專利名稱：副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)微生物學(xué)和動物傳染病技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及副豬嗜血桿菌的一個 具有免疫原性蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗和診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是巴斯德菌科的一種革蘭氏陰性小 桿菌，是副豬嗜血桿菌病(GMsser's disease)的病原體。作為當(dāng)前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán) 重的細菌性傳染病之一，副豬嗜血桿菌病可以影響2周齡到4月齡的豬，仔豬主要在斷奶前 后和保育階段發(fā)病，通常見于5 8周齡的豬，發(fā)病率一般在10% 15%，嚴(yán)重時死亡率 高達50%。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跋行和死亡；剖檢的主要病變表現(xiàn) 為多發(fā)性漿膜炎(纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。副豬嗜血桿菌 還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行，增加了 種豬的淘汰率。此外，由于豬群中副豬嗜血桿菌的帶菌率很高，在豬群發(fā)生豬繁殖與呼吸綜 合征、豬圓環(huán)病毒病等病毒性傳染病時，副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率會急劇升高，危害更為嚴(yán) 重，造成大批豬死亡。近年來，副豬嗜血桿菌病在規(guī)?；i場的高健康豬群的發(fā)病率和死亡率都顯著 升高(Cai X，Chen H，Blackall P J，Yin，Z，Wang, L，Liu Z and Jin Μ. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolatesfrom China.Vet Microbiol， 2005，111 :231-236)。由于該病在多數(shù)情況下爆發(fā)突然，抗生素等抗微生物藥物的治療作用 非常有限，而且耐藥性的產(chǎn)生迅速，因此，藥物和免疫預(yù)防是防控該病的主要途徑。目前，常 規(guī)滅活菌苗是世界上唯一可以用于該病免疫防治的一類疫苗，在包括中國在內(nèi)的多個國家 實現(xiàn)了商業(yè)化。這些滅活疫苗一般由2個或3個血清型的地方流行菌株制備而成(Baumarm G，Bilkei G. Effect of vaccinatingsows and their piglets on the development of Glasser's disease induced by a virulent strain of Haemophilusparasuis serovar 5. Vet Rec，2002，151 18-21 ；Bak H，Riising H J. Protection of vaccinated pigs againstexperimental infection with homologous and heterologous Haemophilus parasuis. Vet Rec, 2002,151 :502_505)，但是，目前已經(jīng)鑒定的副豬嗜血桿菌至少有15種 血清型，還有約12%的分離株尚不能分型，而且不同國家和地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型不盡相 同，不同血清型菌株之間缺乏或僅能提供有限的交叉免疫保護，常規(guī)多價滅活疫苗的交叉 免疫保護率有限，只有在流行菌株血清型相符的地區(qū)的豬群中才能提供較好的免疫保護 (Oliveira S,Pijoan C. Haemophilus parasuis :new trends on diagnosis,epidemiology and control. Vet Microbiol，2004b，99 :1-12)。因此，副豬嗜血桿菌保守的保護性抗原的 鑒定是該病新型疫苗研制的技術(shù)關(guān)鍵。到目前為止，國際上關(guān)于副豬嗜血桿菌保護性抗原 的報道還較少，周明光等2009年發(fā)表于Vaccine上的一篇論文首次做了對四個蛋白外膜蛋 白PalA，0mp2，D15和假設(shè)蛋白HPS 06257的免疫原性做了初步的研究(Zhou Μ, Guo Y, Zhao J, Hu Q, Hu Y,Zhang A,Chen H,Jin M. Identification and characterization of novel
