專利名稱：一種蛇毒凝血酶凍干粉針劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛇毒凝血酶凍干粉針劑及其制備方法，屬于生物制品制劑領域。

背景技術：
凝血酶以纖維蛋白I為作用底物，迅速轉入血管受傷部位成為纖維蛋白凝塊，阻止血液自受傷部位流出。凝血過程大致分為三個階段，即凝血因子X的激活；凝血酶原的激活；纖維蛋白原變成纖維蛋白。能使纖維蛋白原變成纖維蛋白的作用稱為類凝血酶樣作用；能通過激活凝血因子X及凝血酶原而發(fā)揮作用的，稱為類凝血激酶樣作用。蛇毒中含有豐富的蛋白酶，其中一類絲氨酸蛋白酶與蛇傷造成的血液凝固失調(diào)等毒理作用密切相關，屬于凝血酶類。很多凝血酶樣酶(促纖維蛋白原凝固酶)己經(jīng)從各種蛇毒中提純，并已先后用于制備臨床用藥。
自1936年首次從矛頭蝮蛇毒中獲得部分純化的凝血酶以來，迄今已發(fā)現(xiàn)30余種蛇毒中含有凝血酶組分，并有20余種已得到分離和純化。Holleman等用親和層析法自巴西矛頭蝮(Bothrope jararaca)蛇毒中分離純化得到了蛇毒凝血酶，經(jīng)Itoh.N.等測定，Batroxobin為單鏈，由230個氨基酸組成，分子量為3100。V.klobusitzky(1936)首先發(fā)現(xiàn)并將該酶制劑研制成止血劑Reptilase。我國進口的藥物“立芷雪”即是由瑞士巴塞爾素高大藥廠生產(chǎn)。
蛇毒凝血酶活性成分在藥物制劑中的含量非常少，每支注射劑約含0.1KU-10KU(相當于0.1-10微克)，在極稀的溶液中該生物活性成分的活性空間結構很容易被破壞解聚，活性降低甚至失去活性。
制做高純度的蛇毒凝血酶的研究多有報道，但制得的原料在制備成方便臨床有效應用的制劑方面文獻則相對較少。由于蛇毒凝血酶在制劑的制備及貯存過程中效價會明顯下降，實際操作中，制備含蛇毒凝血酶制劑時都按照標示量的130-200％投料。結果由于高純度蛇毒高昂的價格，一方面帶來實際生產(chǎn)成本的增加，另一方面因效價損失的幅度不確定而使實際效價難以確定，影響產(chǎn)品的合格率，給生產(chǎn)帶來很大的麻煩，更重要的是大量異源蛋白的引進使制劑免疫源性及過敏性反應發(fā)生的幾率大大增加，從而影響臨床用藥的安全性。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過大量的研究，提供了一種穩(wěn)定的蛇毒凝血酶凍干粉針劑，其中用作凍干保護劑的是右旋糖苷、明膠和山梨醇的組合物。
本發(fā)明凍干粉針劑能最大程度地保留蛇毒凝血酶的活性，制備及貯存過程中效價穩(wěn)定，而且能夠滿足長期貯存的需要。
本發(fā)明凍干粉針劑解決了以下現(xiàn)有技術的問題1、解決了目前蛇毒凝血酶制劑制備及貯存過程中效價明顯下降的問題，這樣，在制劑投料時就可以正常投料或稍微高于正常投料(110-130％)，不用像現(xiàn)有工藝那樣按150-200％投料；2、因為高純度蛇毒價格非常昂貴，本發(fā)明凍干粉針劑解決了現(xiàn)有制劑因為初始投料過高引起的成本過高的問題；3、解決了現(xiàn)有制劑因效價損失的幅度不確定而使實際效價難以確定，影響產(chǎn)品的合格率，給生產(chǎn)帶來很大的麻煩的問題；4、解決了現(xiàn)有制劑中凍干保護劑配方所含白蛋白帶來的成本高、并且存在潛在的被病原體，如人免疫缺陷病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)感染的可能、誘發(fā)某些人的免疫反應的可能等問題。
本發(fā)明凍干粉針劑采用的右旋糖苷、明膠、山梨醇組成的溶媒系統(tǒng)對蛇毒凝血酶等蛋白、多肽類生物活性物質(zhì)結構起穩(wěn)定作用、保護作用，以減少蛇毒凝血酶在制劑制備過程中發(fā)生構型、構象的改變，維持其較高活性，從而減少凍干前活性成分的投料量，在節(jié)省昂貴的高純度蛇毒生物活性成分的同時，由于蛇毒用量的減少，也降低了臨床使用中引進較多異種毒素蛋白或制劑過程產(chǎn)生的多肽類碎片所造成的過敏反應或其他毒副反應。
本發(fā)明中的凍干保護劑為非活性成分，含右旋糖酐、明膠、山梨醇，均為藥用級輔料。
其中，明膠是膠原蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，肽分子聚合物質(zhì)，為一種吸水性強、粘度高，可溶于熱水，形成熱可逆性凝膠。它具有極其優(yōu)良的物理性質(zhì)，如膠凍力、親和性、高度分散性、低粘度特性、分散穩(wěn)定性、持水性、被覆性、韌性及可逆性等。在本發(fā)明凍干粉針劑中起到凍干保護劑、稀釋劑、賦型劑、凍干支撐劑的作用。在本發(fā)明凍干粉針劑中起到主要和重要的作用。
