專利名稱：華支睪吸蟲的特異性抗原及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種華支睪吸蟲，具體來說是一種華支睪吸 蟲的特異性抗原及用途。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲病(Clonorchiasissinensis)是由華支睪吸蟲[Clonorchis sinensis, Cs]感染所引起的人獸共患病。該病主要分布于亞洲，如中國、日本、韓國(為韓 國主要人體寄生蟲)、朝鮮、越南、東南亞等國家。估計(jì)全球有3500萬人感染。在我國，除新 疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海、西藏、寧夏等省、自治區(qū)未見報(bào)道外，其余25個(gè)省、市、自治區(qū)以及 臺(tái)灣省和香港特別行政區(qū)都已有該病的流行報(bào)道或病例報(bào)告。由于移民的流動(dòng)，以及日益 頻繁的全球范圍的旅游和經(jīng)濟(jì)活動(dòng)，在一些非流行區(qū)和發(fā)達(dá)國家(包括北美和西歐)該病 的病例報(bào)告也越來越多。根據(jù)衛(wèi)生部于2001年6月 2004年底在全國(除臺(tái)灣、香港、澳門外)進(jìn)行的人 體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示，華支睪吸蟲感染率比1990年全國寄生蟲病分布調(diào)查 的結(jié)果上升了 75%，其中廣東、廣西、吉林3省(區(qū))分別上升了 182%、164%和630%。估 計(jì)目前全國華支睪吸蟲感染者達(dá)1200多萬人。華支睪吸蟲病是我國少數(shù)個(gè)別幾個(gè)呈現(xiàn)上 升趨勢的寄生蟲病之一，該病的防治工作已迫在眉睫。在我國南方(如廣東、廣西)及部分北方地區(qū)(如東北3省的朝鮮族居住區(qū))，當(dāng) 地人群有吃生的或未煮熟的淡水魚肉的習(xí)慣，魚肉中活的囊蚴被攝入人體，引起人的感染。 這些地區(qū)居民雖知吃“魚生”會(huì)感染本病，但飲食習(xí)慣一時(shí)難以改變。而且隨著生活水平的 提高，以往不吃或很少吃“魚生”的人群也開始吃“魚生”，現(xiàn)在生魚片的風(fēng)味吃法在非流行 區(qū)，特別是大中城市也很盛行。同時(shí)由于市場開放，流行區(qū)含華支睪吸蟲囊蚴的魚運(yùn)往各 地，因此城鎮(zhèn)居民感染華支睪吸蟲的人數(shù)有增加的趨勢。華支睪吸蟲成蟲寄生于人或其它終宿主的肝膽管內(nèi)，蟲體的分泌/代謝產(chǎn)物及蟲 體本身的機(jī)械刺激，可引起膽管，特別是引起次級膽管的炎癥反應(yīng)，中度感染膽管可出現(xiàn)局 限性擴(kuò)張，膽管上皮增生、管壁增厚、管腔狹窄，如合并細(xì)菌感染，可引起膽管炎和膽管肝 炎，周圍纖維組織增生，晚期可發(fā)生肝硬化。有證據(jù)表明，華支睪吸蟲感染可增加患者患膽 管癌(CLG)的風(fēng)險(xiǎn)，華支睪吸蟲感染相關(guān)性肝膽管腫瘤是華支睪吸蟲病流行區(qū)一個(gè)重要的 公共衛(wèi)生問題。為了快速診斷、及時(shí)治療和有效控制華支睪吸蟲病，需要特異、靈敏、簡便的方法 檢測人群中華支睪吸蟲的感染。對于華支睪吸蟲病人的診斷，傳統(tǒng)的糞便檢查仍是目前確診華支睪吸蟲病的主要 方法。但由于患者依從性較差，且華支睪吸蟲蟲卵較小易于漏檢，該方法有一定的缺陷。目前在現(xiàn)場防治工作中較廣泛地應(yīng)用了免疫診斷方法(主要是ELISA法)。但是 仍存在一些問題對健康人有不同程度的假陽性，對華支睪吸蟲病人有一定的假陰性，對其 它寄生蟲(血吸蟲、并殖吸蟲)感染也有一定的交叉反應(yīng)。Yong TS應(yīng)用ELISA方法檢測48例華支睪吸蟲病人血清抗體，只有75%的陽性反應(yīng)，但在觀例正常對照和16例并殖吸 蟲病例中，分別出現(xiàn)了 7. 和37. 5%的假陽性。已有研究資料表明一些寄生蟲的排泄分泌抗原(ESA)或重組的ESA可應(yīng)用于寄生 蟲病的血清學(xué)診斷。Kim SI用ESA來檢測活動(dòng)性華支睪吸蟲病病人血清相應(yīng)抗體動(dòng)態(tài)反 應(yīng)，發(fā)現(xiàn)30kDa和7kDa區(qū)帶與患者血清呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與吡喹酮治療6個(gè)月后的病人血 清反應(yīng)較弱，其中7kDa區(qū)帶未見與衛(wèi)氏并殖吸蟲病、橫川后殖吸蟲病、華支睪吸蟲病患者 痊愈后的血清起交叉反應(yīng)，特異性比30kDa區(qū)帶更強(qiáng)，據(jù)此認(rèn)為7kDa抗原可作為活動(dòng)性華 支睪吸蟲病的標(biāo)志性診斷抗原。Min-Ho CHOI對華支睪吸蟲的排泄分泌抗原(ESA)檢測抗 體的ELISA法和成蟲粗抗原(CA)檢測抗體的ELISA法的診斷價(jià)值進(jìn)行了比較和評估。ESA 檢測抗體的ELISA法的特異性顯著高于用CA檢測抗體的ELISA法(前者特異性為93. 1 %， 后者為87. 8% )，表明ESA用于檢測華支睪吸蟲患者血清抗體優(yōu)于粗抗原。因此，與華支睪 吸蟲的CA相比，ESA作為華支睪吸蟲病的診斷抗原具有更高的特異性和敏感性。然而傳統(tǒng) 的蟲源性抗原制備復(fù)雜，質(zhì)量可控性較低，制備量有限，難以適應(yīng)大規(guī)模查病的需求。此外，由于該蟲寄生于肝膽管這一特定的部位，決定了宿主血清中的抗原和抗體 水平較低，難以檢測(也是目前該病缺乏良好診斷試劑的原因)，但在糞樣中卻有ESA的存 在。Yong TS等鑒定了與IgE抗體反應(yīng)的華支睪吸蟲抗原，發(fā)現(xiàn)^kDa的抗原與IgE反應(yīng) 最強(qiáng)，該蛋白也存在于糞便排泄物中。Sirisinha S等人用單克隆抗體ELISA(Monoclonal antibody ELISA，McAb_ELISA)檢測麝貓后睪吸蟲患者糞樣中的抗原，能檢測的抗原最低量 為0. 05ng-0. Ingo研究表明，檢測患者糞樣中的特異抗原，可提供早期診斷、現(xiàn)癥患者確診 及療效考核的依據(jù)。