專利名稱：：通過阻斷ptk7蛋白功能的細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：(repulsiveaxonguidance)(Winberg,M丄.等，Neuron32:53-62)。另外，有報(bào)道稱雞KLG連同Plexin-Al—起與Sema6D結(jié)合，所得到的PlexinAl-KLG-Sema6D復(fù)合體在雞心臟發(fā)生期間的心室形成中發(fā)揮重要作用(Toyofuku,T.等，GenesDev18:435-447)。最近有報(bào)道稱，表達(dá)由114個(gè)N端氨基酸殘基組成的缺陷型PTK7的小鼠在圍產(chǎn)期死亡并表現(xiàn)出神經(jīng)管缺陷(NTD)(其中神經(jīng)管從中腦-后腦分界處直至脊柱基底未能閉合)和靜纖毛束定向(stereociliarybundleorientation)缺陷，由此PTK7調(diào)節(jié)平面細(xì)胞極性(planarcellpolarity,PCP)(Lu,X.等,Nature430:93-98)。小鼠PTK7mRNA在早期胚胎組織(包括尾、肢、體節(jié)、消化道和顱面區(qū))中高表達(dá)。據(jù)報(bào)道，與正常結(jié)腸相比，人PTK7mRNA在胎兒結(jié)腸(Mossie，K.等，Oncogene11:2179-2184)和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中顯著增加(Saha,S.等，Science294:1343-1346),但在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中有所降低(Easty，D.J.等，IntJCancer71:1061-1065)。綜上所述，基于PTK7在疾病狀態(tài)(例如肺瘤)中高水平表達(dá)的考慮，推定PTK7的表達(dá)與惡性疾病的發(fā)病機(jī)制之間存在相互關(guān)系，但是尚難具體確定PTK7對(duì)肺瘤發(fā)生或者細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的作用，或者二者之間是否有直接因果關(guān)系。公開內(nèi)容技術(shù)問題鑒于上述問題，因而實(shí)施了本發(fā)明，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑，所述抑制劑能夠通過抑制VEGF-介導(dǎo)的血管發(fā)生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞粘附，抑制PI3激酶和Akt的活化以及抑制FAK和樁蛋白(paxillin)的活化從而在體內(nèi)有效抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，利用功能性抑制PTK7而提供細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑可以實(shí)現(xiàn)上述以及其他目的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制劑可包含具有PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性PTK7片段。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述可溶性PTK7片段可包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或者排除氨基酸殘基1-30之外的SEQIDNO:2的衍生序列。更優(yōu)選地，所述可溶性PTK7的最小活性片段可以是人PTK7(SEQIDNO:2)的氨基酸31-409或氨基酸327-409的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抑制劑可包含介導(dǎo)編碼PTK7之信使RNA(mRNA)的特異性RNA干擾(RNAi)的小RNA序列。更優(yōu)選地，所述小RNA序列可以是與編碼PTK7之mRNA序列形成互補(bǔ)鍵從而抑制PTK7mRNA表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)，或者是包含該siRNA序列的小發(fā)夾RNA(shRNA)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抑制劑可以是PTK7中和抗體，其特異性地與PTK7結(jié)合從而抑制PTK7的活性。所述中和抗體能夠識(shí)別SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是血管內(nèi)皮細(xì)胞。之后將簡要定義本公開內(nèi)容中所使用的術(shù)語。本文所使用的術(shù)語"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，除非另有限定，否則其包括以類似于天然核普酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸之已知類似物。除非另有指明，具體的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。術(shù)語"有效連接至"是指核酸表達(dá)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子、信號(hào)序列或者一系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))與另一核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)所述另一序列對(duì)應(yīng)核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。