專利名稱：：圓錐繡球有效部位、其制備方法及其組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從圓錐繡球提取的有效部位，這種有效部位的制備方法，含有這種有效部位的藥物組合物，以及這種有效部位和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是在制備預防和/或治療腎功能不全、高血壓以及糖尿病腎病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
：慢性腎臟疾病(包括各類慢性腎炎、糖尿病腎病及高血壓性腎損害等)是一種最為常見的慢性的難治性疾病。慢性腎衰竭(CRF)的自然人群年發(fā)病率為98198/100萬人口，發(fā)達國家如美國和日本的發(fā)病率高達8001000萬/100萬人口，近十年來呈指數(shù)上升的趨勢，我國CRF的確切發(fā)病率尚缺乏統(tǒng)計資料，約為每年100/100萬人口。隨著我國經(jīng)濟狀況和疾病譜的不斷變化，糖尿病和高血壓相關(guān)腎臟病的發(fā)病率已顯示出驚人的逐年上升趨勢。糖尿病方面，我國的發(fā)病率97年為3.2%，WHO預測到2010年糖尿病的發(fā)病率將增至14%，其中最后發(fā)展為糖尿病腎病的為40%，即從97年的1500萬增加到2010年的7000萬。高血壓方面，我國90年代初已達到11.26%，目前正以每10年增加20%以上的速度迅速增加。糖尿病自從胰島素應用以來，糖尿病的急性合并癥如酮癥酸中毒的死亡率已顯著下降，但隨著糖尿病人壽命的延長，40%左右的糖尿病病人可能發(fā)生糖尿病腎病，而一旦發(fā)生腎臟損害，則出現(xiàn)持續(xù)進展的蛋白尿、高血壓和腎功能不全，病情常不可逆轉(zhuǎn)，往往進行性發(fā)展直至終末期腎衰竭。據(jù)WHO預測至2020年，上述非傳染病性疾病將成為我國人口死亡原因的首位，而終末期CRF是最重要的致死原因之一。不論何種病因，腎組織病變均會從早期病變逐漸進展為腎小球硬化和/或腎間質(zhì)纖維化的晚期病變。如果得不到有效治療，終將導致慢性腎功能不全和不可逆轉(zhuǎn)的終末期腎衰竭(即尿毒癥)。慢性腎臟病腎臟纖維化的進展的病理生理機制非常復雜，包括原發(fā)致病因素(如免疫炎癥、代謝紊亂等)對腎臟多種細胞的作用及其繼發(fā)的血流動力學異常、細胞因子相互作用以及細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡等等。目前治療慢性腎衰常用的方法有透析和移植兩種，但均為終末期CRF的治療手段。腎移植，臟器來源有限，經(jīng)濟負擔高，能進行腎移植手術(shù)的人很少，約僅有25%的腎病患者有機會實施手術(shù)，術(shù)后還需長期服用免疫抑制劑。透析治療雖然可以達到替代腎臟的目的，但依賴透析機器、醫(yī)療條件要求高，且存在著心血管并發(fā)病高、病人有感染危險，順應性差，經(jīng)濟負擔重，在我國應用極為有限。能有條件進行透析或腎移植的患者僅為極少數(shù)。因此，大量患者迫切需要能夠延緩及阻止腎功能不全進展的有效藥物，新型藥物的研制和開發(fā)顯得尤為重要。傳統(tǒng)應用的激素、免疫抑制劑、降血糖治療等雖然在抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫和代謝方面顯示了對原發(fā)病的治療作用，但在控制慢性腎臟病變進展方面卻難以奏效。藥物治療對延緩CRF患者的腎功能不全惡化至關(guān)重要。目前，世界范圍內(nèi)廣泛用于治療腎功能不全的有效藥物主要有兩類一類為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，即ACEI，包括C即topril、Benaz即ril、Ramipril等，其主要作用機理在于阻斷血管緊張素II(All)合成，從而減少AII所導致的高血壓、腎小球內(nèi)高濾過壓和促硬化因子TGF-I31的產(chǎn)生。另一類為血管緊張素III型受體拮抗劑，即AT1RA，包括Losartan、Irbsartan、Versartan等，其主要作用機理在于通過阻斷AII受體而減少All的上述作用。國外通過大量的研究表明，對各類慢性腎臟疾病患者的早期有效藥物治療的確可帶來明顯的延緩腎功能不全惡化的效果，而且具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。目前臨床上用于治療腎功能不全的藥物主要是Benaz印ril和Losartan，但主要依賴進口，這類藥物價格昂貴，毒副作用較大。如造成部分病人高血鉀、不可克服的咳嗽、降血壓作用不夠強等。因此，臨床上如C即topril因易致高血鉀而難以長期用于慢性腎衰病人，5-15%患者因Benaz即ril所致的咳嗽而被迫終止治療，許多原發(fā)性或腎性高血壓的患者在應用上述藥物的同時，為了達到理想血壓必須同時加用多種其他降壓藥物。圓錐繡球(HydrangeapaniculateSieb)是虎耳草科(Saxifr卿ceae)繡球?qū)?Hydrangea)植物，廣泛分布于浙江、安徽、江西、廣西等地。民間用于治療咽喉痛，瘧疾，食積不化，胸腹脹滿，骨折等。圓錐繡球的天然資源豐富，未見有毒性報告。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)中治療腎功能不全的藥物的不足，本發(fā)明提供一種圓錐繡球有效部位。本發(fā)明的另一目的是提供一種圓錐繡球有效部位的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供含有圓錐繡球有效部位的藥物組合物。本發(fā)明的又一目的是提供圓錐繡球有效部位在制備治療腎功能不全、降血壓以及糖尿病腎病藥物中的應用。本發(fā)明從圓錐繡球提取的有效部位，含有10%以上茵芋甙(Skimmin)。更優(yōu)選的，本發(fā)明從圓錐繡球提取的有效部位，含有50%以上茵芋甙(Skimmin)。根據(jù)本發(fā)明提供圓錐繡球有效部位的制備方法。圓錐繡球原藥材經(jīng)干燥并適當?shù)姆鬯?，以利增大與溶劑的接觸面積，提高效率。原藥材的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物。優(yōu)選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等。水與醇類的混合物，例如濃度為40-99%(體積比)的醇。提取時溶劑浸過藥材為宜，溶劑量為原藥重量的2-14倍。提取可以在靜態(tài)或動態(tài)下，優(yōu)選在動態(tài)條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如2(TC)到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進行，間歇提取時可重復1-4次，優(yōu)選2-3次。上步結(jié)束后，合并濾液，濾去藥渣，濃縮濾液得到浸膏。濃縮優(yōu)選在動態(tài)狀態(tài)下進行，可以在常壓或減壓條件下，優(yōu)選在減壓條件下。濃縮的溫度40-8(TC，優(yōu)選的溫度是50-7(TC，更優(yōu)選的溫度是55-65°C。浸膏的拌樣。此浸膏乙醇四氫呋喃少量水溶解，溶解液100-200目硅膠拌樣(1:2)，烘干。膏狀物通過吸附柱層析純化，純化的次數(shù)可以是1-4次，優(yōu)選是1-2次。吸附劑選自硅膠、氧化鋁、大孔樹脂、離子交換樹脂、反相硅膠(0DS)，優(yōu)選是吸附劑是硅膠、大孔樹脂。吸附劑的用量為樣品量的3-10倍。