而診斷抗體或抗原的特性決定著糞樣和血清中抗原或血清抗體檢測等免疫學(xué)方 法的診斷效果。同時(shí)由于難以取得高純度的特異抗原或大量的天然抗原，故使用分子生物 學(xué)技術(shù)，構(gòu)建特異性重組抗原的技術(shù)路線是尋找合適抗原的必由之路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種華支睪吸蟲的特異性抗原及用途，所述的這種抗原及 用途要解決現(xiàn)有技術(shù)中診斷華支睪吸蟲病的特異性和敏感性不高等技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種華支睪吸蟲的特異性抗原，所述的抗原基因具有SEQ ID NO 1 所示核苷酸序列、或者與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列、 或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原 性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種抗體，它特異性的結(jié)合上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原。進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種分離的蛋白質(zhì)，由上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 的核苷酸序列所編碼、或者與上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列達(dá) 90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的上述的一種華支 睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。進(jìn)一步的，所述的分離的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示、或者對SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸后由SEQ ID N0:2所 示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種載體，所述的載體含有上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有上述的載體，或者所述的細(xì)胞用 上述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了一種疫苗，包括上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原、或者上述 的抗體、或者上述的分離的蛋白質(zhì)、或者上述的載體。本發(fā)明還提供了上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原在制備治療、診斷或者預(yù)防 華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的分離的蛋白質(zhì)在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的 藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的的疫苗在制備治療、或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有上述的抗原、或者上述的抗體。本文中的術(shù)語“表達(dá)載體”，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒及其它各種 病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、 在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體)、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體、腺病毒載體等)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、 合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動(dòng)子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體 可用來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的融合蛋白。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化 細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿 主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化 鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、電融合法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以通過常規(guī)方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)來表達(dá)所需要的融合蛋白，包括 發(fā)酵過程和純化工藝。上述表達(dá)的蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞外。 根據(jù)需要，可利用融合蛋白的物理的、化學(xué)的以及其它生物學(xué)特性，進(jìn)行分離純化。方法包 括但不限于裂菌，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜，反向色譜，以及常規(guī) 的變性、復(fù)性處理等，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明通過對本發(fā)明人構(gòu)建的華支睪吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫，用采自廣西壯族 自治區(qū)的華支睪吸蟲病人混合血清，使用免疫篩選法篩出華支睪吸蟲Csl抗原。經(jīng)同源性 比較，本發(fā)明的華支睪吸蟲Csl抗原是迄今為止還沒有公開的華支睪吸蟲新穎的特異性抗 原。通過華支睪吸蟲Csl抗原的表達(dá)純化，已進(jìn)一步建立了高特異性和敏感性的華支睪吸 蟲病診斷初步方法；并易制備多/單克隆抗體，可應(yīng)用華支睪吸蟲病的科研和防治等不同方面；本發(fā)明的疫苗具有預(yù)防華支睪吸蟲感染的效果。本發(fā)明的試劑盒還可以用來檢測華 支睪吸蟲病。


