專利名稱：IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是適用于可耐受活檢及手術(shù)病人的IL-12及 TNF-a自體腫瘤疫苗。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康和生命的主要疾病之一，其發(fā)病率逐年增高，且目前許 多腫瘤無法用手術(shù)、放療和化療等常規(guī)手段治愈。隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的深入 研究和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的第四種模式，并受到了越 來越多的關(guān)注。腫瘤的生物治療(Biother即y)是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)品進(jìn)行腫瘤防 治的新療法，它通過調(diào)動(dòng)宿主的天然防衛(wèi)機(jī)制或給予天然(或基因工程)產(chǎn)生的靶向性很 強(qiáng)的物質(zhì)來取得抗腫瘤效應(yīng)，主要包括體細(xì)胞療法與細(xì)胞因子療法、腫瘤疫苗、分子靶向治 療、放免靶向治療、腫瘤的基因治療和生物化療等。其中，腫瘤疫苗是近年來國內(nèi)外研究的 熱點(diǎn)之一，其原理是通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的目的。隨著分子 生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，腫瘤疫苗的研究取得了令人鼓舞的成果，現(xiàn)階段研究較多的腫 瘤疫苗有腫瘤細(xì)胞疫苗、腫瘤抗原疫苗、以DC(樹突狀細(xì)胞)為基礎(chǔ)的疫苗以及核酸疫苗 等。盡管現(xiàn)有疫苗表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤潛能，但也存在特異性差、免疫原性不強(qiáng)、副作用大、 安全性差等缺點(diǎn)，故未能在臨床上推廣應(yīng)用，如何研制出適合臨床應(yīng)用，且副作用小的腫瘤 疫苗是目前腫瘤界面臨的一項(xiàng)重大課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種副作用小，免疫原性及靶向性強(qiáng)的IL-12及TNF- a自體 腫瘤疫苗。 本發(fā)明所述IL-12及TNF-a自體腫瘤疫苗為含有IL-12基因、TNF-a基因和腫 瘤細(xì)胞的組合物。 所述組合物具有一種或多種醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑，如Titer Max Gold、 QS21、 PLGA、乙酰殼多糖微粒、SAF、 FAS-m等。 制備表達(dá)IL-12及TNF-a基因的腫瘤疫苗，是在無菌條件下將切除的腫瘤標(biāo)本 分離成單個(gè)腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37°C 、5% C02條件 下，含10X胎牛血清的匿EM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，三天更換培養(yǎng)液，一周左右傳代。為提高轉(zhuǎn)染效 率，避免脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的毒性，采用聲學(xué)微泡造影劑代替脂質(zhì)體將IL-12真核表達(dá)質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞制成IL-12瘤苗，進(jìn)而將TNF- a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IL-12瘤苗，最后獲得含IL-12 及TNF-a基因的腫瘤疫苗。 本發(fā)明所述自體腫瘤疫苗將細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，選用的細(xì)胞因子之一為 IL-12 (白細(xì)胞介素-12) 。 IL-12主要由活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，有 較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，能誘導(dǎo)PHA剌激的T細(xì)胞增殖，體外實(shí)驗(yàn)證明，IL-12是調(diào)節(jié)Thl細(xì) 胞輔助細(xì)胞免疫功能的因素之一。IL-12全身大劑量用藥雖能產(chǎn)生有效的抗腫瘤效果，但毒性反應(yīng)嚴(yán)重而限制其臨床應(yīng)用?；蛑委煹姆椒榫植酷尫臝L-12,可避免上述危及生命的 并發(fā)癥。 本發(fā)明選用的另一細(xì)胞因子為TNF-a (腫瘤壞死因子-a)。 TNF的生物活性與 IL-1十分相似，只是TNF更易引起腫瘤血管阻塞，抗腫瘤作用更強(qiáng)。低濃度的TNF-a主要 在局部發(fā)揮作用，高濃度的TNF-a可以進(jìn)入血流，引起全身性反應(yīng)。研究表明，TNF包括 TNF-a和TNF-P。近來的研究表明人和小鼠TNF-a禾P |3的基因都與腿C基因緊密連鎖， 暗示其可能參與免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)調(diào)控。