專(zhuān)利名稱：一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊及復(fù)合細(xì)胞支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及帕金森病移植治療領(lǐng)域，特別是一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊及復(fù)合 細(xì)胞支架。
背景技術(shù)：
帕金森病(parkinson’ s disease，簡(jiǎn)稱PD)是一種突發(fā)的、緩慢進(jìn)展的中樞神經(jīng) 系統(tǒng)變性疾病，其病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性死亡，臨床特征主 要是動(dòng)作緩慢與缺失、肌肉僵直、靜止性震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)，又名震顫麻痹，是最常見(jiàn)的神經(jīng) 退行性疾病。目前還沒(méi)有能預(yù)防或者徹底治愈帕金森病的方法，治療原則是藥物和手術(shù)治療相 結(jié)合。但帕金森病的藥物治療和外科手術(shù)方法都只能改善部分癥狀，且長(zhǎng)期療效并不樂(lè)觀。 由于帕金森病主要是由黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降所致，因此在 黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)移植能夠分泌多巴胺的細(xì)胞，恢復(fù)多巴胺的神經(jīng)環(huán)路，即成為一種針對(duì) 病因的理想治療方向。自1985年腎上腺髓質(zhì)組織移植首次在臨床應(yīng)用于帕金森治療并取得一定療效 后，經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展，作為一種功能重建性手術(shù)，已成為世界性關(guān)注熱點(diǎn)，加拿大 的D. Doudet報(bào)道了 9只用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)制造的帕金森 病的猴子，在其蒼白球中植入人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)，來(lái)自捐獻(xiàn)者的眼球，經(jīng)過(guò)體 外培養(yǎng)并在其表面包裹了一層抗排斥反應(yīng)的凝膠，結(jié)果顯示一年內(nèi)所有的猴子均有明 顯的改善，PET掃描顯示[18F]-L-dopa(多巴胺)的攝取增加，多巴胺D2受體的示蹤劑 ([llC]-raclopride)結(jié)合位點(diǎn)減少，表明紋狀體多巴胺水平增加。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?“200510123306. 7”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“一種治療老年癡呆癥、帕金森病的神經(jīng)干細(xì)胞注射液” 公開(kāi)一種以人源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為主要成分的注射液，直接注入患者腦組織中病變 部位，并有實(shí)驗(yàn)例數(shù)據(jù)證明該注射液對(duì)帕金森病癥狀的改善有效率達(dá)80%，進(jìn)一步佐證視 網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能在治療帕金森病中發(fā)揮作用。另一方面，該專(zhuān)利申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中提到 腦和脊髓由于血腦屏障的存在使之在干細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反 應(yīng)(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)第4頁(yè)第2行)，同時(shí)傳統(tǒng)觀念也認(rèn)為腦組織具有免疫豁免特性，主要原因有 (1)腦組織缺乏淋巴組織以及淋巴管道，外來(lái)抗原不能引起免疫應(yīng)答；(2)腦組織缺乏抗原 呈遞細(xì)胞，不會(huì)在移植免疫中誘發(fā)同種移植免疫排斥反應(yīng)；C3)腦組織存在血腦屏障，血液 中的抗體以及免疫活性細(xì)胞不能與外來(lái)抗原接觸，便不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)；(4)腦組織缺乏 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原，其在誘發(fā)同種移植免疫排斥反應(yīng)中起重要作用。但是 隨著人們對(duì)腦組織免疫特性的深入研究，腦組織的免疫豁免性受到懷疑，這是因?yàn)?1)腦 內(nèi)血管周?chē)g隙起到淋巴管道的作用；(2)腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮 細(xì)胞在特定情況下可表達(dá)MHC抗原；C3)血腦屏障在某些區(qū)域存在局部組織的損傷導(dǎo)致血 腦屏障的開(kāi)放、淋巴細(xì)胞活化，誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。另外，在移植治療中雖然可以采用自體 細(xì)胞，自體細(xì)胞較少有免疫排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)，但來(lái)源稀少及功能差等缺陷限制了其臨床應(yīng)用，人源視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞主要來(lái)源于早期胚胎中的眼球組織，獲取來(lái)源同樣非常稀少， 因此需要尋找更廣闊的干細(xì)胞來(lái)源。