圖1是華支睪吸蟲抗原Csl5，RACE擴(kuò)增cDNA片段凝膠電泳圖，M:DNA marker, 1-4 擴(kuò)增 cDNA 片段(約 200bp)。圖 2 是 pBluescript SK_Csl 噬菌粒 EcoRI/XhoI 雙酶切 1 % 凝膠電泳圖，Ml ADNA/Hindlll+EcoR I Marker, M2 ΦX174DNA/BsuRI(HaeIII)Marker, 1-2 :pBluescript SK_Csl噬菌粒EcoRlAhoI雙酶切結(jié)果(在160bp處，尚有一條不清晰的條帶)。圖3是pET28a NcoI/HindHI雙酶切和Csl-Ncol PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電 泳，M =DNA Marker ； 1-2 :pET28a NcoI/HindHI 雙酶切結(jié)果；3-4 =Csl-NcoI PCR 擴(kuò)增結(jié)果 (約 610bp)。圖4是pET28a-CSl-NC0I質(zhì)粒Ncol/Hindlll雙酶切1 %的瓊脂糖凝膠電泳圖，其 中，M =DNA Marker ；1 :pET28a-CSl_NC0I 質(zhì)粒 NcoI/HindHI 雙酶切結(jié)果。圖5是pET28b_CSl BL21 (DE3)重組蛋白表達(dá)鑒定16%的聚丙烯胺凝膠電泳圖， M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；1 :pET28b_CSl BL21(DE3)未誘導(dǎo)；2 :pET28b_CSl BL21(DE3)誘導(dǎo)；3 誘導(dǎo)上清；4 誘導(dǎo)沉淀。圖6是pET28a-CSl-Nc0I BL21 (DE3)重組蛋白表達(dá)鑒定16%的聚丙烯胺凝膠電 泳圖，M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；1 :pET28a-CSl_NcoI BL21(DE3)未誘導(dǎo)；2 pET28a-CSl-NcoI BL21(DE3)誘導(dǎo)；3 誘導(dǎo)上清；4 誘導(dǎo)沉淀。圖7是pET28b_CSl BLR(DE3)重組蛋白表達(dá)鑒定12 %聚丙烯胺凝膠電泳圖， M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ； 1 :pET28b_CSl BLR (DE3)未誘導(dǎo)；2 :pET28b_CSl BLR(DE3)誘導(dǎo)；3 誘導(dǎo)上清；4 誘導(dǎo)沉淀。圖8是pET28a-CSl-Nc0I BLR(DE3)重組蛋白表達(dá)鑒定12 %聚丙烯胺凝膠電 泳圖，M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；1 :pET28a-CSl_NcoI BLR(DE3)未誘導(dǎo)；2 pET28a-CSl-NcoI BLR(DE3)誘導(dǎo)；3 誘導(dǎo)上清；4 誘導(dǎo)沉淀。圖9是pET28a-CSlDS-Nc0I B21 (DE3)重組蛋白表達(dá)鑒定12%聚丙烯胺凝膠電泳 圖，，其中，M :Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；1 :pET28a-CSlDS-NcoI BL21(DE3)未誘導(dǎo)； 2 :PET28a-CSlDS-NcoIBL21 (DE3)誘導(dǎo)；3 誘導(dǎo)上清；4 誘導(dǎo)沉淀。圖10是pET28b_CSl BL21 (DE3)不可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖， M =Protein marker ；1 流出液(F)pH8. O ；2-4 =Buffer C 液 1、3、5 管(ρΗ6· 3) ；5-9 =Buffer D 液 1-5 管(ρΗ5· 9) ；10-14 =Buffer E 液 1-5 管(ρΗ4· 5)，其中，pET28b_CSl BL21 (DE3)不 可溶性蛋白集中在PH4. 5的洗脫液中。圖11是pET2m3-CSl BL21 (DE3)可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M Protein marker ；1 :pET28b_CSl 未誘導(dǎo)；2 :pET28b_CSl IPTG 誘導(dǎo) 3 =Ni-NTA 純化流出液 (不含咪唑)；4-7 含20mM咪唑洗滌液管1、3、5、7 ；8-9 含50mM咪唑洗脫液1、2管；10-11 含IOOmM咪唑洗脫液1、2管；12-14 含250mM咪唑洗脫液1、2、3管，其中，pET28b_CSl BL21 (DE3)可溶性蛋白集中在含50-250mM咪唑的洗脫液中。圖12是pET28a-CSl-NcoI BL21 (DE3)可溶性與不可溶性蛋白純化12 %聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M =Protein marker ； 1 :流出液(F) ；2-8 含250mM咪唑可溶性蛋白洗 脫液 1-7 管；9-14 不可溶性蛋白 Buffer E 液 1-6 管(pH4. 5)，其中，pET28a-CSl-NcoI BL21 (DE3)可溶性蛋白集中在含250mM咪唑的洗脫液中。