細(xì)胞內(nèi)MG53蛋白的水平同體內(nèi)的實驗相似，也隨著缺氧時間的延長而逐漸降低(圖2a)；圖2c說明表達GFP-MG53融合蛋白的腺病毒能夠提高體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)的MG53的水平；通過圖2的d和e，可以看出缺氧能夠引起心肌細(xì)胞的死亡，而過表達MG53以后，能夠減少缺氧引起的心肌細(xì)胞的死亡；利用RNA干擾技術(shù)降低MG53的水平(圖2f右)以后，其保護作用就消失了(圖2f左)。圖2中3-￡1(^111(日-肌動蛋白)、6六011(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)參照物；Adv(Adenovirus)表示腺病毒，Adv-GFP、Adv-GFP-MG53分別代表GFP的復(fù)制缺陷型病毒表達系統(tǒng)和GFP-MG53的復(fù)制缺陷型病毒表達系統(tǒng)；“+”、“_”分別表示圖的左側(cè)所示條件的“存在”和“不存在”；Scramble-shRNA代表的是對照短RNA，是一種非特異性的短RNA，用來排除非特異性的短RNA干擾的效應(yīng)。以上實驗結(jié)果清楚地表明了MG53的過表達與缺氧引起的心肌細(xì)胞死亡之間的關(guān)系，從而說明MG53能夠保護缺氧引起的心肌細(xì)胞的損傷。實施例3MG53蛋白參與IPC的抗IR引起損傷和抗凋亡的保護作用目的選用MG53基因敲除小鼠的心臟缺血/再灌和缺血預(yù)適應(yīng)模型，進一步證實MG53的作用。材料和方法通過基因敲除得到不含有MG53基因的小鼠，采用8_10周齡的MG53基因敲除的小鼠和與其同齡的正常小鼠進行實驗。實驗的方法是采用體外心臟灌流的方式進行，利用30分鐘停灌而后復(fù)灌達到缺血的效果，缺血預(yù)適應(yīng)是通過2個周期的5分鐘停灌和5分鐘再灌的循環(huán)實現(xiàn)的。心臟的損傷采用梗死面積的測量(方法同實施例1的大鼠)、細(xì)胞凋亡的檢測(TUNEL染色)以及流出液中乳酸脫氫酶(LDH)的濃度進行評價。結(jié)果和討論通過圖3的a可以看出，利用基因敲除技術(shù)獲得的MG53敲除小鼠的心臟中不含有MG53，同時表1和b圖顯示在正常情況下，MG53基因敲除小鼠和正常小鼠的心臟的功能和形態(tài)沒有差別。圖3的c、d和e圖分別通過乳酸脫氫酶濃度、心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色法)的檢測證明，在正常小鼠的心臟中，缺血/再灌能夠引起心臟的損傷，而缺血預(yù)適應(yīng)能夠減少損傷。但是在MG53基因敲除的小鼠的心臟中，缺血/再灌能夠造成比正常小鼠更嚴(yán)重的損傷，而且缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用也消失了。從而說明MG53是心臟對抗缺血/再灌損傷的重要分子，同時也是缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用中必需的分子。表1左心室功能和形態(tài)指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1所得數(shù)據(jù)為8只基因敲除小鼠和8只正常小鼠所得數(shù)據(jù)的平均值表1和圖3中，wt代表正常小鼠；mg53-/_代表MG53基因敲除小鼠；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)參照物。圖3的a、b所示的結(jié)果為4只基因敲除小鼠和4只正常小鼠所得數(shù)據(jù)的平均值；c、d、e、f所示的結(jié)果為8只基因敲除小鼠和8只正常小鼠所的數(shù)據(jù)的平均值。實施例4MG53蛋白保護心臟缺血/再灌損傷的機制目的研究MG53蛋白對心臟保護的分子機制。材料和方法本實施例中所用的心肌細(xì)胞同實施例2，用攜帶GFP-MG53基因的復(fù)制缺陷腺病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，使GFP-MG53過表達；MG53基因敲除小鼠和正常小鼠的心臟缺血/再灌和缺血預(yù)適應(yīng)模型的制備如實施例3所述。