專利名稱：沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用，可以作為高效靶
向非病毒基因載體在基因治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
載體系統(tǒng)的選擇直接影響基因治療的效率和安全性。常用的基因遞送方法主要分 為兩類，即病毒載體和非病毒載體導(dǎo)入技術(shù)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，是目前體內(nèi)基因治療的 主要工具。盡管病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但其存在基因攜帶能力低、免疫原性和潛在 致瘤性等安全性隱患。非病毒載體為基因遞送提供了另一條途徑，目前非病毒載體主要有 脂質(zhì)體、陽(yáng)離子高聚物等。但是，因缺少病毒載體天然的基因遞送機(jī)制，非病毒基因載體的 效率低下，極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用。 殼聚糖是一種被報(bào)道最多的聚合物轉(zhuǎn)基因載體，也是唯一的一種天然陽(yáng)離子多 糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，高陽(yáng)離子電位。然而，同其他非病毒 載體一樣，殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞靶向性差，需要對(duì)其進(jìn)行修飾，以提高其轉(zhuǎn)染效率和 特異性。而殼聚糖分子上的羥基和氨基官能團(tuán)為其聯(lián)接靶向配體提高轉(zhuǎn)染效率提供了可行 性。
1.殼聚糖基因載體的特異性修飾 細(xì)胞膜表面存在著大量的受體蛋白，一些特異性基團(tuán)會(huì)和某些細(xì)胞膜上的受體發(fā) 生相互作用而內(nèi)化吸收。因而將這些特殊基團(tuán)接到殼聚糖上，有助于增強(qiáng)殼聚糖與細(xì)胞膜 的作用，提高載體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)由于這些基團(tuán)特異性地針對(duì)某 些細(xì)胞上高表達(dá)的受體，實(shí)現(xiàn)高效率的同時(shí)有望實(shí)現(xiàn)靶向治療。這種改性方法已經(jīng)被廣泛 的研究。半乳糖改性后的殼聚糖能夠特異性地提高H印G2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾 的殼聚糖在轉(zhuǎn)染HEK293 cells和HeLa細(xì)胞時(shí)，效率比未修飾時(shí)要高出4倍；葉酸修飾的殼 聚糖對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯要高于未改性的殼聚糖；甘露糖修飾的殼聚糖，用于轉(zhuǎn)染抗 原呈遞細(xì)胞(APCs)Raw264. 7巨噬細(xì)胞，效率也得到了顯著提高。 呼吸道上皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，肥大細(xì)胞，II型肺泡細(xì)胞的細(xì)胞膜表面富含13 2腎 上腺能受體。P 2受體激動(dòng)劑如沙丁胺醇、沙美特羅、福美特羅等，能夠和氣道平滑肌和肥大 細(xì)胞膜表面的P 2受體相結(jié)合，并起到舒張氣道平滑肌、減少肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫 顆粒及其介質(zhì)的釋放、降低微血管的通透性、增加氣道上皮纖毛的擺動(dòng)等效果。這幾種 腎上腺能受體配體被廣泛的用作哮喘治療藥物。因此通過(guò)將13 2腎上腺能受體激動(dòng)劑(沙 丁胺醇)作為靶向配體，用化學(xué)方法耦聯(lián)到殼聚糖上，一方面，可以利用其特異的和呼吸道 細(xì)胞表面受體結(jié)合能力，促進(jìn)細(xì)胞膜對(duì)其吸收，實(shí)現(xiàn)對(duì)呼吸道細(xì)胞的高效靶向轉(zhuǎn)染。另一方 面，利用這些藥物的藥理作用，同時(shí)起到藥物協(xié)同治療的作用。這種改性后的殼聚糖基因載 體，對(duì)哮喘病及其他呼吸道疾病的治療具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
2.殼聚糖基因載體的胍基化修飾 細(xì)胞對(duì)載體/DNA復(fù)合物的內(nèi)吞吸收是制約殼聚糖載體轉(zhuǎn)染效率的一個(gè)重要原因，因此針對(duì)非病毒基因載體跨膜的研究也十分廣泛。1988年，Green等證實(shí)人免疫缺損 病毒(HIV)-1的反式激活蛋白TAT能跨膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。接著，其他一系列多 肽如單純皰疹病毒(HSV)-1的VP22轉(zhuǎn)錄因子，核定位信號(hào)(NLS)也陸續(xù)被證實(shí)具有跨膜能 力。人們把此類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，具有穿膜能力的短肽稱為細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating p印tide)。