專(zhuān)利名稱(chēng)：：治療糖尿病藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有的原材料來(lái)源于傳統(tǒng)中藥的醫(yī)用配置品的制備方法，具體是應(yīng)用生物酶解技術(shù)對(duì)原料藥物進(jìn)行提取的治療糖尿病藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
：金芪降糖片作為一種純中藥制劑。主要由黃芪、金銀花、黃連等組成，有清熱益氣的功能，用于消渴病氣虛內(nèi)熱癥。黃芪補(bǔ)氣、使脾胃健運(yùn)，有較好的降血糖作用；金銀花具有清熱解毒、止渴補(bǔ)氣的功效以及提高免疫力、減少膽固醇吸收作用；黃連清熱瀉火去濕熱，消渴，通過(guò)抑制糖元異生及促進(jìn)糖酵解而產(chǎn)生降糖作用，同時(shí)有降低血脂的作用?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明黃芪多糖和黃連中生物堿具有明顯的降血糖作用，所以金芪降糖片中的多種化學(xué)組分從糖代謝、脂質(zhì)代謝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)環(huán)節(jié)，通過(guò)整體、細(xì)胞、分子等不同水平的作用，改善了機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，有益于糖尿病某些微血管并發(fā)癥的防治。中國(guó)專(zhuān)利155954公開(kāi)了"一種治療糖尿病藥物及其制備方法"，該藥物商品名稱(chēng)為金芪降糖片。它是以黃連、金芪、金銀花為組方的原料提取工藝，其中黃連直接粉碎入藥；黃芪的提取工藝為50%乙醇提取三次，時(shí)間4、2、2小時(shí)；金銀花的提取工藝為總量1/6粉碎，5/6水溫浸。中國(guó)專(zhuān)利1965929A公開(kāi)的是"一種治療糖尿病藥物的制備方法"，該藥物商品名稱(chēng)為金芪降糖片。其是以黃連、黃芪、金銀花為組方的原料提取工藝，其中黃連以50%乙醇提取、純化；黃芪的提取工藝為75%乙醇提取二次，每次提取2小時(shí)；金銀花的提取工藝為全部水溫浸、醇沉。但是，在上述原材料來(lái)源于植物的醫(yī)用配置品制備過(guò)程中，由于植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)有效成分的浸出形成一種屏障，阻礙細(xì)胞內(nèi)成分的擴(kuò)散，影響植物成分的提取效果，有效成分的浸出率低；而且，臨床用藥劑量大，患者服用不便，甚至造成藥材資源浪費(fèi)和耗能成本居高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是為了解決藥物原料的提取工藝中，有效成分轉(zhuǎn)移率低、制劑內(nèi)在質(zhì)量有待提高，以及縮小服用劑量的問(wèn)題，而提供一種治療糖尿病藥物的制備方法。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的?！N治療糖尿病藥物的制備方法，包括按重量份配比的黃連10.3份，黃芪15.4份，金銀花61.8份，分別提取藥物有效成分后，加入24份輔料，制成顆粒，壓制成片，包薄膜衣制成，其藥物有效成分的提取步驟為①黃芪總皂苷提取物的提取步驟a.黃芪加入38倍量pH3.06.0的硫酸水，再加入黃芪用量0.11.0%的纖維素酶，356(TC酶解，收集酶解液；b.酶解液以氫氧化鈉溶液調(diào)至pH中性后，加入6080X乙醇回流提取，收集濾液，減壓濃縮；c.濃縮液上大孔吸附樹(shù)脂柱以210倍樹(shù)脂體積的蒸餾水洗脫，再以510倍樹(shù)脂體積的6080%乙醇洗脫，收集乙醇濃縮液；d.于乙醇濃縮液中加入丙酮至無(wú)沉淀產(chǎn)生為止，過(guò)濾、收集、干燥沉淀劑，即得黃芪總皂苷提取物；②黃連總生物堿提取物的提取步驟a.將黃連剪切成段，加入35倍量pHl.05.0的硫酸水，再加入黃連用量0.11.0%的纖維素酶，306(TC溫浸，分別收集酶解液和藥渣；b.藥渣以816倍0.12.0%的硫酸水溶液浸泡，得酸水浸出液；c.將酶解液與酸水浸出液合并、過(guò)濾，濃縮；d.以鹽酸調(diào)至pHl4，在攪拌下加入食鹽，放置至黃色結(jié)晶析出；e.抽濾收集沉淀，蒸餾水洗沉淀至pH46，烘干，即得黃連總生物堿；③金銀花提取物的提取步驟a.向金銀花中加入812倍量pH4.06.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花用量0.12.0%的果膠酶，收集酶解液；b.酶解后金銀花加815倍量水溫浸提取，收集溫浸液；c.將酶解液與溫浸液合并，過(guò)濾，6(TC減壓濃縮至相對(duì)密度1.101.20;d.于濃縮液中加入24倍量的乙醇，靜置醇沉，過(guò)濾，上清液減壓濃縮即得金銀花提取物。所述治療糖尿病藥物的制備方法，向金銀花中加入812倍量pH4.06.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花用量O.12.0%的復(fù)合酶，收集酶解液，其中復(fù)合酶是由纖維素酶與果膠酶分別按i:i、i:2、2:i的比例組成。所述治療糖尿病藥物的制備方法，其黃芪總皂苷提取物中的黃芪浸膏收率為1017%，黃芪總皂苷提取轉(zhuǎn)移率為6588%，其中黃芪甲苷含量占519%。所述治療糖尿病藥物的制備方法，其黃連總生物堿提取物中的黃連總生物堿粗品得率為1025%，黃連總生物堿提取轉(zhuǎn)移率為7090%，鹽酸小檗堿提取轉(zhuǎn)移率為5090%。所述治療糖尿病藥物的制備方法，其金銀花提取物中金銀花浸膏得率為1540%，綠原酸提取轉(zhuǎn)移率為5090%。這樣，應(yīng)用本發(fā)明制備的治療糖尿病藥物，其處方組分與劑型不變。