專利名稱：血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，尤其是一種以新鮮豬血為原 料，無毒副作用、安全性高、成本廉價(jià)、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽、 制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是引起 腦卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，嚴(yán)重威脅著人類的健康。血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶在 人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，對(duì)血壓調(diào)節(jié)起著重要的作用，它可 以將血管緊張素I轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，使周圍小動(dòng)脈、血管平滑肌收縮，同時(shí)刺激醛固酮 分泌，促進(jìn)人體腎臟對(duì)Na+、K+的重吸收，引起鈉儲(chǔ)量和血容量的增加，使血壓升高；還可以 使舒緩激肽失活，引起血壓升高，如果抑制了血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶的活性，就可以起到降壓 的作用?，F(xiàn)有的作為治療高血壓的合成物卡普托利就是血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶的抑制劑，但 由于它是由化學(xué)藥品合成，因此有很多副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種以新鮮豬血為原 料，無毒副作用、安全性高、成本廉價(jià)、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽、 制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽，其特征是氨 基酸序列為 Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe。一種上述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽的制備方法，其特征在于按如下步驟 進(jìn)行a.在新鮮豬血中加入體積為新鮮豬血0. 3% 0. 3%的檸檬酸鈉溶液，離心去血清， 所得血紅細(xì)胞與水等體積混合溶血，所得的血紅蛋白溶液經(jīng)酸性丙酮重復(fù)處理并干燥后， 得到灰白色的珠蛋白粉末；b.將珠蛋白粉末進(jìn)行酶解并經(jīng)過超濾膜過濾制得珠蛋白可溶蛋白酶解液；c.將珠蛋白可溶蛋白酶解液經(jīng)凝膠柱進(jìn)行層析分離及RP-HPLC純化分離。所述b步驟是稱取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值為2. 0的磷酸緩沖液中，充分 攪拌后，再加入PH值為2. 0的磷酸緩沖液調(diào)節(jié)珠蛋白濃度為3%，按酶與底物質(zhì)量比為 加入木瓜蛋白酶后在37°C的恒溫水浴中反應(yīng)12h后再在沸水中恒溫10min，3000Xg離心 IOmin取上清液，經(jīng)MW 3000道爾頓超濾膜過濾，透過超濾膜的組分為珠蛋白可溶蛋白酶解 液。所述C步驟是取珠蛋白可溶蛋白酶解液經(jīng)Si5Phadex G25柱進(jìn)行層析分離，流動(dòng)相 為純水，溫度為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，按時(shí)間收集具有血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制活性的
3組分，將所得組分在RP-HPLC上純化，具體條件是在RP-HPLC上用Hypersil C18柱，流動(dòng)相 A液為0. 1% TFA+0%乙腈的水溶液，用前超聲脫氣；流動(dòng)相B液為0. 1% TFA+100%乙腈 的水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，室溫，進(jìn)樣體積20 μ 1，采用梯度洗脫，按時(shí)間收集；洗脫梯度0 60min A液 100% 50%線性降低；B液0% 50%線性升高；60 80min A 液 0 % ;B 液 100 %。上述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽在制備降低高血壓產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明是以新鮮豬血為原料，通過提取珠蛋白粉末并對(duì)珠蛋白粉末酶解以及對(duì)珠 蛋白可溶蛋白酶解液進(jìn)一步分離、純化得到其氨基酸序列為Thr Lys ThrTyr Phe Pro His Phe的寡肽，實(shí)驗(yàn)證明是有效的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑，具有無毒副作用、安全性高、成 本廉價(jià)、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于制備降低高血壓的藥品及保健品中。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例中用S印hadex G25柱進(jìn)行層析分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為為280nm的 譜圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例在HPLC上純化譜3是應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例降血壓的效果示意圖。
