專(zhuān)利名稱(chēng)：一種禽流感疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種病毒疫苗，具體涉及一種禽流感病
毒疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的傳染病，是引起人類(lèi)死亡的主要病原之一。1918年西班牙流感大流行曾奪去2000萬(wàn)人的生命；其后人類(lèi)又遭受3次流感大流行，許多人喪命。而每年的小流行也不可小視，全世界每年由于流感病毒感染而死亡的人數(shù)超過(guò)50萬(wàn)。流感病毒也在動(dòng)物中廣泛存在，能引起豬、雞、馬等動(dòng)物流感流行，導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。從1997年開(kāi)始在香港出現(xiàn)的一種新的H5N1型禽流感，到目前為止已有數(shù)百人死于H5N1型禽流感。疫苗是目前預(yù)防流感最普遍切有效的方法。
禽流感病毒屬正黏病毒科，流感病毒屬。根據(jù)抗原性的不同，可分為A、B、C三型。A型流感病毒可見(jiàn)于人類(lèi)、多種禽類(lèi)、豬和馬及其他哺乳動(dòng)物，B型和C型一般只見(jiàn)于人類(lèi)。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原特性，將A型流感病毒分成不同的亞型。目前，有15種特異的HA亞型和9種特異的NA亞型。其中HA是病毒表面最多的糖蛋白，也是變異最大的基因，HA與宿主細(xì)胞表面受體的唾液酸殘基末端的結(jié)合，可以調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞膜的融合，HA還是病毒主要的保護(hù)性抗原抗HA的抗體對(duì)病毒的感染具有中和作用。
然而現(xiàn)有技術(shù)中，大部分禽流感疫苗均以注射方式接種，接種復(fù)雜，順應(yīng)性低，如果能夠?qū)⒅频玫陌琀A抗原的疫苗直接以口服的方式接種，將是非?？扇『头奖愕?，因?yàn)?，采用口服的方式接種疫苗即允許非侵入性自主接種，從而使激發(fā)包括肺部、呼吸道、腸道以及泌尿生殖系統(tǒng)在內(nèi)的粘膜免疫系統(tǒng)成了可能，使疫苗的免疫效果更有效。然而將傳統(tǒng)抗原疫苗進(jìn)行口服直接接種并不是一個(gè)可取的辦法，這是因?yàn)榭诜臃N的疫苗在經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)會(huì)遭到腸胃內(nèi)環(huán)境的破壞，使疫苗失效，并最終導(dǎo)致口服耐受的發(fā)生或者需要更多劑量的疫苗來(lái)完成口服疫苗的接種工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有禽流感HA抗原疫苗難以口服或口服效果不
佳的問(wèn)題，并針對(duì)該問(wèn)題提供一種禽流感疫苗。 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題 —種禽流感疫苗，所述禽流感疫苗的有效成分包括固定成分及選擇性加入成分，所述固定成分為HA抗原，禽流感疫苗為口服劑，固定成分還包括油制劑，所述油制劑包括兩親性物質(zhì)及輔助添加劑。 本發(fā)明所提到的禽流感疫苗正是基于對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，提出了一種新的抗原油載體，該載體為兩親性物質(zhì)，即同時(shí)具有親水性和親油性，本發(fā)明所述的兩親性物質(zhì)的分子中具有至少一個(gè)用于包裹HA抗原的兩親鞘，從而在本發(fā)明所述禽流感疫苗中，每個(gè)兩親鞘均與HA抗原建立一個(gè)類(lèi)似反膠束的結(jié)構(gòu)，由此，HA抗原即可在疫苗進(jìn)入人體腸胃時(shí)，
3與腸胃內(nèi)環(huán)境隔絕，使HA抗原順利到達(dá)全身，從而被巨噬細(xì)胞攝取和處理。 同時(shí)為了配合兩親性物質(zhì)作用的發(fā)揮，應(yīng)當(dāng)將禽流感疫苗制成油制劑口服疫苗，
也即該疫苗必須無(wú)水，這樣就使疫苗中有關(guān)的蛋白質(zhì)變性和相分離等問(wèn)題微乎其微，所以
本發(fā)明所述油制劑還應(yīng)當(dāng)包括輔助油制劑，另外，利用包含的兩親性物質(zhì)，油制劑可以自乳
化，服食后，即可分裂成小液滴，容易通過(guò)淋巴管分散，從而減少服用疫苗后身體所產(chǎn)生的