由于生物酶解作用能夠?qū)⒅参锝M織中的纖維素、半纖維素等分解，破壞植物成分浸出的屏障作用，從而達(dá)到提高有效成分轉(zhuǎn)移率的目的；酶反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、選擇性強(qiáng)、反應(yīng)效率高等特點(diǎn)。本發(fā)明不僅提高有效成分的浸出率，因?yàn)榻档土颂崛囟群涂s短提取時(shí)間，所以還降低了提取過(guò)程中耗能成本。該工藝操作簡(jiǎn)單易行，安全性高，更適合工業(yè)生產(chǎn)。圖1是黃連總生物堿的提取流程圖；圖2是黃芪總皂苷的提取流程圖3是金銀花中綠原酸的提取流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明?！⑻幏浇M成與提取工藝1.1因?yàn)楸景l(fā)明是制備工藝改進(jìn)，所以其處方用藥量保持不變，劑型仍然為片劑。由于所得提取物重量變化致使藥片規(guī)格改變，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以原服用生藥量計(jì)算，片重約為0.50克。其組方與工藝如下表。項(xiàng)目現(xiàn)有技術(shù)工藝本發(fā)明治療糖尿病藥物(金芪降糖片)處方組成黃連IO.3重量份黃甚15.4重量份金銀花61.8重量份黃連IO.3重量份黃甚15.4重量份金銀花61.8重量份黃連粉碎酶解2小時(shí)，酸水溶液浸泡2次(24，24小時(shí))黃芪50%乙醇提取3次(4，2，2小時(shí))酶解2小時(shí)，70%乙醇提取2次(2，2小時(shí))金銀花總量l/6粉碎，5/6溫浸酶解2小時(shí)，全部水溫浸、醇沉服用劑量710片23片1.2本制劑的提取工藝中，黃連具有清熱瀉火去濕熱，消渴等功效，為處方中君藥。藥理實(shí)驗(yàn)證明，黃連中小檗堿及其生物堿通過(guò)抑制糖元異生及促進(jìn)糖酵解而產(chǎn)生降糖作用，同時(shí)有降低血脂的作用，本研究中以小檗堿、藥根堿、巴馬汀含量為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)選了黃連總生物堿的提取工藝，同時(shí)對(duì)酶解的條件也進(jìn)行了優(yōu)選。采用了酶解一酸水常溫浸漬法，該方法較原工藝黃連粉劑量大大縮小。小檗堿及總生物堿提取率可比單純酸水浸漬法提高2040%。黃芪具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒等功效，用于內(nèi)熱消渴、糖尿病等治療。黃芪中含有黃芪皂苷、黃酮等成分具有改善機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)血糖等作用。所以，本研究中以黃芪甲苷和黃芪總皂苷為含量指標(biāo)，采用了正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選了酶解與提取工藝條件。新的提取工藝，使黃芪總皂苷的提取率比未加酶的對(duì)照組高出3050%。金銀花具有清熱解毒功效，含有的綠原酸、黃酮等物質(zhì)，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明除了抗菌、消炎作用外，還可以降低血脂，保護(hù)胰腺B細(xì)胞及降血糖作用。因?yàn)樯鲜鲇行С煞謱?duì)熱較敏感，所以考慮降低提取溫度而不降低綠原酸含量的原則。以綠原酸含量為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選了酶解與提取條件，由于增加酶解處理步驟，較常規(guī)水溫浸法，金銀花中綠原酸得率提高了3050%。通過(guò)處方中的金銀花全部采取提取，并結(jié)合醇沉的步驟，使得現(xiàn)工藝比原工藝的浸膏收率降低，綠原酸含量提高1550%。上述各藥材均采用了酶輔助提取的方法，減弱了植物細(xì)胞對(duì)有效成分浸出的屏障作用，不僅提高有效成分的浸出率，因?yàn)榻档土颂崛囟群涂s短提取時(shí)間，所以還降低了提取耗能成本。該工藝操作簡(jiǎn)單易行，安全性高，更適合工業(yè)生產(chǎn)。2.1黃連總生物堿提取物的提取步驟a.將黃連挑選并除去泥土、雜物，烘干后，適當(dāng)剪切成段；b.向黃連中加入35倍量、pHl.05.0的硫酸水，再加入纖維素酶，其用量為黃連重量的0.11.0%，于306(TC下溫浸0.54小時(shí)，分別收集酶解液和藥渣；c.經(jīng)酶解處理后的藥渣以0.12.0%的硫酸水溶液浸泡24次，每次1248小時(shí)，硫酸水溶液加入量為藥材的816倍，收集酸水浸出液；d.將酶解液與酸水浸出液合并、過(guò)濾，將過(guò)濾后的提取液濃縮至原體積的1/41/2;e.以鹽酸調(diào)pHl4，使硫酸鹽轉(zhuǎn)為溶解度較小的鹽酸鹽，在攪拌下加入食鹽，其加入量為提取液體積的615%，放置1248小時(shí)，至黃色結(jié)晶完全析出為止；f.抽濾收集沉淀，用少量蒸餾水洗沉淀至pH46，將洗滌后的沉淀于5080°C下烘干，即得黃連總生物堿產(chǎn)品。2.2黃芪總皂苷提取物a.將黃芪根莖原料適當(dāng)碾壓，加入38倍量、pH3.06.0的硫酸水，再加入纖維素酶，其用量為生藥重量的O.11.0X，于356(TC下酶解0.54小時(shí)；b.將上述酶解液以氫氧化鈉調(diào)至pH中性后，加入乙醇至含醇量6080%，回流提取2次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，減壓濃縮；c.濃縮液上AB-8或D-101大孔吸附樹(shù)脂柱，先以210倍樹(shù)脂體積的蒸餾水洗脫糖類(lèi)等水溶性雜質(zhì)，再以210倍樹(shù)脂體積的6080%乙醇洗脫，收集乙醇液并進(jìn)行適當(dāng)濃縮；d.