細(xì)胞穿膜肽能作為生物大分子的有效載體，可提高各種生物大分 子，包括寡核苷、肽段、蛋白質(zhì)、納米顆粒和脂質(zhì)體等進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)的能力。Wender 等發(fā)現(xiàn)，精氨酸在細(xì)胞穿膜肽的跨膜中起到關(guān)鍵的作用。于是，可以推測(cè)相對(duì)于電荷或主 鏈結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，精氨酸中的特征基團(tuán)胍基對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞影響更顯著。胍基可以與RNA主 鏈上的磷酸鹽形成氫鍵，也可以和磷脂雙分子層中的磷酸脂形成氫鍵。胍基的這種氫鍵作 用和本身的強(qiáng)堿性(pKa為 12. 5)可能成為控制這些富含精氨酸多肽跨膜的關(guān)鍵因素。 Wender課題組合成了一系列聚胍基類肽衍生物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分衍生物體現(xiàn)出和精氨酸十聚 物相當(dāng)?shù)募?xì)胞攝取效率。同時(shí)，他們還提出了將多肽中的氨基進(jìn)行胍基化的改性方法減少 多肽合成的費(fèi)用。因此對(duì)非病毒基因載體進(jìn)行具有跨膜能力的胍基修飾，有望提高細(xì)胞對(duì) 載體的內(nèi)吞吸收，從而提高載體的轉(zhuǎn)染效率。我們采取這種方法，對(duì)原有殼聚糖進(jìn)行胍基修 飾。結(jié)果表明，和未修飾的殼聚糖相比，轉(zhuǎn)染效率得到顯著提高。經(jīng)過(guò)胍基修飾的殼聚糖， 水溶性極大改善，解決了殼聚糖載體在中性條件下溶解困難的問(wèn)題。此外，有研究表明胍基 化還有助于提高殼聚糖的天然抗菌效果。
與本發(fā)明有關(guān)的參考文獻(xiàn)如下 Calnan B.J. ， Tidor B. ， Biancalana S. ， et al. Arginine-mediated RNA recognition :thearginine fork.Science. 1991 ;252 ;1167-1171. Ying Hu， Yumin Du， Jianhong Yang， et al. Synthesis, characterization and antibacterialactivity of gimnidinylated chitosan. Carbohydrate Polymers. 2007 5 67 ;66-72.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用。采用
促進(jìn)載體跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇雙重修飾的方法，通過(guò)環(huán)氧氯丙烷將沙丁胺
醇耦聯(lián)到殼聚糖分子上，然后利用三氧化硫脲對(duì)殼聚糖氨基進(jìn)行胍基化。對(duì)原始?xì)ぞ厶禽d
體進(jìn)行改性，提高其轉(zhuǎn)染效率和對(duì)于呼吸道細(xì)胞的靶向性。合成方法簡(jiǎn)便，條件溫和。這種
改性后的殼聚糖用作基因載體，轉(zhuǎn)染效率較未改性之前有顯著提高。
本發(fā)明提供一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖糖的結(jié)構(gòu)式表示為其中，殼聚糖Mw = 50kDa ;沙丁胺醇(Sal)接枝率5%;胍基(Gua)取代度17. 5%;
本發(fā)明提供一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖糖的制備方法包括以下步驟
1) 二氧化硫脲與雙氧水的濃硫酸溶液在50-6(TC下反應(yīng)100min，4t:冷卻，靜置 2h，加入過(guò)量無(wú)水乙醇沉淀出白色晶體，乙醇重結(jié)晶三次。最后再用無(wú)水乙醇洗滌，室溫下
用？205干燥，產(chǎn)物三氧化硫脲于41:密封保存。30%雙氧水濃硫酸的體積比=i : 2。 2)殼聚糖在鹽酸溶液中50-8(TC攪拌4h溶解，加入過(guò)量的NaOH溶液，絮狀沉淀產(chǎn)
物離心，10000r/min離心10min，倒掉上清液，得到膠狀堿處理過(guò)的殼聚糖。 3)將沙丁胺醇溶于匿SO，加入環(huán)氧氯丙烷攪拌至均勻。迅速加入一定量
NaOH(lM);室溫反應(yīng)4. 5h，然后加入膠狀堿處理過(guò)的殼聚糖；繼續(xù)反應(yīng)4. 5h，反應(yīng)液在透析
去離子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，凍干。其中，沙丁胺醇、環(huán)氧氯丙烷殼聚糖