TNF-a是由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種可 溶性細(xì)胞因子，是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一。鑒于TNF-a可直接殺傷瘤 細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞，比化療藥物毒性小，TNF-a可望較其他細(xì)胞因子更快地大量應(yīng)用 于臨床。目前已上市的新藥唯美生(mI_chTNF)就是用放射性核素mI標(biāo)記TNF發(fā)揮抗腫 瘤作用。 單獨(dú)使用TNF用量大，不容易獲得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止 用藥。將其它具有腫瘤抑制作用的細(xì)胞因子(如IL-2、 IFN等)或某些抗腫瘤藥物與TNF 聯(lián)合應(yīng)用，既可減少各種藥物的用量、降低毒副作用，又可提高療效。因此本發(fā)明將IL-12 與TNF-a聯(lián)合應(yīng)用，以期更大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞，減少正常組織損傷。
將本發(fā)明所述自體腫瘤疫苗適用于可耐受活檢及手術(shù)的病人，將該自體腫瘤疫苗 加入免疫輔助劑Titer Max Gold回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以激活其自身具有免疫效應(yīng)的淋巴細(xì) 胞，并直接殺死腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 本發(fā)明將細(xì)胞因子與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，目的在于增強(qiáng)腫瘤免疫原性，提高T細(xì)胞
對腫瘤抗原的反應(yīng)性，而IL-12及TNF-a基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可使局部持續(xù)分泌IL_12及
TNF- a ，從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞，減少正常組織損傷，從而提高抑瘤率。 本發(fā)明具有操作簡單、免疫原性及靶向性強(qiáng)、制備成本低和便于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，
主要用于抗腫瘤免疫治療，包括手術(shù)后殘留、不能切除的腫瘤的治療。


圖1、 PCR擴(kuò)增出IL-12目的片段IL-12目的基因理論長度1625bp， PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳顯示成功擴(kuò)增出約1700bp的mlL-12片段，大小與目的基因相符，而陰性對 照pcDNA3. 1 (+)無明顯條帶出現(xiàn)。 圖2、重組IL-12質(zhì)粒的PCR鑒定以pcDNA3. 1 (+)-mIL-12 (lane6， 7)及 pORF-mIL-12 (lane3， 4)為PCR反應(yīng)模板均擴(kuò)增出約1700bp的mIL_12片段，而陰性對照無 明顯條帶出現(xiàn)(lane 1， 2) 圖3、重組IL-12質(zhì)粒的酶切鑒定HindIII、 EcoR I雙酶切后得2個(gè)片段，各約 1700bp和5400bp(lanel)，與插入目的基因mlL-12片段及pcDNA3. 1(+)載體大小相符， HindIII單酶切后(lane2)較原始環(huán)狀質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) (ane3)泳動(dòng)稍慢。
圖4、重組IL-12質(zhì)粒的測序鑒定各連接點(diǎn)正確，插入序列與GENEBANK序列完全 相符(p40Version NM-008352. 1， GI :6680398 ;p35Version M86672. 1， GI :198336)，表明 mIL-12基因已正確插入pcDNA3. 1 (+)載體中，證實(shí)pcDNA3. 1 (+)-mlL-12質(zhì)粒構(gòu)建成功。
圖5、轉(zhuǎn)染前的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，腫瘤細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞較亮，活性較好，貼壁生 長，細(xì)胞數(shù)呈對數(shù)增長，生長曲線較陡。
圖6、轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞
死亡，轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1 (+) -mIL-12組細(xì)胞變圓，貼壁減少，生長曲線平緩，細(xì)胞數(shù)增長緩慢，
與對照組相比P < 0. 05，轉(zhuǎn)染pORF-mIL-12組與對照組相比p > 0. 05。 圖7、IL-12活性檢測pcDNA3. 1(+)-mlL-12轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清能明顯引起
