專利名稱：：一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinaseplasminogenactivator)及尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinaseplasminogenactivatorrec印tor，uPAR)介導(dǎo)纖維蛋白溶解系統(tǒng)在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。隨著uPA、uPAR在癌癥中的作用研究的日益深入，其臨床意義很快受到重視。許多專家認(rèn)為uPA及uPAR是惡性腫瘤的特征，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是一致的。抑制uPA和uPAR的表達(dá)可以減少多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。國內(nèi)外許多研究表明，針對uPAR的抗體可有效地在胞外通過阻斷配體的結(jié)合來實現(xiàn)對uPAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)途徑的抑制，對多種由uPAR過度表達(dá)或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，結(jié)直腸癌，非小細(xì)胞型肺癌等有較好的療效。uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，基因定位于第10號染色體，其mRNA為2.4kb，蛋白分子量為55000。uPA在細(xì)胞合成和分泌時為單鏈無活性的尿激酶原(Pro-uPA)，它與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體uPAR結(jié)合后，Pro-uPA被激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊远蜴I連接的A、B兩條鏈組成的uPA，uPA的A鏈含有EGF樣功能區(qū)，該區(qū)和纖連蛋白及凝血酶原有很高的同源性，可介導(dǎo)uPA和uPAR的結(jié)合。uPAR是由313個氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白，基因定位于第19號染色體，mRNA為1.4kb，相對分子量為4500055000。uPAR結(jié)構(gòu)包括3個同源結(jié)構(gòu)域(D1、D2、D3)，其中Dl含有與uPA結(jié)合的抗原決定族。uPAR使uPA激活并定位于細(xì)胞表面提供了在細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)連接處的局部集中機(jī)制，為表達(dá)uPAR的腫瘤細(xì)胞提供了uPA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解的有利環(huán)境。uPA與uPAR結(jié)合后可以促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制尚不完全明了。目前普遍認(rèn)為，uPA與uPAR結(jié)合后，可以激活纖溶酶系統(tǒng)，使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的多種成分降解，引起蛋白裂解的級連反應(yīng)，基底膜產(chǎn)生灶性和直接的蛋白裂解，從而使腫瘤細(xì)胞穿透正常組織屏障，引起腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。同時，uPA與uPAR結(jié)合后還可以引起細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重塑及特異性角蛋白磷酸化等效應(yīng)。Ploug認(rèn)為在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移引起的重組事件中，uPAR常常被上調(diào)，與多種基質(zhì)金屬蛋白酶(匪P)相互作用，以利于蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)。Andreasen等認(rèn)為，uPA不僅通過降解細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤浸潤中發(fā)揮作用，并在腫瘤細(xì)胞引起的組織重塑中發(fā)揮作用，還可以通過不依賴于纖維蛋白溶解酶系統(tǒng)的機(jī)制引起腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，其中包括uPA、uPAR、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及生長因子等多因素相互作用，這種相互作用允許該系統(tǒng)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，在時間和空間上重新組織，選擇性地降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種可與尿激酶型纖溶酶原激活物受體結(jié)合的抗體及其編碼基因。本發(fā)明所提供的抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。上述抗體的重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列4自5'末端起第157-171bp和261-283bp位核苷酸具有70X以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；上述抗體的輕鏈的編碼基因為如下i)、n)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列2自5'末端起第160-184bp和217_250bp位核苷酸具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子。所述抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)組成，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述重鏈恒定區(qū)的編碼基因為如下a)、b)或c)所示a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子；c)與序列表中序列IO所示DNA分子具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對為如下引物對1)—條引物序列如序列表中序列5所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列6所示；2)—條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列8所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述抗體的方法。