不可溶性蛋白集中在在pH4. 5的 洗脫液中。圖13是pET28b_CSl DS-NcoI BL21 (DE3)可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠 電泳圖，pEI^8b-CSlDS-NcoI BL21(DE3)可溶性蛋白集中在含100_250mM咪唑的洗脫液中。 其中，M =Protein marker ；1 =Ni-NTA純化流出液；2-3 含20mM咪唑洗滌液2、4管；4-6 含 50mM咪唑洗脫液1-3管；7-9 含IOOmM咪唑洗脫液1_3管；10-14 含250mM咪唑洗脫液1_5管。圖14是pET28b_CSl不可溶性純化蛋白檢測血清抗體散點(diǎn)圖。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指 出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論 述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了，而這些等價(jià)修改， 均應(yīng)屬于本發(fā)明所限定的范圍。
具體實(shí)施例方式以下所述實(shí)驗(yàn)方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，2002年，科學(xué) 出版社)所述方法進(jìn)行。實(shí)施例1華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的構(gòu)建用采自廣西壯族自治區(qū)的華支睪吸蟲囊蚴，通過灌胃法感染貓5只。40天后，檢查 糞便蟲卵，然后剖殺，收集華支睪吸蟲成蟲，用滅菌的生理鹽水沖洗干凈，液氮保存。利用TRIzol (GIBC0/BRL公司)試劑盒抽提華支睪吸蟲成蟲(1克華支睪吸蟲成蟲 壓積，液氮保存)的總RNA。采用mRNA純化試劑盒(mRNA Purification Kit，Amersham公司)，從提取的總 RNA 中純化mRNA。具體步驟見產(chǎn)品說明書。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫采用定向克隆法，利用ZAP-cDNASynthesis Kit(Stratagene公司)構(gòu)建。參照試劑盒說明書操作，主要過程包括l.cDNA第一鏈的合成，應(yīng)用含有B10 I內(nèi)切酶位點(diǎn)的多聚T引物，為了使cDNA第 一鏈在合成過程中不受限制性內(nèi)切酶的破壞，用5-甲基dCTP替代dNTP中的dCTP，使合成 的DNA半甲基化，從而在B10 I消化cDNA時(shí)，只有位于多聚T引物內(nèi)的非甲基化位點(diǎn)可被 裂解；2. cDNA第二鏈的合成，由RNase H消化第一鏈合成產(chǎn)物mRNA_DNA雜合體中的RNA， 產(chǎn)生的cDNA片段作為引物在DNA聚合酶I作用下合成第二鏈；3.用Pfu DNA聚合酶將合成的雙鏈cDNA的末端補(bǔ)平，之后在補(bǔ)平的雙鏈DNA的 5’端加上含有EcoR I酶切位點(diǎn)的接頭(adaptor)，并使接頭磷酸化；4.用限制性內(nèi)切酶Β ο I消化，消化后的雙鏈DNA通過kphar0SeCL-2B凝膠柱層 析，進(jìn)行分級分離，去除游離接頭；5.將分離后的DNA片段合并濃縮，連接到Uni-ZAP XR載體上；6. MBffl 1 !!^ (GigapackIII Gold Packing Extract, Stratagene) 1 噬菌體蛋白外殼。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫構(gòu)建完成后，進(jìn)一步對文庫滴度及插入片段平均長度 等進(jìn)行檢測。檢測計(jì)算結(jié)果，華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的滴度為1. 43X 106pfu/ml。從文庫中隨機(jī)挑取16個(gè)重組克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物 鑒定。重組克隆擴(kuò)增片段長度范圍在0.61Λ 21Λ。平均插入片段長度為1. 11Λ。重組插入率為99. 6 %。實(shí)施例2cDNA文庫的免疫篩選噬菌體感染取XLl-blue MRF'菌液200 μ 1與適量cDNA文庫噬菌體液混合(根據(jù)文庫滴度預(yù) 先確定，約3000噬菌斑/每板)，37°C溫育15分鐘后，加入:3ml 48°C的上層瓊脂(top agar) 混勻，立即鋪于NZY培養(yǎng)基平板上。室溫下凝固10分鐘，于42°C孵育。融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)觀察到噬菌斑出現(xiàn)后(約3. 5小時(shí))，用經(jīng)IPTG (15mM/L)浸泡30分鐘的硝酸纖維 素膜(Hybond-C extra, Amersham, NC)覆蓋平板，于37°C再培育3. 5小時(shí)；取出平板4°C冷 卻15分鐘，然后用針在膜以及板上做上標(biāo)記。將膜取下置于TBST中洗3次，每次10分鐘， 然后浸于NC膜浸在封閉液中，室溫，輕微振蕩，封閉過夜。將NC膜從封閉液中取出，用TBST洗膜2次，每次5分鐘。加入華支睪吸蟲病人混 合血清(采自廣西壯族自治區(qū))(5ml/膜)室溫下輕微振蕩3小時(shí)。再用TBST洗膜3次，每 次10分鐘。加入二抗(5ml/膜)即羊抗人堿性磷酸酶結(jié)合物(AP-GAH，BI0-RAD，1 3000 稀釋)室溫下反應(yīng)1小時(shí)，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，用TBS洗膜2次，每次5分鐘， 洗去殘留的Tween20。將NC膜從TBS中取出，用Whatman 3MM的濾紙吸干多余的溶液，放入AP buffer 浸泡NC膜3分鐘。用Color Development Solution 稀釋 NBT 至終濃度 0. 3mg/ml, BCIP 終濃度為 0. 15mg/ml (BCIP應(yīng)逐滴加入已稀釋的NBT中，防止沉淀形成。)，配制成NBT-BCIP顯色液。 