單元摩爾數(shù)相等。 4)將凍干后的殼聚糖溶于水中，加入4倍于殼聚糖單元摩爾數(shù)的三氧化硫脲， 5(TC反應(yīng)半小時(shí)，得透明澄清溶液，反應(yīng)液在去離子水中透析5天(透析袋截留分子量 3500)，凍干。 本發(fā)明沙丁胺醇胍基雙重修飾殼聚糖可以作為高效靶向非病毒基因載體在基因 治療中的應(yīng)用。用于轉(zhuǎn)基因載體，實(shí)現(xiàn)提高殼聚糖載體基因轉(zhuǎn)染效率的作用，以及對(duì)于呼吸 道細(xì)胞的靶向作用，尤其是作為哮喘病的基因治療的載體的應(yīng)用。 本發(fā)明合成了沙丁胺醇胍基雙重修飾殼聚糖，合成方法簡(jiǎn)便，條件溫和。這種改性 后的殼聚糖用作基因載體，轉(zhuǎn)染效率較未改性之前有顯著提高。同時(shí)，改性后的殼聚糖水溶 性的得到極大改善，能夠溶解于中性水溶液中，克服了普通殼聚糖在中性水中難以溶解的 缺陷，減少了對(duì)組織和細(xì)胞的剌激。由于P2能受體配體沙丁胺醇的存在，這種載體對(duì)于呼 吸道上皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，肥大細(xì)胞等具有靶向效果，對(duì)于呼吸道疾病尤其是哮喘的基因 治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 : 燒杯中加入0. 1M的HC1 (150ml)，加入殼聚糖(Mw = 50kDa，0. 161g， lmmol)，然 后攪拌并加熱至8(TC，待殼聚糖完全溶解后停止加熱，冷卻至室溫。加入2M NaOH溶液 (150ml，過(guò)量)，立即產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，10000r/min離心5min，倒掉上清液。得堿液處 理后的殼聚糖白色膠狀沉淀物。將沙丁胺醇硫酸鹽(0. 288g， lmmol)溶于DMS0(20ml)加入三口瓶中，然后滴加環(huán) 氧氯丙烷(78. 3iil，lmmo1)攪拌至均勻。迅速加入1MNaOH(20ml)，室溫反應(yīng)4. 5h。
加入經(jīng)堿液處理過(guò)的殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)4. 5h。反應(yīng)液加水稀釋后于去離子水中透 析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得沙丁胺醇修飾殼聚糖。
H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)沙丁胺醇接枝率約為5 % 。 將得到的最終產(chǎn)物lmg溶于lml醋酸溶液中(0. 1M)，濾菌。與pGL3質(zhì)粒DNA溶液 混合配制成S-CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已 培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。裂解細(xì) 胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為1. 55X104RLU/mg protein。
實(shí)施例2 稱取二氧化硫脲(10.8g，0. lmol)，取少量加入三口燒瓶中，量取雙氧水(30%， 0. 15mol，17ml)和濃硫酸(98%，34ml)先在小燒杯中按比例混合，配成雙氧水酸性溶液。 冷卻至室溫后，將混合溶液加入到恒壓滴液漏斗中?？刂品磻?yīng)器內(nèi)溫度在50-6(TC，邊攪 拌邊緩慢滴加雙氧水酸性溶液，同時(shí)不斷少量加入二氧化硫脲，在lh內(nèi)投完料，繼續(xù)反應(yīng) 40min，停止加熱，將反應(yīng)液倒入燒杯中，4t:冷卻靜置2h。加入過(guò)量的乙醇至反應(yīng)液，生成顆 粒狀白色晶體。過(guò)濾取沉淀，加少量水溶解，加入過(guò)量乙醇使其重結(jié)晶。如此反復(fù)三次。最 后再用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌3次，用P205干燥，于4t:密封保存?zhèn)溆?三氧化硫脲)。
燒杯中加入0. 1M的HC1 (150ml)，加入殼聚糖(Mw = 50kDa， lg)，然后攪拌并加熱 至8(TC，充分溶解殼聚糖，用紗布濾掉不溶殼聚糖。將濾液于去離子水中透析(透析袋截留 分子量3500)內(nèi)透析5天，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得海綿狀蓬松殼聚糖。
取上一步產(chǎn)物(殼聚糖，O. 161g，lmmol)，加入到三口瓶中，加入25ml去離子水，恒 溫?cái)嚢?(TC使其分散，加入三氧化硫脲(0. 5g，4mmo1)，反應(yīng)30min，得透明澄清溶液，于去 離子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得胍基化殼聚 糖。 C-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，元素分析計(jì)算取代度胍基取代度約為17. 5% 。 將得到的最終產(chǎn)物lmg溶于lml超純水中，濾菌，與pGL3質(zhì)粒DNA溶液混合配制
成G-CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指
數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。裂解細(xì)胞，測(cè)定其
中的熒光素酶活性為3. 55X104RLU/mg protein。 實(shí)施例3 稱取二氧化硫脲(10.8g，0. lmol)，取少量加入三口燒瓶中，量取雙氧水(30%， 0. 15mol，17ml)和濃硫酸(98%，34ml)先在小燒杯中按比例混合，配成雙氧水酸性溶液。 冷卻至室溫后，將混合溶液加入到恒壓滴液漏斗中?？刂品磻?yīng)器內(nèi)溫度在50-6(TC，邊攪