幸運(yùn)的是，復(fù)旦大學(xué)附屬醫(yī)院在對(duì)牛視網(wǎng)膜色素上皮 細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，其生長(zhǎng)曲線顯示第ι 4天為其指數(shù)生長(zhǎng)期，多巴胺分泌在第池開(kāi)始 檢測(cè)到，4 達(dá)高峰以后緩慢下降并趨穩(wěn)定；此外，他們?cè)趯?duì)豬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的研究 中發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下豬RPE細(xì)胞在接種后池開(kāi)始分泌DA，4h達(dá)高峰，之后緩慢下降并趨于 平穩(wěn)。這證明，動(dòng)物視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有望在治療帕金森病中發(fā)揮作用，這為細(xì)胞移植治 療帕金森提供了廣闊的細(xì)胞來(lái)源；但這些細(xì)胞用于移植治療帕金森病，一方面需克服免疫 排斥，另一方面，移植細(xì)胞存活時(shí)間需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久以足以修復(fù)病變位置的細(xì)胞。另外有研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元、刺激軸突再生、再髓鞘化、調(diào)節(jié) 小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，中樞神經(jīng)直接給藥時(shí)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)及時(shí)改善帕金森病癥狀有明 顯效果，且有效率達(dá)80%左右。目前已知對(duì)神經(jīng)元有滋養(yǎng)作用四種主要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 已從哺乳動(dòng)物中分離出來(lái)，它們是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 3(NT-3)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 4/5(NT-4/5) (Guyton AC, Hall JE. Textbook of medicalphysiology,Ilth Edition. Philadelphia :Elsevier Saunders. 2006,醫(yī)學(xué)生 理學(xué)，英文影印版，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007)；隨著無(wú)血清培養(yǎng)神經(jīng)元等技術(shù)的應(yīng)用， 在許多組織液和細(xì)胞外基質(zhì)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的特異蛋白質(zhì)分子，也能促進(jìn)神經(jīng)元的 增殖、分化和存活。例如，施萬(wàn)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)能促進(jìn)受損傷的和胚胎的脊髓神經(jīng)元存活，并在治療人 類(lèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性疾病中有重要價(jià)值。又如，膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，⑶NF)在離體實(shí)驗(yàn)中能支持中腦多巴胺能神經(jīng)元的 生存，在各種帕金森病動(dòng)物模型上可提高多巴胺能神經(jīng)元的存活率和神經(jīng)術(shù)梢的密度而改 善其癥狀(韓濟(jì)生主編.神經(jīng)科學(xué)原理.第2版.北京北京醫(yī)科大學(xué)出版社，1999)。這些 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子應(yīng)用在臨床上的效果并不滿意。主要原因是(1)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分子量大，難 于通過(guò)血腦屏障；(2)通過(guò)血腦屏障后不一定能迅速到達(dá)黑質(zhì)紋狀體作用于靶點(diǎn)。因此， 臨床上采用來(lái)治療帕金森必須解決以上兩個(gè)問(wèn)題?！叭斯ぜ?xì)胞”伴隨著包裹技術(shù)和微囊化技術(shù)的出現(xiàn)開(kāi)始在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了廣 泛應(yīng)用。人工細(xì)胞的概念由Chang，Τ. Μ. S提出于1965年，至今已有四十多年的研究歷史， 其概念是將包括細(xì)胞、酶和吸附劑在內(nèi)的生命材料用高分子超薄膜包裹起來(lái)，從而形成微 膠囊，即細(xì)胞微囊化。通過(guò)微膠囊的選擇性滲透膜對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行免疫保護(hù)，可以在無(wú)需 免疫抑制劑的條件下進(jìn)行同種異體或者異種移植，補(bǔ)充疾病體內(nèi)缺乏的生理活性物質(zhì)，同 時(shí)，異種移植的實(shí)現(xiàn)能夠克服人類(lèi)移植器官供體來(lái)源的局限性。