于乙醇濃縮液中加入丙酮至無(wú)沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾、收集干燥沉淀劑，即得黃芪總皂苷提取物。2.3金銀花提取物(金銀花提取方法1)，以綠原酸為代表成分作為考察工藝的標(biāo)準(zhǔn)，它包括以下步驟a.向銀花中加入812倍量、pH4.06.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花重量的0.12.0%果膠酶，于306(TC下溫浸0.54小時(shí)，收集酶解液；b.酶解后藥材加水于407(TC溫浸提取兩次，每次13小時(shí)，加水量為藥材重量的815倍量，收集提取溫浸液；c.將酶解液與溫浸液合并，過(guò)濾，6(TC濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.101.20;d.上述濃縮液中加入24倍量的乙醇靜置1248小時(shí)進(jìn)行醇沉，過(guò)濾，上清液經(jīng)減壓濃縮、干燥即得到金銀花的有效部位。2.4金銀花提取物(金銀花提取方法2)，以綠原酸為代表成分作為考察工藝的標(biāo)準(zhǔn)，它包括以下步驟a.向金銀花中加入812倍量、pH4.06.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花重量的o.11.0%復(fù)合酶，所述復(fù)合酶是由纖維素酶與果膠酶，分別按1:i、i:2、2:i的比例組成，于306(TC下溫浸0.54小時(shí)，收集酶解液；b.酶解后藥材加水于407(TC溫浸提取兩次，每次13小時(shí)，加水量為藥材重量的815倍量，收集溫浸液；c.將酶解液與溫浸液合并，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.101.20(60°C);d.于上述濃縮液中加入24倍量的乙醇靜置1248小時(shí)進(jìn)行醇沉，過(guò)濾，上清液經(jīng)減壓濃縮、干燥即得到金銀花的有效部位。二.制劑與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、制劑本發(fā)明中三種藥材均采取提取物的形式成型，其中黃連是以總生物堿入藥，黃芪總皂苷提取物、金銀花是以浸膏粉的形式壓片，所以選用了流動(dòng)性強(qiáng)、可壓性好的藥用輔料，以利于片劑的崩解問(wèn)題。依據(jù)文獻(xiàn)與原處方，選用了微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂等輔料進(jìn)行配比篩選，確定制劑。稱(chēng)取按各自重量份配比制備的黃連總生物堿、黃芪總皂苷提取物、金銀花浸膏粉三者的混合物68重量份，再加入輔料24份，制成顆粒，壓制成片，包薄膜衣，即得。上述輔料是預(yù)膠化淀粉0.71.5份，微晶纖維素1.01.8份，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉0.10.2份，羧甲基淀粉鈉0.10.3份，硬脂酸鎂0.10.2份組成。2、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2.1原料、輔料質(zhì)量原料、輔料質(zhì)量按照《中國(guó)藥典》2005版標(biāo)準(zhǔn)，金銀花、黃芪原料的質(zhì)量按照《中國(guó)^典》2005版標(biāo)準(zhǔn)，黃連原料的質(zhì)量以自定HPLC法測(cè)定含量，其中黃芪總皂苷選擇紫外法2.2中間體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別進(jìn)行各原料提取中間過(guò)程中黃芪、金銀花浸膏的相對(duì)密度、指標(biāo)有效成分的收率檢測(cè)與含量限度檢查。2.3成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別以鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、綠原酸、黃芪甲苷為對(duì)照，對(duì)成品做TLC鑒別，與原工藝產(chǎn)品的TLC進(jìn)行比較，上述檢測(cè)成分基本一致。檢查重金屬檢測(cè)按照《中國(guó)藥典》2005版標(biāo)準(zhǔn)一部附錄檢查。結(jié)果5批樣品中鉛含量<5ppm，砷含量〈2ppm，符合常規(guī)口服制劑的要求，故該2項(xiàng)未納入常規(guī)檢查標(biāo)準(zhǔn)中。含量測(cè)定以HPLC法對(duì)成品中的黃連、黃芪、金銀花中的指標(biāo)成分小檗堿、藥根堿、巴馬汀、綠原酸、黃芪甲苷的含量進(jìn)行檢測(cè)。黃連，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的黃連是以生藥粉直接入藥，僅對(duì)小檗堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，新工藝中對(duì)黃連實(shí)行了酸水浸漬，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也做了相應(yīng)調(diào)整。采用HPLC法分別測(cè)定了小檗堿、藥根堿、巴馬汀3種生物堿的的含量，制定的含量限度為每片小檗堿的含量不小于15mg。黃芪，本發(fā)明制備的成品也按照《中國(guó)藥典》2005版黃芪藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法測(cè)定黃芪甲苷的含量，在生產(chǎn)的中間過(guò)程還對(duì)黃芪總皂苷進(jìn)行了檢測(cè)。制定的含量限度為每片黃芪甲苷的含量不小于0.20mg。金銀花，金銀花中綠原酸對(duì)熱較敏感，所以在提取工藝考察中盡可能降低溫度，以提高綠原酸的穩(wěn)定性。