具體實(shí)施例方式a.在新鮮豬血中加入體積為新鮮豬血0.3%的檸檬酸鈉溶液，離心去血清，所得 血紅細(xì)胞與水等體積混合溶血，所得的血紅蛋白溶液經(jīng)酸性丙酮重復(fù)處理并干燥后，得到 灰白色的珠蛋白粉末；b.稱取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值為2. 0的磷酸緩沖液中，充分?jǐn)嚢韬?，?加入PH值為2. 0的磷酸緩沖液調(diào)節(jié)珠蛋白濃度為3%，按酶與底物質(zhì)量比為加入木瓜 蛋白酶后在37°C的恒溫水浴中反應(yīng)12h后再在沸水中恒溫lOmin，3000 X g離心IOmin取上 清液，經(jīng)MW 3000道爾頓超濾膜過濾，透過超濾膜的組分為珠蛋白可溶蛋白酶解液。c.取珠蛋白可溶蛋白酶解液經(jīng)S印hadex G25柱進(jìn)行層析分離，流動(dòng)相為純水，溫 度為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，按時(shí)間收集具有血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分，譜圖 如圖1所示，即收集譜圖中的I、II、III、IV、V部分；將所得組分在RP-HPLC上純化，具體 條件是在RP-HPLC上用Hypersil C18柱，流動(dòng)相A液為0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前 超聲脫氣；流動(dòng)相B液為0. 1% TFA+100%乙腈的水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，室溫，進(jìn)樣體積 20 μ 1，采用梯度洗脫，按時(shí)間收集，如圖2所示獲得具有較高ACE抑制活性的吸收峰A ；洗脫梯度0 60min A液100% 50%線性降低；B液0% 50%線性升高；60 80min A 液 0 % ;B 液 100 %。對(duì)所收集的組分用高效毛細(xì)管電泳鑒定純度大于95%，基體輔助激光解吸/電離 飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-MS)和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)測(cè)定此活性肽的分子量為896. 8 氨基酸序列為Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe，此肽及肽的類似物的鹽類均可以用于制 備降低高血壓的藥物、保健品等。實(shí)驗(yàn)例
4
1.靜脈注射動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇20只自發(fā)性高血壓大白鼠(SHR)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，大白鼠飼養(yǎng)一周后，將其分成 2組，每一組10只，將本發(fā)明實(shí)施例的寡肽每日按大白鼠體重5-20mg/kg劑量進(jìn)行靜脈注 射，結(jié)果表明，1周后對(duì)照組SHR血壓持續(xù)升高，而治療組SHR的血壓明顯下降，SHR的平均 收縮壓從195mmHg下降到162mmHg說明此肽具有明顯的降血壓效果。2.灌胃動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇20只SHR為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停曫B(yǎng)一周后，將其分組，將本發(fā)明實(shí)施例的寡肽每日按 SHR體重20-200mg/kg劑量Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe進(jìn)行灌胃投入，結(jié)果表明， 4周后對(duì)照組SHR的血壓持續(xù)升高，而治療組SHR的血壓明顯下降(圖3)，平均收縮壓從 195mmHg下降到160mmHg說明此肽具有明顯的降血壓效果。上述寡肽及肽的類似物的鹽類可以用通常的方法生產(chǎn)。公認(rèn)的與酸反應(yīng)產(chǎn)生的 鹽類，比如說鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸等無機(jī)酸；蟻酸，乙酸，丙酸，甘氨膽酸，蘋果酸，檸檬酸， 酒石酸，琥珀酸等有機(jī)酸等形成的鹽類；公認(rèn)的與金屬離子形成的鹽類，包括鈉鹽，鉀鹽，鈣 鹽，銨鹽；以及氨基乙醇，三乙氨，二環(huán)乙氨等形成的胺類鹽等沒有特別的限制。本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制劑，由各種充填劑所形成的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、懸浮 液、乳化液、噴劑或粉劑等，通過口腔攝取或者是注射液的形式使用。