然后用超聲破碎組織的方法提取蛋白后，利用Westernblot方法檢測細(xì)胞中的相應(yīng)分子。結(jié)果和討論通過圖4的a和b的Westernblot分析結(jié)果，可以看出在體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中，利用腺病毒過表達MG53蛋白，能夠增加細(xì)胞內(nèi)重要的生存分子Akt的磷酸化，提高其活性(a)，同時影響其下游分子GSK30(b)，從而激活細(xì)胞內(nèi)的促生存信號通路。在正常小鼠心臟中，同以前的研究一致，通過缺血預(yù)適應(yīng)刺激以后，細(xì)胞內(nèi)的生存通路(Akt/GSK30)得到激活從而發(fā)揮缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用(圖4c和d的左邊)；但是在MG53基因敲除的小鼠心臟中，基礎(chǔ)狀態(tài)下的生存通路Akt/GSK30的活性比正常小鼠低，同時缺血預(yù)適應(yīng)也無法活化該生存通路(圖4c和d的右邊)。以上結(jié)果表明MG53的心臟的保護作用是通過激活細(xì)胞內(nèi)重要的生存通路Akt/GSK30起作用的，在沒有MG53的心臟中，該生存通路的基礎(chǔ)活性以及受到保護因素激活的能力都受到抑制。圖4中，wt代表正常小鼠；mg53-/_代表MG53基因敲除小鼠；p_Akt473、p_GSK3^分別表示磷酸化的Akt473和磷酸化的GSK33。圖4的c和d所示的結(jié)果分別為4只正常小鼠和4只MG53基因敲除小鼠所得實驗數(shù)據(jù)的平均值；對照(con)分別為未經(jīng)缺血預(yù)適應(yīng)刺激的4只正常小鼠和4只MG53基因敲除小鼠所得實驗數(shù)據(jù)的平均值。實施例5MG53蛋白活化Akt和GSK30的機制目的研究MG53是如何激活細(xì)胞內(nèi)的生存通路Akt/GSK33的。材料和方法分別利用體外培養(yǎng)的成年大鼠的心肌細(xì)胞以及小鼠的心臟組織蛋白通過免疫熒光和免疫共沉淀的方法檢測分子間的相互作用。細(xì)胞生存率的檢測和RNA干擾技術(shù)同實施例2，不同之處是使用的RNA干擾序列是針對CaV3分子的。分子共定位的實驗是利用體外灌流的小鼠的心臟，經(jīng)過或不經(jīng)過缺血預(yù)適應(yīng)刺激后，進行切片、免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。小鼠心肌組織中PI3K激酶的活性用Etholon公司的試劑盒進行測量結(jié)果和討論如圖5的a所示，通過用免疫熒光分別對在由同一個大鼠分離的心肌細(xì)胞中的MG53蛋白和CaV3蛋白染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們在細(xì)胞內(nèi)的分布是基本重合的，即能夠共定位。而利用免疫共沉淀的方法進一步證明，這兩種分子在心臟組織中也能夠形成復(fù)合物(圖5b)。這就說明MG53和CaV3在心肌細(xì)胞內(nèi)能夠相互作用，而以前的研究已證明CaV3在心臟中能夠使Akt/GSK3^的上游調(diào)節(jié)分子PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85亞單位在其周圍聚集，增強其活性，因此我們推斷MG53激活A(yù)kt/GSK33的作用可能是通過其與CaV3相互作用實現(xiàn)的。圖5c的上面兩個圖顯示，在正常的小鼠的心臟中，與前面的研究一樣，CaV3能夠和PI3K的p85亞單位形成復(fù)合物(免疫共沉淀)；而有趣的是，在敲除了MG53的小鼠的心臟中，CaV3就不能夠和PI3K的p85亞單位形成復(fù)合物(圖5c下面兩個圖)，這就說明MG53不但是通過CaV3和PI3K_p85亞單位發(fā)揮其作用，而且MG53也是CaV3和PI3K_p85亞單位相互作用所必需的。對于圖5的d，當(dāng)利用RNA干擾的方式減少細(xì)胞內(nèi)的CaV3的含量時(右圖)，我們發(fā)現(xiàn)MG53對于心肌細(xì)胞的保護作用也相應(yīng)的消失了(左圖)。