洗脫系統(tǒng)的條件依次用不同濃度的石油醚丙酮(混和溶劑比例為3:i到i:i)、丙酮、乙醇梯度洗脫。收集丙酮部分。濃縮丙酮部分得粗品。用乙醇四氫呋喃(i:i)溶解，通過ODS柱，用醇類流動相洗脫，得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。濃縮丙酮部分得粗品也可用大孔樹脂層析用乙醇水系統(tǒng)進行梯度洗脫得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。也可以使用層析l次的方法。用硅膠柱層析，用CH^1:MeOH:H^流動相洗脫，得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。根據(jù)本發(fā)明還涉及含有作為活性成份的圓錐繡球有效部位和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有O.1_95重量％的圓錐繡球有效部位。含有本發(fā)明圓錐繡球有效部位的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明圓錐繡球有效部位與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。本發(fā)明圓錐繡球有效部位或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、透皮、皮下、皮內(nèi)、腹膜、直腸、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、眼內(nèi)、顱內(nèi)、陰道給藥等。本發(fā)明圓錐繡球有效部位或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、穴位注射、鞘內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型的溶液性質(zhì)可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。液體劑型形式可以是糖漿劑、酏劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液；固體劑型例如片劑、錠劑、膠囊、滴丸、丸劑、粒劑、粉劑、霜劑、溶液劑、栓劑、可分散粉劑如凍干粉針劑、氣霧劑等。本發(fā)明圓錐繡球有效部位可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、耙向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子包括，賦形劑例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉；稀釋劑與吸收劑例如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁、葡聚糖、膠態(tài)二氧化硅、阿拉伯膠、明膠、三硅酸鎂、角蛋白等；濕潤劑與粘合劑例如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、三乙胺硬脂酸鎂、三乙胺硬脂酸、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片，以延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，并由此提供在較長時間內(nèi)的持續(xù)作用。例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明圓錐繡球有效部位與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明圓錐繡球有效部位制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。例如為了將給藥單元制成口服液體制劑，包括乳液、溶液、懸浮液、糖漿等。合適的載體包括溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。例如，將本發(fā)明圓錐繡球有效部位制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、l，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機酯例如油酸乙酯、聚氧乙烯山梨醇、脂肪酸酯等。這樣的劑型還可以含有輔料例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑例如薄荷、冬青油等，甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精等或其它材料。本發(fā)明所用的無菌介質(zhì)都可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標準技術(shù)制得?？蓪⑺鼈儨缇?，例如通過經(jīng)由細菌過濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱宋滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌可注射介質(zhì)。為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。當然用于實施本發(fā)明的圓錐繡球有效部位的給藥途徑取決于疾病和需要治療的部位。因為本發(fā)明圓錐繡球有效部位的藥動學和藥效學特征會有某種程度的不同，因此在組織中獲得治療濃度的最優(yōu)選方法是逐漸增加劑量并監(jiān)測臨床效果。對于這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決于給藥途徑。對于任何特定患者，本發(fā)明圓錐繡球有效部位藥物組合物的具體治療有效劑量水平取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質(zhì)、疾病嚴重程度、給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的、圓錐繡球有效部位的清除速度、治療持續(xù)時間，圓錐繡球有效部位聯(lián)合或同時使用的具體藥物，患者或動物的性別、年齡、體重、性格、飲食、個體反應以及一般健康狀況等醫(yī)藥科學領(lǐng)域眾所周知的因素，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。根據(jù)所治療患者的病癥，可能必須對劑量作出某些改變，并且在任何情況下，都由醫(yī)師決定個體患者的合適劑量。給藥劑量是指不包括載體重量在內(nèi)(當使用載體時)的圓錐繡球有效部位的重量。一般來講，本發(fā)明中藥學成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以根據(jù)本發(fā)明圓錐繡球有效部位組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當?shù)恼{(diào)整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預防或治療目的。本發(fā)明圓錐繡球有效部位的每天的合適劑量范圍優(yōu)選為O.l-100mg/kg體重，更優(yōu)選為l-30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥；這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明的圓錐繡球有效部位或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。