本發(fā)明制備的成品也按照《中國(guó)藥典》2005版金銀花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法測(cè)定綠原酸的含量，制定的含量限度為每片綠原酸的含量不小于20mg。本發(fā)明由于在提取工藝中增加了酶解輔助浸取的過(guò)程，有效成分浸出的細(xì)胞壁屏障作用減弱，使得提取溫度降低，時(shí)間縮短，因此使各味藥材中的指標(biāo)成分含量均有不同程度的提高，因此，制定成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也隨之提高，從而新工藝制劑比原工藝產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量提高了。三、應(yīng)用本發(fā)明制備的治療糖尿病藥物片劑(金芪降糖片)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1.兩種工藝制備的金芪降糖片對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響1.1四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立將昆明種小鼠($早兼用，由人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，24±2g，許可證號(hào)SCXK-軍2002-001)，實(shí)驗(yàn)前在室溫22±2°C、相對(duì)濕度65%70%飼養(yǎng)l周，適應(yīng)環(huán)境。然后禁食，不禁水約12h后，尾靜脈注射新配制的四氧嘧啶(Sigma公司，A17413)溶液(1.4mg/mL)，劑量為70mg/kg。于60h后再禁食12h，眼靜脈叢取血，離心分離血清。采用血糖試劑盒(中生北控生物科技有限公司，240181)以葡萄糖氧化酶(GOD)法測(cè)血糖值，大于11.lmmol/1為合格的實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠模型。1.2分組給藥挑選合格的模型小鼠140只，按血糖值均勻分成10組，每組14只，分別為本發(fā)明(實(shí)施例5方法提取)與原工藝金芪降糖片的高劑量組(4.20生藥g/kg)、中劑量組(2.10生藥g/kg)、低劑量組(1.05生藥g/kg)、正常給藥組(2.10生藥g/kg)、正常對(duì)照組及模型組(自來(lái)水10ml/kg)。另取30片苯乙雙胍(25mg/片)，研碎，以煮沸過(guò)的蒸餾水溶解，配成7.5mg/ml的水溶液，作為苯乙雙胍陽(yáng)性對(duì)照組(75mg/kg)、每天灌胃一次，連續(xù)給藥14天。1.3血糖測(cè)試結(jié)果末次給藥后禁食(不禁水)12小時(shí)。眼靜脈叢取血，離心分離血清。GOD法測(cè)定葡萄糖值，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。表1本發(fā)明金芪降糖片對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影響(x士S)組別毅。鬆n(裔w血糖值(咖ol/L)給藥前給藥14天血糖前后變化率(%)本發(fā)明低劑量組1024.16±7.56"JV八18.06±6.63*"AA一25.25本發(fā)明中劑量組ii23.81±7.2915.43±7.15*"—35.19本發(fā)明高劑量組1223.38±8.02"13.95±6.35**AA—40.33模型組923.11±5.28"25.08±6.26"+8.52陽(yáng)性對(duì)照組1123.57±6.21AA14.11±8.26**AA—40.14正常給藥組105.64±1.69**5.08±1.24**一9.93正常對(duì)照組105.83±1.53**6.25±2.14**+7.208承與模型組比較p<0.05;林與模型組比較p<0.01;AA與正常對(duì)照組比較p<0.01;從表1知，四氧嘧啶糖尿病小鼠各組經(jīng)本發(fā)明金芪降糖片治療14天后，比給藥前空腹血糖相比均有不同程度的下降(-25.25%-40.33%)。給藥后，本發(fā)明金芪降糖片各劑量組與模型組比較空腹血糖也顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且各給藥組在降血糖作用上呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系。正常小鼠給藥組同正常對(duì)照組及同組給藥前比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片對(duì)正常小鼠的血糖水平不產(chǎn)生影響。表2兩種工藝金芪降糖片對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的比較(x士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*與模型組比較P<0.05;**與模型組比較P<0.01;A本發(fā)明金芪降糖片與原工藝金芪降糖片同劑量組比較P<0.05;從表2知，四氧嘧啶糖尿病小鼠各組經(jīng)給藥后，兩種工藝金芪降糖片各劑量組與模型組比較空腹血糖均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且各給藥組在降血糖作用上呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系。兩種工藝金芪降糖片分別在低、中同劑量空腹血糖比較具有顯著性差異(P<0.05)，由血糖值知本發(fā)明金芪降糖片在低、中劑量給藥時(shí)降血糖效果優(yōu)于原工藝，而在高劑量時(shí)兩種提取工藝的產(chǎn)品對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖無(wú)顯著性差異。