當(dāng)術(shù)語"重組"用于細(xì)胞時(shí)表示細(xì)胞復(fù)制異源核酸或者表達(dá)異源核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可以表達(dá)在細(xì)胞天然形式中無法找到的基因。重組細(xì)胞還可以表達(dá)在細(xì)胞天然形式中可以找到、但是通過人工方法進(jìn)行修飾并且再引入細(xì)胞的基因。術(shù)語"啟動(dòng)子"是指當(dāng)將目的蛋白的基因融合到該啟動(dòng)子下游時(shí)能夠在乾細(xì)胞中調(diào)控蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子。此外，還可通過與其他轉(zhuǎn)錄-翻譯激活序列連接而進(jìn)一步修飾本發(fā)明的啟動(dòng)子。術(shù)語"中和抗體"是指參與中和反應(yīng)的免疫抗體，并且是當(dāng)抗原(如病毒)對(duì)機(jī)體具有毒性或感染性時(shí)與目標(biāo)抗原結(jié)合從而導(dǎo)致抗原活性喪失或減弱的抗體o術(shù)語"可溶性蛋白片段"是指經(jīng)水解僅產(chǎn)生氨基酸并且可溶于水或鹽溶液的簡單蛋白質(zhì)。有益效果如此后將具體說明地，本發(fā)明提供了細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑，其能夠通過抑制VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞粘附，抑制PI3激酶和Akt的活化以及抑制FAK和樁蛋白的活化而在體內(nèi)有效抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲。可通過多種方法來構(gòu)建用于抑制PTK7功能的本發(fā)明之血管發(fā)生、細(xì)胞遷移或細(xì)胞侵襲抑制劑，例如處理可溶性PTK7片段、PTK7敲低(knockdown)、處理PTK7中和抗體等。圖1示意PTK7多肽結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞分泌之PTK7的完整或部分的胞外結(jié)構(gòu)域；圖2顯示sPTK7對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管發(fā)生的作用；圖3顯示sPTK7對(duì)HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)增加的作用；圖4和圖5顯示sPTK7對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移和侵襲的作用；圖6和圖7是顯示sPTK7對(duì)VEGF誘導(dǎo)體內(nèi)血管發(fā)生的作用的照片和圖8是顯示sPTK7對(duì)HUVEC中VEGF所誘導(dǎo)之信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化的作用的電泳圖語和圖；圖9是電泳圖語和共聚焦顯微照片，其顯示sPTK7對(duì)HUVEC中VEGF所誘導(dǎo)的FAK和樁蛋白活化、樁蛋白的粘著斑(focaladhesion)形成以及肌動(dòng)蛋白絲形成的作用；圖10顯示測(cè)定sPTK7的最小活性片段對(duì)VEGF誘導(dǎo)之HUVEC遷移的分析結(jié)果；圖11顯示PTK7敲低分析中所用siRNAs(ON-TARGETplus,Dharmacon)的序歹寸j圖12是顯示利用相應(yīng)的siRNA及其混合物進(jìn)行PTK7敲低之結(jié)果的電泳圖鐠；圖13顯示PTK7敲低分析中所用shRNA栽體的信息和靶序列(MISSIONTRCshRNAs,SIGMA畫ALDRICH);圖14是顯示利用shRNA載體進(jìn)行PTK7敲低之結(jié)果的電泳圖語；圖15顯示PTK7敲低對(duì)HUVEC中VEGF誘導(dǎo)之血管發(fā)生的作用；圖16是顯示PTK7抗血清處理對(duì)HUVEC中VEGF謙導(dǎo)的Akt褲酸化之作用的電泳圖鐠。最佳實(shí)施方式此后將詳細(xì)描述本發(fā)明。如前所述，通常只知道在疾病狀態(tài)下(如肺瘤)可觀察到PTK7的過表達(dá)，但沒有報(bào)道表明PTK7是否與肺瘤發(fā)生或相關(guān)過程有直接聯(lián)系，以及，如果有聯(lián)系的話，何種機(jī)制受到PTK7影響。通過多種廣泛且深入的研究和實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的發(fā)明人已首次闡明當(dāng)人PTK7的功能被抑制時(shí)，細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生受到阻抑。因此，通過功能性抑制人PTK7來阻抑細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生，將有可能預(yù)防和治療多種由細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生引起的疾病(包括癌癥轉(zhuǎn)移)。此后旨在提供多種能夠抑制人PTK7活性的方法，但本發(fā)明不限于此。具體來說，可以通過多種方法來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的功能性抑制PTK7，例如通過可溶性PTK7(sPTK7)片段或其部分來實(shí)現(xiàn)，其可以通過與PTK7竟?fàn)巵碜钄郟TK7的功能。如圖1所示，構(gòu)建可溶性PTK7片段，使其具有PTK7的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。已表明，如此構(gòu)建的PTK7片段抑制管形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲，同時(shí)也抑制體內(nèi)血管發(fā)生，并且還抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(如PI3激酶和Akt)的活化。