右旋糖酐、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、甘露醇都是低分子糖類，常用做生物制品凍干保護劑。
各種不同種蛇毒凝血酶均屬蛋白酶類物質(zhì)，其活性立體空間結構在配制溶液中很容易被破壞，降低甚至失去活性。本發(fā)明利用明膠在溶液中一定的粘度及支架作用，再配合其他小分子糖類形成凍干保護溶液，經(jīng)過大量處方篩選和試驗研究發(fā)明了含明膠、右旋糖苷等的蛇毒凝血酶藥物組合物以降低蛇毒中生物活性酶類在制劑過程中活性的損失，并在長期存放中保持其活性穩(wěn)定。
用此保護劑凍干的蛇毒凝血酶/凝血激酶等生物活性物質(zhì)在制劑配制及凍干過程中效價損失低于10％，在2℃-8℃條件下，保存24個月以后，蛇毒凝血酶的生物活性不變，效價無明顯下降。
本發(fā)明所提供的注射用蛇毒凝血酶藥物組合物，其中蛇毒凝血酶的含量為0.5-100KU/支，優(yōu)選1-10KU/支。
本發(fā)明所述的“蛇毒凝血酶”是指廣義上的蛇毒凝血酶，包括但不限于以下情況矛頭蝮蛇蛇毒凝血酶、蘄蛇蛇毒凝血酶、尖吻蝮蛇蛇毒凝血酶、白眉蛇蛇毒凝血酶，也包括，通常所說的蛇毒凝血酶、蛇毒類凝血酶、蛇毒血凝酶、蛇凝血素酶、降纖酶、去纖酶、抗栓酶、蛇毒凝血酶樣酶、巴曲酶、蛇毒凝血酶原、蛇毒凝血酶原激酶等從蛇毒中提取出的蛋白酶，或者以基因工程等方式人工制備的蛋白酶。
本發(fā)明所提供的注射用蛇毒凝血酶組合物為凍干粉針劑，配制成的溶液中活性成分百分含量極低屬于微量成分，根據(jù)每次制劑的需要核加一定的劑量，控制其含量為標示量的110％即可。
本發(fā)明的技術方案為提供一種蛇毒凝血酶凍干粉針劑，由蛇毒凝血酶做為有效成分，凍干保護劑由右旋糖苷、山梨醇、明膠組成。
所述的凍干粉針劑各組分的配比為 蛇毒凝血酶1-10000KU 明膠 1-12g 右旋糖苷-20 10-40g 山梨醇15-50g 所述的凍干粉針劑各組分的配比優(yōu)選為 蛇毒凝血酶100-10000KU 明膠 3-9g 右旋糖苷-20 15-30g 山梨醇30-45g 所述的凍干粉針劑各組分的配比進一步優(yōu)選為 蛇毒凝血酶100-10000KU 明膠 6g 右旋糖苷-20 24g 山梨醇36g 所述的凍干粉針劑各組分的配比進一步優(yōu)選為 蛇毒凝血酶1000KU 明膠 6g 右旋糖苷-20 24g 山梨醇 36g 本發(fā)明所述蛇毒凝血酶凍干粉針劑的制備方法為 制法 1、稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解； 2、稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8； 3、加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml； 4、無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥； 5、冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-50--10℃，最優(yōu)選-45℃，升溫1-10℃/小時，最優(yōu)選5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度不超過15-37℃，最優(yōu)選30℃； 6、干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋即得制成品。
本發(fā)明中使用的蛇毒凝血酶購自市場，或可按照已有文獻的方法制備，蛇毒凝血酶提取方法舉例如下 取長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)毒液的冷凍干燥品用水配成5％的溶液，離心(10000rpm，15min)取上清液，加固體硫酸銨到45％飽和度，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH到7.0，4℃靜置過夜，離心(10000rpm，15min)，收集沉淀，用pH7.5的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液溶解，用截留分子量10000的超濾器脫鹽，濃縮。用DEAE-Sepharose FF層析(用PH7.5的0.01mol/LTriS-HCl緩沖液平衡)，洗脫時用含0-0.5mol/L氯化鈉的pH7.5的0.01mol/LTris-HCl緩沖液直線剃度洗脫，流速0.6ml/min，208nm波長檢測，部分收集，取有活性部分，適當濃縮，繼續(xù)用Sephadex G-25層析，用pH7.5的0.01mol/L Tris-HCI緩沖液平衡，洗脫，取有活性部分，用截留分子量10000的超濾器脫鹽、濃縮、凍干。用國家藥品標準WS-XG-031-2000中所述比活力測定法檢測活性組分，取比活力大于1200單位的組分。
