專利名稱：一種阻止Aβ聚集的化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阻止AP聚集的小分子化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年癡呆癥(AD)是在老年人群中引起癡呆的一種漸進(jìn)性的神經(jīng)變性疾病。不 同的病理學(xué)信號(hào)和漸進(jìn)性的老年斑沉積以及導(dǎo)致神經(jīng)元退化神經(jīng)元纖維纏結(jié)伴隨著認(rèn) 知力和記憶力的衰退。AD的一個(gè)典型特征是跨膜糖蛋白P-淀粉體前身蛋白(PAPP) 水解而來(lái)的amyloid-!3p印tide(AI3)(淀粉樣-l3肽鏈(AP))累積。兩種主要的A |3 (Alzheimer' s P -amyloid)變體分別由40和42個(gè)氨基酸構(gòu)成，他們促進(jìn)前炎癥反應(yīng)， 激活神經(jīng)毒害通路，導(dǎo)致腦細(xì)胞功能異常甚至死亡。有關(guān)研究表明當(dāng)AP以纖絲形式聚合 時(shí)，其在細(xì)胞和體內(nèi)均有神經(jīng)毒害作用。因此，找到可以阻止AP聚集的小分子化合物在 AD治療中變得很有價(jià)值(Ce' line Rivie—re etc, Inhibitory activity of stilbenes on Alzheimer' s -amyloid fibrils in vitro， Bioorganic & Medicinal Chemistry 15(2007)1160-1167)。 目前對(duì)老年癡呆癥的治療主要有四大類藥物，分別為膽堿脂酶抑制劑、抗氧化劑 藥物、激素替代治療藥物及非甾體抗炎藥，但這些藥物在一定程度上都存在風(fēng)險(xiǎn)或限制。目 前篩選研究具有抑制A 13聚集的小分子先導(dǎo)化合物，成為研制治療老年癡呆癥的熱點(diǎn)之 鳶尾科鳶尾屬植物。在我國(guó)主要分布在西南、西北和東北地區(qū)。該屬約有300 個(gè)種，廣泛的分布于世界各地，中國(guó)約有60個(gè)種及13個(gè)變種，(Mahmood U， Kaul VK， Jirovetz L. Alkylated benzoquinones from Iris k咖aonensis. Phytochemistry， 2002,2(61) :923-926. Qin MJ， Xu LS， Tanaka T， et al.A preliminarystudy on the distribution pattern of isoflavones in rhizomes of Iris from China and its systematic significance. Acta Phyto Sinica， 2000， 38 :343-349.)該屬植物已被作為 傳統(tǒng)的民間藥物，用來(lái)治療多種疾病，例如，癌癥、炎癥、細(xì)菌和病毒感染。目前，從鳶尾屬 分離得到的化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗瘧原蟲和抗結(jié)核等作用(l.Atta-ur-Rahmn M， et al. Anti_inflammatory isoflavonoids from the rhizomes of Iris germanica. Journal of Ethnopharmacology，2003，86 :177_180.2.Bonfils JP et al. Cytotoxicity of iridals， triterpenoidsfrom Iris.on human tumor cell lines A2780 andK562. Planta Med，2001，67 :79-82)。 細(xì)葉鳶尾(Iris tenuifolia)，為鳶尾科鳶尾屬植物，其化學(xué)成分已有一定的報(bào) 道，(l.Kojima，K. ， Gombosurengyin， P. ，Ondogyni，P. ， Begzsurengyin， D. ， Zevgeegyin， 0.， Hatano，K. ，Ogihara，Y. Flavanones from Iris te皿ifolia. Phytochemistry, 1997， 44 (4): 711—714 ;2. M. I. Choudhary， S. Hareem and H. Siddiqui， et al.A benzil andisof lavone from Iris te皿ifolia，Phytochemistry，2008，69， 1880-1885)。我們繼續(xù)研究該植物的化 學(xué)成分，分離、鑒定了一個(gè)新的化合物；生物活性實(shí)驗(yàn)表明該化合物能夠阻止AP聚集，預(yù)示對(duì)老年癡呆癥有一定的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)化合物，該化合物具有抑制淀粉樣蛋白13聚集的作 用。 本發(fā)明提供的化合物，結(jié)構(gòu)如式I所示
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(I)。 本發(fā)明的另一 目的在于提供上述化合物的制備方法。