本發(fā)明觀察了圓錐繡球提取物在小鼠一次灌胃給藥的急性毒性，發(fā)現(xiàn)給小鼠一次灌胃5g/kg，給藥后動物無異常反應，兩周內(nèi)無死亡。兩周后雌性小鼠體重增加52.8%，雄性小鼠體重增加84.8%，尸檢肉眼觀察各主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。說明圓錐繡球提取物的毒性較低。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)圓錐繡球提取物的對順鉑所致小鼠急性腎損傷用具有較好的保護作用，作用與陽性對照藥Benza印ril相當。本發(fā)明還觀察了圓錐繡球提取物的對5/6大鼠腎切除致慢性腎功能不全的影響。手術(shù)切除5/6腎，術(shù)后4個月，大鼠殘腎病變特點符合慢性腎炎模型。通過在模型建立2周即給藥前，給藥后2周，4周，6周，8周和12周分別檢測實驗鼠血清生化指標中的血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Cre)、尿蛋白含量、血漿血管緊張素II(AI1)水平以及動物體重，說明圓錐繡球有效部位具有較好的治療由大部分腎切除所引起的慢性腎功能不全且無毒副作用。給藥結(jié)束后對實驗鼠的腎組織進行了病理學檢查，通過對各組動物腎小球病變分級發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組96%以上腎小球未見病變，模型組(手術(shù)組)II-IV級腎小球病變在94%以上，其中IV級病變腎小球可達到27.6X。陽性對照藥組和圓錐繡球有效部位組對腎小球病變具有一定的保護作用，特別是IV級腎小球百分數(shù)明顯低于模型組。對各組動物腎小球病變總積分，正常對照組腎小球病變積分最低，與其它各組比較差異非常顯著，模型組小球病變積分最高，陽性藥組和圓錐繡球有效部位大劑量組腎小球病變積分明顯低于模型組。除腎小球病變外，腎小管及間質(zhì)也發(fā)生明顯的病理改變，這些變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)炎性細胞浸潤，不同程度纖維組織增生，腎小管上皮扁平，管腔擴張及蛋白管型等，模型組上述病變最嚴重，陽性藥組和圓錐繡球提取物大、中劑量組明顯減輕。病理學檢查也說明受試藥大、中劑量組，對慢性腎炎大鼠腎臟病變具有一定的保護作用。本發(fā)明還通過兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型，觀察圓錐繡球有效部位對動物血壓的影響。在研究中，動物經(jīng)兩腎一夾型手術(shù)后，動脈血壓逐漸升高，至第七周時與假手術(shù)組相比具有明顯的顯著性差異(P<0.01)。給予陽性對照藥血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)——卡托普利和Al\受體拮抗劑——氯沙坦兩周后，動物血壓明顯下降，說明本實驗高血壓大鼠模型是成功的。通過觀察圓錐繡球?qū)δI血管性高血壓大鼠收縮壓、舒張壓和心率的影響，發(fā)現(xiàn)圓錐繡球低劑量組(7.5mg/kg)口服給藥兩周對腎血管性高血壓大鼠收縮壓有明顯的降低作用。對動物的心率則無明顯影響；其機制可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)源性血壓正負調(diào)控因子的平衡有關(guān)。圓錐繡球有效部位組動物停藥兩周后，收縮壓和舒張壓均明顯回升，故未見受試品圓錐繡球有效部位具有后遺效應。具體實施例方式提取物的制備實施例1圓錐繡球根或莖lkg，95^乙醇回流3次，每次2小時，6(TC減壓濃縮得到浸膏。此浸膏乙醇四氫呋喃少量水(8:8:i)溶解，取上清液與100-200目250g硅膠拌樣，7水浴6(TC烘干，通過1個100-200目100g硅膠柱，分別用3500ml石油醚丙酮(1:1)、2000ml丙酮、乙醇洗脫，收集丙酮洗脫液，6(TC減壓濃縮分別得到各個部分。丙酮部分(粗品部分)用乙醇四氫呋喃水(7:8:3)溶解，通過ODS柱，用10-15%乙醇流動相洗脫，得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。實施例2圓錐繡球根或莖lkg，95^乙醇回流3次，每次2小時，6(TC減壓濃縮得到浸膏。此浸膏乙醇四氫呋喃少量水(8:8:i)溶解，取上清液與100-200目250g硅膠拌樣，水浴6(TC烘干，通過1個100-200目100g硅膠柱，分別用不同濃度的3500ml石油醚丙酮(1:1)、2000ml丙酮、乙醇洗脫，收集丙酮洗脫液，在6(TC減壓濃縮丙酮洗脫液，得到丙酮部分(粗品部分)。丙酮部分經(jīng)大孔樹脂柱層析，用10-40%乙醇洗脫，得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。實施例3圓錐繡球根或莖lkg，95^乙醇回流3次，每次2小時，6(TC減壓濃縮得到浸膏。此浸膏乙醇四氫呋喃少量水(8:8:i)溶解，取上清液與100-200目250g硅膠拌樣，水浴6(TC烘干，進行硅膠柱層析(上樣量和硅膠的比例)，用CH3C1:MeOH:H20(8:2:0.1)流動相洗脫，得到含有50%以上茵芋甙的圓錐繡球提取物。藥理實驗實驗例1圓錐繡球提取物的小鼠急性毒性實驗實驗目的觀察圓錐繡球提取物在小鼠一次灌胃給藥的急性毒性，得到最大耐受劑量(MTD)。受試藥物名稱圓錐繡球提取物(由方法1制備)提供單位中國醫(yī)學科學院藥物研究所植化室配制方法0.5%羧甲基纖維素納配制成混懸液進行灌胃。動物昆明種小鼠，雌雄各半，由中國醫(yī)學科學院實驗動物所繁育場提供。合格證號scxkl1-00-0006實驗方法選上述昆明種小鼠20只，雌雄各半，給藥前禁食12小時。一次灌胃給予圓錐繡球提取物5g/kg。觀察給藥后小鼠中毒反應及死亡情況，連續(xù)觀察14天。稱重，解剖。實驗結(jié)果給小鼠一次灌胃5g/kg的圓錐繡球提取物，給藥后動物無異常反應，兩周內(nèi)無死亡。兩周后雌性小鼠體重增加52.8%，雄性小鼠體重增加84.8%，尸檢肉眼觀察各主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。結(jié)論圓錐繡球提取物在小鼠一次灌胃給藥的MTD為5g/kg。實驗例2圓錐繡球提取物的對順鉑所致小鼠急性腎損傷的影響。取雄性昆明KM小鼠，16g18g，按體重隨機分為溶劑對照組、順鉑模型組和給藥組，每組8只。對照組腹腔注射生理鹽水，順鉑以生理鹽水溶解，腹腔注射，按7mg/kg。以上各給藥體積均為0.4ml/20g，于注射順鉑前2天開始給予對照藥和提取物，注射順鉑后第3天、5天、7天分別眼球取血，用試劑盒檢測血清BUN、Cre。研究結(jié)果表1.提取物對順鉑所致小鼠腎損傷的保護作用(造模后3天)樣品濃度(mg/kg)CreOng/dL)降低(《Bun(mg/dL)降低(％)陰性對照組6.10±2.22順鉬712.83±6.69110.4fB+順拍5.0x3+78.90±3.1230,610.0x3+78.69±7.6732.3HP+順鈾12.5x5+75.97±2.20*53.425.0x5+713.6±5.486.7t19.77±2.5567.21±24.90240.Ot29.39±28.44*56.335.51±20.68*47.222.68±11.70*66.324.04±9.04*64.2注表中B為陽性對照藥Benaz印ril，HP代表圓錐繡球提取物，*:P<0.05，與模型組比較；t:為升高。