局部不良反應(yīng)的發(fā)生。 所述兩親性物質(zhì)，進(jìn)一步的，至少包括甘油磷脂類(lèi)(如磷脂酰膽堿)或鞘氨醇磷脂 中的一種。 所述輔助油制劑可以是由礦物油、角鯊烯、葉綠醇、合成中鏈甘油三酯M818及 M840丙二醇酯所組成的組成油。 正如本發(fā)明在對(duì)疫苗口服所能得到的益處講到的一樣，疫苗口服使激發(fā)包括肺 部、呼吸道、腸道以及泌尿生殖系統(tǒng)在內(nèi)的粘膜免疫系統(tǒng)成了可能，但在臨床上，單獨(dú)口服 抗原并不能有效的激發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)，從而不能保證人體在通過(guò)疫苗接種后獲得長(zhǎng)期有效 的免疫力。在本發(fā)明之前，一些化學(xué)制劑通常也可以被用來(lái)提高人體的免疫反應(yīng)，但事實(shí) 上，大部分已經(jīng)被證明是無(wú)效的。 基于這一點(diǎn)，本發(fā)明所述禽流感疫苗還包括選擇性加入成分，該成分為重組霍亂 毒素B亞單位(rCTB)佐劑，該佐劑可以充分提高抗原特異性IgA的抗體反應(yīng)，并且rCTB安 全無(wú)毒，容易獲準(zhǔn)用于人體使用。 為了使本發(fā)明易于實(shí)施，本發(fā)明還提供了制備禽流感疫苗的方法，該方法包括HA
抗原的制備以及禽流感疫苗的制備，所述禽流感疫苗的制備包括 ①、將兩親性物質(zhì)經(jīng)超聲處理分散在蒸餾水中，得到第一溶液； ②、向第一溶液中加入HA抗原或者由HA抗原和選擇性加入成分構(gòu)成的加入成分，
從而得到第一混合物； ③、將第一混合物真空凍干，形成凍干粉，并向凍干粉中加入輔助油制劑得到第二 混合物； 、將第二混合物在室溫下攪拌混合，直至變成清澈溶液，從而得到禽流感疫苗。
所述HA抗原的制備可以采用現(xiàn)有方法進(jìn)行，例如 (1).接種雞胚擴(kuò)增病毒，通過(guò)收集尿囊液、差速離心濃縮的辦法獲得粗制病毒抗 原，但該方法獲得的抗原純度不高，制備抗體針對(duì)性不強(qiáng)，需通過(guò)血凝、血抑等試驗(yàn)進(jìn)一步 篩選； (2).通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，但原核表達(dá)缺 乏翻譯后加工系統(tǒng)，對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾，且有報(bào)道表 明血凝素基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌有毒性，無(wú)法保證蛋白的活性和滿(mǎn)足大量生產(chǎn)的需要；
(3).構(gòu)建真核表達(dá)載體并通過(guò)轉(zhuǎn)染劑誘導(dǎo)或電轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，獲得 瞬時(shí)表達(dá)，但是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法也不適用于大量抗原制備，同時(shí)容易受到轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞狀 態(tài)等試驗(yàn)因素的影響； (4).通過(guò)構(gòu)建能夠表達(dá)血凝素抗原的重組禽痘病毒載體，制備禽痘疫苗，雖然對(duì)
禽類(lèi)顯示出較好的攻毒保護(hù)性，但不可能通過(guò)該方法獲取大量血凝素抗原； (5).將血凝素抗原在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和枯草桿菌中表達(dá)，但顯示出較低的表達(dá)量。
為了克服現(xiàn)有制備禽流感HA抗原的方法不能大量生產(chǎn)高純度高生物活性的HA抗原，本發(fā)明在制備HA抗原時(shí)，采用了不同的技術(shù)方案，即所述HA抗原的制備包括重組桿狀病毒的構(gòu)建以及在重組桿狀病毒的外殼制備HA抗原，所述重組桿狀病毒的構(gòu)建包括