本發(fā)明提供的制備方法包括如下的步驟 1)取細(xì)葉鳶尾地下部分，用無(wú)水甲醇提取，收集提取液，再去除所述提取液中的無(wú) 水甲醇，得到細(xì)葉鳶尾地下部分總提取物； 2)將步驟1)得到的細(xì)葉鳶尾地下部分總提取物溶于水中，再加入氯仿進(jìn)行氯仿 萃取，收集氯仿相，再去除所述氯仿相中的氯仿，得到氯仿提取物； 3)將步驟2)得到的氯仿提取物用甲醇溶解后，在硅膠G中進(jìn)行以下兩次梯度洗 脫 a、依次用體積比分別為io : o，9.5 : o.5，9 : i，8 : 2和o : io的氯仿與甲醇
組成的五個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，依次獲得第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分； b、將步驟a獲得的第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分中的第四個(gè)組分用體積比
分別為9.5 : o.5，9 : i，8 : 2和o : io的氯仿與甲醇組成的四個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，
依次獲得第一至第四個(gè)洗脫液洗脫出的組分；取第三個(gè)洗脫液洗脫出的組分，得到本發(fā)明
保護(hù)的化合物。 進(jìn)一步，上述步驟l)中，所述提取重復(fù)3次。 上述步驟2)中，氯仿萃取可重復(fù)5次。 上述步驟3)中，硅膠G的目數(shù)是100-200目。 上述的化合物在制備阻止AP聚集(纏結(jié))的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。 進(jìn)一步，上述產(chǎn)品可以是藥物。 上述的化合物在制備治療老年癡呆癥的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。 本發(fā)明的又一 目的在于提供一種治療老年癡呆癥的藥物。 本發(fā)明提供的治療老年癡呆癥的藥物，其活性成分是上述的化合物。 實(shí)驗(yàn)證明化合物1可以阻止AP聚集。因?yàn)锳P聚集是老年癡呆癥的一個(gè)典型
特征，因此預(yù)示化合物1可用來(lái)治療老年癡呆癥。


圖1為本發(fā)明中化合物制備流程圖。
圖2為化合物1雙分子疊合圖。
圖3為單分子的立體結(jié)構(gòu)投影圖。
圖4為分子晶胞堆積圖。 圖5為本發(fā)明的化合物使AP纏結(jié)程度下降的結(jié)果圖，其中aggregates表示未加化合物1的對(duì)照組，5為本發(fā)明的化合物1，圖5的縱坐標(biāo)是將對(duì)照組的熒光強(qiáng)度記作l，其余組的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組的熒光強(qiáng)度的比為相應(yīng)縱坐標(biāo)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、一種具有抑制淀粉樣蛋白13聚集作用的化合物1的制備
—、化合物1的制備
制備流程如圖l所示。
1)無(wú)水甲醇浸泡 取1661g新鮮細(xì)葉鳶尾的地下部分，用無(wú)水甲醇室溫浸泡處理三次(每次5L無(wú)水甲醇/lkg材料)，三次提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收甲醇，得到細(xì)葉鳶尾地下部分的總提取物241. 8g。
2)氯仿萃取 將步驟1)得到的提取物溶解于300mL蒸餾水，移入1000mL分液漏斗中，加入等體積的氯仿進(jìn)行萃取，萃取共進(jìn)行5次，合并氯仿萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿，得到細(xì)葉鳶尾地下部分的氯仿提取物198. 6g。
3)柱層析分離 取步驟2)得到的氯仿提取物15g，用1. 5mL無(wú)水甲醇充分溶解，用硅膠G(100-200目，青島海洋化工公司)700g進(jìn)行常壓柱層析分離。按照溶劑極性遞增的原則，依次用體積
比分別為io : o，9.5 : o.5，9 : i，8 : 2，o : io(每個(gè)比例溶劑用量isomL)的氯仿與甲
醇組成的五個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，依次獲得第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分；
取上述第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分中的第四個(gè)組分2. 6g重新用130g的硅膠G(100-200目)進(jìn)行常壓柱層析分離。按照溶劑極性遞增的原則，依次用體積比分別為9. 5 : 0. 5，9 : 1，8 : 2，0 : 10(每個(gè)比例溶劑用量lOOmL)的氯仿與甲醇組成的四個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，依次獲得第一至第四個(gè)洗脫液洗脫出的組分；取第三個(gè)洗脫液洗脫出的
組分(即化合物1)。 二、結(jié)構(gòu)的確認(rèn) 1、化合物1的物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)如下 無(wú)色透明片狀晶體，易溶于氯仿。 分子式C17H1605 分子量300 ESI-MS(m/z) :337 (M+Na， 100% ) ， 301 (M_CH3) ， 242， 205， 147。 化合物1的核磁共振(NMR)數(shù)據(jù)