2.兩種工藝金芪降糖片對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖、血脂的影響2.1糖尿病大鼠模型的建立SD雄性大鼠，SPF級(jí)，220-240g，由人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，140-170g，許可證號(hào)SCXK-(軍)2002-001。以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組和造模組。其中正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高糖高脂飼料(由天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，連續(xù)8周。8周后，禁食、不禁水12h，造模組按30mg/kg劑量一次性靜脈注射，給予小劑量2%鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，053K3869)溶液，建立2型糖尿病模型。STZ注射一周后，測(cè)動(dòng)物空腹血糖(FBG)，選擇空腹血糖^11.lmmol/L的動(dòng)物為合格模型動(dòng)物。2.2分組給藥挑選建模合格的大鼠，按血糖值和體重均勻分成10組。分別為兩種工藝金芪降糖片高劑量(3.6生藥g/kg)、中劑量(1.8g生藥/kg)、低劑量組(0.9g生藥/kg)、鹽酸二甲雙胍(天津中新藥液集團(tuán)股份有限公司，4105478)陽(yáng)性對(duì)照組(92.5mg/kg)、模型對(duì)照組以及正常對(duì)照組和正常給藥組，正常對(duì)照組給予蒸餾水(10ml/kg)，正常給藥組(1.8g生藥/kg)，每組ll只。以上各組每日灌胃l次，連續(xù)灌胃IO周。用藥治療期間各組糖尿病大鼠每日飼以高糖高脂飼料，正常對(duì)照組和正常給藥組給予普通飼料。于用藥治療第10周，末次給藥后12h，禁食(不禁水)，眼靜脈叢取血，離心10min后，分離血清分裝于1.5ml離心管中，_201:冰箱冷貯待檢血糖以及血脂等相關(guān)生化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3表6。2.3測(cè)試結(jié)果2.3.1兩種工藝金芪降糖片對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠空腹血糖影響利用美國(guó)強(qiáng)生OneTouchUltra型血糖儀，分別于給藥前、給藥后4周、6周、8周、IO周后禁食不禁水12h，檢測(cè)血糖變化，采用SPSS16.O統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行各組間比較，計(jì)算數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表3知，各組糖尿病大鼠經(jīng)本發(fā)明金芪降糖片治療4周、6周后，高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比狡，空腹血糖均有明顯下降(P〈0.05)，至給藥8、10周時(shí)，本發(fā)明金芪降糖片各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較空腹血糖顯著降低(P<0.Ol，P<0.05)，并且給藥各組在降血糖作用上呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)。正常大鼠給藥組同正常對(duì)照組相比，以及自身給藥前后比較均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片對(duì)正常大鼠的血糖水平影響不明顯。從表4知，各組糖尿病大鼠經(jīng)本發(fā)明金芪降糖片治療4周后，僅高劑量組與模型組比較，空腹血糖均有明顯下降(P<0.05);至給藥8、10周時(shí)，本發(fā)明金芪降糖片各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較空腹血糖均顯著降低(P<0.01，P〈0.05)，而原工藝金芪降糖片僅中、高劑量與模型組比較，空腹血糖明顯下降(P<0.05，P<0.01);兩種工藝金芪降糖片低劑量空腹血糖比較具有顯著性差異(AP<0.05)，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片在低、中劑量給藥時(shí)降血糖效果優(yōu)于原工藝，而在高劑量時(shí)兩種工藝的產(chǎn)品對(duì)高糖、高脂的糖尿病大鼠的空腹血糖無(wú)顯著性差異。(寸實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠空腹血糖影響的比較(x士S)眠o網(wǎng)歐敘呢還細(xì)攻違效.頃a亂鄰培亂龍J-s-。尿l糖(TZIOSB〕剖鵬萄降-^芪金〔^《-齒0-銜^瞎^鵬￥瞎瞎鵬扭每試智.1￡*敏賊禍沼與*E媽*h兩表二0,0:v^qq辟匪貨I;15n二Q.OV總qq崩p雜f*一S.0V違；R細(xì)勒雜5Y..aas宰眾UBI7d-SBOrf9soz7d4s^snN47-寸"B認(rèn)-s3iiss5i9K3豕I500K:rf-d-SB!tzlz33*JS39S寶SKVV寸.3WS€Z**i=FS3**S3=_W￡S.1SIZ6崩n霜被堅(jiān)扭長(zhǎng)崩擁霜+豕l扭恃、親擁頃9，豕弒褲盟院敘扭H1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與模型組比較。<0.05;**與模型組比較。