此外，PTK7-Igl4s片段(其包含從PTK7胞外結(jié)構(gòu)域第一個(gè)Ig環(huán)至第四個(gè)Ig環(huán)的結(jié)構(gòu)域)也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這與sPTK7類似。認(rèn)為本發(fā)明的可溶性PTK7片段作為內(nèi)源性PTK7的竟?fàn)幮灾T辨受體(decoyreceptor)通過結(jié)合PTK7配體(目前尚未充分了解)來抑制PTK7的功能。具體地，盡管對(duì)可用于本發(fā)明的可溶性PTK7(sPTK7)片段的種類未作具體限制，只要其可抑制人PTK7的活性即可，然而可優(yōu)選使用具有SEQIDNO:2氨基酸序列或其最小活性片段的蛋白質(zhì)。不對(duì)編碼靶蛋白的基因堿基序列的種類作具體限制，只要其可編碼SEQIDNO:2的氨基酸序列即可。優(yōu)選地，可使用SEQIDNO:1所示的基因堿基序列。更優(yōu)選地，SEQIDNO:2所示的sPTK7序列具有His標(biāo)簽，并且可包含排除氨基酸殘基l-30(其對(duì)應(yīng)于ER信號(hào)肽)之外的氨基酸序列。同時(shí)，如此后實(shí)施例9中可見，所述最小活性片段包含SEQIDNO:2sPTK7序列的氨基酸31-409以及更優(yōu)選地氨基酸327-409?？扇缦聵?gòu)建本發(fā)明的可溶性PTK7片段構(gòu)建有效連接以表達(dá)具有His標(biāo)簽之人sPTK7的載體(pcDNA3-hPTK7-Ext-His)或者表達(dá)部分人sPTK7的載體，將所述載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，分離并培養(yǎng)表達(dá)sPTK7或其部分的HEK293細(xì)胞，然后使用Ni2+-NTA柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化可溶性PTK7。然而，本發(fā)明不限于此。為了便于純化在重組表達(dá)載體中表達(dá)的重組肽或蛋白質(zhì)，所述表達(dá)載體還可在鄰近5，-或3，-端包含編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、FLAG、5~7xHis(六組氨酸)、NusA(N利用物質(zhì)A(NutilizationsubstanceA))或Trx(硫氧還蛋白)的核普酸序列。當(dāng)宿主是原核細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可包含有利于特定基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、lacUV5啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、pLl啟動(dòng)子、pRX啟動(dòng)子、rac5啟動(dòng)子、amp啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子)、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。當(dāng)構(gòu)建針對(duì)真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體時(shí)，可使用源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物病毒基因組的啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子、痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、CMV-IE啟動(dòng)子以及HSV的tk啟動(dòng)子)。所述載體通常包含多腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄終止序列。同時(shí)，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可包含本領(lǐng)域已知的常規(guī)抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，例如對(duì)抗生素(如氨節(jié)青霉素、慶大霉素、羧節(jié)青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳霉素(geneticin)、新霉素和四環(huán)素)具有抗性的基因以及G418抗性基因。本發(fā)明的優(yōu)選表達(dá)栽體可通過對(duì)本領(lǐng)域常規(guī)使用的質(zhì)粒(例如pSC101、ColEl、pBR322、pUC8/9、pHC79、pUC19、pET等)、謹(jǐn)菌體(例如，Xgt4XB、l-Charon、XAzl和M13)或病毒(例如SV40)進(jìn)行操作來構(gòu)建。然而，本發(fā)明不限于此。任何本領(lǐng)域常規(guī)的、并適于載體穩(wěn)定連續(xù)克隆和表達(dá)的宿主細(xì)胞均可用于本發(fā)明。所述宿主細(xì)胞的實(shí)例可包括大腸桿菌(￡."http://)JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌RR1、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776、大腸桿菌W3110、芽孢桿菌屬(5flci7/wssp.)菌林(如枯草芽孢桿菌(fiflci7/ws仰6"7/s)和蘇云金芽抱軒菌(5fl"7/"s幼im'"g/ews/s))、腸軒菌屬(五"&n6"c^J菌林(如鼠傷寒沙門氏菌(iS"/附offg〃"妙/r/附i/nTi/11)、粘質(zhì)沙雷氏菌(5^mirifl附"frescms))以及假單胞菌屬(/^wflfe附0wassp.)等。