本發(fā)明所提供的制備上述抗體的方法，是將上述任一所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。所述方法中，是通過重組表達(dá)載體將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞中的；所述重組表達(dá)載體中既含有上述重鏈可變區(qū)的編碼基因又含有上述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調(diào)控。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑。本發(fā)明所提供的制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑，其活性成分為上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑。本發(fā)明所提供的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑，其活性成分為上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述腫瘤具體可為宮頸癌；上述腫瘤細(xì)胞具體可為宮頸癌HeLa細(xì)胞。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和力為1.74X10—8mol/L)和抑制腫瘤細(xì)胞生長遷移能力。本發(fā)明的人源化抗體能更好與uPAR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接近l:l，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。圖1為輕鏈基因、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。圖2為抗uPAR人源化抗體的pIRES表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為抗uPAR人源化抗體的還原型SDS-PAGE檢測。圖4為抗uPAR人源化抗體與uPAR的親和力檢測圖。圖5為ELISA檢測抗體表達(dá)結(jié)果。圖6為免疫印跡分析結(jié)果。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、抗體的輕鏈編碼基因和重鏈可變區(qū)編碼基因的獲得根據(jù)計算機(jī)模擬，以鼠單克隆抗uPAR抗體為模板，對其鼠源FR表面基因進(jìn)行人源化改造而設(shè)計合成輕鏈序列L2和重鏈可變區(qū)序列S2H。輕鏈L2的氨基酸序列如序列表中序列l(wèi)所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；重鏈可變區(qū)S2H的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。重鏈恒定區(qū)的6氨基酸序列如序列表中序列9所示，重鏈恒定區(qū)的編碼基因序列如序列表中序列10所示。通過引物對2L/2LR，采用重疊延伸PCR的方法，擴(kuò)增得到輕鏈的編碼基因序列；通過引物對2H/2HR，采用重疊延伸PCR的方法，擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)的編碼基因序列。輕鏈(U弓|物2L:CGGATCCGCTAGCCGCCACCATGGACATCCAGATGACTCAGTCCCCATCTACTCTGTCTGCTTCCGT(序列5)2LR:CGGAATTCTCAGGAACTCCAGTAGCGCGAGAGGAAGCCTCGTACATCAGT(序列6)重鏈(H)可變區(qū)引物2H:GTGTCTAGAGCCGCCACCATGGAGGTTCAGCTGGTTCAGTCCGGTGCT(序列7)2HR:GTGGGATCCACTTACCTGTCTTAGGCTCAACCTTCTTGTCAACCTTAGT(序列8)將擴(kuò)增得到的各片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，結(jié)果與預(yù)期大小一致，L和H片段大小分別約為735bp和770bp(圖l，M.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A:泳道2為輕鏈基因產(chǎn)物L(fēng)2;B:泳道1為重鏈可變區(qū)基因S2H);將獲得的L2和S2H片段分別克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測序鑒定。結(jié)果表明，獲得片段的序列正確，將含有正確的L2的重組載體記作pMD18-T/L2，將含有正確的S2H的重組載體記作pMD18-T/S2H。將輕鏈L2、重鏈可變區(qū)S2H、重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的抗體記作S2。實施例2、抗體的表達(dá)與純化—、重組表達(dá)載體的構(gòu)建pIRES雙表達(dá)載體購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號為631605;pMD18-T表達(dá)載體購自TakaraBioCompany,產(chǎn)品目錄號為D504CA.載體pIRES-Anti-CD20(《抗CD20嵌合抗體的表達(dá)和活性檢測》，中國生物工程雜志(chinabiotechnology)，2005，25(7):34-39.)(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)。將重組載體pMD18-T/L2和pIRES雙表達(dá)載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(NheI和EcoRI)酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段；將輕鏈基因片段L2與載體片段混勻，在連接試劑的作用下，16t:反應(yīng)12h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測序鑒定，結(jié)果該重組表達(dá)載體中基因的插入方向正確及插入序列正確，記作重組表達(dá)載體pIRES/L2?？寺∮兄劓満愣▍^(qū)基因的pMD18-T載體用BamHI和NotI酶切pIRES-Anti-CD20，回收重鏈恒定區(qū)片段，克隆于亦用BamHI和NotI酶切的pMD18-T載體，測序鑒定，得到正確的克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pMD18-T載體。以重組表達(dá)載體pIRES/L2為模板，用XbaI和NotI酶切，回收載體大片段，記作片段1;以克隆有重鏈可變區(qū)基因的pMD18-T載體(即pMD18-T/S2H)為模板，用XbaI和BamHI酶切，回收重鏈可變區(qū)片段，記作片段2;以克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pMD18-T載體為模板，用BamHI和NotI酶切，回收重鏈恒定區(qū)片段，記作片段3;將片段1、2和片段3連接，得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測序鑒定。