<0.01;A本發(fā)明金芪降糖片與原工藝金芪降糖片同劑量組比較P<0.05;2.3.2兩種工藝金芪降糖片實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的血脂影響按照總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)的具體操作，檢測(cè)大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。結(jié)果見(jiàn)表5、表6。表5本發(fā)明金芪降糖片對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血脂的影響(x士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與模型組比較。<0.05;**與模型組比較。<0.01;A與空白對(duì)照組比較p<0.05;AA與空白對(duì)照組比較p<0.01;由表5知，給藥10周后，本發(fā)明金芪降糖片各劑量組的總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)濃度與模型組比較均顯著降低，有顯著性差異(P<0.Ol，P<0.05);并且隨著本發(fā)明金芪降糖片劑量的增加，總膽固醇水平的均值呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)，降血脂作用呈現(xiàn)一定的量效相關(guān)性。各給藥組可以部分糾正糖尿病造成的甘油三酯水平異常，使糖尿病大鼠的甘油三酯濃度達(dá)到正常大鼠的水平。正常給藥組大鼠同空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片對(duì)正常大鼠的總膽固醇和甘油三酯水平影響不明顯。從表5試驗(yàn)結(jié)果知，給藥10周后，本發(fā)明金芪降糖片各劑量組的LDL-C濃度與模型組比較均顯著下降，有顯著性差異(P<0.05，P<0.01);隨著本發(fā)明金芪降糖片劑量的增加，其LDL-C水平逐步降低。并且本發(fā)明金芪降糖片高劑量組LDL-C濃度與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片可以糾正糖尿病造成的LDL-C水平異常，使糖尿病大鼠的LDL-C濃度達(dá)到正常大鼠的水平。本發(fā)明金芪降糖片各劑量組的HDL-C濃度與模型組比較均顯有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，各劑量組升高HDL-C的作用呈現(xiàn)一定的量效相關(guān)性。并且本發(fā)明金芪降糖片各劑量組HDL-C濃度與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P<0.05，P〈0.01)，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片可以使糖尿病大鼠的HDL-C濃度達(dá)到正常大鼠的水平。正常給藥組同空白對(duì)照組LDL-C、HDL-C比較均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片對(duì)正常大鼠的LDL-C和HDL-C水平影響不明顯。表6兩種工藝金芪降糖片對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血脂的影響的比較(x±S)組別nTC(mmol/UTG(mmol/ULDL-C(mmol/UHDL-C(mmol/U本發(fā)明低劑量組104.61±1.23*1.56±0.65承承a0.79±0.24*A0.66±0.19承承a本發(fā)明中劑量組104.02±0.63*1.59±0.39**0.61±0.25**0.79±0.21**本發(fā)明高劑量組103.86±0.71**1.29±0.45**0.53±0.19**0.86±0.23**模型對(duì)照組95.65±0.842.35±0.870.94±0.500.54±0.29原工藝低劑量組94.73±0.81*1.93±0.32*0.89±0.350.56±0.15原工藝中劑量組103.97±0.78**1.64±0.49**0.68±0.28**0.72±0.23**原工藝高劑量組104.04±1.06**1.36±0.58**0.64±0.20**0.89±0.29***與模型組比較p<0.05;**與模型組比較p<0.01;a本發(fā)明金芪降糖片與原工藝金芪降糖片同劑量組比較P<0.05;13從表6知，各組糖尿病大鼠經(jīng)本發(fā)明金芪降糖片治療10周后，各劑量組與模型組比較，其TC、TG、LDL-C、HDL-C值均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01);而原工藝金芪降糖片各劑量組與模型組比較其TC、TG有顯著性差異(P<0.05，P<0.01);但是LDL-C、HDL-C水平僅中、高劑量與模型組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。本發(fā)明與原工藝金芪降糖片比較，低劑量的TG、LDL-C、HDL-C水平具有顯著性差異(AP<0.05)，而在中、高劑量給藥時(shí)兩種工藝提取的產(chǎn)品對(duì)糖尿病大鼠的血脂的代謝無(wú)顯著性差異。說(shuō)明本發(fā)明金芪降糖片在低劑量給藥時(shí)降血脂效果優(yōu)于原工藝金芪降糖片，也正說(shuō)明新的提取工藝在提高有效成分的基礎(chǔ)上也顯示較好地降血脂效果。綜上，本發(fā)明與原來(lái)金芪降糖片對(duì)正常小鼠的空腹血糖影響不明顯。兩種工藝下的金芪降糖片均可以降低四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病小鼠的血糖值，本發(fā)明金芪降糖片在低、中劑量給藥時(shí)降血糖效果優(yōu)于原工藝，而在高劑量時(shí)兩種工藝的產(chǎn)品降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖作用相當(dāng)。