此外，當(dāng)將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化至真核細(xì)胞時(shí)，可使用酵母(釀酒酵母(Sflcc/^rowj;cecwevi's,'"e))、昆蟲和人細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞系)作為宿主細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞時(shí)，可利用CaCh法(Cohen，S.N.等，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9:2110-2114(1973))、Hanahan法(Cohen,S.N.等，Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973);以及Hanahan，D"J.Mol.Biol"166:557-580(1983))、電穿孔(Dower，WJ.等，Nucleic.AcidsRes.，16:6127-6145(1988))等將本發(fā)明的載體遞送至宿主細(xì)胞中。此外，可4吏用顯微注射(Capecchi,M.R.，Cell,22:479(1980))、磷酸鉀沉淀(Graham,F.L.等,Virology,52:456(1973))、電穿孔(Neumann,E.等，EMBOJ.，1:841(1982))、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wong，T.K.等，Gene，10:87(1980))、DEAE-葡聚糖處理(Gopal,Mol.CellBiol"5:1188-1190(1985))以及基因槍轟擊(genebombardment)(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci，87:9568-9572(19卯))將載體引入真核宿主細(xì)胞。為了研究sPTK7是否抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生、遷移和侵襲，本發(fā)明使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并使用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性誘導(dǎo)劑。在上述測(cè)定中，對(duì)HUVEC施用不同濃度的可溶性PTK7片段，約30分鐘后用VEGF處理該HUVEC，評(píng)估可溶性PTK7片段對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管發(fā)生的作用。因此，在不存在可溶性PTK7片段時(shí)，僅用VEGF處理HUVEC導(dǎo)致HUVEC的毛細(xì)血管樣管形成(這與血管類似)，而用可溶性PTK7片段預(yù)處理HUVEC則導(dǎo)致對(duì)VEGFi秀導(dǎo)之HUVEC管形成的劑量依賴性抑制(參見圖2)。為了研究可溶性PTK7片段對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的細(xì)胞毒作用，利用MTT測(cè)定來檢測(cè)經(jīng)可溶性PTK7片段處理后HUVEC細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化。因此，證實(shí)了可溶性PTK7片段對(duì)HUVEC的生存力或增殖沒有影響(參見圖3)。因此，表明可溶性PTK7片段對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的抑制活性并非由細(xì)胞毒性所致。細(xì)胞遷移和侵襲對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生很重要。因此，使用趨化性運(yùn)動(dòng)測(cè)定(chemotacticmotilityassay)在Transwell系統(tǒng)中效'J定細(xì)胞遷移(參見圖4)，并使用侵襲測(cè)定在Transwell系統(tǒng)中用無生長因子Matrigel(growthfactor-reducedMatrigel，GFR-Matrigel(GFRM))包被后來測(cè)定細(xì)胞侵襲(參見圖5)。細(xì)胞定量分析顯示出遷移和侵襲，證實(shí)了可溶性PTK7片段以劑量依賴性方式抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移和侵襲。從這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，可溶性PTK7片段在體外不具有細(xì)胞毒性，并且抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生、遷移和侵襲。因此，試圖證實(shí)可溶性PTK7片段在體內(nèi)條件下是否也表現(xiàn)出同樣的活性。為此，以與構(gòu)建人sPTK7同樣的方式構(gòu)建小鼠sPTK7。然后，將Matrigel本身、含VEGF的Matrigel以及含小鼠sPTK7和VEGF的Matrigel分別注射到小鼠的腹部內(nèi)皮和上皮之間，然后進(jìn)行體內(nèi)Matrigel栓測(cè)定(Matrigelplugassay)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，VEGF在所述栓上資導(dǎo)血管發(fā)生，而用PTK7和VEGF聯(lián)合處理的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出血管發(fā)生的顯著抑制(參見圖6和圖7)。為了確定sPTK7的最小活性片段區(qū)，以與sPTK7同樣的方式對(duì)具有His標(biāo)簽的sPTK7Ig-環(huán)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表達(dá)、純化并測(cè)定細(xì)胞遷移。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PTK7國Igl4s畫His、PTK7國Igl4國His和PTK7畫Igl5-His以劑量依賴性方式抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移(參見圖1和圖10)。然而，與sPTK7相比，PTK7-Igl3-His表現(xiàn)出非常弱的細(xì)胞遷移抑制能力。這些結(jié)果證實(shí)，PTK7-Igl4s-His包含人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的最小活性片段，尤其是人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域完整的第四個(gè)Ig-環(huán)區(qū)域(人PTK7的氨基酸327-409)對(duì)于PTK7的正常功能是必需的。本發(fā)明的技術(shù)特征在于提供了能夠通過功能性抑制PTK7來抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲的抑制劑。因此，除了使用可溶性PTK7片段作為抑制劑以外，還可通過多種抑制劑來實(shí)現(xiàn)功能性抑制PTK7。例如，可通過以下方式來功能性抑制PTK7:使用小干擾RNA(siRNA)(其與編碼PTK7的mRNA序列形成互補(bǔ)鍵從而抑制PTK7mRNA序列的表達(dá))，使用含有上述siRNA序列的小發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體，或者使用特異性結(jié)合PTK7從而抑制PTK7活性的PTK7中和抗體。為了確定RNAi對(duì)PTK7功能的功能性抑制作用，用siRNA和shRNA載體敲低PTK7的表達(dá)，并分析PTK7敲低對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生和Akt磷酸化的作用。使用PTK7抗血清通過Western印跡分析來測(cè)定PTK7的敲低程度。結(jié)果，用PTK7siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC或用PTK7shRNA載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞導(dǎo)致PTK7表達(dá)減少70%或以上，因此證實(shí)PTK7被有效敲低(參見圖11至圖15)。因此，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低PTK7表現(xiàn)出與sPTK7處理類似的作用，從而證實(shí)sPTK7阻斷內(nèi)源性PTK7的功能，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的管形成、遷移和侵襲以及體內(nèi)血管發(fā)生的抑制。作為抑制劑的另一實(shí)施方案，可使用特異性結(jié)合PTK7以抑制PTK7活性的PTK7中和抗體。在這種情況下，所述中和抗體優(yōu)選能夠識(shí)別SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(參見實(shí)施例11)。本發(fā)明的抑制劑還可包含常規(guī)用于制備藥物組合物的適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑和稀釋劑。可以使用常規(guī)方法將包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA的組合物制備成各種劑型，如口服制劑(例如，粉劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑、混懸液、乳劑、糖漿和乳液)、外用制劑、栓劑和無菌注射溶液?？捎糜诎景l(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA的組合物中的載體(carrier)、賦形劑和稀釋劑可以是制劑中常規(guī)使用的材料，其包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸曱酯、羥基苯曱酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。可使用常規(guī)稀釋劑或運(yùn)載體(vehicle)(如填充劑、增充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等)將本發(fā)明的組合物制成各種制劑?？诜腆w制劑包括例如片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑和膠嚢劑，并通過將本發(fā)明的組合物與一種或多種運(yùn)載體(如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等)進(jìn)行混合來制備。除了簡單的運(yùn)載體以外，還可使用潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石等。口服液體制劑包括例如混懸液、內(nèi)用溶液、乳劑和糖漿，除了常規(guī)的簡單稀釋劑(如水、液體石蠟等)，還可含有多種賦形劑(如潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑)。腸胃外施用的制劑可包括無菌水溶液、非水溶劑、混懸液、乳劑、凍干制劑和栓劑。對(duì)于非水溶劑和助懸劑來說，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、注射用酯(injectableester)(如油酸乙酯)等?？墒褂肳itepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可脂、月桂酸甘油酯(laurinfat)和甘油明膠作為栓劑的基質(zhì)。