將NC膜浸入NBT-BCIP顯色液中，在暗處進(jìn)行顯色反應(yīng)直到陽性斑點(diǎn)清晰可見。終止顯色 反應(yīng)。根據(jù)NC膜上陽性斑點(diǎn)在原培養(yǎng)板上的相應(yīng)位置，挑取陽性噬菌斑，再經(jīng)過復(fù)篩、 三篩使得陽性噬菌體單克隆化。實(shí)施例3噬菌體刪除環(huán)化為pBluescript SK_噬菌粒及提取噬菌粒E.coli XLl-blue MRF'于 LB 培養(yǎng)基(含有 IOmM MgS04，0. 2%麥芽糖，15 μ g/ml Tet)中培養(yǎng)過夜。次日，取培養(yǎng)液100μ1轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培 養(yǎng)約2小時(shí)。培養(yǎng)液經(jīng)2000g，離心10分鐘，沉淀細(xì)菌，用IOmM MgS04重懸至OD6tltl = 1. 0。 在細(xì)菌培養(yǎng)管中加入200 μ 1 E.coli XLl-blue MRF'重懸液、50 μ 1含有陽性噬菌體的SM buffer和1 μ 1輔助噬菌體。將細(xì)菌培養(yǎng)管放置于37°C水浴中15分鐘。然后加入:3ml LB, 于37°C振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。取出細(xì)菌培養(yǎng)管，在65°C加熱20分鐘，然后3000g，離心15分鐘， 將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中，置于4°C保存。SOLR菌于LB培養(yǎng)基(含有IOmM MgS04, 50 μ g/ml Kan)中振蕩培養(yǎng)，然后2000g，離心10分鐘，用IOmM MgS04重懸至OD600 = 1. 0，在1. 5ml Ep離心管中加入200 μ 1 SOLR 和上述制備的上清保存液1 μ 1，在37°C溫育15分鐘，然后取出25 μ 1均勻涂布于LB (含 100 μ g/ml Amp)瓊脂平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)基上生長的菌落，即為含華支睪吸蟲cDNA插入片段的pBluescript SK_噬菌 粒的SOLR菌落。使用Axyft^p質(zhì)粒DNA小量試劑盒[愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司]提取 pBluescript 51(_噬菌粒。實(shí)施例4Csl抗原基因的分離使用華支睪吸蟲病人混合血清(采自廣西壯族自治區(qū))篩選華支睪吸蟲成蟲 (采自廣西壯族自治區(qū))cDNA文庫(使用Stratagene公司的The ZAP-cDNA synthesis Synthesis Kit構(gòu)建)，獲得的陽性克隆，經(jīng)刪除環(huán)化為pBluescript SK_Csl。由上海 Invitrogen公司測序，得到華支睪吸蟲Csl抗原基因的部分mRNA序列(如SEQ ID NO 6 所示)。使用 hvitrogen 公司的試劑盒(5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends)，使用下列引物(GSP1 :TGCGCACCATCCGCATCG ；GSP2 GATGTGCTCGAGCCTGAAG,上 海Invitrogen公司合成)反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增的cDNA片段，插入pGEM-T Easy Vector (Promega 公司)，經(jīng)測序(由上海^witrogen公司測序)，獲得華支睪吸蟲Csl抗原基因的全長序 列，如SEQ ID NO :1所示，共733堿基，23位為起始子(ATG)，617位為終止子(TAG)，推導(dǎo)的 Csl抗原氨基酸序列如SEQID NO 2所示，Csl抗原含198個(gè)氨基酸。Csl5，RACE擴(kuò)增cDNA 片段凝膠電泳圖如圖1所示。實(shí)施例5表達(dá)載體的構(gòu)建1. pET28b-Csl表達(dá)載體的構(gòu)建將pBluescript SK_Csl噬菌粒，用EcoRI/XhoI (NEB公司)限制性內(nèi)切酶作部分 雙酶切，37 °C反應(yīng)15分鐘。酶切產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割分離的目的片段，用 Ε. Z. N. A. Ultra-Sep Gel Extraction Kit(0miga 公司)純化回收目的片段(718bp)。因 Csl抗原基因在pBluescript SK-中插入片段含有兩個(gè)BioI酶切位點(diǎn)，所以在部分酶切的 條件下，插入片段呈現(xiàn)三個(gè)片段(718、559和159bp)，如圖2所示。ρΕΤ2^3表達(dá)載體同樣用EcoRlAhoI (NEB公司)限制性內(nèi)切酶作雙酶切，37 °C 反應(yīng)過夜。酶切產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割分離的目的片段，用 Ε. Z. N. A. Ultra- Sep Gel ExtractionKit (Omiga 公司)純化回收。將目的片段和載體片段按8 1摩爾比進(jìn)行連接，連接體系中含T4DNA連接酶 (NEB公司)lul，10XT4 ligase buffer 2ul，去離子水，目的片段和載體片段共計(jì)體積為 20ul于1. 5ml Eppendorf管中16°C連接過夜，構(gòu)建成pET28b_Csl的原核表達(dá)的重組質(zhì)粒。取連接的pET28b_CSl重組質(zhì)粒與剛?cè)芑腅. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(天根公 司)混合，冰浴30分鐘，于42°C熱激1分鐘，再經(jīng)冰浴放置3min，無菌條件下加入Iml的 SOC培養(yǎng)基，37°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。