本發(fā)明蛇毒凝血酶凍干粉針劑，1KU/支，臨床主要用于止血。用于需減少流血或止血的各種醫(yī)療情況，如外科、內(nèi)科、婦產(chǎn)科、眼科、耳鼻喉科、口腔科等臨床科室的出血及出血性疾病；也可用來預防出血，如手術前用藥，可避免或減少手術部位及手術后出血。
本發(fā)明蛇毒凝血酶凍干粉針劑，大劑量，如10KU/支，可用于治療血栓性疾病，腦栓塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血栓性疾病以及預防術后血栓再發(fā)等。
本發(fā)明蛇毒凝血酶凍干粉針劑還對腎病、紅斑狼瘡、病毒性肝炎及雷諾氏病等有治療效果。
本發(fā)明凍干粉針劑(1KU/支)的用法用量為靜注、肌注成人1.0-2.0KU，兒童0.3-1.0KU。緊急出血，立即靜注1KU，同時肌注1KU。手術前后，術前1hr肌注1KU或術前15min靜注1KU，術后肌注1KU/日，連用3日。
以下是本發(fā)明凍干粉針劑配方的的篩選過程 處方篩選情況同樣的主藥效價，不同的賦型劑、凍干保護劑配方，相同的生物制品凍干條件下，不同處方的凍干保護效果。各處方均配制100ml溶液，凝血酶500KU，分裝100瓶，凍干前理論效價均為5KU/支。
本發(fā)明中使用的蛇毒凝血酶其測定方法參照國家藥品標準WS1-XG-031-2000。使用的右旋糖苷-20、山梨醇及明膠為市售藥用注射級輔料；本發(fā)明所提到的水是指注射用水。本發(fā)明凝血單位參考立芷雪單位定義。
評價該組合物凍干前后活性成分的效價變化，參照中國藥典2005年版三部附錄VIB方法；其他制劑水分及pH值測定按照中國藥典內(nèi)的相關辦法；溶解性測定方法取10支該組合物制品，每支用1ml生理鹽水溶解，記錄各支完全溶解成澄清透明的溶液的時間，取這10支制品溶解時間的平均值做為該批次制劑的溶解時間。
KU(克氏單位)一個克氏單位指在體外37℃下，使1ml標準人血漿在60±20秒內(nèi)凝固的血凝酶活性量。
表1第一次處方篩選 將以上9批樣品分裝1ml/支，半壓膠塞置凍干機中進行凍干。
表2第一次處方篩選結果(凍干時間38h) 在第一次處方篩選中，1號、2號、3號及5號處方，同時含有明膠和右旋糖苷的情況下(另外分別含有蔗糖、山梨醇、海藻糖等小分子糖)，凍干保護效果較好，效價保留較高。但制品外觀塊狀不蓬松，不太理想；另外，成品溶解時間較長，不夠理想。
為確定最佳處方，繼續(xù)進行第二次處方及工藝優(yōu)化。
表3第二次處方篩選和篩選結果(凍干時間27h)
注效價損失率＝(凍干前效價-凍干后效價)/凍干前效價×100％ 在第二次處方篩選中，所得樣品溶解時間較理想，低于3分鐘。凍干保護液配方中，在同時含有明膠和右旋糖苷的情況下，另外的組分中以分別含有蔗糖、山梨醇、甘露醇的配方凍干保護效果較好，效價保留較高。
為確定最佳處方，繼續(xù)進行第三次處方篩選
經(jīng)過第三次處方篩選試驗，處方16最理想，即明膠1％，右旋糖酐4％，山梨醇6％，該配方是將生物活性的蛇毒凝血酶制備成穩(wěn)定的凍干粉針劑的理想保護組合物溶液配方，此配方凍干過程中效價損失最小。
進一步篩選有效成分與凍干保護劑之間的最佳比例 配方A 處方組成 每1000支用量 蛇毒凝血酶 1000KU 明膠 6g 右旋糖酐-20 24g 山梨醇 36g 稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解；稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8。加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘脫碳，再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml，無菌濾過加入蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液于西林瓶中，半壓膠塞置入凍干機中進行冷凍干燥操作。