表2.提取物對順鉑所致小鼠腎損傷的保護作用(造模后5天)樣品濃度(mg/kg)Cre(mg/dL)降低(《Bun(mg/dL)降低(％)陰性對照組順鉑KB+順鉑HP+順鉑2.34±1.123.07±2.3931.3t22.30±3.8356.94±15.43155.3t5.0x3+72.10±1.4031.610.0x3+72.37±3.1222.712.5x5+71.42±0.7153.925.0x5+72.85±1.477.123.91±6.21*58.076.05±47.6133.6t35.25±19.6138.142.63±15.6625.1注表中B為陽性對照藥Benaz印ril，HP代表圓錐繡球提取物，*:P<0.05，與模型組比較；t:為升高。表3.提取物對順鉑所致小鼠腎損傷的保護作用(造模后7天)樣品濃度(mg/kg)Cre(mg/dL)降低(％)Bun(rag/dL)降低(W陰性對照組順鉑tB+順拍59.2HP+順鉑1.31±0.221.36±0.124.0t5.0x3+71.46±0.507.4t10.0x3+70.90±0.4133.512.5x5+71.39±0.772.3t25.0x5+71.39±0.402.3t20.99±4.8365.36±18.47211.426.64±10.60*24.82±4.08*62.022.45±7.8665.627.39±5.4858.1注表中B為陽性對照藥Benaz印ril，HP代表圓錐繡球提取物，*:P<0.05，與模型組比較；t:為升高。上述實驗結(jié)果表明，在造模型后3天，模型組血清肌酐(Cre)、尿素氮(Bun)顯著升高，圓錐繡球提取物在12.5mg/kg劑量下可明顯降低血肌酐及尿素氮水平，分別降低53.4%、66.3%，作用強于Benaz印rillOmg/kg劑量組。造模型后5天，模型組血清肌酐、尿素氮仍保持較高水平，圓錐繡球提取物在12.5mg/kg劑量下可明顯降低血肌酐及尿素氮水平，分別為53.9%、38.1%，作用與Benaz印ri15mg/kg劑量組相當。造模型后7天，模型組及各給藥組血肌酐水平恢復正常(Benaz印ril10mg/kg劑量組血肌酐水平低于正常水平)，模型組血尿素氮水平仍顯著高于陰性對照組，圓錐繡球提取物12.5mg/kg及25mg/kg劑量組降低血尿素氮水平達65.6%和58.1%，與陽性藥Benaz印ril作用相當。實驗結(jié)果表明，圓錐繡球提取物對順鉑造成的小鼠腎損傷有一定的保護作用，作用與陽性對照藥Benza印ril相當。實驗例3圓錐繡球提取物對5/6大鼠腎切除致慢性腎功能不全的影響方法取體重200g左右的雄性Wistar大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉35mg/kg，待麻醉后，手術(shù)摘除右腎，切除左腎上下極腎實質(zhì)，止血、關(guān)閉腹腔，縫合。手術(shù)2周后，將存活大鼠隨機分組，并開始給藥。圓錐繡球有效部位為灌胃給藥，每周6次，持續(xù)給藥10周，Losartan(10mg/kg/day)灌胃給藥每周6次，持續(xù)給藥16周。實驗共設(shè)6組，每組6只鼠，設(shè)假手術(shù)組(陰性對照組)，手術(shù)組(模型組)、Losartan陽性藥對照組，圓錐繡球有效部位7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg三個劑量給藥組。手術(shù)后2周測定血清尿素氮、肌酐、血管緊張素II及尿蛋白指標，以后每2周測一次，至實驗結(jié)束。每周稱體重，觀察大鼠生長狀況，末次給藥后24小時，取血清測上述生化指標；處死動物，取腎臟作詳細病理檢查。實驗結(jié)果血清生化指標、尿蛋白含量、血漿AII水平，動物體重及病理改變。具體結(jié)果詳見表4-9表4.手術(shù)后2周圓錐繡球有效部位對大鼠慢性腎功能不全的治療作用4-A.血Cre、血BUN水平組別劑量CreBUNfflg/kg%mg/dL%對照組(SM)1.43±0.4714.97±1.38模型組1.65±0.2814.8t48.39±10.35**223.2t101.65±0.3646.20±5.51圓錐繡球有.效部位7.515.030.01.88±0.821.83±0.671.72±0.4146.45±3.9247.17±14.3745.99±7.974-B.血管緊張素11、尿蛋白和體重的水平療作用組別劑量血漿血管緊張素II體重mg/kgpg/ml%g%對照組(SM)129.67±41.11252.5±8.9模型組115.41±40.38215.0±31.114.9Losartan10108.16±31.72211.9±21.4圓錐繡球有效部位7.515.030.097.95±50.6094.81±19.13110.04±28.54213.8±24.9216.3±22.2214.3±17.4注意每一個處理組均沒有給藥，包括對照組和模型組。表5.手術(shù)后4周(給藥后2周)圓錐繡球有效部位對大鼠慢性腎功能不全的治5-A.血Cre、血BUN的水平組別劑量mg/kgCreBUNmg/dt%mg/dL%對照組(SM)0.91±0.3017.01±1.10模型組1.25±0.7038.1t45.04±14.17**164.7t100.90±0.4028.0149.28±11.839.4t7.51.40±0.8311.3f42.67±2.695.31圓錐繡球15.01.33±0.686.12t44.17±14.401.91有效部位30.01.19±0.274.88141.28±5.008.3715-B.血管緊張素n、尿蛋白和體重的水平組別劑量血管緊張素II尿蛋白體重mg/kgpg/ml%mg/24h%g%對照組(SM)253.15土84.192.88±0.98278.5±12.5模型組116.00±24.194.81±2.0167.3t228.0±55.818.11Losart肌10207.47士78.1078.85t4.68±1.702.711209.7±52.7'7.5101.61±22.2612.4(H4.73±2.791.641239.2±15.64.9個圓錐繡球有效部位15.091.50±5.5921.1244.91±1.652.14t221.7±18.32.8130.082.41±13.3628.9644.27±0.8811.241227.5±22.30.21*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比。表6.手術(shù)后6周(給藥后4周)圓錐繡球有效部位對大鼠慢性腎功能不全的治療作用6-A.血Cre、血BUN的水平組別劑量CreBUNmg/kgmg/dL%mg/dl>%對照組(SM)2.32±0.8019.00±1.54模型組3.67±1.11*58.6t41.25±6.84**117.1tLosartan102.32±0.84837.0i36.34±6.2211.901圓錐繡球有效部位7.515,030.03.35±2.228.912.90±1.1921.241.30±0.74""64.68441.12±6.8933.12±4.51*36.67±1.880.30119.70111.091*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比。6-B.