然后，將菌液于3500rpm，離心3分鐘，棄去部 分上清，留約100 μ 1重懸菌體。將重懸液涂布于LB平板(含50 μ g/ml的Kan)上，待吸收 后于37°C倒置培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化的Dffia細(xì)菌在LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml的Kan)，200rpm,振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液于3500rpm，離心10分鐘，收集細(xì)菌。使用Axyft^p質(zhì)粒DNA小量試劑盒[愛思進(jìn)生物 技術(shù)(杭州)有限公司]提取質(zhì)粒，并由上海hvitrogen公司測序，證實(shí)目的片段插入正確。取提取的pET28b_CSl重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(NOvagen 公司)，方法同上。該重組蛋白(pET28b-CSl重組質(zhì)粒)的氨基酸序列如如SEQ ID N0:3所不。2. pET28a-CSl-NcoI 表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Csl基因的序列，設(shè)計(jì)如下引物(由上海hvitrogen公司合成):PF-CS1-NC0I 5，CATGCCATGGGGATGAAACCGCAACTTGTATAC 引入 Nco I 位點(diǎn)PR-CS1-NC0I 5，CCCAAGCTTTGATATGATTCTTCGTAGAAT 弓丨入 Hindi11 位點(diǎn)以pBluescript SK_Csl噬菌粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50ul，其中模 板 0. 2ul，雙向引物各 lul，dNTP(賽百勝公司)lul，IOXbuffer 5ul, platinum Taq 酶 (Invitrogen公司)0. 5ul，50mM鎂離子1. 5ul，去離子水39. 8ul。反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5 分鐘；變性95°C 1分鐘；退火50°C 1分鐘；復(fù)性72°C 1分鐘；循環(huán)30次，最后一個(gè)循環(huán)復(fù) 性延長至7分鐘，樣品保存于4°C。PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠電泳(如圖3所示)，在紫 外燈下切割分離的目的片段，用Ε. Z. N. A. Ultra- Sep Gel Extraction Kit (Omiga公司) 純化回收。pET28a表達(dá)載體質(zhì)粒，用Ncol、HindIII限制性內(nèi)切酶(NEB公司)酶切過夜； 使用小牛腸堿性磷酶(CIP，NEB公司)去磷酸化。酶產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠電泳(如 圖3所示)，在紫外燈下切割分離的目的片段，用Ε. Z. N. A. Ultra- Sep Gel Extraction Kit (Omiga公司)純化回收。純化回收的Csl-Ncol PCR片段同樣使用NC0I、HindIII限制性內(nèi)切酶雙酶切。并 使用上述同樣方法回收。將目的片段和載體片段按8 1摩爾比進(jìn)行連接，連接體系中含T4DNA連接酶 (NEB公司)lul，10XT4 ligase buffer 2ul，去離子水，目的片段和載體片段共計(jì)體積為 20ul于1. 5ml Eppendorf管中16°C連接過夜，構(gòu)建成pET28b-Csl_NcoI的原核表達(dá)的重組 質(zhì)粒。連接好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至DH5a，提取質(zhì)粒后，驗(yàn)證插入序列無誤。并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。該重組蛋白(pET28b-Csl_NcoI重組質(zhì)粒)的氨基酸序列 如如SEQ ID NO :4所示。3. pET28a-CSlDS-NcoI 表達(dá)載體的構(gòu)建以Pci I.Hind III限制性內(nèi)切酶(NEB公司)酶切pET28a-CSl_NC0I質(zhì)粒。凝膠 電泳共有四個(gè)片段76bp、526bp、2260bp、3000bp (如圖 4 所示)，用 Ε. Z. N. A. Ultra-Sep Gel ExtractionKit (Omiga公司)割膠純化526bp片段，與pET28a表達(dá)載體質(zhì)粒(Ncol、 Hind III限制性內(nèi)切酶雙酶切)連接。連接好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至Dffia，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證插 入序列無誤后，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。pET28a-CSlDS_NcoI重組蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