微囊化常用的材料主要有 天然、半合成和合成高分子三大類(lèi)數(shù)十種，常用的方法有海藻酸鈉、多聚賴氨酸(APA)微膠 囊制備法；海藻酸鈉、殼聚糖(ACA)微膠囊制備法、瓊脂囊心制備法和合成聚電解質(zhì)微膠囊 制備法等；細(xì)胞微囊制備過(guò)程有一步法和兩步法。一步法是將殼聚糖和氯化鈣的混合溶液 直接滴入海藻酸鈉溶液中反應(yīng)得到微囊，囊壁含有殼聚糖沉積層、海藻酸鈉-殼聚糖絡(luò)合 層和海藻酸鈣凝聚層共3層，傳統(tǒng)的微囊制備方法是兩步法。第一步是將細(xì)胞與海藻酸鈉 溶液的混合液通過(guò)注射器泵的微孔滴入氯化鈣溶液中制備出海藻酸鈣微球，第二步將得到 的海藻酸鈣微球置于殼聚糖溶液中成膜，再以海藻酸鈉溶液中和成膜后的海藻酸鈣微球即 得到海藻酸鈉-殼聚糖微囊。另外一種更好的微囊體系是以海藻酸鈉、多聚賴氨酸為微囊材料，其步驟是第一步將細(xì)胞與海藻酸鈉溶液的混合液通過(guò)注射器泵的微孔滴入氯化鈣 溶液中制備出海藻酸鈣微球，第二步海藻酸鈣微球以聚賴氨酸水溶液浸漬在表面形成海藻 酸納-聚賴氨酸聚電解質(zhì)配合物層，然后將此微球浸于檸檬酸鈉水溶液中，海藻酸鈉從微 囊中溶出使微球轉(zhuǎn)變成海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)的半透膜膜層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞在 此微囊中比在海藻酸鈣凝膠中易自由活動(dòng)，且膜強(qiáng)度高，細(xì)胞不會(huì)泄漏，適于長(zhǎng)期使用。目前，沒(méi)有見(jiàn)到細(xì)胞色素上皮細(xì)胞做成人工細(xì)胞以克服免疫排斥反應(yīng)的報(bào)道，同 時(shí)也沒(méi)有見(jiàn)到與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相結(jié)合用于延長(zhǎng)移植細(xì)胞存活期的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的缺陷及空白，提供一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊及復(fù) 合細(xì)胞支架，細(xì)胞微囊為異源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用于治療人帕金森病提供了可行途 徑；本發(fā)明中移植細(xì)胞存活率高、存活期長(zhǎng)，為緩解帕金森病癥狀和修復(fù)病變細(xì)胞提供了一 種理想的途徑。一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊，其特征在于內(nèi)含細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，微 囊的囊殼材料中混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。所述囊殼從里到外依次為海藻酸鈉層、殼聚糖層、海藻酸鈉層；或海藻酸鈉層、多 聚賴氨酸層、海藻酸鈉層。所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為明膠包裹而成的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球。所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球?yàn)?0%明膠溶液與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以體積質(zhì)量比5 IOml 50 200 μ g，通過(guò)凝聚法制得。所述囊殼為3%的海藻酸鈉溶液、1.5%的殼聚糖溶液和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球制 得；所述3%的海藻酸鈉溶液、1. 5%的殼聚糖溶液及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球的體積比為0. 5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5，所述殼聚糖溶液與所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球先混合后再參與 反應(yīng)。所述囊殼為1.5%的海藻酸鈉溶液、0.05%的多聚賴氨酸溶液和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微 球制得；所述1. 5%的海藻酸鈉溶液、0. 05%的多聚賴氨酸溶液及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球的體 積比為0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5，所述殼聚糖溶液與所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球先 混合后再參與反應(yīng)。所述細(xì)胞微囊中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為lX108 lX109cellS/L。所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3和/或 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4/5。所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為第3 5代傳代細(xì)胞。所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的來(lái)源為人、牛、豬、兔。