ConA激活的小鼠脾細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性(A570分別為0. 507±0. 035，0. 802±0. 040，
1. 246±0. 028)，與對照組相比p < 0.05 (圖2-3)，與O' donnell等的結(jié)果一致。 圖8、成瘤的裸鼠裸鼠右后腿皮下接種對數(shù)生長期的A549細(xì)胞2X 106個(gè)細(xì)胞/
只后，小鼠的精神狀態(tài)、食欲、活動(dòng)能力下降，睡眠時(shí)間增加，成瘤率90%，平均成瘤時(shí)間為
10d，未接種腫瘤的10只小鼠生存狀況良好。 圖9、PBS治療組腫瘤組織病理切片PBS治療后腫瘤組織無明顯壞死，也無巨噬細(xì)
胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤，腫瘤細(xì)胞較多，生長狀態(tài)較好。 圖10、 A549瘤苗治療組腫瘤組織病理切片A549瘤苗治療組與
pcDNA3. 1(+)-mlL-12質(zhì)粒治療組腫瘤出現(xiàn)大片壞死，有大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜
酸性粒細(xì)胞等浸潤。免疫組化結(jié)果證實(shí)，腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞主要為CD4+、 CD8+淋巴
細(xì)胞浸潤(黃色_棕黃色顆粒)，且A549瘤苗治療組更多(p < 0. 05)，而空載體治療組
pcDNA3. 1 (+)及PBS治療組無CD4+、 CD8+淋巴細(xì)胞(不顯色)。
具體實(shí)施例方式
—、制備表達(dá)IL-12及TNF-a基因的腫瘤疫苗 1、腫瘤細(xì)胞分離將切除的腫瘤標(biāo)本放入含50 ii g/ml慶大霉素的生理鹽水中，無 菌條件下快速送至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺內(nèi)去除壞死組織、脂肪和正常組織，用滅菌的PBS液將 取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成lmm3左右的小塊， 再用PBS清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀 到管底，棄去上清。吸取0. 25%胰蛋白酶一 0. 02% EDTA混合消化液lml，加入離心管中，與 組織塊混勻后，加上管口塞子，37t:水浴中消化8 10分鐘，每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管，使 組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5 10ml含5%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測活細(xì)胞> 80X，細(xì)胞濃度2X107ml。將細(xì) 胞移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞在37°C、5% 0)2條件下，在含10X胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，三天更換培養(yǎng)液， 一周左右傳代。傳代培養(yǎng)時(shí)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用 0. 25%胰酶消化2-5min后，用DMEM培養(yǎng)液終止消化，在低速離心機(jī)上1500rpm離心5min， 棄上清液，再用PBS液重懸細(xì)胞，再離心5min。利用ELX800微孔板讀數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞濃度后， 接種到新的培養(yǎng)瓶。 3、制備IL-12腫瘤疫苗IL-12真核表達(dá)質(zhì)粒由發(fā)明人制備并進(jìn)行鑒定(圖1，2， 3，4)，其生物學(xué)活性已檢測(圖5，6)，為提高轉(zhuǎn)染效率，避免脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的毒性，本 發(fā)明采用聲學(xué)微泡造影劑代替脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 ①聲學(xué)微泡造影劑的配制將聲諾維(六氟化硫聲學(xué)微泡)凍干制劑加入雙蒸水 2ml/支復(fù)溶，終濃度為20 ii g/ml，輕微振動(dòng)5min，即成聲學(xué)微泡造影劑(A液)，室溫靜置備 用。
②濃度為1 y g/ y L的IL-12質(zhì)粒溶液1 y L加入100 ii 1無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中作為B液。 ③將A液及B液各lOOiU按體積比1 : 1混合，使聲學(xué)微泡造影劑充分包裹質(zhì) 粒，此時(shí)肉眼可見呈云霧狀。室溫下靜置10—15min備用。加入轉(zhuǎn)染液800iil，終體積lml， 輕微振蕩，使之充分混勻。 ④從培養(yǎng)箱中取融合率達(dá)到40% —60%的LLC細(xì)胞2瓶。用100 iU轉(zhuǎn)染液清洗 細(xì)胞表面2次備用。 ⑤將步驟③中的液體加入培養(yǎng)細(xì)胞中，使均勻覆蓋于細(xì)胞表面。放入37t:、5X(A 培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染20hr。 ⑥棄上清液，加入新鮮DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)72hr， 24hr換液一次。