5
力NMR(DMS0-de， 500MHz) S卯m :5. 34(1H， br， s， H_2) ， 2. 09(1H， m， H_3a) ， 2. 15(1H，m， H-3b) ，5. 62(1H， br， s， H_4)，6. II(IH， d， J = 2. 3Hz， H_8) ， 6. 70 (1H， d， J = 1. 62Hz，H-4' ) ，6. 68(1H， d， J = 7. 4Hz， H-5' ) ， 6. 80 (1H， dd， J = 1. 5， 7. 2Hz， H_6' ) ， 3. 67 (3H，s， 5-0CH3) ， 3. 80 (3H， s， 7_0CH3)。 13CNMR(DMS0-d6， 125MHz) S ppm :66. 71 (C-2) ， 26. 01 (C-3) ， 60. 99 (C-4)，158. 77 (C_5) ，91. 32(C_6) ， 161. 43(C_7) ，92. 86 (C_8) ， 154. 50 (C_9) ， 103. 05(C_10)，121.98(C-1 ' )，145.62(C-2 ' ) ， 141. 71 (C_3 ' )，116.01(04' ) ， 119. 63 (C_5 ')，120. 94 (C-6' ) ， 56. 13 (5_0CH3) ， 55. 62 (7_0CH3)。
OCH3 'O OH 化合物1的主要HMBC (H — C)相關(guān)
2、化合物1單晶結(jié)構(gòu)分析
1)衍射實(shí)驗(yàn) 化合物1晶體呈無(wú)色透明柱狀，衍射分析使用晶體尺寸為0. 20X0. 27X0. 48mm，屬正交晶系，空間群為P2^^，晶胞參數(shù)a = 8. 154(1) ，b = 14. 158(l)，c=25. 333(1) A，晶胞體積丫=2924. 6(1)A3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z = 8。 用日本Rigaku MicroMax 002+單晶衍射儀收集衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，CuKa輻射，共聚焦單色器，準(zhǔn)直光管直徑4=0. 30mrn，晶體與CCD探測(cè)器距離d = 50mrn，管壓45kV，管流0.88mA，"與k掃描方式，最大2e角141. 38° ，攝取774幅衍射圖象，總衍射點(diǎn)11019個(gè)，獨(dú)立衍射點(diǎn)5053個(gè)，可觀察點(diǎn)(|F|2>2o F卩)4818個(gè)，數(shù)據(jù)完整度為96.6%。
2)結(jié)構(gòu)計(jì)算 使用直接法shelxs-97解析晶體結(jié)構(gòu)，從E圖上獲得全部44個(gè)非氫原子位置，采用最小二乘法修正結(jié)構(gòu)參數(shù)和判別原子種類，用幾何計(jì)算法獲得全部氫原子位置，最終可靠因子& = 0. 0433， wR2 = 0. 1213， S = 1. 074。最終確定不對(duì)稱單位化學(xué)計(jì)量式為(C17H1605) 2，計(jì)算分子量為600. 60，計(jì)算晶體密度1. 364g/cm3。晶態(tài)下分子排列屬于第一類空間群，故樣品應(yīng)具有旋光活性。計(jì)算晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)型的Flack系數(shù)為O. 17(18)，獲得該化合物分子的絕對(duì)構(gòu)型如式I所示。圖2為雙分子疊合圖，圖3為單分子的立體結(jié)構(gòu)投影圖，圖4為分子晶胞堆積圖。
6OCH3 H式(I) 3)結(jié)構(gòu)分析 結(jié)構(gòu)分析表明SAMP5112分子為含氧螺環(huán)類化合物。該分子骨架由4個(gè)六元環(huán)組成A和D(苯環(huán))、B和C(含氧雜環(huán))。其中A環(huán)與D環(huán)呈平面，B環(huán)與C環(huán)呈半椅式構(gòu)象，B/C環(huán)為順式連接。單晶結(jié)構(gòu)分析證明樣品在一個(gè)不對(duì)稱單位中存在有兩個(gè)分子相同手性化合物分子，但在側(cè)鏈構(gòu)象上存在一定差異，其中C16A、 C17A、 C16B、 C17B原子存在無(wú)序現(xiàn)
象，造成原子的溫度因子較高。計(jì)算雙分子各環(huán)間平均二面角值分別為A/B :7. 5° ， A/D :
81.0° ，B/C:91.3° ，C/D:9. 5° 。晶態(tài)下分子內(nèi)存在氫鍵聯(lián)系為05B"*02B :2. 704A，分子間存在氫鍵聯(lián)系為05A"'04B(-x，y+l/2，-z-l/2) :3. 154A。晶態(tài)下分子以氫鍵作用力與范德華力維系其在空間的穩(wěn)定排列。 實(shí)驗(yàn)例2、化合物1抑制淀粉樣蛋白13聚集作用的活性評(píng)價(jià) 試劑來(lái)源AP蛋白(1-40， M = 4329.84)購(gòu)自瑞士 Bachem公司，硫磺素T(Tht)購(gòu)自Sigma公司 活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)Ce ' line Rivie—re etc. Inhibitory activityof stilbenes onAlzheimer' s_amyloid fibrils in vitro， Bioorganic & MedicinalChemistry15 :1160-1167(2007)進(jìn)行，具體步驟如下