一種治療帕金森病的復(fù)合細(xì)胞支架，通過(guò)以下步驟制得(1)將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合，再加入殼聚糖或多聚賴氨酸溶 液混勻，最后加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混勻，置于0 7°C冰箱冷凍；(2)按預(yù)設(shè)的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)三維受控組裝方法得到組裝產(chǎn)物；(3)在組裝產(chǎn)物上滴加氯化鈣使其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為明膠包裹著的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球。
本發(fā)明提供的治療帕金森的細(xì)胞微囊，將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞包裹于微囊材料 中，微囊的囊殼起著半透膜的作用，允許小分子量的分泌物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出，而對(duì)大分子 量的免疫活性物質(zhì)有屏蔽作用。該微囊移植到大腦病變位置后，使囊內(nèi)細(xì)胞免受人體免疫 系統(tǒng)的攻擊，提高了細(xì)胞移植的成功率和細(xì)胞存活率，同時(shí)，也使用于移植的細(xì)胞來(lái)源不再 局限于自體細(xì)胞或人源細(xì)胞，也可以是牛、豬、兔等動(dòng)物的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；而囊內(nèi)細(xì) 胞分泌的多巴胺類(lèi)物質(zhì)擴(kuò)散到囊外，細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以擴(kuò)散到囊內(nèi)，因此囊內(nèi)合成 的多巴胺可以分泌到病變部位，而植入環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)分子可以擴(kuò)散到囊內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞使之持 續(xù)保持分泌多巴胺的活力；本發(fā)明細(xì)胞微囊的囊殼中，加入了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)營(yíng)營(yíng)養(yǎng)因 子通過(guò)移植直接與病變部位接觸，使其發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)元的功能，使病變細(xì)胞主動(dòng)修復(fù)；另一 方面，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠刺激誘導(dǎo)囊內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)囊內(nèi)細(xì)胞的存活期，達(dá)到持續(xù)分 泌多巴胺、延長(zhǎng)移植治療的有效期；同時(shí)將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子加入到用于微囊的囊殼材料中，解 決了其在臨床上使用治療帕金森的存在的難題。本發(fā)明制作微囊的材料采用目前常用的海藻酸鈉與殼聚糖微囊體系，或者海藻酸 鈉與多聚賴氨酸體系，這兩種體系生物相容性較好，膜層的半透性穩(wěn)定，膜層強(qiáng)度足以為其 中的細(xì)胞的生理代謝活動(dòng)提供保護(hù)。本發(fā)明中，為了使囊殼材料中混合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能 夠長(zhǎng)期起作用，本發(fā)明優(yōu)選將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包裹于明膠中形成明膠微球，明膠微球與囊殼 材料混合一起制作細(xì)胞微囊，明膠起著緩釋的作用，使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩慢釋放出來(lái)，延長(zhǎng)對(duì) 神經(jīng)元的修復(fù)時(shí)間，逐漸達(dá)到使部分病變神經(jīng)元側(cè)底修復(fù)的目的；。本發(fā)明中，優(yōu)選明膠微 球?yàn)?0%的明膠溶液與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以5 IOml 50 200 μ g的比例制成，制作方法采 用常用的凝聚法，制成的明膠微球的緩釋作用可持續(xù)2 3年，足以配合視網(wǎng)膜色素上皮細(xì) 胞一起徹底治療帕金森患者的病變腦組織，但本發(fā)明不限于該比例和方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，囊殼材料為1 3%的海藻酸鈉溶液和1. 5%的殼聚 糖溶液，本發(fā)明優(yōu)選的3%的海藻酸鈉溶液、1. 5%的殼聚糖溶液、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球按體積 比0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5混合，這一比例范圍制作而得的微囊具有合適的 膜強(qiáng)度及適宜多巴胺分泌及小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出交換的半透膜孔隙。