配方B 處方組成每 1000支用量 蛇毒凝血酶 1000KU 明膠 9g 右旋糖酐-2036g 山梨醇 54g 稱取處方量的明膠加水700ml加熱攪拌使完全溶解；稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8。加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘脫碳，再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至900ml，無菌濾過加入蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.9ml/支溶液于西林瓶中，半壓膠塞置入凍干機中進行冷凍干燥操作。
冷凍干燥 兩種制備方法理論灌裝量均為1000支，凍干前理論效價5KU/支。
預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度不超過30℃，干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋。
表5兩種配方的比較 根據(jù)以上篩選結果，配方A的每支有效成分凍干效價損失在10％之內(nèi)的基礎上，減少輔料用量，每支分裝0.6ml進行凍干，凍干效果明顯較好，冷凍干燥時間縮短，且獲得了整齊的類白色疏松體，溶解時間在2分鐘以內(nèi)，效果最為理想。所以 蛇毒凝血酶 1000KU 明膠 6g 右旋糖苷-2024g 山梨醇 36g 是篩選獲得的最優(yōu)配方。在此配方的基礎上制備方法中優(yōu)選加水至600ml，共1000支，0.6ml/支。
評價本發(fā)明凍干粉針劑的長期穩(wěn)定性 評價該組合物的長期穩(wěn)定性的方法為取3批樣品，分別于2-8℃條件下放置，在放置前和放置期間的第3個月、6個月、9個月、12個月、18個月和24個月末取樣，檢查3批樣品的外觀、pH值、水份、溶液的澄清度與顏色、無菌、熱原和效價等各項參數(shù)。外觀、pH值、水份、溶液的澄清度與顏色、無菌、熱原和效價等的檢測方法均按照中國藥典規(guī)定的方法進行。
用本發(fā)明的方法制備的蛇毒凝血酶凍干粉針制劑，按照蛋白質(zhì)的凍干曲線凍干，于4℃貯藏長達并包括36個月。從開始貯藏起的0、1、3、6、9、12、18、24和36個月，隨即選取等分試樣，并做效價及無菌、熱原、水分測定。
下表列出不同時間點取出的等分試樣的測試結果。這些結果顯示，根據(jù)本發(fā)明制備的制劑是穩(wěn)定的，表1說明，當在4℃貯藏至少36個月時，效力在貯藏時間為零時所記錄的效價范圍內(nèi)(1KU士20％/支)。
表614℃時制劑的穩(wěn)定性 表7顯示蛇毒凝血酶凍干粉針制劑在25℃貯藏的穩(wěn)定性。結果顯示，在該制劑下25℃穩(wěn)定至少1年，其證據(jù)是，在25℃貯藏6個月后，平均效價仍在規(guī)定之內(nèi)(1KU士20％/支)。
表725℃時制劑的穩(wěn)定性 本發(fā)明的蛇毒凝血酶凍干粉針的凍干保護劑能提供介于pH5和pH6.8之間的緩沖范圍及由液體溶液凍干制成可貯藏的粉針劑時使蛇毒凝血酶效價損失低于20％。本發(fā)明的蛇毒凝血酶凍干粉針能以固體形式，在介于-20℃～7℃的溫度下保持穩(wěn)定至少1年。
通過以下實驗檢驗本發(fā)明不同蛇種凝血酶凍干粉針劑的制劑效果 用本發(fā)明方法制備巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)凝血酶凍干粉針劑和長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)凝血酶凍干粉針劑。
表8不同蛇種凝血酶與本凍干保護液組合物凍干效果比較 試驗結果表明，不同來源、分子量不同的蛇毒凝血酶使用本發(fā)明的凍干保護劑配方和制備方法制備，凍干過程效價損失均很低，說明了，本發(fā)明的配方適合于目前常用的任何種類的蛇毒凝血酶。
在藥品生產(chǎn)和臨床應用中，本發(fā)明具有重要的實際意義和可操作性。