結(jié)果表明，得到的重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)正確，插入的基因的方向及順序正確；抗體的輕重鏈基因共用同一個啟動子，通過IRES序列連接，最終構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒。將陽性重組表達(dá)載體記作pIRES-Anti-uPAR(圖2)。二、載體轉(zhuǎn)化及抗體的表達(dá)293T細(xì)胞(293T人胚腎T細(xì)胞)購自美國菌種保藏中心(Americantypeculturecollection，ATCC，又稱美國模式菌種收集中心)，產(chǎn)品目錄號為CRL-11268;Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為12566014;HyQSFM4CH0培養(yǎng)基購自HyClone公司，產(chǎn)品目錄號為SH30518.02;rProteinA層析柱購自購自GEHealthcare公司，產(chǎn)品目錄號為17-5080-01。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，產(chǎn)品目錄號為12100-046;山羊抗人-IgG-HRP抗體購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為046K4801。將293T細(xì)胞按1X107ml分別接種于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中裝有含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37t:、5X0)2孵箱，培養(yǎng)。取5yg步驟一中得到的質(zhì)粒pIRES-Anti-uPAR轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體操作參照Lipofectamine2000的試劑說明。得到重組細(xì)胞293T-pIRES-Anti-uPAR。將重組細(xì)胞293T-pIRES-Anti-uPAR用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)68h后吸出無血清培養(yǎng)基，代之以HyQSFM4CH0培養(yǎng)基。相同條件下繼續(xù)共培養(yǎng)84h，間隔12h收取一次細(xì)胞上清，用ELISA法初步檢測抗體的表達(dá)。擴(kuò)大轉(zhuǎn)染體系，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清45L，調(diào)pH至6.07.0，用0.45iim濾膜過濾，再用rProteinA層析柱純化抗體，具體操作參見產(chǎn)品說明書。ELISA法用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法1.包被用0.05M0碳酸鹽包被緩沖液將抗體(一抗為山羊抗人IgG)稀釋至蛋白質(zhì)含量為110yg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加O.lml，4。C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。2.加樣加一定稀釋的待檢樣品0.lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37。C孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。3.加酶標(biāo)抗體(二抗為山羊抗人IgG-HRP(山羊抗人IgG-辣根過氧化物酶))于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.lml。37t:孵育0.51小時，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.lml，37°C1030分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"-"號表示。也可測0D值在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔0D值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2.1倍，即為陽性。試劑(1)包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):Na2C031.59克，NaHC032.93克，加蒸餾水至lOOOrnl。(2)洗滌緩沖液(PH7.4PBS):0.15M:KH2P040.2克，Na2HP0412H202.9克，NaCl8.0克，KC10.2克，Tween-200.05%0.5ml，加蒸餾水至1000ml。(3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。(4)終止液(2MH2S04):蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。結(jié)果如圖5所示，圖5中，Al為空白對照，A2-A12為重組表達(dá)載體pIRES-Anti-uPAR瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，不同細(xì)胞培養(yǎng)皿表達(dá)的S2抗體。結(jié)果表明pIRES-Anti-uPAR在293T細(xì)胞獲得表達(dá)，得到目的蛋白S2抗體。盡管不同細(xì)胞培養(yǎng)皿表達(dá)量有差異，這可能與轉(zhuǎn)染時細(xì)胞狀態(tài)和載體量等因素有關(guān)。用rProteinA層析柱純化抗體純化介質(zhì)HiTraprProteinAFF，5ml，購自GE公司，目錄號17-5079-01，詳細(xì)使用說明書請參閱其公司提供的說明書。操作1)清洗，用1MNaOH和ddH20先后清洗管道，將小濾器用0.1MNaOH煮沸l(wèi)Omin后再用ddH20浸泡12min;2)設(shè)定程序，連接rProteinA親和層析柱；3)用20mM結(jié)合緩沖液(pH7.0)平衡層析柱；4)將已制備好的細(xì)胞上清以12ml/min的流速上樣；細(xì)胞上清制備以12000g離心15分鐘，取出上清，經(jīng)過0.22um硝酸纖維素濾膜過濾除菌。5)上樣將要結(jié)束時用1M洗脫緩沖液(pH3.0)洗脫目的蛋白；6)收集蛋白，用Trise堿(pH9.0)將其pH調(diào)至7.0，電泳檢測；7)按步驟1)清洗管道和小濾器。磷酸鈉鹽緩沖液(結(jié)合緩沖液)用作ProteinA純化的結(jié)合緩沖液。配制方法為取1MNa2HP0457.7ml和1MNaH2P0442.3ml混勻，即為0.1MpH7.0的磷酸鈉鹽緩沖液100ml，再用蒸餾水稀釋至20Mm備用。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(洗脫緩沖液)用作ProteinA純化的洗脫緩沖液。