專利名稱：一種新型glp-1衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有GLP-I活性的GLP-I衍生物及其制 備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是世界性疾病，發(fā)展迅速，對人類危害巨大。2007年全球約2. 46億人患糖 尿病，預(yù)計(jì)到2025年，全世界糖尿病患者將增加到3. 8億。根據(jù)2007年的中華醫(yī)學(xué)會的調(diào) 查，我國城市和城鎮(zhèn)20歲以上的人群中糖尿病患病率為約10%，并且患者年齡還呈現(xiàn)出日 趨低齡化的趨勢。在糖尿病患者中，接近90%患者為II型糖尿病，不能單獨(dú)使用胰島素進(jìn) 行治療。伴隨著糖尿病患者的激增，對其和相關(guān)并發(fā)癥的治療開銷也隨之巨幅增長，對我國 帶來勞動力巨大損失。糖尿病已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。近年來對GLP-I及其類似物研究進(jìn)展很快，應(yīng)用于糖尿病治療取得了較好的療 效。GLP-I是進(jìn)食后由遠(yuǎn)端回腸、結(jié)腸和直腸的L細(xì)胞分泌釋放的一種31氨基酸的多肽 激素，在體內(nèi)有兩種活性形式GLP-l(7-36)及GLP-I (7-37)，兩者具有相同的生物學(xué)活性。 GLP-I的促胰島素分泌作用是依賴于血液中葡萄糖濃度，使用GLP-I治療糖尿病不會產(chǎn)生 低血糖，因此具有較高的安全性，因此在治療II型糖尿病方面具有較好的前景。但是，天然GLP-I在體內(nèi)極易被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解，脫去N端的 His7-Ala8。被DPPIV降解后，GLP-1成為無活性形式的GLP-1 (9-36)，為GLP-1受體拮抗劑， 抑制GLP-I活性。其體內(nèi)靜脈注射半衰期僅為5min。由于GLP-I的半衰期極短，大大限制 了其在臨床上的應(yīng)用，因此急需尋找更為長效的具有臨床價(jià)值的GLP-I類似物。目前GLP-I研究的主要方向之一是通過對GLP-I結(jié)構(gòu)進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變改造， 使其能夠抵抗DPPIV降解，以達(dá)到延長藥物體內(nèi)藥效的目的。DPPIV催化的降解反應(yīng)具有嚴(yán) 格的底物特異性，由于GLP-I存在His7-Ala8結(jié)構(gòu)，因此GLP-I極易被降解。本專利申請人的在先發(fā)明專利申請中已經(jīng)提出一種GLP-I衍生物及其制備方法， 詳見發(fā)明專利申請(申請?zhí)?006100M355.X ；發(fā)明名稱一種人胰高血糖素樣肽_1衍生 物及其制備和應(yīng)用)。該發(fā)明專利申請所提供的GLP-I衍生物存在以下缺點(diǎn)，如第2位氨 基酸在體內(nèi)仍然極易被DPPIV降解失去活性。因此，為了更好地保留GLP-I衍生物的活性， 提高抗DPPIV降解能力，需要進(jìn)一步開發(fā)其他長效GLP-I衍生物。本發(fā)明正是克服上述技 術(shù)缺陷，對該第2位氨基酸進(jìn)行改造，將N端第2位Ala突變?yōu)镚ly、Thr, Val等，從而延緩 其降解速率，顯著提高其抗DPPIV降解的能力。經(jīng)改造后的本發(fā)明GLP-I衍生物，其半衰期 可延長至原來5倍左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及的GLP-I 指 GLP-I (7-37)，其序列(kq ID No. 1)為His-Ala-Glu_Gl y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe -A1a-Trp-Leu-Va1-Lys-G1y-Arg-G1y。
本申請人的在先發(fā)明專利申請(申請?zhí)?006100M355.X;發(fā)明名稱一種人胰 高血糖素樣肽-1衍生物及其制備和應(yīng)用)中所提出GLP-I衍生物，是指mGLP-1 (7-38)，其 序列 Geq ID No. 2)為His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa,其中 Xaa32是Cys，Ala, Gly, His, Ser和Thr中的任何一個氨基酸。本發(fā)明所解決的技術(shù)方案，是提供一種GLP-I衍生物，該衍生物具有分子結(jié)構(gòu)式 cGLP-1 (7-38)，即kq ID No. 3。本專利申請中以cGLP_l表示本發(fā)明GLP-I衍生物。其序 列為:His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa ；其中，Xaa2 是 Gly，Thr 或 Val中的任何一個氨基酸，Xaa32是Cys。本發(fā)明提供的GLP-I衍生物，該衍生物具有分子結(jié)構(gòu)式CGLP-I (7-38)，即kq ID No. 3,其序列為:His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gl y-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa ；其中 Xaa2 是 Gly, Xaa32 是 Cys0上述衍生物不僅保持了天然GLP-I在體內(nèi)的活性，還顯著延長了體內(nèi)藥效時(shí)間， 具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，該衍生物可通過DNA重組技術(shù)或固相化學(xué)合成制備，技術(shù) 成熟，適宜普及使用。本發(fā)明提供利用DNA重組技術(shù)制備上述衍生物的方法。本發(fā)明GLP-I衍生物重組 制備方法，包括步驟(1)合成包含GLP-I衍生物氨基酸編碼序列的融合基因片段。按GLP-I衍生物的 氨基酸編碼序列，合成GLP-I衍生物氨基酸編碼序列的長度為729bp的融合基因片段，即 Seq ID No. 4 ；其中，n535 = n536 = g，n537 = c ；其中，該片段含有硫氧還蛋白、六聚組氨 酸、腸激酶位點(diǎn)、GLP-I衍生物基因、終止密碼子TAA、限制性內(nèi)切酶^CbaI和HindIII位點(diǎn)；(2)構(gòu)建含有GLP-I衍生物基因的重組表達(dá)載體。用限制性內(nèi)切酶)(ba I和 HindIII雙酶切，插入帶有卡那霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建得到含有GLP-I衍 生物基因的重組表達(dá)載體pET28a(+)-cGLP-1 ；(3)將含有GLP-I衍生物基因序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞，比如，原核宿主 細(xì)胞大腸桿菌，獲得基因工程菌株；
(4)將基因工程菌株液體發(fā)酵，獲得含GLP-I衍生物融合蛋白的濕菌體；(5)將濕菌體破壁，從上清液中分離獲得含GLP-I衍生物融合蛋白的粗品；(6)用腸激酶裂解融合蛋白，經(jīng)純化、冷凍干燥制得GLP-I衍生物純品。以上步驟(3)中的基因工程菌可以是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5ci，BL21(DE3) 或 BLR(DE3)。通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)GLP-I衍生物，成本低，產(chǎn)量高。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供GLP-I衍生物在制備治療糖尿病的藥物中作藥物 活性成分的應(yīng)用。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供含有有效量GLP-I衍生物以及藥學(xué)可接受的成分 的組合物。本發(fā)明的GLP-I衍生物優(yōu)選以無菌凍干物形式儲存，在給藥前與合適的等滲溶液混合，其中含有藥學(xué)上可接受的成分如甘露醇、氯化鈉等，然后可通過靜脈注射或皮下注射 等方式給藥。


以下附圖用于闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，附圖中以cGLP-1表示本發(fā)明GLP-I衍生 物。圖1 質(zhì)粒pET28a(+)-cGLP-1的構(gòu)建，其中該質(zhì)粒含本發(fā)明GLP-1衍生物。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明。說明書及以下實(shí)施例中所用質(zhì)粒、菌體等， 以及未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可按常規(guī)條件進(jìn)行，可按商品供貨商所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例1本申請人的在先發(fā)明專利申請(申請?zhí)?006100M355. X ；發(fā)明名稱一 種人胰高血糖素樣肽-1衍生物及其制備和應(yīng)用)中所提出GLP-I衍生物的氨基酸序列，如 Seq ID No. 2，其中 Xaa32 = Cys0實(shí)施例2本發(fā)明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Gly, Xaa32 = Cys0實(shí)施例3本發(fā)明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Thr， Xaa32 = Cys0實(shí)施例4本發(fā)明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Val, Xaa32 = Cys0實(shí)施例5DNA重組技術(shù)制備本發(fā)明的GLP-I衍生物，該衍生物的分子結(jié)構(gòu)式為 cGLP-1 (7-38)，如實(shí)施例 2 所示，即 Seq ID No. 3，其中 Xaa2 = Gly，Xaa32 = Cys ；步驟(1)，按GLP-I衍生物的氨基酸編碼序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，通過PCR 方法合成以下長度為 729bp 的片段，艮口 Seq ID No. 4 :gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60catatgagcg ataaaattat tcacctgact gacgacagtt ttgacacgga tgtactcaaa 120gcggacgggg cgatcctcgt cgatttctgg gcagagtggt gcggtccgtg caaaatgatc 180gccccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg 240aacatcgatc aaaaccctgg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 300ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag 360ttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggttctggtt c tggccatat gcaccatcat 420catcatcatt cttctggtct ggtgccacgc ggttctggta tgaaagaaac cgctgctgct 480aaattcgaac gccagcacat ggacagccca gatctggacg acgacgacaa gcatnnngaa 540ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc aggccgccaa agaatttatt 600gcctggctgg tgaaaggcag aggctgttga taaccatggc tgatatcgga tccgaattcg 660agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg 720gctgctaac 729其中，n535 = n536 = g，n537 = c ；其中，該片段含有硫氧還蛋白、六聚組氨酸、腸激酶位點(diǎn)、GLP-I衍生物基因、終止 密碼子TAA以及限制性內(nèi)切酶Xba I和HindIII位點(diǎn)；
步驟O)，上述融合基因片斷以限制性內(nèi)切酶)(ba I和HindIII雙酶切并純化回 收，以限制性內(nèi)切酶)(ba I和HindIII雙酶切大腸桿菌質(zhì)粒pET28a(+)并純化回收大片斷， 二者混合后加入T4DNA連接酶，16°C連接2-6小時(shí)，構(gòu)建得到含有GLP-I衍生物基因序列的 重組質(zhì)粒 pET28a(+)-cGLP-l ；步驟(3)，重組質(zhì)粒pET28a(+)-cGLP-l與大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，冰 浴15-30分鐘，42 °C水浴熱激60-90秒，37°C培養(yǎng)30-45分鐘，菌液涂布含30ug/mL卡那霉 素的LB固體平板，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)后出現(xiàn)的菌落即為含有GLP-I衍生物基因序列的基 因工程菌株；步驟，含有GLP-I衍生物基因序列的基因工程菌株在含30ug/mL卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600nm = 0. 6-0. 8，加IPTG至終濃度0. 5-0. 8mmol/L，37°C誘導(dǎo) 3-5小時(shí)，離心收集濕菌體；步驟(5)，菌體重懸于IDA-O緩沖液，冰浴中超聲破碎，離心后收集上清進(jìn)行鎳離 子螯合親和層析，收集含GLP-I衍生物融合蛋白的洗脫組分，采用截留分子量為IOkD的 Amicon Ultra_15超濾離心管將蛋白脫鹽、濃縮至3mg/mL以上，得到含有GLP-I衍生物融合 蛋白的粗品；步驟(6)，在GLP-I衍生物融合蛋白粗品中加入腸激酶，23_25°C裂解8-16小時(shí)，反 應(yīng)混合液再進(jìn)行鎳離子螯合親和層析，收集流穿液，冷凍干燥獲得GLP-I衍生物。實(shí)施例6DNA重組技術(shù)制備本發(fā)明GLP-I衍生物，該衍生物的分子結(jié)構(gòu)式為 cGLP-1 (7-38)，如實(shí)施例 3 所示，即 kq ID No. 3，其中 Xaa2 = Thr, Xaa32 = Cys ；步驟(1)合成的kq ID No. 4 基因片段中，n535 = a, n536 = n537 = c ；其余步驟同實(shí)施例5。實(shí)施例7DNA重組技術(shù)制備本發(fā)明的GLP-I衍生物，該衍生物的分子結(jié)構(gòu)式為 cGLP-1 (7-38)，如實(shí)施例 4 所示，即 kq ID No. 3，其中 Xaa2 = Val，Xaa32 = Cys ；步驟(1)合成的kq ID No. 4 基因片段中，n535 = n537 = g, n536 = t ；其余步驟同實(shí)施例5。實(shí)施例8GLP-1衍生物的降血糖作用。實(shí)驗(yàn)材料與方法雌性健康昆明小鼠(清潔級，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供)；16%葡萄糖溶液；0.9% NaCl 溶液；GLP-I ；cGLP-1，具有實(shí)施例2所述GLP-I衍生物的結(jié)構(gòu)；血糖測試儀(上海新立醫(yī)療器械有限公司出品)。雌性健康昆明小鼠禁食16小時(shí)，分為4組(n = 10)。1，生理鹽水對照組；2，GLP-I 給藥對照組；3 4，cGLP-1給藥組，具體的序列結(jié)構(gòu)是實(shí)施例2中所述的結(jié)構(gòu)。GLP-I給 藥對照組2腹腔注射0. 4ug的GLP-I ；cGLP-1給藥組3腹腔注射0. 4ug的cGLP-1 (7-38)； cGLP-1給藥組4腹腔注射3. 2ug的cGLP-1 (7-38)；記此時(shí)為零時(shí)刻。1組于0. 5、1. 5、3. 5、 5. 5,7. 5小時(shí)給予200uL 16%葡萄糖溶液，分別于1、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)行小鼠尾靜脈取血 10uL，用血糖測試儀測定血糖濃度；2組于0. 5,1. 5小時(shí)給予200uL 16%葡萄糖溶液，分別于1、2小時(shí)進(jìn)行小鼠尾靜脈取血10uL，用血糖測試儀測定血糖濃度；3組于0. 5,1. 5,3. 5、 5. 5小時(shí)給予200uL 16 %葡萄糖溶液，分別于1、2、4、6小時(shí)進(jìn)行小鼠尾靜脈取血IOul，用血 糖測試儀測定血糖濃度；4組于3. 5、7. 5小時(shí)給予200uL 16%葡萄糖溶液，分別于4、8小時(shí) 進(jìn)行小鼠尾靜脈取血10uL，用血糖測試儀測定血糖濃度。結(jié)果如下表所示，所示數(shù)值均為n= 10的均值，所示降糖率按如下方法計(jì)算降糖 率(％)=(生理鹽水對照組血糖值-給藥組血糖值)/生理鹽水對照組血糖值。與生理 鹽水對照組小鼠相比，在給藥后1小時(shí)，cGLP-1和GLP-I均能顯著降低小鼠血糖，且cGLP_l 的降血糖幅度更大；在給藥后2小時(shí)，GLP-I的降血糖作用已不顯著，而cGLP-1可在6 8 小時(shí)內(nèi)顯著降低小鼠血糖，體內(nèi)藥效時(shí)間比GLP-I延長。結(jié)果表明，按本發(fā)明GLP-I衍生物 cGLP-1表現(xiàn)出比GLP-I更加長效的降血糖活性。表cGLP-1的降血糖作用
降糖率(％)
組別 -
Ih2h4h6h8h
100000230.311. 5000368. 353. 740.920.904--67. 5-25. 2實(shí)施例9GLP-1衍生物mGLP-1和本發(fā)明GLP-1衍生物cGLP-1的降血糖作用比較。實(shí)驗(yàn)材料與方法雌性健康昆明小鼠(清潔級，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供)；16%葡萄糖溶液；0.9% NaCl 溶液；mGLP-1，具有實(shí)施例1所述GLP-I衍生物的結(jié)構(gòu)；cGLP-1，具有實(shí)施例2所述GLP-1衍生物的結(jié)構(gòu)；血糖測試儀(上海新立醫(yī)療器械有限公司出品)。雌性健康昆明小鼠禁食16小時(shí)，分為3組(η= 10)。1，生理鹽水對照組；2，mGLP_l 給藥對照組，具體的序列結(jié)構(gòu)是實(shí)施例1中所述的結(jié)構(gòu)；3，cGLP-1給藥組，具體的序列結(jié)構(gòu) 是實(shí)施例2中所述的結(jié)構(gòu)。mGLP-1給藥對照組2腹腔注射0. 4ug的mGLP-1 ；cGLP-1給藥 組3腹腔注射0. 4ug的cGLP-1 (7-38)；記此時(shí)為零時(shí)刻。1組于1. 5,3. 5,5. 5,7. 5小時(shí)給 予200uL 16%葡萄糖溶液，分別于2、4、6、8小時(shí)進(jìn)行小鼠尾靜脈取血10uL，用血糖測試儀 測定血糖濃度；2組于1. 5、3. 5、5. 5小時(shí)給予200uL 16%葡萄糖溶液，分別于2、4、6小時(shí)進(jìn) 行小鼠尾靜脈取血10uL，用血糖測試儀測定血糖濃度；3組于1. 5,3. 5,5. 5,7. 5小時(shí)給予 200uL 16%葡萄糖溶液，分別于2、4、6、8小時(shí)進(jìn)行小鼠尾靜脈取血IOul，用血糖測試儀測 定血糖濃度。結(jié)果如下表所示，所示數(shù)值均為n= 10的均值，所示降糖率按如下方法計(jì)算降糖 率(％)=(生理鹽水對照組血糖值-給藥組血糖值)/生理鹽水對照組血糖值。與生理鹽水對照組小鼠相比，在給藥后2 4小時(shí)，mGLP-1和cGLP_l均能顯著降低小鼠血糖，且 cGLP-1的降血糖幅度更大；在給藥后6小時(shí)，mGLP-1的降血糖作用已不顯著，而cGLP_l仍 然能夠顯著降低小鼠血糖，體內(nèi)藥效時(shí)間比mGLP-1延長。結(jié)果表明，按本發(fā)明GLP-I衍生 物cGLP-1表現(xiàn)出比按背景技術(shù)公開的mGLP-1更加長效的降血糖活性。表mGLP-1和cGLP-Ι的降血糖作用比較
權(quán)利要求
1.一種GLP-I衍生物，其特征在于，該衍生物具有分子結(jié)構(gòu)式CGLP-I (7-38)，即％(1 ID No. 3 ；其中，)(aa2是Gly, Thr或Val中的任何一個氨基酸，Xaa32是Cys0
2.如權(quán)利要求1所述的GLP-I衍生物，其中，所述是Gly。
3.如權(quán)利要求2所述GLP-I衍生物的重組制備方法，其特征在于，包括步驟(1)按GLP-I衍生物的氨基酸編碼序列，合成GLP-I衍生物氨基酸編碼序列的長度為 729bp的融合基因片段，即kq ID No. 4 ；其中，n535 = n536 = g, n537 = c ；其中，該片段 含有硫氧還蛋白、六聚組氨酸、腸激酶位點(diǎn)、GLP-I衍生物基因、終止密碼子TAA、限制性內(nèi) 切酶Xba I和HindIII位點(diǎn)；(2)用限制性內(nèi)切酶)(baI和HindIII雙酶切，插入帶有卡那霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒 pET28a (+)中，構(gòu)建得到含有GLP-I衍生物基因的重組表達(dá)載體pET28a (+) -cGLP-1 ；(3)將含有GLP-I衍生物基因序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞大腸桿菌，獲得基因 工程菌株；(4)將基因工程菌株液體發(fā)酵，獲得含GLP-I衍生物融合蛋白的濕菌體；(5)將濕菌體破壁，從上清液中分離獲得含GLP-I衍生物融合蛋白的粗品；(6)用腸激酶裂解融合蛋白，經(jīng)純化、冷凍干燥制得GLP-I衍生物純品。
4.如權(quán)利要求2所述GLP-I衍生物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的基因工程菌 是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α，BL21 (DE3)或BLR (DE3)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的GLP-I衍生物在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性 成分的應(yīng)用。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的按權(quán)利要求1或2所述的GLP-I 衍生物，以及藥學(xué)可接受的成分。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型GLP-1衍生物，該衍生物具有分子結(jié)構(gòu)式cGLP-1(7-38)即Seq ID No.3，其中Xaa2是Gly，Thr和Val中的任何一個氨基酸。該衍生物通過DNA重組技術(shù)制備，具有長于GLP-1的半衰期，適合于在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分。
文檔編號A61P3/10GK102108097SQ20091024734
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者包志宏, 吳自榮, 楊利, 汪洋, 蔣子威, 黃靜 申請人:上海海泰藥業(yè)有限公司, 華東師范大學(xué)