1、AP纏結(jié) lmgA P蛋白+2mlPBS (磷酸緩沖液，PH = 7. 4)，得到0. 5mg/ml的A P溶液，加入EDTA(lmM)促進(jìn)纏結(jié)，在37°C ， 300rmp，孵育72h，在-S(TC冰箱中保存。
2、硫磺素T(Tht)的配制 配成300uM的Tht，備用，在4t:冰箱中保存，熒光測(cè)量時(shí)，需要稀釋到3uM。
3、樣品+AP 向tube管中加入20ul濃度為20uM的AP溶液(步驟1保存的AP溶液稀釋成20uM)和2ul濃度為10ug/ml化合物1溶液(該溶液的溶劑是二甲基亞砜(匿SO)，溶質(zhì)是化合物1)，充分混勻，37°C ，孵育30分鐘。
4、熒光測(cè)量 取1500ul的3uM的Tht于新的tube管中，加入15ul步驟3中孵育好的混合物，然后進(jìn)行熒光測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)442nm，測(cè)定波長(zhǎng)480nm。
統(tǒng)計(jì)方法用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件方差分析*P < 0. 05。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與未加化合物1的對(duì)照組相比，加了化合物1的實(shí)驗(yàn)組中AP的纏結(jié)度顯著下降，說(shuō)明化合物1可以阻止AI3聚集。因?yàn)锳P聚集是老年癡呆癥的一個(gè)典型特征，因此化合物1可用來(lái)治療老年癡呆癥。
權(quán)利要求
一種化合物，結(jié)構(gòu)如式I所示F2009102438931C00011.tif
2. 權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，包括如下的步驟1) 取細(xì)葉鳶尾地下部分，用無(wú)水甲醇提取，收集提取液，再去除所述提取液中的無(wú)水甲 醇，得到細(xì)葉鳶尾地下部分總提取物；2) 將步驟1)得到的細(xì)葉鳶尾地下部分總提取物溶于水中，再加入氯仿進(jìn)行氯仿萃取， 收集氯仿相，再去除所述氯仿相中的氯仿，得到氯仿提取物；3) 將步驟2)得到的氯仿提取物用甲醇溶解后，在硅膠G中進(jìn)行以下兩次梯度洗脫a、 依次用體積比分別為io : o，9.5 : o.5，9 : i，8 : 2和o : io的氯仿與甲醇組成的五個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，依次獲得第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分；b、 將步驟a獲得的第一至第五個(gè)洗脫液洗脫出的組分中的第四個(gè)組分用體積比分別為9.5 : o.5，9 : i，8 : 2和o : io的氯仿與甲醇組成的四個(gè)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，依次獲得第一至第四個(gè)洗脫液洗脫出的組分；取第三個(gè)洗脫液洗脫出的組分，得到權(quán)利要求1所述的化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述提取重復(fù)3次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述氯仿萃取重復(fù)5次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述硅膠G的目 數(shù)是100-200目。
6. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備阻止AI3聚集產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品是藥物。
8. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備治療老年癡呆癥的藥物中的應(yīng)用。
9. 一種治療老年癡呆癥的藥物，其活性成分是權(quán)利要求1所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化合物。本發(fā)明提供的化合物的結(jié)構(gòu)如式I所示，本發(fā)明提供的化合物，具有抑制淀粉樣蛋白β聚集作用，預(yù)示對(duì)治療老年癡呆癥有一定的作用，
文檔編號(hào)A61K31/352GK101735235SQ20091024389
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者崔艷梅, 張大勇, 王輝, 趙長(zhǎng)琦, 韓梅 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)