6拌邊緩慢滴加雙氧水酸性溶液，同時(shí)不斷少量加入二氧化硫脲，在lh內(nèi)投完料，繼續(xù)反應(yīng) 40min，停止加熱，將反應(yīng)液倒入燒杯中，4t:冷卻靜置2h。加入過(guò)量的乙醇至反應(yīng)液，生成顆 粒狀白色晶體。過(guò)濾取沉淀，加少量水溶解，加入過(guò)量乙醇使其重結(jié)晶。如此反復(fù)三次。最 后再用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌3次，用P205干燥，于4t:密封保存?zhèn)溆?三氧化硫脲)。
燒杯中加入0. 1M的HCl(150ml)，加入殼聚糖(Mw = 50kDa，0. 161g， lmmol)，然 后攪拌并加熱至8(TC，待殼聚糖完全溶解后停止加熱，冷卻至室溫。加入2M NaOH溶液 (150ml，過(guò)量)，立即產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，10000r/min離心5min，倒掉上清液。得堿液處 理后的殼聚糖白色膠狀沉淀物。 將沙丁胺醇硫酸鹽(0. 288g， lmmol)溶于DMS0(20ml)加入三口瓶中，然后滴加環(huán) 氧氯丙烷(78. 3iil，lmmo1)攪拌至均勻。迅速加入1M NaOH(20ml)，室溫反應(yīng)4. 5h。
加入經(jīng)堿液處理過(guò)的殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)4. 5h。反應(yīng)液加水稀釋后于去離子水中透 析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得沙丁胺醇修飾殼聚糖。
取上一步產(chǎn)物(沙丁胺醇修飾殼聚糖，O. 161g，lmmol)，加入到三口瓶中，加入 25ml去離子水，5(TC恒溫?cái)嚢枋蛊浞稚?，加入三氧化硫?0. 5g，4mmo1)，反應(yīng)30min，得透 明澄清溶液，于去離子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍 干得沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖。 將得到的最終產(chǎn)物lmg溶于lml超純水中，濾菌，與pGL3質(zhì)粒DNA溶液混合配制 成SG-CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指 數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。裂解細(xì)胞，測(cè)定其 中的熒光素酶活性為2. 95X 105RLU/mg protein。
實(shí)施例4 : 稱取二氧化硫脲(10.8g，0. lmol)，取少量加入三口燒瓶中，量取雙氧水(30%， 0. 15mol，17ml)和濃硫酸(98%，34ml)先在小燒杯中按比例混合，配成雙氧水酸性溶液。 冷卻至室溫后，將混合溶液加入到恒壓滴液漏斗中?？刂品磻?yīng)器內(nèi)溫度在50-6(TC，邊攪 拌邊緩慢滴加雙氧水酸性溶液，同時(shí)不斷少量加入二氧化硫脲，在lh內(nèi)投完料，繼續(xù)反應(yīng) 40min，停止加熱，將反應(yīng)液倒入燒杯中，4t:冷卻靜置2h。加入過(guò)量的乙醇至反應(yīng)液，生成顆 粒狀白色晶體。過(guò)濾取沉淀，加少量水溶解，加入過(guò)量乙醇使其重結(jié)晶。如此反復(fù)三次。最 后再用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌3次，用P205干燥，于4t:密封保存?zhèn)溆?三氧化硫脲)。
燒杯中加入0. 1M的HCl(150ml)，加入殼聚糖(Mw = 50kDa，0. 161g， lmmol)，然 后攪拌并加熱至8(TC，待殼聚糖完全溶解后停止加熱，冷卻至室溫。加入2M NaOH溶液 (150ml，過(guò)量)，立即產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，10000r/min離心5min，倒掉上清液。得堿液處 理后的殼聚糖白色膠狀沉淀物。 將沙丁胺醇硫酸鹽(0. 288g， lmmol)溶于DMS0(20ml)加入三口瓶中，然后滴加環(huán) 氧氯丙烷(78. 3iil，lmmo1)攪拌至均勻。迅速加入1M NaOH(20ml)，室溫反應(yīng)4. 5h。
加入經(jīng)堿液處理過(guò)的殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)4. 5h。反應(yīng)液加水稀釋后于去離子水中透 析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得沙丁胺醇修飾殼聚糖。
取上一步產(chǎn)物(沙丁胺醇修飾殼聚糖，O. 161g，lmmol)，加入到三口瓶中，加入 25ml去離子水，恒溫?cái)嚢?(TC使其分散，加入三氧化硫脲(0. 5g，4mmo1)，反應(yīng)30min，得透 明澄清溶液，于去離子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小時(shí)換一次水，然后凍干得沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖。 將得到的最終產(chǎn)物lmg溶于1ml超純水中，濾菌，與GFP質(zhì)粒DNA溶液混合配制成 SG-CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù) 生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用熒光顯微鏡觀察 綠色熒光蛋白的表達(dá)(如下圖l-b所示，同未經(jīng)修飾殼聚糖相比綠色熒光蛋白能表達(dá)顯著 增加)。
對(duì)比例1 :將原始?xì)ぞ厶?Mw = 50kDa， lmg)溶于1ml醋酸溶液中(0. 1M)，濾菌。與pGL3質(zhì) 粒DNA溶液混合配制成CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液 加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。 裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為3.67X 103RLU/mg protein
對(duì)比例2: 將原始?xì)ぞ厶?Mw = 50kDa， lmg)溶于1ml醋酸溶液中(0. 1M)，濾菌.與GFP質(zhì)
粒DNA溶液混合配制成CS/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液 加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞含血清培基中，轉(zhuǎn)染24h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。 用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(如圖l-a所示)。
權(quán)利要求
一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖糖，其特征在于它的結(jié)構(gòu)式為其中，殼聚糖Mw≈50kDa；沙丁胺醇(Sal)接枝率5％；胍基(Gua)取代度17％。F2009102451936C00011.tif
2. —種權(quán)利要求1所述的沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖糖的制備方法，其特征在于它包 括以下步驟1) 二氧化硫脲與雙氧水的濃硫酸溶液在50-6(TC下反應(yīng)100min，4t:冷卻，靜置2h，加 入過(guò)量無(wú)水乙醇沉淀出白色晶體，乙醇重結(jié)晶三次；最后再用無(wú)水乙醇洗滌，室溫用P205干燥，產(chǎn)物三氧化硫脲于4t:密封保存；雙氧水濃硫酸的體積比=i : 2;2) 殼聚糖在鹽酸溶液中50-8(TC攪拌4h溶解，加入過(guò)量的NaOH溶液，絮狀沉淀產(chǎn)物離 心，10000r/min離心10min，倒掉上清液，得到膠狀堿處理過(guò)的殼聚糖；3) 將沙丁胺醇溶于DMSO，加入環(huán)氧氯丙烷攪拌至均勻，迅速加入等體積1M的NaOH，室 溫反應(yīng)4. 5h，然后加入膠狀堿處理過(guò)的殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)4. 5h，反應(yīng)液于去離子水中透析5 天，凍干。4) 將凍干后的殼聚糖溶于水中，加入4倍于殼聚糖單元摩爾數(shù)的三氧化硫脲，5(TC反 應(yīng)半小時(shí)，得透明澄清溶液，反應(yīng)液在去離子水中透析5天，凍干。
3. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟3)中所述的沙丁胺醇，環(huán)氧氯丙 烷與殼聚糖單元摩爾數(shù)相等。
4. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟4)中所述的三氧化硫脲與殼聚糖 單元摩爾數(shù)比為4 : 1。
5. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的透析袋的截留分子量3500。
6. 權(quán)利要求1所述的沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖糖的應(yīng)用，其特征在于作為高效靶向 非病毒基因載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于它作為哮喘病的基因治療的載體。H\2〕全文摘要
本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用。采用促進(jìn)載體跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇雙重修飾的方法，通過(guò)環(huán)氧氯丙烷將沙丁胺醇耦聯(lián)到殼聚糖分子上，然后利用三氧化硫脲對(duì)殼聚糖氨基進(jìn)行胍基化。對(duì)原始?xì)ぞ厶禽d體進(jìn)行改性，提高其轉(zhuǎn)染效率和對(duì)于呼吸道細(xì)胞的靶向性。合成方法簡(jiǎn)便，條件溫和。這種改性后的殼聚糖用作基因載體，轉(zhuǎn)染效率較未改性之前有顯著提高。對(duì)于呼吸道疾病尤其是哮喘的基因治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P11/06GK101781373SQ20091024519
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉文廣, 孫鵬, 徐軍, 羅永峰 申請(qǐng)人:天津大學(xué);廣州醫(yī)學(xué)院