本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制劑，可經(jīng)口腔和非經(jīng)口腔投入使用。非經(jīng)口腔的投入方法 比如皮下和靜脈注射，肛腸投入等。注射液的制作可以任意選用生理鹽水，葡萄糖，安定劑， 防腐劑，懸浮劑，乳化劑等。本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制劑，可以添加到各種食品當(dāng)中，作為抑制血壓保健食品。食 品的形態(tài)可以是清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，湯類，奶酪，火腿，點(diǎn)心等。本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制劑，使用量是沒有特別的限制，具體的要根據(jù)高血壓的程 度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素，適當(dāng)?shù)卮_定。序列表
<110>大連水產(chǎn)學(xué)院
<120>血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽、制備方法及其應(yīng)用
<160>1
<170>PatentIn Version 3. 1
<210>1
<211>8
<212>蛋白質(zhì)或肽
<213>新鮮豬血
<220>
<223>misc_feature
<400>1
Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe 8
權(quán)利要求
一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽，其特征是氨基酸序列為Thr LysThr Tyr Phe Pro His Phe。
2.一種如權(quán)利要求1所述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽的制備方法，其特征在于 按如下步驟進(jìn)行a.在新鮮豬血中加入體積為新鮮豬血0.3%的檸檬酸鈉溶液，離心去血清，所得血紅 細(xì)胞與水等體積混合溶血，所得的血紅蛋白溶液經(jīng)酸性丙酮重復(fù)處理并干燥后，得到灰白 色的珠蛋白粉末；b.將珠蛋白粉末進(jìn)行酶解并經(jīng)過超濾膜過濾制得珠蛋白可溶蛋白酶解液；c.將珠蛋白可溶蛋白酶解液經(jīng)凝膠柱進(jìn)行層析分離及RP-HPLC純化分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽的制備方法，其特征在于所 述b步驟是稱取3g珠蛋白粉末溶于90ml的pH值為2. 0的磷酸緩沖液中，充分?jǐn)嚢韬?，?加入PH值為2.0的磷酸緩沖液調(diào)節(jié)珠蛋白濃度為3%，按酶與底物質(zhì)量比為加入木瓜 蛋白酶后在37°C的恒溫水浴中反應(yīng)12h后再在沸水中恒溫lOmin，3000 X g離心IOmin取上 清液，經(jīng)MW 3000道爾頓超濾膜過濾，透過超濾膜的組分為珠蛋白可溶蛋白酶解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽的制備方法，其特征在于 所述c步驟是取珠蛋白可溶蛋白酶解液經(jīng)Si^phadex G25柱進(jìn)行層析分離，流動(dòng)相為純水， 溫度為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，按時(shí)間收集具有血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分，將 所得組分在RP-HPLC上純化，具體條件是在RP-HPLC上用Hypersil C18柱，流動(dòng)相A液為 0. TFA+0%乙腈的水溶液，用前超聲脫氣；流動(dòng)相B液為0. 1% TFA+100%乙腈的水溶 液，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，室溫，進(jìn)樣體積20μ 1，采用梯度洗脫，按時(shí)間收集；洗脫梯度0 60min A液 100% 50%線性降低；B液0% 50%線性升高；60 80minA 液 0%; B 液 100%。
5.一種如權(quán)利要求1所述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽在制備降低高血壓產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是以新鮮豬血為原料，通過提取珠蛋白粉末并對(duì)珠蛋白粉末酶解以及對(duì)珠蛋白可溶蛋白酶解液進(jìn)一步分離、純化得到其氨基酸序列為Thr Lys ThrTyr Phe Pro His Phe的寡肽，實(shí)驗(yàn)證明是有效的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑，具有無毒副作用、安全性高、成本廉價(jià)、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于制備降低高血壓的藥品及保健品中。
文檔編號(hào)A61K38/08GK101955512SQ20091024861
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者曲敏, 汪秋寬, 王剛, 胡建恩, 趙前程, 金橋, 陳瑋, 馬馳宇, 黃曉娟 申請(qǐng)人:大連水產(chǎn)學(xué)院