實(shí)施例6重組蛋白的表達(dá)鑒定及純化轉(zhuǎn)化好的表達(dá)宿主菌接種于細(xì)1的LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml的Kan)中，于37°C， 200rpm,振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6時(shí)，取出2ml菌液加入2 μ 1 IM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，剩余的 2ml菌液不加IPTG作為對照，37°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液于4°C，經(jīng) 5000rpm離心10分鐘收集菌體，棄去上清。向誘導(dǎo)管和對照管中分別加入200 μ 1 0. 15Μ的 PBS重懸菌體。分別從誘導(dǎo)管和對照管中取出5μ 1的重懸液，加入2XSDS-PAGE加樣緩沖 液5 μ 1，混勻后于100°C煮沸5分鐘變性。以8 μ 1/孔樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析(濃縮膠為 5%，分離膠為12%或16%)。電泳條件為濃縮膠80V，分離膠100V。電泳結(jié)束后，用染色液 染色4小時(shí)，再用脫色液脫色，直到蛋白條帶清晰可見。結(jié)果pET28b-CSlBL21 (DE3)在ImM的IPTG條件下37°C誘導(dǎo)，在43KD處可見明顯的重 組蛋白條帶。該重組重組蛋白主要位于沉淀中，少量位于上清。如圖5所示。pET28a-CSl-NcoI BL21 (DE3)在 ImM 的 IPTG 條件下 37°C誘導(dǎo)，在 42KD 處可見明 顯的重組蛋白條帶。該重組重組蛋白主要位于沉淀中，少量位于上清。如圖6所示。pET28b_CSl、pET28a-CSl_NcoI 在 Ε. coli BLR(DE3)表達(dá)宿主菌(NOvagen 公司) 中也可經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的重組蛋白，如圖7、8所示。pET28a-CSlDS-NcoI BL21 (DE3)在 ImM 的 IPTG 條件下 37°C誘導(dǎo)，在 42KD 處可見 明顯的重組蛋白條帶。該重組重組蛋白主要位于上清中，如圖9所示。重組蛋白的純化誘導(dǎo)后的菌液(500ml)經(jīng)4000rpm，4°C，離心10分鐘，棄盡上清。按每克細(xì)菌 糊加入5ml的比例，向菌體中加入BugBuster 蛋白抽提劑(NOvagen公司)，并加入5Ku rLysozyme(每克細(xì)菌糊，NOvagen公司)以及125u Benzonase核酸酶(每克細(xì)菌糊， NOvagen公司)，充分懸浮沉淀后，室溫振蕩30min。然后于4°C，9000rpm離心10分鐘?？扇苄缘鞍椎募兓ml的Ni-NTAAgarose (Qiagen公司)裝柱，加入大量0. 15M的PBS沖洗，除去 殘留的乙醇。將離心后的誘導(dǎo)細(xì)菌上清液加入到已經(jīng)處理好的Ni-NTAAgarose中，置于搖床 上，室溫振蕩60-90分鐘，使蛋白與Ni-NTAAgarose充分結(jié)合。停止振蕩后，待Ni-NTA Agarose沉降，打開柱子下面的塞子，收集流出的液體。用4倍床體的Washing Buffer洗柱兩次，收集流出的液體。然后用2-4倍床體的含不同濃度咪唑的Elution Buffer洗滌柱子，分別收集洗脫 液。將收集的液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，檢測蛋白純化的效果。不可溶性蛋白的純化取Iml的Ni-NTAAgarose (Qiagen公司)裝柱，加入大量0. 15M的PBS沖洗，除去 殘留的乙醇。然后加入2倍床體的Buffer B平衡。將離心后的誘導(dǎo)細(xì)菌沉淀物，按每克5ml的比例加入Lysis BufferB (pH8. 0)混 勻，室溫振蕩30-60分鐘。然后，經(jīng)9000rpm，4°C，離心10分鐘。取保留上清液加入到已經(jīng) 處理好的Ni-NTAAgarose中，置于搖床上，室溫振蕩60分鐘，使蛋白與Ni-NTAAgarose充分結(jié)合。停止振蕩后，待Ni-NTA Agarose沉降，打開柱子下面的塞子，收集流出的液體。然后用2-4倍床體的不同pH值的Buffer C、D、E洗滌柱子，分別收集洗脫液。將收集的液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，檢測蛋白純化的效果。結(jié)果如圖10、 11,12和13所示。 實(shí)施例7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測抗體1.間接ELISA方法檢測血清中的抗體用重組蛋白包被酶標(biāo)板(Nunc公司，96孔板)，4°C過夜；1 % BSA37°C封閉1小時(shí)； 分別加入1 100稀釋的華支睪吸蟲病人、正常人血清100ul，37°C反應(yīng)1.5小時(shí)；加入 100μ 1的HRP標(biāo)記羊抗人IgG (Sigma公司，1 10000稀釋)，37 °C反應(yīng)1小時(shí)；加入底物 TMB (天根公司)顯色，酶標(biāo)儀450nm讀取數(shù)值。重組蛋白抗原檢測抗體效果的初步評價(jià)隨機(jī)選取采自廣西橫縣的華支睪吸蟲病人血清10份混合為陽性混合血清，隨機(jī) 抽取10份采自華支睪吸蟲病非流行區(qū)的廣西靖西市的正常人血清混勻?yàn)殛幮曰旌涎濉?重組抗原pET28b-CSl的可溶性純化蛋白、不可溶性純化蛋白、pET28a-CSl-NcoI的可溶性 純化蛋白、不可溶性純化蛋白的包被濃度分別為4、2、4和如g/ml，每孔lOOul。以上述間接 ELISA方法檢測血清中的抗體。結(jié)果如下
包被抗原混合陽性 血清OD 值混合陰性 血清OD 值陰陽性 OD值的 比值pET28b-CSl不可溶性純化蛋白0.4960.0667.57pET28b-CSl可溶性純化蛋白0.5320.1423.76pET28a-CSI-NcoI不可溶性純化 蛋白0.4960.0905.54pET28a-CSI-NcoI可溶性純化蛋 白0.4990.1174.28結(jié)果表明4類純化的重組蛋白均可較好的區(qū)分混合陽性血清和陰性血清。2. pET28b-CSl不可溶性純化蛋白檢測抗體效果的進(jìn)一步評價(jià)對采自廣西橫縣的35份華支睪吸蟲病人血清，采自華支睪吸蟲病非流行區(qū)的廣 西靖西市的36份正常人血清，15例血吸蟲病人血清和9例肺吸蟲病人血清，以上述間接 ELISA方法檢測血清中的抗體。重組抗原pET28b-CSl的不可溶性純化蛋白的包被濃度分別 為 10ug/ml，每孔 IOOul0ELISA結(jié)果如下36份正常人血清平均OD值=0. 057，SD = 0. 0234 (去除一個(gè)離散較遠(yuǎn)的數(shù)值)。 以均值的2. 