在細(xì)胞微囊中，細(xì)胞與囊殼材料應(yīng)該有一個(gè)合適的比例，應(yīng)該為細(xì)胞與植入環(huán)境 之間提供盡可能大的接觸面積，同時(shí)保證細(xì)胞之間信號(hào)和物質(zhì)傳輸途徑暢通形成良好互 相保護(hù)的機(jī)制，若微囊中容納太多細(xì)胞，則細(xì)胞與植入環(huán)境之間的接觸面積不夠分泌的多 巴胺物質(zhì)不能高效地?cái)U(kuò)散到靶點(diǎn)，細(xì)胞太少則容易死亡，影響移植細(xì)胞存活期。因此，本 發(fā)明通過(guò)大量的對(duì)比摸索實(shí)驗(yàn)，確定本發(fā)明中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在微囊中的體積比為 1 X IO8 1 X 109cells/L，能達(dá)到上述目的。本發(fā)明針對(duì)治療帕金森這一目的提供的細(xì)胞微囊，其中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以為神 經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4/5中的一種或幾種，上 述四種是目前已經(jīng)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離到的證明有神經(jīng)元修復(fù)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。有研究數(shù)據(jù)證明，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞傳代后可保持分泌DA特性，在4代細(xì)胞中 明顯可見(jiàn)多巴胺的分泌，本發(fā)明采用的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞優(yōu)選為干細(xì)胞傳代3 5代的 細(xì)胞，這樣使得制作出來(lái)的細(xì)胞微囊在移植到病變部位后，可立即分泌多巴胺，立即改善患 者癥狀。
本發(fā)明中的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞優(yōu)選自目前研究證明有多巴胺分泌功能的牛、 豬、兔，也可以采用生物公司中培養(yǎng)的人源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種治療帕金森的復(fù)合細(xì)胞支架，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞先與囊殼材 料混合成細(xì)胞支架混合物，然后采用與李曼，趙銥民等(“細(xì)胞直接三維受控組裝技術(shù)體外 構(gòu)建組織工程化軟骨”，實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008年kp，M(5))報(bào)道的三維受控組裝方法 及其設(shè)備，按預(yù)設(shè)的復(fù)合細(xì)胞支架的三維結(jié)構(gòu)的二維線路進(jìn)行逐層堆積成型制得雛形的復(fù) 合細(xì)胞支架，最后再進(jìn)行交聯(lián)化或者固定步驟，從而制得具有一定宏觀結(jié)構(gòu)復(fù)合細(xì)胞支架。 復(fù)合支架的作用在于可以為微囊細(xì)胞提供一種利于培養(yǎng)的宏觀支撐結(jié)構(gòu)，可直接將支架移 植到病變位置，為細(xì)胞提供了良好的生存環(huán)境，支架的材料就是的具有半滲透多孔隙微的 囊殼材料，支架的三維結(jié)構(gòu)有利于提高植入物與體內(nèi)環(huán)境的接觸表面積，便于植入環(huán)境和 微囊內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和治療物質(zhì)釋放，提高治療效果和延長(zhǎng)有效治療周期。


圖1細(xì)胞微囊治療帕金森小鼠的效果曲線橫坐標(biāo)表示移植時(shí)間，縱坐標(biāo)表示旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少的比例圖2.復(fù)合細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)左上復(fù)合細(xì)胞支架組裝過(guò)程中右上組裝完成的復(fù)合細(xì)胞支架左下顯微鏡下觀察孔隙的情況右下電子顯微鏡下觀察復(fù)合細(xì)胞支架上細(xì)胞附著的情況
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞原代細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司所用培養(yǎng)液為美國(guó)ScienCell公司的EpiCM培養(yǎng)基(EpiCM，Catalog Number為 4101)，該培養(yǎng)基組分為每500ml培養(yǎng)基含有IOml胎牛血清FBS (Catalog No. 0010)，5ml上 皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物(Catalog No. 4152)和5ml青霉素鏈霉素抗體(P/S，Catalog No. 0503)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)使用0.25%的胰蛋白酶Trypsine作為消化液。所購(gòu)原代細(xì)胞為 75cm2培養(yǎng)瓶裝，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合傳 代。細(xì)胞分裂增殖至融合時(shí)應(yīng)及時(shí)傳代，將培養(yǎng)液吸去，PBS緩沖液沖洗3次，0. 