血管緊張素n、尿蛋白和體重的水平[o川]組別劑量血管緊張素n尿蛋白體重mg/kgpg/ml%mg/24h%g%對照組(SM)98.67土32.803.25±1.02303.0±24.7模型組73.20±14.156.13±1.31林88,7t283.1±36.56.61Losartan1088.11±15.3220.37t2.67±1.28*"56.4250.0±50.311.77.550.24±8.8f31.362.70±3.82m55.9275.0±14.22.9圓錐繡球有效部位15.055.40±19.1024.314.82±3.9721.4253.8±40.410.430.065.28±28.2310.8247.13±2.7516.3t276.7±18.62.31療作用*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比。表7.手術(shù)后8周(給藥后6周)圓錐繡球有效部位對大鼠慢性腎功能不全的治7-A.血Cre、血BUN的水平組別劑量CreBUNmg/kgmg/dL%mg/dL%對照組(SM)1.50±0.8822.80±3.55模型組3.51±0.61**134.12t39.58±20.85*73.61tLosaxt肌103.99±1.6413.48f39.22±4.090.90{圓錐繡球有效部位7.515.030.02.63±0.913.42±1.002.66±0.9525.0412.51124.20136.22±5.6235.39±7.7839.32±7.338.49110.5840.641*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，7-B.血管緊張素II、尿蛋白和體重的水平:P<0.01:與模型組相比,組別All尿蛋白體重mg/kgpg/mlng/24hg對照組(SM)模型組Losartan圓錐繡球有效部位107.515.0126.68±38.7069.51±6.17149.95±54.2362.8±11.3579.89±38.399.66I3.38±1.028.59±3.61**4.02±1.2618.97±6.906.89±5.78154.1553.19I19.76130.095.45±52.826.30±1.83ffl26.69284.3士23.7292.1±41.4244.2±51.0301.7±18.3275.8±46.3287.5±19.416.423.26t5.58I1.59*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比。表8.手術(shù)后12周(給藥后8周)圓錐繡球有效部位對大鼠慢性腎功能不全的治療作用8-A.血Cre、血BUN的水平組別劑量Cre畫Mg/kgmg/dL%mg/dL%對照組(SM)0.98±0.2119.71±1.31模型組1.36±0.23*37.68t44.97±10.37**128.16tLosart肌101.41±0.284.21t40.18±5.9410.651圓錐繡球3.751.11±0.1517.89141.03±0.368.751有效部位7.51.40±0.292.95t34.38±5.2623.53115.01.26±0.157.16145.79±15.041.83t*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比8-B.血管緊張素II、尿蛋白和體重的水平組別劑量All尿蛋白體重mg/kgpg/ml%mg/24hg%對照組(SM)145.5±42.95.27±1.17364.4±18.8模型組117.8±46.215.16±0.72氺氺187;68359.t3±43.1Losartan10136.5±15.9045.2f11.60±0.3423.501324.2±59.89.773.7599.5±16.215:4817.41±0.6814.82t345.8士34.13.745.376.20圓錐繡球，c7.5有效部位84.3±66.92,4411L3±553425.0b'b"1L55±0.5923.84I340.0±51.815.014.35土0.575.341337.0±27.7*P<0.05，制，<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比手14術(shù)8周后停藥2周，2周后繼續(xù)給藥，給藥劑量調(diào)整為3.75mg/.kg，7.5mg/kg，15.0mg/kg。表9.手術(shù)后16周(給藥后12周)圓錐繡球有效部位對鼠慢性腎功能不全的治療作用9-A.血Cre、血BUN的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*P<0.05，:**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比9-B.血管緊張素11、尿蛋白和體重的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01:與對照組相比，#:P<0.05，##:P<0.01:與模型組相比。(1)模型建立2周模型組血清BUN升高223.2%(P<0.01)，血肌酐升高14.8%(詳見表4)。手術(shù)組動物體重均有所下降。(2)模型建立4周(給藥2周)?；笜?模型組血清BUN升高164.7%(P〈0.01)，肌酐(Cre)升高38.1%，尿蛋白升高67.3%，模型組動物體重下降18.1%。與模型組相比，圓錐繡球有效部位7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg的BUN分別下降5.3%、1.9%和8.37%(P>0.05，P>0.05，P>0.05)，肌酐水平在30mg/kg，下降4.88%，陽性對照藥Losartan的BUN上升9.3%，肌酐水平下降了28.0%(P>0.05)。圓錐繡球有效部位7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg的AII水平分別降低12.4%、21.1%和28.96%，陽性對照藥Losartan升高了78.8%。圓錐繡球有效部位30mg/kg的尿蛋白含量降低11.24%，陽性藥Losartan降低腎衰大鼠尿蛋白2.71%(結(jié)果見表5)。[O142](3)模型建立6周(給藥4周)生化指標模型組血清BUN升高117.1%(P<0.Ol)，肌酐(Cre)升高58.6%(P<0.05)，尿蛋白升高122.54%(P<0.01)。AII水平、動物體重均無顯著差異。與模型組相比，圓錐繡球有效部位7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg的BUN分別下降0.3%、19.7%和11.09%;肌酐水平分別下降8.9%、21.2%和64.48%(P<0.01)，尿蛋白分別下降56.4%、21.4%及上升了16.3X;血管緊張素II(AI1)分別降低31.36%、24.31%和10.82%;陽性對照藥Losartan的BUN下降11.90%，肌酐水平下降37.0%。尿蛋白下降56.4%(結(jié)果詳見表6)。(4)模型建立8周(給藥6周)生化指標模型組血清BUN升高73.61%(P<0.01)，肌酐(Cre)升高134.12%(P<0.05)，尿蛋白升高154.15%(P<0.01)。AII水平、動物體重均無顯著差異。與模型組相比，HP制劑7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg的BUN分別下降8.49%、10.58%和0.64%;肌酐水平分別下降25.04%、2.51%和24.20%，尿蛋白在中劑量和大劑量分別下降19.76%及和26.69%;陽性對照藥Losartan的BUN下降0.90%，尿蛋白下降53.19%(結(jié)果詳見表7)。(5)模型建立12周(給藥8周)中途停藥2周后減量繼續(xù)給藥生化指標模型組血清BUN升高128.16%(P<0.01)，肌酐(Cre)升高37.68%(P<0.05)，尿蛋白升高187.68%(P<0.01)。