兩種工藝金芪降糖片對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)，并注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，通過(guò)降低血清TC、TG、LDL-C，升高HDL-C水平，調(diào)節(jié)血脂的代謝作用，中、高劑量給藥時(shí)本發(fā)明與原工藝工藝金芪降糖片對(duì)糖尿病大鼠的血脂的調(diào)節(jié)作用相當(dāng)，在低劑量時(shí)本發(fā)明金芪降糖片的降血糖與降血脂作用優(yōu)于原工藝金芪降糖片。研究表明，長(zhǎng)期應(yīng)用該制劑可以明顯抑制糖尿病模型動(dòng)物的血糖、血脂升高，而對(duì)正常機(jī)體血糖、血脂無(wú)明顯影響。本發(fā)明的降血糖制劑與原工藝比較有效成分含量、藥效作用均有所增強(qiáng)，且本發(fā)明制劑的劑型縮小，更便于生產(chǎn)保管與臨床服用。四、實(shí)施例實(shí)施例1:黃芪總皂苷提取物的提取方法。稱(chēng)取中藥材黃芪lkg，碾壓后剪成23cm長(zhǎng)，加入5g纖維素酶，再加入4000mlpH4.5的硫酸水，于45。C酶解2小時(shí)，調(diào)pH至中性后，加入7000ml乙醇(含醇量約60%)，回流提取兩次，每次2小時(shí)。過(guò)濾、減壓濃縮至無(wú)醇味，加水10000ml到已處理好的AB-8或D101大孔吸附樹(shù)脂柱上(約500g樹(shù)脂)，以3000ml蒸餾水洗脫糖類(lèi)等水溶性雜質(zhì)，以4000ml的80%乙醇洗脫黃芪皂苷，收集洗脫液，濃縮至原體積的1/4后，加入丙酮至無(wú)沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，干燥沉淀，即得黃芪總皂苷提取物。經(jīng)測(cè)定，該工藝條件下黃芪的浸膏收率為15%，黃芪總皂苷的提取轉(zhuǎn)移率為87%，其中黃芪甲苷占19%。實(shí)驗(yàn)顯示通過(guò)酶解輔助提取的黃芪總皂苷比未加酶的對(duì)照組高出35%。實(shí)施例2:黃連總生物堿提取物的提取方法。稱(chēng)取中藥材黃連lkg，剪切成段，長(zhǎng)23cm，加入3g纖維素酶，再加入4000mlpH4.5的硫酸水，于35t:酶解2.5小時(shí)后，過(guò)濾，收集濾液，藥渣再用8倍量、0.3%硫酸水溶液冷浸提取兩次，每次24小時(shí)，合并濾液，減壓濃縮至3升，然后以鹽酸調(diào)節(jié)pHl2，在攪拌下加入溶液體積8%的食鹽進(jìn)行鹽析，靜置12小時(shí)，抽濾，得沉淀物于6(TC下烘干、研碎，即可得到黃連總生物堿鹽酸鹽成品。經(jīng)測(cè)定，該工藝條件下黃連堿提取物收率達(dá)到18%，小檗堿及總生物堿提取轉(zhuǎn)移得率分別為85%和87%，與傳統(tǒng)的冷浸法相比，小檗堿及總生物堿提取率分別提高了32%和31%。實(shí)施例3:金銀花提取物的提取方法1。稱(chēng)取中藥材金銀花lkg，加入果膠酶5g、p朋.0檸檬酸緩沖液10000ml，于40oC酶解1.5小時(shí)后，收集酶解液，再將藥材用水于70oC進(jìn)行溫浸提取兩次，每次1小時(shí)，水的用14量依次為8000ml、6000ml。合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.101.20(60°C)，待溫度降低至室溫，于濃縮液中加入3倍量乙醇，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，減壓濃縮，干燥即得到金銀花提取物。經(jīng)測(cè)定，金銀花的浸膏得率為20%，綠原酸的提取轉(zhuǎn)移率達(dá)到73%。增加酶解輔助提取工藝方法較常規(guī)溫浸法，可使綠原酸得率提高了27%。實(shí)施例4:金銀花提取物的提取方法2稱(chēng)取中藥材金銀花lkg，加入復(fù)合酶(纖維素酶果膠酶l:1)2g、pH6.0檸檬酸緩沖液10000ml，于4(TC酶解1.5小時(shí)后，收集酶解液，再將藥材用水于70oC進(jìn)行溫浸提取兩次，每次1小時(shí)，水的用量依次為8000ml、6000ml。合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.101.20(60°C)，待溫度降低至室溫，于濃縮液中加入3倍量乙醇，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，減壓濃縮，干燥即得到金銀花提取物。經(jīng)測(cè)定，金銀花的浸膏得率為24%，綠原酸的提取轉(zhuǎn)移率達(dá)到82%。與傳統(tǒng)溫浸法相比，綠原酸得率提高了34%。實(shí)施例5:應(yīng)用本發(fā)明制備的治療糖尿病藥物片劑組分及配比黃連343g、黃芪513g、金銀花2058g、預(yù)膠化淀粉65g、微晶纖維素70g、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉5.5g、羧甲基淀粉鈉9g，硬脂酸鎂2.5g。制備方法1.將黃連挑選并除去泥土、雜物，適當(dāng)剪切成段，長(zhǎng)23cm，于343g黃連中加入4倍量硫酸水(pH4.5)1372ml，再加入黃連重量0.5%的纖維素酶1.715g，于5(TC下溫浸酶解2小時(shí)，收集溫浸提取液；于酶解后的藥渣加入12倍量的0.1%的硫酸水浸泡2次，每次24小時(shí)，合并酶解液與酸水浸出液、調(diào)至中性，過(guò)濾，將濾液減壓濃縮至原體積的1/3;以鹽酸調(diào)pH2，攪拌下加入濾液體積8%的食鹽，放置12小時(shí)，至黃色結(jié)晶析出為止，過(guò)濾、蒸餾水洗沉淀至pH6，8(TC下烘干，即得黃連總生物堿產(chǎn)品。