⑦UGT1025型超聲基因轉(zhuǎn)染儀探頭用75%酒精作偶合劑，將已經(jīng)加好IL-12質(zhì)粒 溶液+聲學(xué)微泡造影劑細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在裝有一定脫氣水的玻璃缸中進(jìn)行超聲照射，每瓶 照射20s，探頭聲波發(fā)射設(shè)置為定時(shí)間歇觸發(fā)，即兩次聲波發(fā)射間隔ls，每次發(fā)射聲波持續(xù) ls。本實(shí)驗(yàn)選用0. 5W/cm2超聲聲強(qiáng)。 ⑧轉(zhuǎn)染后的LLC細(xì)胞即為IL-12腫瘤疫苗，瘤苗中加入DMEM培養(yǎng)基，放入37t:、 5% C02培養(yǎng)箱中大量培養(yǎng)，三天換液，一周左右傳代。 4、制備IL-12及TNF-a腫瘤疫苗從培養(yǎng)箱內(nèi)取出處于對數(shù)生長期的IL-12腫 瘤疫苗，將濃度為1 y g/ y L的TNF- a質(zhì)粒溶液1 ii L加入100 y 1無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中作為B液，聲學(xué)微泡造影劑為A液，按前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最后獲得含IL-12及 TNF-a基因的腫瘤疫苗。
二、體外實(shí)驗(yàn) lj中瘤疫苗IL-12及TNF-a表達(dá) ELISA :收集轉(zhuǎn)染48h后的A549腫瘤疫苗上清，用蒸餾水將mIL_12標(biāo)準(zhǔn)品稀 釋至2000pg/mL，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品分別加入已包被mlL-12單克隆抗體的酶標(biāo) 板上，100 L/孔，三復(fù)孔，再加入生物素化的抗mIL-12，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 Str印tavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，加終止液硫酸，在492nm處測OD值，用 mIL-12標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(第8孔作為空白對照)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測樣品的mIL-12 濃度。TNF- a的檢測方法一樣，只是取TNF- a ELISA試劑盒檢測。 RT-PCR :收集轉(zhuǎn)染48h后的A549細(xì)胞，PBS洗2次，lOOOrpm離心5min，抽提總RNA 后經(jīng)DNasel處理再進(jìn)行RT-PCR， PCR的反應(yīng)條件94°C ， 2min預(yù)變性；94°C ， 50s， 55°C ， 90s， 72。C，2min，27個(gè)循環(huán);72"延長10min。 ， 1 %瓊脂糖電泳。抽提轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1 (+)的LLC細(xì) 胞總RNA進(jìn)行RT-PCR作為陰性對照。 2、檢測IL-12生物活性(T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))采用"單克隆抗體捕獲法"進(jìn)行。首先 用化20)3緩沖液(pH 9. 5)稀釋大鼠抗小鼠IL-12抗體至濃度為5ii g/L，包被96孔板，然后 加入不同稀釋度的待測樣品和對照樣品100iU，37t:作用lh，以利于單克隆抗體將樣品中 的mIL-12捕獲，培養(yǎng)孔經(jīng)PBS洗滌3次后，于每孔內(nèi)加入經(jīng)ConA(2mg/L)和mIL-12 (20mg/ L)活化培養(yǎng)3d的裸鼠脾淋巴細(xì)胞2X104，37^5^ 0)2培養(yǎng)2處，采用MTT法測定淋巴細(xì) 胞增殖活性。 TNF-a生物活性TNF-a 、TNF_|3具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株小鼠成纖維細(xì)胞株L929作為指示細(xì)胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢 測待檢樣品中TNF的活性水平。 3、內(nèi)毒素檢測經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測，產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量低于5個(gè)內(nèi)毒素單位/kg，符合疫 苗生產(chǎn)的國際標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示成功擴(kuò)增出約1700bp的mIL-12片段，大小 與目的基因相符，而陰性對照pcDNA3. 1(+)無明顯條帶出現(xiàn)。PCR鑒定、酶切鑒定及測序均 證實(shí)重組IL-12質(zhì)粒構(gòu)建成功。含IL-12及TNF- a的A549肺癌細(xì)胞腫瘤疫苗具有生物學(xué) 活性，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