具體實施例方式 下面以具體實施例來詳細說明本發(fā)明所提供的一種供注射用的蛇毒凝血酶凍干粉針劑及其制備方法，以下非限制性實施例的目的是為了更好地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例1 配方 巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶1000KU 明膠 6g 右旋糖苷-20 24g 山梨醇 36g 制法 1、稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解； 2、稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8； 3、加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml； 4、無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥； 5、冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度30℃； 6、干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋即得制成品。
實施例2 配方 長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶1000KU 明膠 6g 右旋糖苷-20 24g 山梨醇 36g 制法 1、稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解； 2、稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8； 3、加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml； 4、無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥； 5、冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度30℃； 6、干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋即得制成品。
實施例3 配方 巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶10000KU 明膠6g 右旋糖苷-20 24g 山梨醇 36g 制法 1、稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解； 2、稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8； 3、加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml； 4、無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥； 5、冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度30℃； 6、干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋即得制成品。
實施例4 配方 長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶10000KU 明膠 6g 右旋糖苷-2024g 山梨醇 36g 制法 1、稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解； 2、稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8； 3、加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml； 4、無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥； 5、冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度30℃； 6、干燥結束后壓塞、出箱，軋蓋即得制成品。
通過以下試驗例進一步驗證本發(fā)明蛇毒凝血酶凍干粉針劑的作用 試驗例本發(fā)明蛇毒凝血酶凍干粉針劑對家兔全血的促凝作用與立芷雪比較 實驗動物日本大耳白家兔，體重2-3公斤，雌雄各半。
家兔72只，分成4組，每組18只，第1組為本發(fā)明實施例1組，第2組為本發(fā)明實施例2組，第3組為立芷雪(英文名Reptilase；通用名注射用血凝酶；生產(chǎn)公司瑞士素高藥廠；購自市場)組，1、2、3組劑量均為2KU/kg.BW，第4組為空白對照，2ml/kg.BW生理鹽水.各組靜脈注射15分鐘后，測定家兔出血時間和凝血時間(出血時間測定采用DuKe氏法-實用醫(yī)學檢驗學P116；凝血時間測定采用玻片法-實用醫(yī)學檢驗學P129)。結果如表結果如表9所示 表9家兔出血時間及凝血時間測定結果