2.將黃芪513g根莖碾壓，加入4倍量、pH5.0的硫酸水2052ml及生藥量1.0%的纖維素酶5.13g，于4(TC下酶解2小時(shí)后調(diào)至中性，再加入70%乙醇回流提取兩次，每次2小時(shí)，收集濾液，減壓濃縮；濃縮液上AB-8或D-lOl大孔吸附樹(shù)脂柱，先以5倍樹(shù)脂體積的蒸餾水洗，再以5倍樹(shù)脂體積的80%乙醇洗脫，收集乙醇液并減壓濃縮至原體積的1/5;加入丙酮至無(wú)沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾、收集沉淀、干燥，即得黃芪總皂苷提取物。3.于2058g金銀花中加入10倍量、pH5的檸檬酸緩沖液20580ml，再加入金銀花重量的0.2%纖維素酶與果膠酶(1:1)混合物4.116g，5(TC下溫浸2小時(shí)，過(guò)濾，收集酶解液；再于藥材中分別加10、8倍量水20580ml、16464ml于60。C溫浸提取2次(2，2小時(shí))，收集提取液；合并酶解液與溫浸提取液，過(guò)濾，減壓濃縮濾液至相對(duì)密度1.101.20(60°C);于上述濃縮液(冷至4(TC)中加入3倍量的乙醇靜置12小時(shí)，過(guò)濾，上清液經(jīng)減壓濃縮、干燥粉碎備用，即得到金銀花的有效部位。取上述3種粉末，加入預(yù)膠化淀粉65g，微晶纖維素70g，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉5.5g，羧甲基淀粉鈉9g，硬脂酸鎂2.5g混合的輔料，制粒，壓制成1000片，包薄膜衣，即得本發(fā)明制備的制劑。權(quán)利要求一種治療糖尿病藥物的制備方法，包括按重量份配比的黃連10.3份，黃芪15.4份，金銀花61.8份，分別提取藥物有效成分后，加入輔料，制成顆粒，壓制成片，包薄膜衣制成，其特征在于藥物有效成分的提取步驟為①黃芪總皂苷提取物的提取步驟a.黃芪加入3～8倍量pH3.0～6.0的硫酸水，再加入黃芪用量0.1～1.0％的纖維素酶，35～60℃酶解，收集酶解液；b.酶解液以氫氧化鈉溶液調(diào)至pH中性后，加入60～80％乙醇回流提取，收集濾液，減壓濃縮；c.濃縮液上大孔吸附樹(shù)脂柱以2～10倍樹(shù)脂體積的蒸餾水洗脫，再以5～10倍樹(shù)脂體積的60～80％乙醇洗脫，收集乙醇濃縮液；d.于乙醇濃縮液中加入丙酮至無(wú)沉淀產(chǎn)生為止，過(guò)濾、收集、干燥沉淀劑，即得黃芪總皂苷提取物；②黃連總生物堿的提取步驟a.將黃連剪切成段，加入3～5倍量pH1.0～5.0的硫酸水，再加入黃連用量0.1～1.0％的纖維素酶，30～60℃溫浸，分別收集酶解液和藥渣；b.藥渣以8～16倍0.1～2.0％的硫酸水溶液浸泡；得酸水浸出液；c.將酶解液與酸水浸出液合并、過(guò)濾，濃縮；d.以鹽酸調(diào)至pH1～4，在攪拌下加入食鹽，放置至黃色結(jié)晶析出；e.抽濾收集沉淀，蒸餾水洗沉淀至pH4～6，烘干，即得黃連總生物堿。③金銀花提取物的提取步驟a.向金銀花中加入8～12倍量pH4.0～6.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花用量0.1～2.0％的果膠酶，收集酶解液；b.酶解后金銀花加8～15倍量水溫浸提取，收集溫浸液；c.將酶解液與溫浸提取液合并，過(guò)濾，60℃減壓濃縮至相對(duì)密度1.10～1.20；d.于濃縮液中加入2～4倍量的乙醇，靜置醇沉，過(guò)濾，上清液減壓濃縮即得金銀花提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療糖尿病藥物的制備方法，其特征在于向金銀花中加入812倍量pH4.06.0的檸檬酸緩沖液，再加入金銀花用量0.12.0%的復(fù)合酶，收集酶解液，其中復(fù)合酶是由纖維素酶與果膠酶分別按i:i、i:2、2:i的比例組成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療糖尿病藥物的制備方法，其特征在于黃芪總皂苷提取物中的黃芪浸膏收率為1017%，黃芪總皂苷提取轉(zhuǎn)移率為6588%，其中黃芪甲苷含量占519%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療糖尿病藥物的制備方法，其特征在于黃連總生物堿提取物中的黃連總生物堿粗品得率為1025%，黃連總生物堿提取轉(zhuǎn)移率為7090%，鹽酸小檗堿提取轉(zhuǎn)移率為5090%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療糖尿病藥物的制備方法，其特征在于金銀花提取物中金銀花浸膏得率為1540%，綠原酸提取轉(zhuǎn)移率為5090%。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種治療糖尿病藥物的制備方法，屬于含有的原材料來(lái)源于傳統(tǒng)中藥的醫(yī)用配置品的制備方法。本發(fā)明是將黃芪經(jīng)纖維素酶處理后乙醇回流提取，黃連、金銀花分別經(jīng)纖維素酶、果膠酶處理后冷浸提取。本發(fā)明與傳統(tǒng)的提取方法比較，黃芪總皂苷的提取率提高30～50％，小檗堿及總生物堿提取率均可提高20～40％，綠原酸得率分別提高了15～30％、30～50％，本發(fā)明提高植物藥材中有效物質(zhì)的轉(zhuǎn)移率，能夠充分利用藥材資源。文檔編號(hào)A61K36/718GK101695520SQ200910309588公開(kāi)日2010年4月21日申請(qǐng)日期2009年11月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者喬衛(wèi),周晶,寧娜,張金紅,楊茉,符敬偉申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué);