專利名稱：一種可治療肝癌的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，尤其是一種可治療肝癌的藥物。
背景技術(shù)：
肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡排位中僅次于胃、食道 而居第三位；在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占第二位，僅次于胃癌。我國(guó)每年死于肝癌約11萬人， 占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。肝癌的治療多采用手術(shù)切除，放療和化療相結(jié)合的方式，目前常用的化療藥為順 氯銨鉬、阿霉素或表阿霉素、絲裂霉素、5-氟脲嘧啶或氟苷等，這些藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的 同時(shí)，對(duì)正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生了很大的損傷，使病人不能耐受。因此，尋找高效、高選擇性、 低毒的抗腫瘤化療藥成為當(dāng)前抗癌藥物研究的方向和迫切任務(wù)。從天然物質(zhì)中尋找抗腫瘤 藥物被認(rèn)為是一種有效的途徑，對(duì)天然活性物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤作用的研究，尤其在抑制增殖 及誘導(dǎo)凋亡和分化方面進(jìn)行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠通過啟動(dòng)凋亡機(jī)制治療肝癌的藥物，它對(duì)人肝癌 細(xì)胞可產(chǎn)生選擇性殺傷，而對(duì)人正常肝細(xì)胞影響卻較小。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的 藥物中的應(yīng)用。其中殼聚糖亞硒酸酯為藥物的有效成分。進(jìn)一步的，上述治療肝癌的藥物可為片劑、膠囊、混懸劑。其中，片劑的制備方法為殼聚糖亞硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂鎂0.65mg/片、無 水乳糖80mg/片，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，與硬脂鎂，無水乳糖混勻、壓片。膠囊的制備方法為殼聚糖亞硒酸酯50 IOOmg/膠囊、淀粉150mg/膠囊、硬脂鎂 Img/膠囊，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，與硬脂鎂，淀粉混勻，裝入2號(hào)硬空心膠囊?；鞈覄┑闹苽浞椒闅ぞ厶莵單狨?0 100mg/5ml、單硬脂酸鋁75/5ml、椰子 油5ml，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度， 放冷后加入過篩后的殼聚糖亞硒酸酯及適量的校味劑。再進(jìn)一步的，所述殼聚糖亞硒酸酯的口服劑量范圍為每日1000毫克至4克。有益效果本發(fā)明所述的一種殼聚糖亞硒酸酯在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，通過研究表 明硒是人和動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素之一，硒對(duì)多種腫瘤都具有顯著的預(yù)防和治療作用。 而殼聚糖[β (1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一種堿性生物多 糖，在酸性條件下帶正電，與腫瘤細(xì)胞表面的陰離子可以通過吸附放電進(jìn)行中和，抵制其生 長(zhǎng)，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性，且生物相容性良好，幾乎無毒性，沒有其它不 良反應(yīng)，殼聚糖亞硒酸酯是將硒酸根吸附于殼聚糖單體2-ΝΗ2和6-0Η制備成的低分子量有 機(jī)硒，可有效克服無機(jī)硒不易被細(xì)胞吸收，活性和毒性范圍較窄，致死量LC5tl相對(duì)較小，具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時(shí)劑量難以控制等缺點(diǎn)。因此，殼聚糖亞硒酸酯比無機(jī)硒 具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用，且毒副作用也小得多。
具體實(shí)施例方式以下通過對(duì)具體實(shí)施例的研究分析進(jìn)一步分析、確認(rèn)本發(fā)明。實(shí)施例1 殼聚糖亞硒酸酯對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞增殖抑制作用及對(duì)人正常肝 細(xì)胞的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人正常肝細(xì)胞L02接種于96孔培養(yǎng)板 上，每孔接種量分別為3000 4000個(gè)/100 μ L和6000個(gè)/100 μ L，培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入 不同濃度的殼聚糖亞硒酸酯100 μ L，每個(gè)濃度做三個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照組加培養(yǎng)液100μ L， 作用不同時(shí)間(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，甩去上清，每孔 加二甲亞砜150 μ L。用DG-3022型酶標(biāo)儀(中國(guó)南京)測(cè)定550nm處各孔的吸光度值，各 組取平均值，計(jì)算抑制率。生長(zhǎng)抑制率=(空白組光密度-實(shí)驗(yàn)組光密度)/空白組光密 度X 100%。用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC5(I。結(jié)果殼聚糖亞硒酸酯對(duì)人肝 癌細(xì)胞SMMC-7721具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其4 和7 的IC5tl值分別為35. 25%和12. 71% ；而殼聚糖亞硒酸酯對(duì)人正常肝細(xì)胞抑制作用則較小， 其4 和72h的IC5tl值分別大于80%和40%?？梢姎ぞ厶莵單狨?duì)肝癌細(xì)胞具有明顯 的選擇性抑制作用。實(shí)施例2 殼聚糖亞硒酸酯對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用。(1)殼聚糖亞硒酸酯對(duì)人肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響①熒光顯微鏡觀察不同濃度的殼聚糖亞硒酸酯處理12J4和7 后的肝癌細(xì)胞 用丫啶橙(AO)和溴化乙錠(EB)混合熒光染料染色后，分別接種于多個(gè)蓋玻片上，在熒光顯 微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果鏡下可觀察到早、中期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 有濃染致密的顆粒狀黃綠色熒光，核染色質(zhì)濃縮，核破裂，凋亡小體釋放等典型的凋亡細(xì)胞 形態(tài)學(xué)改變；同時(shí)凋亡有時(shí)間及劑量依賴關(guān)系。②電子顯微鏡觀察100mg/L殼聚糖亞硒酸酯處理人肝癌細(xì)胞4 后為實(shí)驗(yàn)組，不 加硒化殼聚糖及殼聚糖處理的肝癌細(xì)胞為對(duì)照組，兩組細(xì)胞經(jīng)0. 25%胰酶消化后，離心收 集細(xì)胞沉淀，用4°C預(yù)冷的2. 5%戊二醛加多聚甲醛混合液固定，鋨酸后固定，環(huán)氧 樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬鉛染色，日立HU-12A型透射電鏡觀察并拍照。結(jié)果不 同濃度的殼聚糖亞硒酸酯處理后的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變小，細(xì)胞 質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核仁消失，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊聚集于核膜下，可見核固縮、核破裂和凋 亡小體；凋亡細(xì)胞約占10%至20%。(2)流式細(xì)胞儀分析收集殼聚糖亞硒酸酯作用后的細(xì)胞，加70%乙醇lml，-20°C 固定Mh，加入碘化丙錠(PI)(終濃度為50ul/ml)和RNA酶(終濃度為0. 25mg/ml)，室溫下 避光孵育30min后，用Epics Elite ESP型流式細(xì)胞儀作DNA分析，以DNA含量低于Gl期 的亞Gl期細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，以ModFit LT軟件分析，擬合計(jì)算出各時(shí)相細(xì)胞的百分比。結(jié) 果肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度殼聚糖亞硒酸酯作用對(duì)和4 后，可見到典型的亞二倍體凋亡峰， 且呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性。軟件分析可見隨著殼聚糖亞硒酸酯劑量的增加，GO-Gl期細(xì) 胞的比例由對(duì)照的35. 4%上升到58. 2%，S期細(xì)胞的比例由對(duì)照的58. 5%下降至41. 4%,而G2-M期細(xì)胞的比例則由對(duì)照的6. 下降至0. 4%，細(xì)胞受阻于GO-Gl期。(3)片段化DNA的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定收集3X IO6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞， 用PBS離心洗滌，置_20°C冰箱放置IOmin后，加入Iml細(xì)胞裂解液(lOmmol/LTris. HCL PH8. 0,0. lmmol/L EDTA, 10mmol/L NaCL, 1% SDS)中，再加入蛋白酶 K 至終濃度為 lg/L，輕 輕振搖使溶液混勻呈粘糊狀，50°C過夜，待其冷卻至室溫后，加入等體積的飽合酚溶液，混 合兩相，IO5g離心lOmin，小心吸出上層水相，再加入等體積飽合酚溶液重復(fù)抽提1次，直 到無蛋白混入，吸上清加入氯仿異戊醇(1 1)按上述方法再抽提1次后，取水相層加入 1/10體積3mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2. 5倍體積的冰冷無水乙醇混合置_20°C中放 置30min，IO5g離心IOmin沉淀DNA，棄去無水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，將EP管倒置于 吸水紙上，吸干乙醇，加入 200 μ ITE 緩沖液(lmmol/L EDTA, lOmmol/LTris. HCLPH7. 8)溶 解DNA，再加入25ulRNA酶(10g/L)放置37°C中，30min后，置4°C冰箱保存。瓊脂糖凝膠電 泳用TBE (lmmol/L EDTA PH 8.0,45mmol/L Tris.硼酸)緩沖液配制1. 8%瓊脂糖凝膠，取 10 μ IDNA樣品與含0. 25%溴酚蘭、4%蔗糖的上樣緩沖液混勻后加樣。電壓60V，電泳Ih 后，以終濃度為0. 5mg/L溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀察并拍照。結(jié)果對(duì)照組在靠近加 樣孔的地方出現(xiàn)了一個(gè)大分子條帶，而殼聚糖亞硒酸酯100、200mg/L作用4 可引起肝癌 細(xì)胞DNA的降解，見明顯的凋亡特征性梯狀條帶。結(jié)果表明，殼聚糖亞硒酸酯對(duì)肝癌細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。實(shí)施例3 殼聚糖亞硒酸酯對(duì)肝癌細(xì)胞CaSpaSe-3、8、9酶活性影響。收集3 X IO6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加預(yù)冷)細(xì)胞裂解液05 μ L/106個(gè)細(xì) 胞)混勻，冰浴IOmin后IO5g離心lmin，吸取上清存于冰水浴管中，用于測(cè)定Caspase酶 活性及蛋白含量。