與空白對照組相比較*p＜0.01；**p＜0.01；**p＜0.01；****p＜0.01；與立芷雪組相比較***p＜0.05； 從表9的數(shù)據(jù)可以看出，實施例1組和實施例2組家兔出血時間及凝血時間明顯短于空白對照組，并且作用優(yōu)于立芷雪。
權利要求
1.一種蛇毒凝血酶凍干粉針劑，其特征在于，由蛇毒凝血酶做為有效成分，凍干保護劑由明膠、右旋糖苷-20、山梨醇組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，各組分的配比為
蛇毒凝血酶1-10000KU
明膠 1-12g
右旋糖苷-20 10-40g
山梨醇15-50g。
3.根據(jù)權利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，各組分的配比為
蛇毒凝血酶100-10000KU
明膠 3-9g
右旋糖苷-20 15-30g
山梨醇30-45g。
4.根據(jù)權利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，各組分的配比為
蛇毒凝血酶100-10000KU
明膠 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇36g。
5.根據(jù)權利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，各組分的配比為
蛇毒凝血酶1000KU
明膠 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇36g。
6.根據(jù)權利要求1-5中任意一項所述的凍干粉針劑，其特征在于，所述蛇毒凝血酶為巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶或長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶。
7.權利要求1-5中任意一項所述的凍干粉針劑的制備方法為
1)稱取處方量的明膠加水加熱攪拌使完全溶解；
2)稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8；
3)加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附，脫碳后再用0.22μM濾膜過除菌過濾，放至室溫加注射用水定容；
4)無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝溶液，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥；
5)干燥結束后壓膠塞、出箱，軋蓋即得制成品。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于
1)稱取處方量的明膠加水400ml加熱攪拌使完全溶解；
2)稱取處方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，攪拌使完全溶解，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8；
3)加熱煮沸后加入適量活性炭保溫吸附30分鐘，脫碳后再用0.22μM的濾膜過濾，放至室溫加注射用水定容至600ml；
4)無菌濾過加入處方量的蛇毒凝血酶，混合均勻后，定量灌裝0.6ml/支溶液，共1000支，半壓膠塞裝箱放入冷凍干燥機箱進行冷凍干燥；
5)冷凍干燥參數(shù)預凍溫度-45℃，升溫5℃/2小時，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥溫度30℃；
6)干燥結束后壓膠塞、出箱，軋蓋即得制成品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛇毒凝血酶凍干粉針劑及其制備方法，屬于生物制品制劑領域。該凍干粉針劑以蛇毒凝血酶做為有效成分，凍干保護劑由明膠、右旋糖苷-20、山梨醇組成。用作止血劑等用途。
文檔編號A61K9/19GK101756912SQ200910259669
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權日2009年12月22日
發(fā)明者郭欲曉, 張立紅, 易崇勤, 李洋 申請人:北大方正集團有限公司, 方正醫(yī)藥研究院有限公司