25% 胰酶消化3 5分鐘，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞邊緣開(kāi)始收縮時(shí)，吸去消化液，加入培養(yǎng)液中 止消化，吹打混勻，分裝至新培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。實(shí)施例2 單凝聚法制備包含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的明膠微球制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的明膠溶液5ml，烘箱80°C高溫滅菌2 3次，每次4 5小 時(shí)。無(wú)菌條件下加入IOOug神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ScienCell, NGS, Catalog No. 1562)，在pH3. 8 條件下滴加丙酮使明膠溶液發(fā)生凝聚，再加入戊二醛交聯(lián)得到直徑200-400nm、表面光滑的 明膠微球。實(shí)施例3.制作海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉細(xì)胞微囊
步驟1.取實(shí)施例1中制得的75cm2培養(yǎng)瓶的生長(zhǎng)接近融合的第3 5代視網(wǎng)膜 色素上皮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為8 X IO6 10 X 106/L步驟2.提取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，加入0. 25%胰酶消化3 5分鐘，加入培養(yǎng)液 (EpiCM，CatalogNumber為4101)中止，充分吹打混勻，離心后棄上清液，即可獲得RPE。步驟3，將RPE與1. 5%的海藻酸鈉混合制成密度為IX 106/ml的細(xì)胞懸液。用4 號(hào)針頭將細(xì)胞懸液滴入輕微攪動(dòng)的1. 1% CaCl2中，使其形成凝膠珠。步驟4，實(shí)施例2制得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球與0. 05%多聚賴氨酸以等體積混合，步驟5.凝膠珠依次與步驟4的混合液、海藻酸鈉化合反應(yīng)，最后用濃度約5. 5%的 檸檬酸鈉液化微球的核心，即得到細(xì)胞微囊。實(shí)施例4.制作海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉細(xì)胞微囊步驟1.取實(shí)施例1中制得的75cm2培養(yǎng)瓶的生長(zhǎng)接近融合的第3 5代視網(wǎng)膜 色素上皮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為8 X IO6 10 X 106/L步驟2.提取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，加入0. 25%胰酶消化3 5分鐘，加入培養(yǎng)液 (EpiCM, CatalogNumber為4101)中止，充分吹打混勻，離心后棄上清液，即可獲得RPE。步驟3.將RPE與3%的海藻酸鈉混合制成密度為1 X 106/ml的細(xì)胞懸液。用4號(hào) 針頭將細(xì)胞懸液滴入輕微攪動(dòng)的1. 1% CaCl2中，使其形成凝膠珠。步驟4.實(shí)施例2制得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球與1. 5%殼聚糖溶液以等體積混合，步驟5.凝膠珠依次與步驟4的混合液、海藻酸鈉化合反應(yīng)。實(shí)施例^制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞微囊化的復(fù)合支架步驟1.取實(shí)施例1中制得的75cm2培養(yǎng)瓶的生長(zhǎng)接近融合的第3 5代視網(wǎng)膜 色素上皮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為8 X IO6 10 X 106/L步驟2.提取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，加入0. 25%胰酶消化3 5分鐘，加入培養(yǎng)液 (EpiCM, CatalogNumber為4101)中止，充分吹打混勻，離心后棄上清液，即可獲得RPE步驟3.將提取的RPE細(xì)胞與ImL 3%海藻酸鈉溶液無(wú)菌條件下混合制成密度為 1 X 106/ml的細(xì)胞懸液，再加入ImL 1. 5%的殼聚糖溶液混勻，再加入實(shí)施里2制得的ImL明 膠包裹的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球，混合均勻后置于O 7°C冰箱冷凍20分鐘。步驟4.將冷凍好的凝膠態(tài)混合物裝入與三維受控組裝機(jī)I代相配合的5mL注射 器中，裝好針頭，安裝在細(xì)胞三維受控組裝機(jī)上(即李曼，趙銥民等，“細(xì)胞直接三維受控組 裝技術(shù)體外構(gòu)建組織工程化軟骨”，實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008年kp，24 (5)中的采用的設(shè) 備)，啟動(dòng)控制程序，按照預(yù)設(shè)的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)行組裝。步驟5.組裝好的蜂窩狀的復(fù)合細(xì)胞支架，見(jiàn)圖2，位于載波片上，將載波片取出， 無(wú)菌條件下加入lOOmmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液500ul進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，固化5 30分鐘 后即得到復(fù)合細(xì)胞支架。