三、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1、建立荷瘤鼠模型裸鼠右后腿皮下接種對數(shù)生長期的A549細(xì)胞2Xl(f個(gè)細(xì) 胞/只，觀察接種腫瘤后小鼠的精神狀態(tài)、食欲、活動(dòng)能力、睡眠狀況等。腫瘤長至直徑 0. 5-1. 0cm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。另設(shè)一空白對照組(無腫瘤的10只小 鼠)，進(jìn)行生存期比較(圖7)。 2、免疫程序從培養(yǎng)箱內(nèi)取出制備好的含IL-12及TNF-a基因的A549腫瘤疫苗，
PBS洗三次，再加入免疫輔助劑Titer Max Gold (購于美國CytRx公司)，調(diào)整細(xì)胞濃度，每
次每只小鼠瘤內(nèi)注射2X106個(gè)細(xì)胞，整個(gè)療程分5次接種，每次間隔3d。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)用S±s表示，Excel軟件作圖，采用SPSS10. 0軟件進(jìn)行
單因素方差分析，比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異，p < 0. 05有顯著性差異。
4、療效評價(jià) 1)特異性CTL、 NK細(xì)胞活性檢測 (1)脾臟單細(xì)胞懸液的制備(在開始治療后第21d分別分離4組接種小鼠的脾臟 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞) ①將無菌飼養(yǎng)小鼠斷頸處死后接血，制備血清(室溫放置2h后于4t:過夜，次日 4000rpm離心10min，吸取上清)。 @小鼠浸泡在75%酒精中10min，用無菌眼科剪刀和鑷子取出脾臟。 ③無菌PBS沖洗后以眼科彎剪刀反復(fù)剪碎，無菌PBS沖洗至無菌平皿中，2000rpm
離心5min，棄上清。
沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液2ml ，室溫裂解2min后加入含10 %小牛血清的 RPMI1640完全培養(yǎng)基，200目尼龍網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，2000rpm離心5min，棄上清。
⑤沉淀懸浮于2ml完全培養(yǎng)基中，即為脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)至2 X 107個(gè)細(xì)胞/ml ，置于 37°C 5% (A孵箱中備用，即效應(yīng)細(xì)胞。 (2)腫瘤細(xì)胞特異性CTL活性檢測采用3H_TdR釋放法[10]
①取體外傳代處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞2X 106個(gè)。 ②加入740KBq/20 ill的[3H]-TdR，混勻后于37°C ， 5% C02條件下培養(yǎng)4h，每0. 5h 振蕩1次。 ③標(biāo)記后用Hank' s液充分洗滌細(xì)胞3次以洗去游離的[3H]_TdR，計(jì)數(shù)后調(diào)細(xì)胞 濃度至4X 105個(gè)細(xì)胞/ml，即靶細(xì)胞。 ④于96孔板中每孔分別加100iil(2Xl()6個(gè))脾細(xì)胞，50 iU (2 X 104個(gè)細(xì)胞)及 25 iU (1 X 104個(gè)細(xì)胞)[3H] -TdR標(biāo)記的靶細(xì)胞，三復(fù)孔，設(shè)自發(fā)釋放對照孔，37°C ， 5% C02條件下培養(yǎng)18h。 ⑤收集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜上，烤干，液閃儀測cpm值。
⑥按下列公式計(jì)算特異性CTL細(xì)胞殺傷活性
CTL細(xì)胞殺傷活性=(1-實(shí)驗(yàn)孔cpm/自發(fā)釋放孔cpm) X 100%
(3)脾臟NK細(xì)胞毒活性檢測 ①取體外傳代處于對數(shù)生長期的Yac-l細(xì)胞2 X 106個(gè)，加入740KBq/20 ii 1 的3H-TdR，混勻后于37°C ， 5% C02條件下培養(yǎng)4h，每0. 5h振蕩1次。 ②標(biāo)記后用Hank' s液充分洗滌細(xì)胞3次以洗去游離的3H_TdR。計(jì)數(shù)后調(diào)細(xì)胞濃 度至4X105個(gè)細(xì)胞/ml。 ③于96孔板中每孔加100iil(2Xl()6個(gè)細(xì)胞)脾細(xì)胞，50 iU (2X 104個(gè)細(xì)胞)，
25 iil (1 X 104個(gè)細(xì)胞)3H-TdR標(biāo)記的Yac-l細(xì)胞，三復(fù)孔，設(shè)自發(fā)釋放對照孔，37°C ， 5% C02
條件下培養(yǎng)18h后收集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜上，烤干。
液閃測cpm值，按下列公式計(jì)算特異性NK細(xì)胞殺傷活性 NK細(xì)胞殺傷活性=(1-實(shí)驗(yàn)孔cpm/自發(fā)釋放孔cpm) X 100% 脾臟NK細(xì)胞毒活性檢測方法不同之處在于其標(biāo)記體外傳代處于對數(shù)生長期
Yac-l細(xì)胞作為靶細(xì)胞。 2)治療前后IL-12、IFN-y濃度的變化主動(dòng)免疫治療前3d， 5次免疫治療后1周，
分別采集小鼠血清，檢測血清中IL-12、IFN-y水平。IFN-y及IL-12ELISA試劑盒由美國
Genezyme公司提供。結(jié)果判定每個(gè)血清標(biāo)本的A (OD)值減去對照孔的A值為絕對值，根
據(jù)A值計(jì)算標(biāo)本的IL-12、 IFN- y濃度。 3)腫瘤組織免疫組化分析CD4+、 CD8+T細(xì)胞 (1)載玻片處理 ①清潔液浸泡，自來水沖洗。 ②泡硫酸洗液過夜。 ③取出后自來水沖洗，用蒸餾水沖洗后烘干。 ④在無水乙醇中浸泡過夜，擦干后用鋁箔包好備用。 ⑤使用時(shí)取出用防脫片液浸泡lmin，蒸餾水浸洗2次，晾干備用。 (2)免疫組化檢測CD4+及CD8+細(xì)胞 ①瘤組織石蠟切片，6(TC加溫l-2h， 二甲苯脫蠟2次，10min/次。②無水乙醇洗2次，5min/次，新鮮配制的0. 5%過氧化氫甲醇液中浸泡30min，水
化后在O. 1%的胰蛋白酶中37t:溫浴45min。 ③滴加大鼠抗小鼠CD4+、 CD8+單抗，濕盒內(nèi)lh， PBS洗3次。
加生物素標(biāo)記的二抗，37"，濕盒內(nèi)lh， PBS洗3次。 ⑤加酶作用底物DAB顯色，蘇木精液復(fù)染40min， PBS洗3次后中性樹膠封片保存。
陽性結(jié)果為細(xì)胞核呈棕褐色。 4)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡分別取各組荷瘤鼠3只處死后，取出腫瘤組織，常規(guī)固定、 切片，按試劑盒說明書進(jìn)行原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色，觀察細(xì)胞凋亡情況。
5)觀察病理學(xué)改變21d后處死小鼠，取治療組和對照組腫瘤組織10%福爾馬林 固定，石臘包埋切片后HE染色，鏡下觀察病理學(xué)改變。取治療組和對照組腫瘤組織10%福爾馬林固定，石臘包埋，切片。切片二甲苯染色15minX2次，100X乙醇浸泡5minX2次， 95%乙醇浸泡5min，80X乙醇浸泡3min，70X乙醇浸泡2min，50X乙醇浸泡2min，蒸餾水 洗，HE染色，光學(xué)顯微鏡下常規(guī)病理觀察(圖9、圖10)。 結(jié)果裸鼠右后腿皮下接種對數(shù)生長期的A549細(xì)胞2X 106個(gè)細(xì)胞/只后，成瘤 率90%，平均成瘤時(shí)間為10d。未接種腫瘤的IO只小鼠生存狀況良好。A549瘤苗治療組 與pcDNA3. 1 (+)-mIL-12質(zhì)粒治療組腫瘤出現(xiàn)大片壞死，有大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜 酸性粒細(xì)胞等浸潤。免疫組化結(jié)果證實(shí)，腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞主要為CD4+、 CD8+淋巴 細(xì)胞浸潤(黃色_棕黃色顆粒)，且A549瘤苗治療組更多(p < 0. 05)，而空載體治療組 pcDNA3. 1 (+)及PBS治療組無CD4+、 CD8+淋巴細(xì)胞(不顯色)。 此結(jié)果說明含IL-12及TNF-a基因的A549肺癌細(xì)胞瘤苗能夠產(chǎn)生針對腫瘤的免 疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤組織壞死，從而降低腫瘤局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)，而對正常組織無損傷，適合 各種實(shí)體瘤治療，且副作用小，具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?br> 權(quán)利要求
IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗，其特征在于為含有IL-12基因、TNF-α基因和腫瘤細(xì)胞的組合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述IL-12及TNF-a自體腫瘤疫苗，其特征在于所述組合物具有 一種或一種以上醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于可耐受活檢及手術(shù)病人的IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗，該疫苗為含有IL-12基因、TNF-α基因和腫瘤細(xì)胞的組合物，具有操作簡單、免疫原性及靶向性強(qiáng)、制備成本低和便于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，主要用于抗腫瘤免疫治療，包括手術(shù)后殘留、不能切除的腫瘤的治療。
文檔編號A61P35/00GK101716339SQ20091025100
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者尹曉玲, 林海波 申請人:尹曉玲