按順序加入50 μ L上清，50 μ L反應(yīng)液(臨用前每ImL反應(yīng)液加IOyL DTT)、5 μ L底物于96孔板中，37°C溫育池，酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm波長(zhǎng)光密度。設(shè)無上清孔及陰 性對(duì)照孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果殼聚糖亞硒酸酯100、200mg/L作用肝癌細(xì)胞24h、4 !后， Caspase-3,9酶活性較對(duì)照組顯著升高，且隨藥物劑量增加及時(shí)間延長(zhǎng)酶活性也相應(yīng)升高， 存在一定的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。而Caspase-8酶活性與對(duì)照比較無意義。說明殼聚糖亞 硒酸酯能夠激活肝癌細(xì)胞CaspaseU，而不能激活Caspase-8。實(shí)施例4 殼聚糖亞硒酸酯對(duì)小鼠灌胃或皮下注射的半數(shù)致死量(LD5tl)測(cè)定。以小鼠能允許的最大濃度10%的殼聚糖亞硒酸酯混懸液0.%il/10g灌胃或皮下 注射測(cè)不出ID5tl，根據(jù)新藥審批辦法中對(duì)急性毒性的要求，進(jìn)行了最大耐受量的測(cè)定，當(dāng)給 予殼聚糖亞硒酸酯16g/kg. Mh，對(duì)小鼠未見明顯毒性反應(yīng)，表明其最大耐受量大于16g/ kg，毒性很低。實(shí)施例5 殼聚糖亞硒酸酯對(duì)動(dòng)物肝癌腹水瘤的抑制作用。選擇腫瘤生長(zhǎng)良好，全身狀態(tài)較好的肝癌腹水瘤荷瘤小鼠，頸椎脫白處死，固定后 碘酒酒精消毒，無菌條件下抽取腹水，按1 4比例加入無菌生理鹽水，取0.2mL接種于ICR 小鼠(合格證書SCXK(鄂)2007-0001)腹腔中，接種腫瘤后，小鼠按體重隨機(jī)分組，設(shè)陽性 對(duì)照組、陰性對(duì)照組及不同劑量給藥組。陽性對(duì)照組給予氟尿嘧啶，陰性對(duì)照組給予等量溶 劑，給藥組給予不同劑量殼聚糖亞硒酸酯。于接種當(dāng)日開始給藥，連續(xù)10d。記錄實(shí)驗(yàn)小鼠 生存時(shí)間，并計(jì)算生命延長(zhǎng)率。生命延長(zhǎng)率％=(藥物組平均生存時(shí)間/陰性對(duì)照組平均 生存時(shí)間-1) X 100%，將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果大、中、小劑量殼聚糖亞硒酸酯(3、2、
5lg/kg)皮下注射對(duì)肝癌腹水瘤荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)率分別是36. 3%,21.9%,19. 3%;而灌胃 給藥生命延長(zhǎng)率則分別是39.4%, 31. 5%和20. 4% ο綜上所述，本發(fā)明所涉及的殼聚糖亞硒酸酯可通過激活肝癌細(xì)胞CaspaseU從 而啟動(dòng)凋亡，對(duì)人肝癌細(xì)胞產(chǎn)生選擇性殺傷作用，而對(duì)人正常肝細(xì)胞影響較小。本發(fā)明中所述的殼聚糖亞硒酸酯的制備方法參見篇名為《硒化殼聚糖的制備及其 表征》，期刊為海峽藥學(xué)STRAIT PHARMACEUTICAL JOURNAL 2005年17卷3期的文章。文中 所述的硒化殼聚糖化學(xué)名稱為殼聚糖亞硒酸酯。
權(quán)利要求
1.殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述殼聚糖亞硒酸酯 為藥物的有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述藥物 為片劑、膠囊、混懸劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述片劑是由殼聚糖 亞硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂鎂0. 65mg/片、無水乳糖80mg/片組成，將殼聚糖亞硒酸酯 過200目篩，與硬脂鎂、無水乳糖混勻，然后壓片。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述膠囊是由殼聚糖 亞硒酸酯50 IOOmg/膠囊、淀粉150mg/膠囊、硬脂鎂Img/膠囊組成，將殼聚糖亞硒酸酯 過200目篩，與硬脂鎂、淀粉混勻，裝入2號(hào)硬空心膠囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述混懸劑是由殼聚 糖亞硒酸酯50 100mg/5ml、單硬脂酸鋁75/5ml、椰子油5ml組成，將殼聚糖亞硒酸酯過 200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度，放冷后加入過篩后的殼聚糖 亞硒酸酯及適量的校味劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。通過研究表明硒是人和動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素之一，硒對(duì)多種腫瘤都具有顯著的預(yù)防和治療作用。而殼聚糖[β(1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一種堿性生物多糖，在酸性條件下帶正電，與腫瘤細(xì)胞表面的陰離子可以通過吸附放電進(jìn)行中和，抵制其生長(zhǎng)，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性，且生物相容性良好，幾乎無毒性，沒有其它不良反應(yīng)，殼聚糖亞硒酸酯是將硒酸根吸附于殼聚糖單體2-NH2和6-OH制備成的低分子量有機(jī)硒，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且毒副作用也小得多。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102078324SQ20091027294
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者余開峰, 曹鳳軍, 曾小華, 李林均, 李芳 , 潘東風(fēng), 王一平, 蔡曉軍, 鄧守恒, 陳萍 申請(qǐng)人:鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院