步驟6.用細(xì)胞培養(yǎng)液(同實(shí)施例1)沖洗干凈，將載波片上的復(fù)合支架刮入多孔 培養(yǎng)板，加入3 5ml培養(yǎng)液(同實(shí)施例1)進(jìn)行培養(yǎng)觀察，培養(yǎng)3 5細(xì)胞分裂周期(D) 后，取少量進(jìn)行檢測(cè)。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢驗(yàn)支架上的細(xì)胞活性，僅少量細(xì)胞著色說(shuō)明細(xì)胞 活性良好，可用于移植治療。實(shí)驗(yàn)例1.小鼠試驗(yàn)采用實(shí)施例3制作的細(xì)胞微囊，采用帕金森大鼠模型，6-0HDA大鼠模型術(shù)后3周腹腔注射阿樸嗎啡(0. 5mg/kgBff)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于210次/30min為成模標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)定生理鹽水(NS)對(duì)照組，裸細(xì)胞組(RPE)和本發(fā)明制得的細(xì)胞微囊組 (RPE-APA)。其中NS組12只，RPE組和RPE-APA組各15只。移植時(shí)將RPE細(xì)胞懸液調(diào)整至 lX106cells/ml, RPE-APA組濃度調(diào)整至2X IO6個(gè)囊/L用于移植，采用右側(cè)紋狀體兩點(diǎn)移 植。NS組按相同方法注射20ul生理鹽水，留針15分鐘；RPE組和RPE-APA組采用注射法。分別在細(xì)胞移植后第1，2，4，8，14周觀察各組大鼠阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為變 化，測(cè)定30min的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。旋轉(zhuǎn)行為評(píng)定采用自身前后對(duì)比，即用移植后阿樸嗎啡誘發(fā)的 旋轉(zhuǎn)次數(shù)較移植前減少的百分比(％ )來(lái)表示旋轉(zhuǎn)行為變化程度(見(jiàn)圖1)。觀察結(jié)果表明 RPE-APA組中大鼠阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)在移植后第2周開(kāi)始減少，第4周減少幅度更加 明顯，為79%，旋轉(zhuǎn)次數(shù)的減少一直持續(xù)到第14周，減少幅度為60. 25%。RPE組的大鼠 旋轉(zhuǎn)次數(shù)從第2周開(kāi)始有所減少，但隨后減少幅度來(lái)回波動(dòng)，與生理鹽水組對(duì)照無(wú)顯著差 異。實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明采用細(xì)胞微囊移植具有明顯療效，而且與直接移植RPE細(xì)胞相比，前者持 續(xù)療效時(shí)間更長(zhǎng)，效果更顯著。直接移植的細(xì)胞僅在移植初期能產(chǎn)生治療效果。實(shí)驗(yàn)例2.臨床試驗(yàn)采用本發(fā)明的細(xì)胞微囊移植治療2例晚期帕金森病病人，手術(shù)采用立體定位，通 過(guò)CT或MRI掃描定位，確定手術(shù)靶點(diǎn)，再通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助定位系統(tǒng)軟件，確定靶點(diǎn)的三維 坐標(biāo)。將細(xì)胞微囊，調(diào)整至2X IO6個(gè)囊/L注入帕金森病患者腦內(nèi)紋狀體區(qū)靶點(diǎn)(殼核，丘 腦腹后外側(cè)核)。所有患者均未使用免疫抑制藥物，治療前后應(yīng)用統(tǒng)一帕金森病等級(jí)評(píng)分 (Unified Parkinson，sDisease Rating Scale, UPDRS)對(duì)病人進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，采用 細(xì)胞微囊的移植療效更持久，可顯著改善病人的運(yùn)動(dòng)機(jī)能，其功能改善可持續(xù)3年。患者對(duì) 細(xì)胞移植過(guò)程耐受良好，沒(méi)有明顯副作用。綜上所述，本發(fā)明為異源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用于治療人帕金森病提供了可行 方法，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子加入到了囊殼中一起移植治療患者病變腦組織，既克服了臨床應(yīng)用中 存在的問(wèn)題，直接發(fā)揮其修復(fù)神經(jīng)元的功能；又與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間由協(xié)同作用，延 長(zhǎng)移植細(xì)胞的存活期，為緩解帕金森病癥狀和修復(fù)病變細(xì)胞提供了一種理想的途徑。
權(quán)利要求