AII水平、動物體重均無顯著差異。與模型組相比，HP制劑3.75mg/kg、7.5mg/kg和15mg/kg的BUN分別下降8.75%、23.53%和升高1.83%;肌酐水平分別下降17.89%、0%和7.16%，尿蛋白在7.5mg/kg和15mg/kg分別下降23.84%和5.34%;血管緊張素II(AII)分別降低15.48%、28.44%和5.53%;陽性對照藥Losartan的BUN下降10.65%，肌酐水平上升4.21%。尿蛋白下降23.50%(結(jié)果詳見表8)。(6)模型建立16周(給藥12周)生化指標模型組血清BUN升高160.00%(P<0.01)，肌酐(Cre)升高55.78%(P<0.05)，尿蛋白升高275.22%(P<0.01)。AII水平、動物體重均無顯著差異。與模型組相比，HP制劑3.75mg/kg、7.5mg/kg和15mg/kg的BUN分別上升5.64%，下降了22.04%和2.08%;肌酐水平分別下降45.93%、42.58%(P.0.05)和54.07%(P<0.01)，尿蛋白在3.75mg/kg下降了16.74%;血管緊張素II(AII)分別降低38.45%、25.56%和18.89%;陽性對照藥Losartan的BUN下降39.76%，肌酐水平下降46.97%。尿蛋白下降58.13%(結(jié)果詳見表9)。腎組織病理學檢查實驗方法將大鼠腎切除5/6，術(shù)后給藥，停藥24小時處死動物，取殘腎，標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡檢查。每例動物計數(shù)30個腎小球，根據(jù)文獻報導將腎小球病變分五級(o-iv)，級數(shù)越大病變越嚴重，在分級的基礎(chǔ)上，再乘以不同權(quán)數(shù)(從O-IV分別x0.05-0.4)，求出每只動物各級病變腎小球的百分數(shù)(％)以及每組腎小球病變總積分(X士S)，積分越高，病變越重。實驗結(jié)果表10為各組動物腎小球病變分級結(jié)果，對照組96%以上腎小球未見病變，模型組II-IV級腎小球病變在94%以上，其中IV級病變腎小球可達到27.6%，只有個別動物可見到0級和I級腎小球。陽性對照組和圓錐繡球有效部位給藥大、中劑量組對腎小球病變有一定的保護作用，特別是IV級腎小球百分數(shù)明顯低于模型組(因個體差異較大，例數(shù)少統(tǒng)計未見明顯差異)。表10腎小球病變分級<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表11為各組動物腎小球病變總積分，正常對照組腎小球病變積分最低(1.55±0.06)，與其它各組比較差異非常顯著(P<0.01)，模型組小球病變積分最高(8.77±1.55)，陽性藥組和圓錐繡球有效部位給藥大劑量組小球病變積分明顯低于模型組，其中陽性組與模型組比較差異顯著(P<0.05)。術(shù)后除腎小球病變外，腎小管及間質(zhì)也發(fā)生明顯的病理變化，這些變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)炎性細胞浸潤，不同程度纖維組織增生，腎小管上皮扁平，管腔擴張及蛋白管型等，模型組上述病變最嚴重，陽性藥組和圓錐繡球有效部位給藥大、中劑量組明顯減輕。表11腎小球病變積分(X±S)注*P<0.05與模型組比較；AP<0.01與正常對照組比較結(jié)論1.手術(shù)切除5/6腎，術(shù)后4個月，大鼠殘腎病變特點符合慢性腎炎模型；2.陽性藥及受試藥大、中劑量組，對慢性腎炎大鼠腎病變有一定保護作用。即圓錐繡球有效部位對大部分腎切除所引起的慢性腎功能不全具有較好的治療作用。實施例4圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血壓的影響目的通過兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型，觀察圓錐繡球?qū)游镅獕旱挠绊?。l材料1.1動物Wistar大鼠，體重160_180g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCXKl1-00-0006。1.2儀器BESN-II多通道動物無創(chuàng)測壓系統(tǒng)，南京德賽生物技術(shù)有限公司提供。1.3藥品受試品圓錐繡球有效部位，白色粉末，批號030703。氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品，批號02103?？ㄍ衅绽?，北京太洋藥業(yè)有限公司，批號030301。戊巴比妥鈉，北京化學試劑公司分裝，批號020919。注射用青霉素鉀，華北制藥集團動物保健品有限責任公司，批號030553。腎動脈夾內(nèi)經(jīng)0.2mm0.3mm，由中國藥科大學生理學教研室傅繼華教授提供。2方法2.1血管性高血壓大鼠模型建立健康Wistar大鼠共140只，雄性，適應性喂養(yǎng)4天。以BESN-II測壓系統(tǒng)測定動物基礎(chǔ)血壓，每周一次，連續(xù)測定三次。而后隨機抽取IO只動物編為假手術(shù)組。大鼠以戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，剃毛消毒腹部，于腹正中線偏左0.5mm處打開腹腔，暴露左腎并鈍性分離腎動脈，用內(nèi)經(jīng)0.2mm0.3mm的腎動脈夾縮窄左腎動脈，而后逐層消毒關(guān)腹。手術(shù)過程中不觸及右側(cè)腎臟。假手術(shù)組僅分離左腎動脈，但不縮窄。手術(shù)結(jié)束后肌肉注射青霉素5萬U/只以預防感染，置于籠中飼養(yǎng)。2.2實驗方案治療給藥術(shù)后持續(xù)監(jiān)測手術(shù)大鼠血壓，收縮壓^160mmHg者確定為高血壓模型形成。將造模成功的大鼠按血壓分層隨機分為9組，分別為模型組，氯沙坦(4.5mg/kg)，卡托普利組(6mg/kg)，圓錐繡球高劑量組(30mg/kg)，中劑量組(15mg/kg)，低劑量組(7.5mg/kg)，各組動物灌胃給藥，每日一次，模型組和假手術(shù)組給予等容量蒸餾水。給藥體積0.5ml/100g。連續(xù)給藥兩周后觀測各組動物血壓和心率的變化?；謴蛯嶒灨鹘M動物給藥五周后停止給藥。于停藥后第三周測定動物血壓和心率，觀察受試品的藥效學后遺作用。3結(jié)果18組別例數(shù)X±S61.55±0.0678.77±1.59A66.57±1.37*57.36±1.0157.10±1.2168.36±0.94對照組模型組rTT.lPTTIFTTIPTTI自經(jīng)自自藥量量量性劑劑劑陽大中小3.1圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠收縮壓、舒張壓和心率的影響腎血管性高血壓大鼠是目前最常用的研究高血壓藥物評價的動物模型之一，其具有模型穩(wěn)定、操作簡單、且與人類腎性高血壓發(fā)病機理相似等特點。在本研究中，動物經(jīng)兩腎一夾型手術(shù)后，動脈血壓逐漸升高，至第七周時與假手術(shù)組相比具有明顯的顯著性差異(P<0.01)。給予陽性對照藥血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)——卡托普利和Al\受體拮抗劑——氯沙坦兩周后，動物血壓明顯下降，說明本實驗高血壓大鼠模型成功。由表12-14可見，與模型組相比，受試品圓錐繡球有效部分低劑量組(7.5mg/kg)口服給藥兩周對腎血管性高血壓大鼠收縮壓有明顯的降低作用；其它各組動物給藥兩周后舒張壓與模型組比較均無顯著性差別。