不但如此，細(xì)胞內(nèi)的CaV3的含量降低時，MG53對于Akt/GSK33的活化作用也消失了(圖5的e)，這就進一步證明CaV3是MG53激活細(xì)胞內(nèi)的生存信號進而發(fā)揮其保護作用所必需的分子。圖5的f通過免疫組織化學(xué)技術(shù)制成，它顯示在正常小鼠心臟中，PI3K-p85和CaV3在細(xì)胞的邊緣形成共定位，而缺血預(yù)適應(yīng)使這種共定位增加；而在MG53基因敲除小鼠的心臟中，無論有無缺血預(yù)適應(yīng)，PI3K-p85和CaV3都無法形成共定位；圖5的g是通過ELISA試劑盒檢測的結(jié)果在正常小鼠心臟中，缺血預(yù)適應(yīng)引起PI3K的活性增加，而MG53基因敲除小鼠的心臟中，PI3K的活性比正常小鼠低，同時缺血預(yù)適應(yīng)不能引起其增加。圖5中，裂解物(Lysate)為陽性對照；IP(Immunoprecipitation)、IB(Immunoblot)分別表示免疫沉淀、免疫印跡；CaV3_shRNA代表針對CaV3的短RNA干擾序列；Adv-GFP、Adv-MG53分別表示GFP的復(fù)制缺陷型病毒表達系統(tǒng)和MG53的復(fù)制缺陷型病毒表達系統(tǒng)；p-Akt473、p-GSK3^分別表示磷酸化的Akt473和磷酸化的GSK3^；其余符號和縮寫的含義同前所述。至此，我們發(fā)現(xiàn)了MG53蛋白是在傳統(tǒng)的細(xì)胞生存通路CaV3/PI3K/Akt/GSK33通路中的一個重要的調(diào)節(jié)分子，是這條通路發(fā)揮其保護作用所必需的。實施例6正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟中幾種信號分子的表達的比較目的研究MG53基因敲除小鼠的心臟中幾種信號分子的表達情況。材料和方法采用正常小鼠與MG53基因敲除小鼠的心臟，分別用超聲破碎組織的方法提取蛋白后，利用免疫印跡的方法檢測相應(yīng)分子。結(jié)果和討論圖6的a和b表明，與正常小鼠相比，MG53敲除后的小鼠心臟中PI3K的p85亞單位和CaV3分子的含量都沒有改變，由此可說明MG53對其功能的影響是通過改變其相互作用而實現(xiàn)的。權(quán)利要求MG53蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的心臟缺血/再灌損傷所致疾病為心力衰竭。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的心臟缺血/再灌損傷所致疾病為心率失常。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所說的心臟缺血/再灌損傷所致疾病為心臟破裂。5.用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物組合物，其中包括作為活性成分的MG53蛋白以及藥用的賦型劑或載體。全文摘要本發(fā)明公開了MG53蛋白的新用途，尤其是在制備用于預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物中的用途。MG53蛋白參與了缺血預(yù)適應(yīng)過程，它將兩條重要的IPC(缺血預(yù)適應(yīng))分子通路，即PI3K-Akt-GSK3β通路和CaV3通路聯(lián)系起來，通過促進CaV3和PI3K-p85的相互作用，進而活化Akt/GSK3β通路，對心臟缺血/再灌損傷產(chǎn)生保護作用，為制備一種心臟的保護藥物提供了新的支持證據(jù)，從而可應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療心臟缺血/再灌損傷所致疾病的藥物。文檔編號A61P9/10GK101797375SQ20091024145公開日2010年8月11日申請日期2009年12月2日優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日發(fā)明者張巖,曹春梅,肖瑞平,麻建杰申請人:北京大學(xué)