配制方法為取0.IM檸檬酸186ml和0.IM檸檬酸鈉14ml混勻，即為0.1MpH3.0的檸檬酸鹽緩沖液200ml。分別取15ii1純化抗體S2在12%凝膠上進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮蘭R-250染色。結(jié)果顯示，純化所得抗體的重鏈的相對分子質(zhì)量分別為50X103，輕鏈的相對分子質(zhì)量為25X103(圖3中，泳道2為抗體的重鏈和輕鏈，泳道1為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，與預(yù)期結(jié)果一致。Rituxan(藥名美羅華)(通用名利妥昔單抗注射液)購自上海羅氏制藥有限公司，制造商F.Hoffmann-LaRocheInc.免疫印跡分析實驗分別取15ii1純化抗體在12%凝膠上進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出膜用封閉液(含有5%脫脂奶粉的1XPBST)在室溫封閉2h，用1:5000稀釋的羊抗人IgG-HRP抗體與之孵育2h(室溫)，再用1XPBST洗膜3次。最后用ECL顯色，用X線片進(jìn)行曝光。結(jié)果如圖6所示(1是標(biāo)準(zhǔn)品Rituxan;2是S2抗體)。結(jié)果表明獲得的S2抗體可與羊抗人IgG特異性結(jié)合。分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致。實施例3、抗體的功能—、Biacore檢測人源化抗體S2與抗原的結(jié)合能力uPAR蛋白購自R&DSystems,產(chǎn)品目錄號為807-區(qū)-100。SensorChipCM5購自BD公司，產(chǎn)品目錄號為Br-1000-14;BDBioCoatMatrigelInvasionChamber購自BD公司，產(chǎn)品目錄號為354480.用Biacore3000設(shè)備測定抗體S2與uPAR的親和力。配制不同pH值(4.0，4.5，5.0和5.5)的10mmol/LNaAc稀釋uPAR蛋白，在CM5芯片上做預(yù)濃縮，選擇最適pH值的NaAc稀釋蛋白。將純化的抗體共價偶聯(lián)于CM5傳感芯片上，流動相為HBS-EP(pH7.4)，流速20iil/min，取抗體五種濃度(0，12.5，25、50和100nmol/L)與uPAR蛋白結(jié)合親和力的檢測。親和力用Biacore3000附帶軟件計算。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。將純化的抗uPAR人源化抗體S2與抗原uPAR結(jié)合，Biacore檢測其結(jié)合能力，結(jié)果顯示S2與抗原的親和力為1.74X10-W/L(圖4)。二、腫瘤細(xì)胞侵襲實驗HeLa細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(Americantypeculturecollection,ATCC，又稱美國模式菌種收集中心)，產(chǎn)品目錄號為CCL-2;人IgG購自北京新經(jīng)科生物技術(shù)公司，產(chǎn)品目錄號為30101;用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。用無血清DMEM水化侵襲室(invasionchamber)，孵育2h(37。C，5^C0》。棄無血清DMEM，在侵襲室的孔室加入750ii1DMEM(含10X血清);在插入(insert)室中加入475iUDMEM(含1%血清)，然后向其中加入25消化的HeLa細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)>1075001)，最后分別向插入室中加入陰性對照人IgG和人源化抗體S2，每個樣品均有兩個復(fù)孔，抗體終濃度均為100ng/ml。孵育24h后，將未能穿透侵襲盒基底膜的細(xì)胞用無菌棉簽擦去；穿透基底膜的細(xì)胞固定、染色、室溫晾干后，光鏡計數(shù)。統(tǒng)計學(xué)處理在100倍顯微鏡下計算每個插入室中樣品的相應(yīng)3組細(xì)胞數(shù)。運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件對細(xì)胞侵襲實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，將S2組與人IgG組比較。若結(jié)果為P<0.05，兩種處理效果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。t檢驗分析結(jié)果顯示(表l):人IgG組與S2組的P值小于0.01，抗uPAR抗體S2與對照組人IgG組相比，差異顯著，對HeLa腫瘤細(xì)胞的侵襲具有顯著的抑制作用。表1、細(xì)胞侵襲實驗的t檢測結(jié)果組別n細(xì)胞平均數(shù)(個)人IgG組8146±16.531S2組876±26.937*注與人IgG組對比，*P<0.01;序列表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所〈120〉一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因與應(yīng)用〈160>10〈210>1〈211>237〈212>PRT〈213>人工序列10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>〈400>20153]gtgtct卿gccgccaccatggattttcag0154]gctegcgtcateatgtccagaggagacatc0155]gcttccgttggcgaccgtgtteccatcact0156]cactggteccagc朋朋gccgggtcgtgct0157]cgcgctectggagttccatctcgcttctct0158]actetctcctctctgcagagcgacgacttc0159]ccattcactttcgg織gggtecteagctg0160]gttttcatcttcccaccgtccgacgagcag0161]ctgctgaacaatttctecccgcgcgaggct0162]cagtccggteactcccaggagtctgttect0163]ctgtcctcaactctgactctctcteaggct0164]gaggttectcaccagggtctgtcctctcca0165]〈210>30166]〈211>2340167]〈212>PRT0168]〈213〉人工序列0169]〈220〉0170]〈223〉0171]〈400>30172]ValSerArgAlaAlaThrMetGly0173]150174]ValAlaValAlaThrArgValLeu0175]200176]GlyAlaGluValLysLysProGly0177]35400178]AlaSerGlyTyrThrPheThrAsp0179]5055:0180]AlaProGlyGinGlyLeuGluTrp:0181]6570:0182]AspAsnThrGluTyrAsnAspAla:0183]85:0184]AlaAspGluSerThrSerThrAla:0185]100:0186]SerGluAspThrAlaValPheTyr:0187]115120:0188]TyrPheAspAlaTrpGlyArgGly