3immunogenicouter membrane proteins of Haemophilus parasuis serovar 5.Vaccine, 2009,27(38) :5271_7)。PilA蛋白屬于蛋白質(zhì)二型分泌系統(tǒng)IV型菌毛(Type IV Pili) ；PilA蛋白與DNA 的攝取相關(guān)；致病過程中介導(dǎo)細菌吸附于黏膜上皮細胞完成入侵的第一步，在流感嗜血桿 菌中pilA基因?qū)ζ渚吧锉荒さ漠a(chǎn)生以及對該病原菌在哺乳動物上呼吸道上皮細胞 的定植起著重要的作用。程安春等(2007)將鴨源和雞源致病性大腸桿菌的PilA重組蛋白 疫苗，分別在雛鴨和雛雞進行免疫，能得到很高的ELIAS抗體效價，通過攻毒實驗觀察，該 重組蛋白對宿主有著有效地保護效果(程安春，于小娜，汪銘書，朱德康，李玲，孫磊，陳孝 躍.鴨源致病性大腸桿菌I型菌毛PilA基因的原核表達及重組蛋白對強毒攻擊的免疫保 護作用.生物工程學(xué)報，2007，23:440-445;于珊，張倩，水小溪，于宙亮，趙寶華.致病性雞 大腸桿菌PilA基因和外膜蛋白C基因的克隆.生物工程學(xué)報，2008，24 :1561_1567)。

發(fā)明內(nèi)容
本研究的目的在于克隆一個具有免疫原性的副豬嗜血桿菌的蛋白基因，利用其編 碼的蛋白應(yīng)用于研制對副豬嗜血桿菌感染具有保護力的亞單位疫苗和診斷試劑中。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的申請人:從副豬嗜血桿菌的地方分離株SH0165菌株(菌株來源參見實施例1)中克 隆到IV型菌毛蛋白基因PilA。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白基因PilA其編碼區(qū)由453個 堿基組成，具有序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)的pilA基因 編碼的蛋白PilA是由150個經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的pil4基因編碼的蛋白PilA是由 286個氨基酸殘基組成，具有序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，去掉信號肽部分之后 表達蛋白預(yù)計分子量大小為15kDa。通過原核表達和室內(nèi)生物測定證實本發(fā)明的基因pilA 在微生物中表達的PilA蛋白，能夠?qū)Ω必i嗜血感染有保護作用，這就預(yù)示著該蛋白可以用 于研制副豬嗜血桿菌的亞單位疫苗。本發(fā)明提供的上述基因序列是副豬嗜血桿菌的具有免疫原性的蛋白基因，該蛋白 還可以應(yīng)用于對于副豬嗜血桿菌的診斷和疫苗的研制中。更詳細的技術(shù)方案參考實施例部分的描述。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離克隆的副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因的核苷 酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列；圖1 是本發(fā)明實施例中副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA所在的原核表達載 體pET28a/Hps-pilA的構(gòu)建圖和物理圖譜；圖2 是本發(fā)明實施例中副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因pilA在重組菌BL21中 表達純化的SDS-PAGE電泳分析；圖中M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3 評估免疫原性蛋白免疫仔豬后的抗體水平；圖4 蛋白對仔豬免疫的致死保護率；具體實施方案以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實施方案的實施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實施例對于 本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品均參考 《分子克隆實驗指南》所描述的內(nèi)容(參見薩姆布魯克和拉塞爾，2001，分子克隆實驗指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)。本發(fā)明中所涉及的其他各種實驗操作，均為 本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申 請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關(guān)的說明書、手冊等加以實施。實施例1副豬嗜血桿菌SH0165菌株免疫原性蛋白基因pilA的克隆本發(fā)明以副豬嗜血桿菌SH0165作為免疫原性蛋白基因pilA的來源菌株(該 菌株的來源見文獻Yue Μ, Yang F，Yang J, Bei W, Cai X，Chen L，Dong J, Zhou R， Jin M, Jin Q, Chen H. Complete genome sequence ofHaemophilus parasuis SH0165. J Bacteriol. 2009,191(4) 1359-60)該菌株為地方分離株，血清型5型，感染了一定劑量的該菌株的仔豬或青年豬會 在4日內(nèi)發(fā)病或死亡，為高毒力菌株1.副豬嗜血桿菌SH0165中免疫原性蛋白基因pilA的克隆利用副豬嗜血桿菌SH0165的基因組為模板，申請人依據(jù)該基因的特異序列并在 兩端引入酶切位點BamHI和XhoI設(shè)計上游引物Pl (引物序列為5 ’-ATAGGATCCTCTTACACCA GTTACAC-3，)和下游引物 P2(引物序列為5，-ATACTCGAGTTATTGCCTACAGAAATTC-3，)，進行 PCR擴增以獲得目標(biāo)基因，PCR反應(yīng)的體系和程序如下25 μ L 反應(yīng)體系包含2· 5 μ LlOXPCR 反應(yīng)緩沖液，1 μ LdNTP (各 2. 5mM)，0. 5 μ L 特異性上游引物Pl (20mM),0. 5 μ L特異性下游引物Ρ2 (20mM)，1 μ L模板(副豬嗜血桿菌 SH0165),0. 25 μ LEx Taq酶，加滅菌去離子水至25 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù)和程序為94°C，5min， 1 個循環(huán);94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin，30 個循環(huán)；72°C, IOmin, 1 個循環(huán)。將擴增到的目標(biāo)片段通過PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限 公司純化回收后通過T/A克隆連接到T載體pMD18-T Simple Vector上(購自TaKaRa公 司)，將目標(biāo)片段連接到pET28a購自默克公司(上海)得到含有pilA全長序列的重組質(zhì) 粒pET28a/HpS-pilA(見圖1)。之后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5 α，并涂布卡 那霉素抗性平板(KanK，終濃度為50μ g/mL)。將抗性平板置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12_16h， 待轉(zhuǎn)化子長到一定大小以后，篩選轉(zhuǎn)化子。將篩選到的轉(zhuǎn)化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化 培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒進行酶切驗證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致。最后將篩選到的陽性轉(zhuǎn) 化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，取ImL的過夜培養(yǎng)物送樣測序(由北京三博遠志生 物技術(shù)有限責(zé)任公司完成)。測序結(jié)果顯示該基因具有如序列表SEQ ID NO :1中所示的核 苷酸序列，申請人將該基因命名為PilA(在本發(fā)明中，被命名的基因以斜體小寫表示)。通 過軟件分析預(yù)測此段編碼序列可編碼一個如序列表SEQ ID NO :1中所示的由116個氨基酸 組成的多肽片段，預(yù)測其分子量為15kDa，申請人將其命名為PilA(在本發(fā)明中，被命名的 蛋白以正體大寫表示)。申請人:將上述轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET28a/HpS-pilA的重組大腸桿菌命名為大腸桿 菌(Escherichia coli) DH5 α/Hps-pi 1A，于2009年12月16日將該重組大腸桿菌送交湖北 省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCN0
5M209303。實施例2副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA在大腸桿菌BL21中的表達純化及 對副豬嗜血感染保護力的檢測1.副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA在大腸桿菌BL21中的表達和純化為了大量表達pilA蛋白，申請人將上述攜帶有其編碼序列的重組表達質(zhì)粒 pET28a/Hps-pilA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (大腸桿菌購自Tiangen公司)中，得到了重組菌 BL21/pET28a/Hps-pilA。將該重組菌株 BL21/pET28a/Hps_pilA 接種于 5mL LB 液體培養(yǎng)基 中(附加終濃度為50 μ g/mL卡那霉素)，過夜活化。以1 100 (ν/ν)轉(zhuǎn)接至50mL LB液體培 養(yǎng)基中，置于37°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5-0. 8左右以后，加入1. Ommol/L的異丙基-B-D-硫 代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。將上述50mL重組菌BL21/ pET28a/Hps-pilA的3h誘導(dǎo)培養(yǎng)物經(jīng)過12000rpm離心30s收集菌體，利用超聲波(技術(shù)參 數(shù)功率400W，破碎30s，間歇30s)將細胞破碎后12000rpm離心15min取上清。然后將上 清液過Ni-IDA親和層析柱(His鎳柱)(購自Novagen公司)提純該特異蛋白PilA(具體 的純化步驟按照試劑盒操作說明書進行)。對最終的純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié) 果如圖2所示，提純的蛋白與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比對，估算分子量為15kDa，與預(yù)計的PilA蛋 白分子量大小基本吻合，證明本發(fā)明的副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白PilA在大腸桿菌BL21 中得到了成功的表達。2對副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白進行免疫后仔豬抗體水平評價為了對PilA蛋白進行免疫后抗體水平評價，申請人將PilA及其他4個副豬嗜血 桿菌的蛋白，滅活苗及佐劑對照進行免疫后仔豬抗體水平評價。將仔豬隨機分成7組，每組 3頭豬。第1組每只肌肉注射副豬嗜血桿菌滅活苗25 μ g(與等體積氫氧化鋁佐劑混合)。 第2 6組注射各個副豬嗜血桿菌的重組蛋白(加入等體積氫氧化鋁佐劑)；第7組為對 照組，注射氫氧化鋁佐劑。第1次，每只200 μ g蛋白，總劑量3ml/只，約2周后頸靜脈采血 (大約Iml)，進行ELIAS檢測。第2次，劑量為500 μ g/3ml/只，1周后進行ELIAS檢測。第 3次，劑量為500 μ g/3ml/只。0周為第一次免疫，2周為第二次免疫，4周為第三次免疫；第 0，1，3，5周進行了采血檢測(圖3)。結(jié)果顯示PilA蛋白在二免后，抗體水平就已經(jīng)達到較 好的水平。3.副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白對副豬嗜血感染保護力的檢測申請人:將PilA及其他4個副豬嗜血桿菌的蛋白，滅活苗及佐劑對照進行三免7天 后用副豬嗜血桿菌分離菌株進行感染試驗，副豬嗜血桿菌SH0165株經(jīng)氣管內(nèi)注射21頭豬，每 頭豬注射3ml菌液2X IOltl/只。注射后連續(xù)觀察6天。將純化的蛋白DnaK，GidA，PilA，RfTA 和SiaB免疫仔豬，攻毒評價重組表達蛋白的免疫保護力。致死保護力率如圖4所示，滅活苗 和PilA蛋白免疫組的致死保護率為100%，GidA蛋白和佐劑免疫組的致死保護率為0%。通過評分評價，結(jié)果如表1所示。其中PilA蛋白免疫對陰性對照差異顯著 (p ^ 0.01)，而PilA蛋白免疫對滅活苗免疫差異不顯著(ρ > 0.05)。表1副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白對副豬嗜血感染保護力的評測
權(quán)利要求
pilA基因作為副豬嗜血桿菌的免疫原性蛋白的應(yīng)用，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO1所示，編碼150個氨基酸。
2.一株表達副豬嗜血桿菌的免疫原性蛋白基因的重組大腸桿菌(Escherichia coli) DH5 α /Hps-pi 1Α,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO Μ209303。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的應(yīng)用包括在制備副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的的應(yīng)用，其中的應(yīng)用包括在制備副豬嗜血桿菌病診斷試劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的保藏編號為CCTCCNO :Μ209303的重組大腸桿菌在制備副豬嗜血 桿菌病亞單位疫苗中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的保藏編號為CCTCCNO :Μ209303的重組大腸桿菌在制備副豬嗜血 桿菌病診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸醫(yī)微生物學(xué)和動物傳染病技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及副豬嗜血桿菌的一個具有免疫原性蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗和診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明從副豬嗜血桿菌的強毒株SH0165菌株中分離得到一個新的具有免疫原性的蛋白基因pilA；它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，編碼150個氨基酸。該基因的編碼產(chǎn)物為一種新的具有免疫原性蛋白PilA；該蛋白PilA對仔豬感染副豬嗜血桿菌0165能提供有效的免疫保護力。本發(fā)明還包括表達免疫原性蛋白基因pilA的大腸桿菌重組菌DH5α/Hps-pilA的制備，該重組大腸桿菌菌已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NOM209303。
文檔編號A61K39/102GK101940786SQ20091027343
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者嚴(yán)琦, 周銳, 郭志偉, 金卉, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)