造模六周后所有腎血管性高血壓大鼠與假手術(shù)動物相比心率沒有明顯差別。給藥兩周后陽性對照藥卡托普利和氯沙坦對動物心率未見明顯影響。與模型組相比，圓錐繡球有效部位高劑量組可略降低動物心率外，其它各給藥組動物心率無明顯變化。受試品組動物停藥兩周后，收縮壓和舒張壓均明顯回升，統(tǒng)計學結(jié)果表明，圓錐繡球有效部位各劑量組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)。對腎血管性高血壓大鼠心率亦無明顯影響。各組給藥前及給藥后動物收縮壓、舒張壓和心率見表12-14。表12.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠收縮壓的影響(mmHg)組別劑量(mg/kg)術(shù)前術(shù)后給藥后第三周停藥后第三周正常-l正常-2正常-3二周閃周六周假手術(shù)組模型組—130.33±7.44133.416.60120.0±7.21129-7±12.06進6±8.84137.5±12.78137.4±9.49141.6±I9.58141.4±11.44亂6土17.32142.4±I0.61179.4土21.87"154.1±9.14172,9±10.17'144.7±10.0152.8±10.2+氯沙坦對照組4.5132.0±I3.30129.8±11.88131.2±10.05]55.4±23.41J49.9士17.0817(1.9士n.32"l犯.肚17.0,149.肚14.6卡托普利對照組6135.6±12.04129.8±9.47133.5±7.44157.3±12.47161.7±12.45170.6±10.76"157.肚U.74**159.7±15.(3HP高劑量30m.8±丄4.91126.2±12.87135.3±li.34149.8±24.26176.肚85.16170.1±9.25"163.肚17.48159.2±19.3中劑量組15126.2±9.00124.2±i0.00133.9±13.36155.3±18.38151.9±19.01170.1土9.30++跳4±33.78164.肚17.0HP低劑量組136.7±22.49133.8±14.43139.肚14.82164.0土17.60157.6±19.95169.4±8.08++155.8±13.20**154.8±10.9注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較;+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。表13.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠舒張壓的影響(mmHg)組別劑量手術(shù)前手術(shù)后給藥后停藥后<mg/kg)正常-l正常-2正常-3二周四周六周第三周第三周假手術(shù)組模型組—102.3土7.63107.8±16.48102.7±8.25106.8±5.04105.5±9.77U3.5±12.78lll.O土lO.79117.9±20.49117.6±9.92132.2±19.40106.2±16.61142.0士30.19++125.7±15.79M5.7±12.82++126.2±10.2131.6±11.3氯沙坦對照組4.5105.2+955112.8±ll.34J10.6±11.03122.0±23.78118.1土12.65128.0土29.83—'121.9±18.26**125.7±17.0卡托普利對照組6跳9±11.78皿3±9.23107.5±12.47129.8±14.741341±15.51126.7±28.01130.3土15.41承136.7±16.1HP高劑量組30106.9±14.59105.2±13.59115.6±14.15120.7±26.19118.2±20.15135.9±16.95"137.5±17.92137.9±I8.5IIP中劑量組1593.U±11.78皿5±8.77116.9±13.84119.1±23.80125.6±20.80125.8±20.97'132.5±32.88141.5±20.1HP低劑暈組7.5107.8±21.36115.1±10.86120.3±8.97132.0±18.63118.8±24.69125.8±23.48'131.5±R62m2±13.3注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。表14.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠心率的影響(次/分)組別劑量(mg/kg)手術(shù)前手術(shù)后正常-l正常-2正常-3二周剛六周給藥后第三周停藥后第二周335.7±66.1333.6±58.0368.1±38.9330.9±52.9335.6±46.8321.4±30.8370.7±50.1假手術(shù)組模型組氯沙坦對照組卡托普利對照組HP高劑量組HP中劑量組HP低劑量組3015438.0±45.88417.4±34.27425.6±51-65413.9±44.04416.2±37.10415.6±48.28微6±29.76400.7±23.50皿6±37.17413.6±61.21395.9±49.53407.0±55.65409.7±26.87426.3土49.37400.諸.67407.2±37.38391-1±46.47402.8±37.61403.8±37.34403.2±32.45394.4±39.32391.9±36.75375.8±30.12377.6±38.94399.0±45.17364.0±33.21373.0±46.43390.6±45.52375.5±41.65362.0±50.49385.5±64.38405.0±61.69373.7±38.95393.2±60.56410.3±fi9.20377.3±27.963fi5.9±53.46362.8±59.00347.0±41.20364.4±31.89363.8±42.76358.9±44.53331.6±44.19354.6±29.76350.0±35.09355.4±32.74310.1±30.84**353.2±57.34364.6±40.12注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較;+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。3.2圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血中一氧化氮、血管緊張素II、內(nèi)皮素、一氧化氮合酶和降f丐素基因相關(guān)肽含量的影響動物血壓的穩(wěn)定依賴于體內(nèi)血壓正負調(diào)控因子的平衡。一氧化氮是內(nèi)源性血壓負調(diào)控因子，有降低血壓、舒張血管和抑制血管平滑肌細胞增殖等作用。本實驗中模型組大鼠體內(nèi)一氧化氮水平明顯降低，此與其它文獻報道相一致。受試品圓錐繡球有效部位各劑量組對一氧化氮及其合酶均活性無明顯影響(見表15和表19)。血管緊張素II和內(nèi)皮素(ET)均為體內(nèi)較強的血壓正調(diào)控因子。體外實驗證明二者有相互促進轉(zhuǎn)化的作用。本實驗中模型組大鼠體內(nèi)AII和ET水平明顯升高，說明動物血壓的升高與體內(nèi)此類調(diào)控因子水平呈正相關(guān)，與其它文獻報道相一致。給藥兩周后，受試品圓錐繡球有效部位低劑量組可降低高血壓大鼠血槳中AII和ET水平，但無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)，我們認為此結(jié)果與標準差較大有關(guān)。受試品各劑量組對內(nèi)源性降壓物質(zhì)降鈣素基因相關(guān)肽未見明顯影響(見表16、表17和表18)。表15.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血槳NO的影響(umol/L)組別劑量(mg/kg)術(shù)前術(shù)后六周給藥后第三周假手術(shù)組——34±455.2±4.613.3±9.4模型組—28±3313.1±10.85.2±2.4++卡托普利對照組4.559±5210.9±10.810.2±7.4*氯沙坦對照組623±179.8±5.713.0±12.3*HP高劑量組3037±326.1±7.410.9±12.0HP中劑量組15127±15714.0±14.86.6±4.8HP低劑量組7.547±8911.2±9.28.1±5.5注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比ml)表16.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血漿血管緊張素II的影響(pg/20組別劑量(mg/kg)手術(shù)前術(shù)后六周給藥后第三周假手術(shù)組—81.8±78.358.0±39.480.7±14.9模型組——54.4±34.772.9±42.8139.3±101.1卡托普利對照組4.535.7±24.484.6±46.1130.6±53.6氯沙坦對照組638.7±31.181.5±42.092.3±28.9HP高劑量組3052.7±32.364.0±38.1122.7±132.8HP中劑量組1567.7±66.2110.6±66.3115.3±50.5HP低劑量組7.569.4±40.989.5±69.680.0±33.5注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。表17.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血漿內(nèi)皮素的影響(pg/ml)組別劑量(mg/kg)手術(shù)前術(shù)后六周給藥后第三周假手術(shù)組——427±30215±10176±87模型組—425±38456±88331±190+普利對照組4.5426±25216±10311±145氯沙坦對照組6398±31432±53205±88HP高劑量組30464±42667±107255±137HP中劑量組15383±341424±781233±93HP低劑量組7.5454±40234±42205±117注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。表18.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血漿降鈣素基因相關(guān)肽的影響(pg/ml)組別劑量(mg/kg)手術(shù)前術(shù)后六周給藥后第三周假手術(shù)組—64土74300土21451±31模型組—56±54196±15840±20卡托普利對照組4.534±30329±47038±25氯沙坦對照組645±31286±38541±22HP高劑量組3053±32520±113641±22HP中劑量組15106±96229±31152±39HP低劑量組7.553±37182±28740±23注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。表19.圓錐繡球有效部位對腎血管性高血壓大鼠血槳NOS的影響(U/mgprot)組別劑量(mg/kg)手術(shù)前術(shù)后六周給藥后第:三周假手術(shù)組——7.2±12.313.0±3.126.6±3.0模型組—5.9±10.810.9±10.526.1±2.7卡托普利對照組4.517.6±34.412.6±2.624.4±3.2氯沙坦對照組65.9±17.912.0±2.322.9±5.4HP高劑量組306.6±17.713.3±2.323.3±6.7HP中劑量組159.2±8.612.0±2.322.8±5.3HP低劑量組7.56.8±15.911.7±3.523.8±6.6注*P<0.05，**P<0.01與模型組比較；+P<0.05，++P<0.Ol，與假手術(shù)組比較。4.結(jié)論1、受試品圓錐繡球有效部位低劑量組可明顯降低腎血管性高血壓大鼠動脈血壓，對動物的心率無明顯影響；其機制可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)源性血壓正負調(diào)控因子的平衡有關(guān)。2、受試品組動物停藥兩周后，收縮壓和舒張壓均明顯回升，故未見受試品圓錐繡球有效部位具有后遺效應。權(quán)利要求一種含有10％以上茵芋甙的圓錐繡球有效部位的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(a)圓錐繡球根或莖用溶劑提取，濃縮，得到浸膏；所述的溶劑是水、醇類、或水與醇類的混合物；(b)使用硅膠柱層析，用CH3Cl:MeOH:H2O流動相洗脫，層析1次得到圓錐繡球有效部位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的醇類選自甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇之一。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述的濃縮是在減壓條件下。4.權(quán)利要求1-3中任一項制備的圓錐繡球有效部位，其特征在于，含有10%以上的茵芋甙。5.根據(jù)權(quán)利要求4的圓錐繡球有效部位，其特征在于，含有50%以上的茵芋甙。6.—種預防和/或治療腎功能不全的藥物組合物，其特征在于，含有的權(quán)利要求4-5中任一項的有效部位及藥用載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物選自片劑、膠囊、丸劑、注射劑。8.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物選自緩釋制劑或控釋制劑。9.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物選自微粒給藥系統(tǒng)。10.權(quán)利要求4-5中任一項的有效部位在制備預防和/或治療腎功能不全的藥物中的應用。11.權(quán)利要求4-5中任一項的有效部位在制備預防和/或治療高血壓的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了從圓錐繡球(HydrangeapaniculataSieb)提取的有效部位，這種有效部位的制備方法，含有這種有效部位的藥物組合物，以及這種有效部位和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是在制備預防和/或治療腎功能不全、高血壓以及糖尿病腎病的藥物中的應用。文檔編號A61P13/00GK101693045SQ20091025431公開日2010年4月14日申請日期2004年4月23日優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日發(fā)明者張東明,李燕,楊敬芝,鄭旭光,陳曉光申請人:北京協(xié)和藥廠;中國醫(yī)學科學院藥物研究所;