1.一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊，其特征在于內(nèi)含細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，微 囊的囊殼材料中混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞微囊，所述囊殼從里到外依次為海藻酸鈉層、殼聚糖層、 海藻酸鈉層；或海藻酸鈉層、多聚賴氨酸層、海藻酸鈉層。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞微囊，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為明膠包裹而成的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子微球。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞微囊，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球?yàn)?0%明膠溶液與神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子以體積質(zhì)量比5 IOml 50 200 μ g，通過(guò)凝聚法制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞微囊，所述囊殼為3%的海藻酸鈉溶液、1.5 %的殼聚糖 溶液和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球制得；所述3%的海藻酸鈉溶液、1. 5%的殼聚糖溶液及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子微球的體積比為0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5，所述殼聚糖溶液與所述神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子微球先混合后再參與反應(yīng)；或者所述囊殼為1.5%的海藻酸鈉溶液、0. 05%的多聚 賴氨酸溶液和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球制得；所述1.5%的海藻酸鈉溶液、0. 05%的多聚賴氨酸 溶液及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球的體積比為0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5，所述殼聚糖溶 液與所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球先混合后再參與反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞微囊，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)與所述細(xì)胞微囊的體積 比為 1 X IO8 1 X 109cells/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一所述的細(xì)胞微囊，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3和/或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4/5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一所述的細(xì)胞微囊，所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為第3 5代 傳代細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一所述的細(xì)胞微囊，所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的來(lái)源為人、 牛、豬、兔。
10.一種治療帕金森病的復(fù)合細(xì)胞支架，通過(guò)以下步驟制得(1)將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合，再加入殼聚糖或多聚賴氨酸溶液混 勻，最后加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混勻，置于0 7°C冰箱冷凍；(2)按預(yù)設(shè)的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)三維受控組裝方法得到組裝產(chǎn)物；(3)在組裝產(chǎn)物上滴加氯化鈣使其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為明膠包裹著的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子微球。
全文摘要
本發(fā)明一種治療帕金森病的細(xì)胞微囊及復(fù)合細(xì)胞支架，涉及帕金森病移植治療領(lǐng)域。細(xì)胞微囊內(nèi)含細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，囊殼中混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。為異源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用于治療人帕金森病提供了可行方法，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子加入到了囊殼中一起移植治療患者病變腦組織，既克服了臨床應(yīng)用中存在的問(wèn)題，直接發(fā)揮其修復(fù)神經(jīng)元的功能；又與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間由協(xié)同作用，延長(zhǎng)移植細(xì)胞的存活期，為緩解帕金森病癥狀和修復(fù)病變細(xì)胞提供了一種理想的途徑。
文檔編號(hào)A61L27/54GK102091056SQ20091024241
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者唐果林, 張定軍, 戴麗娜, 郭戈, 顏旭濤 申請(qǐng)人:北京殷華激光快速成形與模具技術(shù)有限公司