:0189]130135:0190]SerThrLysGlyProSerValPhe9/13頁gtgcagattetcagcttcctgcteatcagt60cagatgactcagtccccatctectctgtct120tgccgtgcttctegctccgtttcttecatc180ccgaagccactgatgtecgaggcttcctct240ggttccggttctggcactgagtecactctg300gctecttectactgccagcagtgg皿ctec360gagatc皿gcgtectgttgctgctccatct420ctgaagtctggcactgcttctgttgtctgc■皿ggttcagtgg皿ggttgacaacgctctg540gagcaggactcteaggactctecttectct600gactecgaga3gC3C皿gCtgtecgcttgc660gttecteagtctttcaaccgt711TrpSerLeulieLeuLeuPheLeu1015SerGluValGinLeuValGinSer2530SerSerValLysValSerCysLys45TyrTyrlieHisTrpValArgGin60lieGlyTrpliePheHisGlySer7580ValLysGlyArgPheSerlieThr9095TyrMetGluLeuSerSerLeuArg105110CysAlaArgTrpGlyProHisTrp125ThrLeuValThrValSerProAla140ProLeuAlaProSerSerLysSer0191]1451501551600192]ThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPhe0193]1651701750194]ProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGly0195]1801851900196]ValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeu0197]1952002050198]SerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyr0199]2102152200200]lieCysAsnValAsnHisLysProSerAsn0201]2252300202]〈210>40203]〈211>7020204]〈212>DNA0205]〈213〉人工序列0206]〈220〉0207]〈223〉0208]〈400>40209]gtgtct卿gccgccaccatgggttggElgCctcatcttgctcttccttgtcgctgttgct600210]acgcgtgtcctgtccgaggttcagctggttcagtccggtgctgaggtteagaagccaggt1200211]tcctctgtteaggtttcttgcaaggcttctggctecactttcaccgactectecatccac1800212]tgggttcgtcaggctccaggccagggtctggagtggatcggttggatcttccacggttct2400213]gac朋cactgagtec朋cgacgctgtteagggtcgtttctccatcactgctgacgagtcc3000214]acttcteccgcttecatggagctgtcctctctgcgttccgaggacactgctgttttctec3600215]tgcgctcgttggggtccacactggtecttcgacgcttggggtcgtggtectctggttect4200216]gtttccccagcttcteccaagggtccatccgttttcccactggctccgtcctcteagtct■0217]actegcggcggtectgccgctctgggttgcctggtteaggactecttcccagagccagtt5400218]actgtttcatggaactcaggtgctctgacttctggcgttcacactttccctgctgttctg6000219]cagtcctctggtctgtecagcctgtcttccgttgtcactgttccgtccagctctctgggt6600220]actcagacatacatctgcaacgtteaccac朋gCC3tCC33C7020221]〈210>50222]〈211>670223]〈212>DNA0224]〈213〉人工序列0225]〈220〉0226]〈223〉0227]〈400>50228]cggatccgctagccgccaccatggacatccagatgactcagtccccatctactctgtctg600229]cttccgt67<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThr65707580TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095LysAlaGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu165170175GluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu180185190HisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGly210215220GinProArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu225230235240LeuThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr245250255ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn260265270AsnTyrLysAlaThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330〈210>10〈211>1795〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>10gctegcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60ggc織gcggccctgggctgcctggtcaaggactecttccccgaaccggtgacggtgtcg120tgg朋ctcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180ggactctactccctcagcagcgtggtg織gtgccctccagcagcttgggcacccagacc240tecatctgca3Cgtg朋tC3caagcccagc皿cacc朋ggtggac皿g皿3gC朋C3ggt300朋gtggatccgg3ggg3gggtgtctgctgg皿gcaggctcagcgctcctgcctggacgca360tcccggctetgcagccccagtccagggragC皿ggC3ggCcccgtctgcctcttcacccg420gaggcctctgcccgccccactcatgctcaggg卿gggtcttctggctttttccccaggc■tctgggcaggcacaggcteggtgccccteacccaggccctgC3C3C皿3ggggc郷tgc540tgggctc卿cctgccaagagccatetccgggaggaccctgcccctgacctaagcccacc600CC3朋ggCC3aactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagt660aactcccaatcttctctctgC3g3gCCC皿atcttgtgaccatgcccacc720gtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctca郷cggg織ggtgcccteg780agtegcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctctt840cctcagcacctgaactcctgggggg紅gtcagtcttcctcttcccccca朋accc朋gg■acaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgg3Cgtgagccacg960朋gaccctgaggtcaagttc朋ctggtecgtggacggcgtggaggtgcat朋tgcc朋ga1020c朋agccgcggg￡lgg￡lgC￡lgcgteccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcc1080tgC3CC3gg3ctggctgaatgg咖ggagtac皿gtgc皿ggtctccaacaaagccctcc1140cagcccccatcgag朋朋ccatctccaaagCC皿3ggtgggacccgtggggtgcg郷gc1200C3C3tgg3C3gaggccggctcggcccaccctctgccctgggagtgaccgctgteccaacc1260tctgtccctecagggcagccCCg3g朋CC3C3ggtgtecaccctgcccccatcccgggat1320g3gCtg3CC33g朋CC3ggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctetcccagcgac1380atcgccgtgg3gtggg卿gc皿tgggcagCCgg3g皿C3actec朋ggccacgcctccc1440gtgctggactccgacggctccttcttcctctecagc朋gctcaccgtggaC朋g3gC3gg1500tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgratgaggctctgcac朋ccactec1560acgcagaagagcctctccctgtctccgggtgacggccggcaagcccccgc1620tccccgggctctcgcggtcgcacgaggatgcttggcacgtaccccgtgtecatecttccc1680gggcgcccagcatgg朋ate朋gC3CCC3gcgctgccctgggcccctgcgagactgtgat1740ggttctttccacgggtcaggccgagtctgaggcctgagtggC￡ltg￡lggg￡lggC3g17951權(quán)利要求一種抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.權(quán)利要求l所述抗體的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下1)、2)或3)所示:1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列4自5'末端起第157-171bp和261-283bp位核苷酸具有70X以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；所述輕鏈的編碼基因為如下I)、II)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列2自5'末端起第160-184bp和217-250bp位核苷酸具有70X以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子；所述抗體中包括重鏈恒定區(qū)；所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述重鏈恒定區(qū)的編碼基因為如下a)、b)或c)所示a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子；c)與序列表中序列10所示DNA分子具有70X以上的同源性且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子。4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下引物對1)一條引物序列如序列表中序列5所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列6所示；2)—條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列8所示。6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。7.—種制備權(quán)利要求1所述抗體的方法，是將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，是通過重組載體將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞中的；所述重組載體中既含有權(quán)利要求2或3所述重鏈可變區(qū)的編碼基因又含有權(quán)利要求2或3所述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調(diào)控。9.一種抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑或一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒。10.權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒在制備抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因與應(yīng)用。該抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和力為1.74×10-8mol/L)和抑制腫瘤細(xì)胞生長遷移能力。本發(fā)明的人源化抗體能更好與uPAR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接近1∶1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。文檔編號A61K39/395GK101704892SQ20091024231公開日2010年5月12日申請日期2009年12月9日優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日發(fā)明者戴維·威孚,曹誠,米歇爾·瑞奇韋茲,靳彥文申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所