1、將含有白斑癥病毒(WSSV)iel啟動(dòng)子的HA表達(dá)盒通過(guò)插入穿梭載體并與桿狀病毒的基因組整合得到含重組桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒； 2、將1步驟得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)分離該昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞得到重組桿狀病毒。 在制備HA抗原的過(guò)程中，本發(fā)明首先構(gòu)建了包含白斑癥病毒(WSSV)iel啟動(dòng)子的表達(dá)載體表達(dá)H5N1禽流感病毒HA抗原的重組桿狀病毒，所使用的(WSSV)iel啟動(dòng)子已經(jīng)在Microarray and RT-PCR screening for white spotsyndrome virus immediate-earlygenes in cycloheximide—treated shrimp, (Virology, 334 (2) ， 327—341 (2005))中有所手艮道，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)在WSSV iel啟動(dòng)子的幫助下，重組桿狀病毒能夠高效率的生產(chǎn)HA抗原，同時(shí)所得到的HA抗原具有高生物活性。 另一方面，利用桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗是具有眾多優(yōu)點(diǎn)的，例
如不需要在開(kāi)發(fā)，制造，或管理中使用任何活流感病毒，從而提高疫苗的安全性。 又如，作為一種替代傳統(tǒng)的雞蛋為基礎(chǔ)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗的方法，利
用重組桿狀病毒生產(chǎn)疫苗采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞，簡(jiǎn)化培養(yǎng)和純化程序，而且不需
要進(jìn)行滅活，通過(guò)重組桿狀病毒制備的HA抗原也可以維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象，在宿主體內(nèi)引
發(fā)的更好的免疫反應(yīng)。 此外，重組桿狀病毒可以使循環(huán)病毒和疫苗抗原完全一致。作為一個(gè)DNA病毒，經(jīng)過(guò)幾代的擴(kuò)增后，重組桿狀病毒基因組仍然是穩(wěn)定的，而流感病毒經(jīng)常受到抗原變化和漂移。這一特點(diǎn)使重組桿狀病毒高質(zhì)量可靠的大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗成為現(xiàn)實(shí)。由于技術(shù)人員可靈活構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，桿狀病毒載體可任意構(gòu)建任意組合的流感蛋白質(zhì)抗原。 得到的重組桿狀病毒用于制備HA抗原，使用重組桿狀病毒表面展示技術(shù)可以在
桿狀病毒外殼制備大量復(fù)雜抗原蛋白，并且保持蛋白的天然抗原性構(gòu)象，良好的穩(wěn)定性可
以使通過(guò)表面展示技術(shù)制備的抗原蛋白在人體內(nèi)的半衰期較普通抗原蛋白更長(zhǎng)。 同時(shí)相比于通過(guò)其它重組桿狀病毒策略在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HA抗原這一手段來(lái)制
備HA抗原，使用本發(fā)明所述重組桿狀病毒表面展示技術(shù)制備HA抗原不存在HA抗原的純化
難題，而且得到的HA抗原純度也比前者高。 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明也可以使用表達(dá)HA抗原的重組桿狀病毒本身作為禽流感疫苗。


圖1是實(shí)施例1中口服免疫抗體測(cè)量實(shí)驗(yàn)所得到的血清血凝抑制滴度的結(jié)果(V表示油制劑，BacHA表示本發(fā)明制得的疫苗用HA抗原)； 圖2是實(shí)施例1中口服免疫抗體測(cè)量實(shí)驗(yàn)所得到的H5HA抗原特異血清IgG滴度的結(jié)果(V表示油制劑，BacHA表示本發(fā)明制得的疫苗用HA抗原)； 圖3是實(shí)施例1中口服免疫抗體測(cè)量實(shí)驗(yàn)所得到的H5HA抗原特異粘膜IgA水平
5結(jié)果(V表示油制劑，BacHA表示本發(fā)明制得的疫苗用HA抗原)。
具體實(shí)施例方式
HA抗原的制備方法包括重組桿狀病毒的構(gòu)建以及在重組桿狀病毒的外殼制備HA 抗原，該方法以流行范圍廣致病能力強(qiáng)的H5N1禽流感病毒血凝素H5抗原作為靶標(biāo)，選用桿 狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)用于疫苗的HA抗原，所述重組桿狀病毒的構(gòu)建包括
a、將含有白斑癥病毒(WSSV)iel啟動(dòng)子的HA表達(dá)盒通過(guò)插入穿梭載體并與桿狀 病毒的基因組整合得到含重組桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒； b、將a步驟得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)分離該昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞得到重 組桿狀病毒。 其中a步驟可以根據(jù)Bac-To-Bac系統(tǒng)操作手冊(cè)的指導(dǎo)進(jìn)行操作，作為一種優(yōu)選， a步驟中的內(nèi)桿狀病毒為DH10BACTM，所述穿梭載體為pFastBacl，而b步驟中的昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì) 胞可以為SF9細(xì)胞。 b步驟所述的培養(yǎng)分離可以采用常規(guī)的方法進(jìn)行，例如a步驟得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞后，培養(yǎng)經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒感染的昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，獲取含有重 組桿狀病毒的上清，對(duì)上清進(jìn)行離心。 測(cè)量離心后的產(chǎn)物的病毒滴度，用于疫苗的HA抗原由血凝滴度(HA)為1og28的 病毒表達(dá)制備。 所述重組桿狀病毒的HA基因部分由H5N1流感病毒的印度尼西亞菌株的HA部分
擴(kuò)增而來(lái)。作為一種優(yōu)選，可以選用CDC/669/印度尼西亞/06或CDC/594/印度尼西亞/06，
以獲得的兩種不同亞型(669clade 2. 1. 2及594clade2. 1. 3) 實(shí)施例1 1.禽流感疫苗的制備 1. 1、重組桿狀病毒的構(gòu)建 從兩種不同H5N1流感印度尼西亞病毒株(CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/ Indonesia/06)擴(kuò)增獲得到HA基因全長(zhǎng)開(kāi)放表達(dá)盒，利用引物WSSVielF-5' -CCTACGTATCA ATTTTATGTGGCTAATGGAGA-3'和WSSVielR-5' -CGCGTCGACCTTGAGTGGAGAGAGAGCTAGTTATAA-3'從WSSV DNA擴(kuò)增得到Iel啟動(dòng)子。 原始桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體pFASTBacl (也即穿梭載體，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司) 先進(jìn)行了如下修飾刪除多角蛋白啟動(dòng)子系列，包括His標(biāo)簽、ATG、Rsr11與HindIII限制 性?xún)?nèi)切酶多克隆位點(diǎn)，然后pFASTBacl通過(guò)HA表達(dá)盒上的Accl和RsrII限制位點(diǎn)插入，從 而使擴(kuò)增的HA基因位于pFASTBacl載體SV40終止子上游和WSSViel啟動(dòng)子下游，形成構(gòu) 建物。 根據(jù)Bac-To-Bac系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，通過(guò)定點(diǎn)轉(zhuǎn)座將構(gòu)建物整合進(jìn)入DHlOBac (購(gòu)自 美國(guó)Invitrogen公司)的桿狀病毒基因組，得到含重組桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒，然后 將該質(zhì)粒感染200mi細(xì)胞密度為2Xl(fcells/ml Sf9細(xì)胞，并使復(fù)合感染率(MOI)為0. 5， 使用SF-90011 SFM(購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司)培養(yǎng)基，27。C條件下擴(kuò)增重組桿狀病毒。
擴(kuò)增得到的重組桿狀病毒釋放至培養(yǎng)基中，收集4dpi時(shí)的成熟病毒顆粒，并對(duì)收 集得到的成熟病毒顆粒用0. 22 m濾器過(guò)濾，利用噬菌斑方法測(cè)定病毒滴度，病毒儲(chǔ)液4°C保存。 重組桿狀病毒大量擴(kuò)增，通過(guò)兩輪蔗糖梯度離心收集病毒，實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(0' Reilly et al. ，1992)。 利用單一反射免疫擴(kuò)散方法(SRID)測(cè)定重組桿狀病毒HA含量，疫苗按照10828血
凝集滴度(HA)制備。 1. 2、 口服油制劑疫苗的制備 在2-『C下，用探頭超聲將兩親性磷脂酰膽堿超聲lOmin，并將其分散在蒸餾水中，形成的溶液濃度為100mg/ml。將100iil該溶液加入2ml帶螺帽玻璃小瓶，然后單獨(dú)加入來(lái)自重組桿狀病毒的150 ii g HA蛋白(來(lái)自CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/Indonesia/06 H5HA各75 y g)，得到的第一混合物在4。C下真空凍干過(guò)夜，得到凍干粉；
將1ml由礦物油、角鯊烯、葉綠醇、合成中鏈甘油三酯M818及M840丙二醇酯所組成的輔助油制劑，其中礦物油、角鯊烯、葉綠醇、合成中鏈甘油三酯M818及M840丙二醇酯的
體積比為3 :i:i:2:i。 添加到凍干粉，在室溫下攪拌混合，直至變成清澈溶液，即為口服油制劑疫苗，疫苗-2(TC儲(chǔ)藏備用。 口服油制劑疫苗也可以這樣制備 在2-『C下，用探頭超聲將兩親性磷脂酰膽堿超聲10min將其分散在蒸餾水中，濃
度為100mg/ml。將100iil該溶液加入2ml帶螺帽玻璃小瓶。然后加入來(lái)自重組桿狀病毒
的150iig HA蛋白(來(lái)自CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/Indonesia/06H5HA各75 ii g)
和100 ii g rCTB，得到的第一混合物在4t:下真空凍干過(guò)夜，得到凍干粉； 將lml由礦物油、角鯊烯、葉綠醇、合成中鏈甘油三酯M818及M840丙二醇酯所組
成的輔助油制劑 添加到凍干粉，在室溫下攪拌混合，直至變成清澈溶液，即為口服油制劑疫苗，疫苗-2(TC儲(chǔ)藏備用。 所述重組霍亂毒素B亞單位(rCTB)由上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司提供。
2.禽流感疫苗的免疫性實(shí)驗(yàn) 所有活病毒實(shí)驗(yàn)均在符合疾病預(yù)防控制中心/美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院和世界衛(wèi)生組織建議的生物安全3級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
2. 1、 1. 0高致病性禽流感H5N1型病毒的擴(kuò)增 對(duì)于本實(shí)施例所述疫苗的效果用1. 0高致病性禽流感H5N1型流感毒株進(jìn)行宿主挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)，該病毒是由下列方法擴(kuò)增得到 H5N1A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因序列信息來(lái)源NCBI流感數(shù)據(jù)庫(kù)，由美國(guó)GenScript合成，將合成的HA和NA基因克隆到雙啟動(dòng)子質(zhì)粒，用于甲型流行性感冒反向遺傳學(xué)操作，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑將包含HA和NA的質(zhì)粒及來(lái)自于甲型波多黎各Rico/8/34 (H1N1病毒)的六個(gè)基因質(zhì)粒(PB 1、PB2、PA、NP、M、NS)轉(zhuǎn)染至293T和MDCK細(xì)胞共培養(yǎng)物，使該重組病毒獲得拯救，隨后向雞胚胎接種，接種48小時(shí)后收獲尿囊液，用血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。 然后在4。C，將尿囊液20，000Xg離心20min，棄沉淀，接著上清液在4t:，100， 000 X g超速離心2h，得到1. 0高致病性禽流感H5N1型流感毒株，在-8(rC下儲(chǔ)存。
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2. 2、 H5N1病毒感染挑戰(zhàn)試驗(yàn) 事先測(cè)定小鼠鼻腔流感病毒挑戰(zhàn)試驗(yàn)所需半數(shù)致死劑量，SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠 (6周齡)末次接種疫苗4周后，將小鼠轉(zhuǎn)移至動(dòng)物BSL3環(huán)境，每組5只小鼠通過(guò)鼻腔給予 5MLD50(小鼠半數(shù)致死劑量)的異源1. 0高致病性禽流感H5N1型病毒進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)，對(duì)于 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(6周齡)1. 0高致病性禽流感H5N1型流感毒株的半數(shù)致死劑量為 lOul 28說(shuō)的病毒。每日觀察小鼠體重和死亡率，直到所有的動(dòng)物死亡，或直至挑戰(zhàn)試驗(yàn)后 第14天，所有挑戰(zhàn)試驗(yàn)在第3級(jí)動(dòng)物生物安全控制設(shè)施中進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照國(guó)家 傳染病研究所(NIID)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南繁殖培育，下表為H5N1病毒感染挑戰(zhàn)試驗(yàn)的結(jié)果，在該 表中存在不同的分組，如在14天之內(nèi)該組所有的動(dòng)物死亡，則數(shù)據(jù)紀(jì)錄到當(dāng)時(shí)為止，若尚 有幸存者則繼續(xù)記錄至14天為止。挑戰(zhàn)試驗(yàn)表疫苗分組存活率w體重減輕百分比Voil+BacHA+rCTB100%4. 6%Voil+BacHA100%8. 4%Voil+rCTB20%25. 17%Voil單獨(dú)0%26. 86%BacHA+rCTB60%18. 76%BacHA單獨(dú)60%21. 54%rCTB單獨(dú)0%25. 55%對(duì)照0%27. 54% *5MLD50劑量的存活率；
**體重減輕百分比； Voil表示油制劑，BacHA表示本發(fā)明制得的疫苗用HA抗原；
對(duì)照即不對(duì)小鼠進(jìn)行任何免疫。 另夕卜，BacHA單獨(dú)的或者加有rCTB的油制劑免疫的組在挑戰(zhàn)后第3天體重降低 8%，并獲得100%對(duì)H5N1病毒的保護(hù)。并且同時(shí)服用BacHA和rCTB的油制劑小鼠體重很 快恢復(fù)(5天內(nèi))。然而，BacHA單獨(dú)的或者加有rCTB的非油制劑組的小鼠在挑戰(zhàn)試驗(yàn)后第 6天體重分別降低約22 %和18%，并且這兩組小鼠對(duì)5MLD50高致病性禽流感H5N1病毒僅 表現(xiàn)出了60%的保護(hù)作用。 2. 3、 口服免疫抗體測(cè)量實(shí)驗(yàn)以及測(cè)量方法
2. 3. 1抗體的采集 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(6周齡)，免疫前，所有免疫小鼠禁食2h，其余時(shí)間自由 飲水和進(jìn)食。每組10只小鼠(n= 10/組)，分別在0，7和14日用100iU選擇性的含有 1og28HA滴度(15iig)重組桿狀病毒血凝素、10iig rCTB以及由礦物油、角鯊烯、葉綠醇、合 成中鏈甘油三酯M818及M840丙二醇酯所組成的輔助油制劑的疫苗灌胃免疫，分別在第14 天采集各組(每組隨機(jī)選5只)小鼠血清，來(lái)自同一組的另5只小鼠在28天處死，采集血 清和粘膜拭子。 2. 3. 2抗體的檢測(cè)方法 本實(shí)施例采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(間接ELISA法)檢測(cè)抗H5HA型特異性抗體(粘膜IgA以及血清IgG)濃度 96孔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板用經(jīng)純化、碳酸鹽緩沖液配制最佳濃度為400ng/孔的重組H5HA包被； 測(cè)試血清樣品用含有0. 05%吐溫20的3%脫脂奶粉/磷酸鹽緩沖液(PBS-T)連續(xù)稀釋2倍，粘膜沖洗液直接按1 : 20稀釋?zhuān)?然后，在各孔添加與辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)的羊抗鼠IgG(來(lái)自Sigma公司，USA)和山羊抗鼠IgA(來(lái)自Bethyl Lab)，隨后加入底物3， 3' ，5，5' _四甲基聯(lián)苯胺(來(lái)自Sigma公司，USA)，即可顯色檢測(cè)，用25 ill 1M硫酸停止反應(yīng)，450nm酶標(biāo)儀測(cè)量吸光值。
本實(shí)施例采用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)抗體反應(yīng)抑制HA的效果 受體破壞酶處理過(guò)的血清在V型底96孔板連續(xù)稀釋2倍，室溫下，約4HA單位病毒抗原與血清孵育30分鐘，然后添加1 % cRBCs，并在室溫孵育40分鐘，抑制血凝的最高血清稀釋度作為血清血凝抑制滴度。 2. 4、對(duì)2. 3 口服免疫抗體測(cè)量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析
2. 4. 1 口服疫苗后全身性抗體反應(yīng) 血清HA特異性IgG抗體反應(yīng)表明，口服BacHA油制劑免疫小鼠組特異性IgG抗體滴度比無(wú)油BacHA組顯著增強(qiáng)。 然而，擁有rCTB佐劑的BacHA油制劑相比于無(wú)佐劑BacHA油制劑，IgG抗體滴度并無(wú)顯著提高。 HI滴度結(jié)果表明，與無(wú)佐劑BacHA油制劑相比，加有佐劑(rCTB)的BacHA油制劑口服免疫小鼠第14天和42天血清HI滴度顯著提高。然而，單獨(dú)用BacHA或加入rCTB的BacHA無(wú)油制劑僅表現(xiàn)較低HI滴度。
2.4.2粘膜免疫反應(yīng)的口服給藥 在第42天(末次免疫后4個(gè)星期)用間接ELISA法確定HA特異性粘膜IgA水平。與無(wú)佐劑BacHA油制劑免疫的小鼠相比，加有佐劑(rCTB)的BacHA油制劑免疫的小鼠粘膜IgA明顯要高(P > 0. 05) 。 BacHA單獨(dú)的或者加有rCTB的BacHA無(wú)油制劑僅誘導(dǎo)非常低的HA特異粘膜IgA抗體反應(yīng)。
權(quán)利要求
一種禽流感疫苗，所述禽流感疫苗的有效成分包括固定成分及選擇性加入成分，所述固定成分為HA抗原，其特征在于禽流感疫苗為口服劑，固定成分還包括油制劑，所述油制劑包括兩親性物質(zhì)及輔助油制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感疫苗，其特征在于所述輔助油制劑包括礦物油、 角鯊烯、葉綠醇、合成中鏈甘油三酯M818及M840丙二醇酯，所述兩親性物質(zhì)至少包括甘油 磷脂類(lèi)或鞘氨醇磷脂中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感疫苗，其特征在于所述選擇性加入成分包括重組 霍亂霉素B亞單位(rCTB)佐劑。
4. 一種權(quán)利要求1或2或3所述禽流感疫苗的制備方法，包括HA抗原的制備以及禽流 感疫苗的制備，所述禽流感疫苗的制備包括① 、將兩親性物質(zhì)經(jīng)超聲處理分散在蒸餾水中，得到第一溶液；② 、向第一溶液中加入HA抗原或者由HA抗原和選擇性加入成分構(gòu)成的加入成分，從而 得到第一混合物；③ 、將第一混合物真空凍干，形成凍干粉，并向凍干粉中加入輔助油制劑得到第二混合物；④ 、將第二混合物在室溫下攪拌混合，直至變成清澈溶液，從而得到禽流感疫苗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述HA抗原的制備包括重組桿狀病毒 的構(gòu)建以及在重組桿狀病毒的外殼制備HA抗原，所述重組桿狀病毒的構(gòu)建包括a、 將含有白斑癥病毒(WSSV)iel啟動(dòng)子的HA表達(dá)盒通過(guò)插入穿梭載體并與桿狀病毒 的基因組整合得到含重組桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒；b、 將a步驟得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)分離該昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞得到重組桿 狀病毒。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種病毒疫苗，具體涉及一種禽流感病毒疫苗及其制備方法，為了解決現(xiàn)有禽流感HA抗原疫苗難以口服或口服效果不佳的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種禽流感病毒疫苗及其制備方法，該疫苗為口服劑，其有效成分包括固定成分及選擇性加入成分，所述固定成分為HA抗原及由兩親性物質(zhì)及輔助油制劑組成的油制劑，同時(shí)為了便于實(shí)施本發(fā)明，本發(fā)明還提供了一種制備禽流感疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101745108SQ20091024738
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者況慧星, 穆坎·普拉巴卡蘭, 耿雨紅, 舒躍龍, 賽爾瓦拉吉·馬丹 申請(qǐng)人:上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司