1倍為判斷標(biāo)準(zhǔn)，OD值大于0. 120為陽性。36份糞檢陰性的正常人血清中，有2例大于0. 120。以pET28b-CSl不可溶性純化蛋白檢測抗體的ELISA方法的特異性= 34/36X100%= 94. 4%。35份糞檢陽性血清平均OD值=0. 362，SD = 0. 234，其中30例血清OD值大于 0. 120。建立的 ELISA 方法的敏感性=30/;35X100%= 85. 7%。本ELISA 方法的總符合率=(34+30) / (36+35) X 100 % = 90. 1 % 015例血吸蟲病人血清和9例肺吸蟲病人血清的OD值均小于0. 120，無一呈現(xiàn)假陽 性。該ELISA方法特異性較高，與血吸蟲、肺吸蟲抗體無交叉反應(yīng)。pET28b-CSl不可溶性純化蛋白檢測各類血清中的特異性抗體的散點(diǎn)圖見圖14。pET28b-CSl不可溶性純化蛋白檢測血清中特異性抗體間接ELISA結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種華支睪吸蟲的特異性抗原，其特征在于所述的抗原基因具有SEQ ID N0:1所 示核苷酸序列、或者與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列、或 者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性 的核苷酸序列。
2.一種抗體，其特征在于它特異性的結(jié)合權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異 性抗原。
3.如權(quán)利要求2所述的一種抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
4.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于由權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗 原基因的核苷酸序列所編碼、或者與權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 的核苷酸序列達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的 權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。
5.如權(quán)利要求4所述的分離的蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:2所 示、或者對SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸后 的由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
6.一種載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性 抗原基因。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體，或者所述的細(xì) 胞用權(quán)利要求1所述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
8.一種疫苗，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原、或者 權(quán)利要求2所述的抗體、或者權(quán)利要求4所述的分離的蛋白質(zhì)、或者權(quán)利要求6所述的載 體。
9.權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪 吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求4所述的分離的蛋白質(zhì)在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物 中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求8所述的疫苗在制備治療、或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
13.—種試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的抗原、或者權(quán)利要求2所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種華支睪吸蟲的特異性抗原，還提供了特異性的結(jié)合華支睪吸蟲的特異性抗原的抗體。本發(fā)明還提供了一種分離的蛋白質(zhì)，由華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。本發(fā)明還提供了一種含有一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的載體。本發(fā)明還提供了一種疫苗和試劑盒。本發(fā)明還提供了上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原、抗體、疫苗和試劑盒在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的華支睪吸蟲Cs1抗原具有較高的免疫原性，易制備多/單克隆抗體，進(jìn)而進(jìn)一步應(yīng)用于抗原檢測等方面。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠)對該抗原免疫應(yīng)答較強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61P33/10GK102071205SQ20091025289
公開日2011年5月25日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者馮正, 包意芳, 周巖, 徐斌, 董玉婷, 許學(xué)年 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所