本文公開的有待向受影響部位提供的編碼蛋白質(zhì)之DNA可以插入載體的形式來應(yīng)用，所述載體例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰滲病毒載體或質(zhì)粒。對(duì)于用于包含蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA的組合物的基質(zhì)材料來說，沒有具體的限制，只要是常用于注射制劑的基質(zhì)材料即可。所述基質(zhì)材料的實(shí)例可包括蒸餾水；氯化鈉鹽溶液或氯化鈉與無機(jī)酸等的混合物鹽溶液；甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等溶液；氨基酸(如甘氨酸和精氨酸)溶液；有機(jī)酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液的混合溶液等。還有可能根據(jù)常規(guī)方法將輔藥(如滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑)、植物油(如芝麻油和大豆油)或卵磷脂或表面活性劑(如非離子表面活性劑)添加到這樣的基質(zhì)材料中來制備溶液、混懸液或膠體溶液，從而制備腸胃外注射制劑?？梢苑勰┗騼龈芍破返男问絹硖峁┻@樣的腸胃外注射制劑，其使用前用水或其他合適的運(yùn)載體進(jìn)行重構(gòu)(reconstitution)。如果使用包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA的固體組合物作為活性成分，在基因治療原位使用前將所述組合物溶于滅菌基質(zhì)中?？蔁o需特定處理而直接使用本發(fā)明的液體組合物。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA的優(yōu)選劑量可取決于多種因素而變化，所述因素例如患者的病癥和體重、疾病的嚴(yán)重程度、藥物形式、施用途徑和周期，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)丶右赃x擇。然而，為了取得理想的效果，通常建議在由血管發(fā)生引起的損傷部位局部施用0.0001~1000mg/kg量的本發(fā)明蛋白質(zhì)或DNA。所述劑量可以單次日劑量或多次日劑量來施用?；蛘?，可在手術(shù)后通過導(dǎo)管等以單次劑量施用本發(fā)明的活性成分，從而該活性成分可被吸收到靶部位中。所述活性成分的有效劑量可取決于多種因素而變化，所述因素例如施用途徑、疾病的嚴(yán)重程度、受試者的性別、體重和年齡等。因此，不應(yīng)以任何方式將上述指定劑量解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制?？赏ㄟ^多種施用途徑向人和哺乳動(dòng)物物種(例如大鼠、小鼠和家畜)施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)之DNA?？赏ㄟ^任意途徑進(jìn)行施用，包括口服、直腸、注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、子宮內(nèi)以及腦室內(nèi)。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明組合物的應(yīng)用領(lǐng)域包括醫(yī)藥產(chǎn)品以及常規(guī)的功能性食品和保健食品。發(fā)明實(shí)施方式現(xiàn)在，將參考以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍和主旨。實(shí)施例1:細(xì)胞培養(yǎng)通過膠原酶處理從人臍靜脈分離得到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。將HUVEC培養(yǎng)于含有20%(重量/體積)胎牛血清(FBS)、100單位/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素、3ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，UpstateBiotechnology,U.S.A.)和5單位/ml肝素的M199培養(yǎng)基(Invitrogen，U.S.A)中。同時(shí)，將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS、100單位/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素的Dulbecco，sModifiedEagle，s培養(yǎng)基(DMEM)中。將所述細(xì)胞培養(yǎng)在37X:、5%<:02和95%空氣的氛圍中。實(shí)施例2:構(gòu)建連有His標(biāo)簽的人sPTK7表達(dá)質(zhì)粒首先，從人的全長PTK7cDNA(Park,S.K.等，JBiochem(Tokyo)119:235-239)中獲得4.2kb的￡"RI片段，并亞克隆至pcDNA3載體(Invitrogen)的五coRI位點(diǎn)來構(gòu)建人PTK7表達(dá)載體pcDNA3-hPTK7。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所構(gòu)建的表達(dá)載體，使其在640bpcDNA片段(編碼人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的C端)中包含編碼His標(biāo)簽的序列和翻譯終止密碼子。pcr的引物對(duì)是5，國AAAAGCTCAAGTTCACACCA-3，(GenBankU40271的核苷酸1646-1665)以及5，-GCrCT4G^TCAATGATGATGATGATGATGCTGGATCATCTTGTAGGG-3，[對(duì)應(yīng)于GenBankU40271的核苷酸2239-2256(標(biāo)有下劃線的字母)之編碼His標(biāo)簽的序列、終止密碼子和AT6fll位點(diǎn)(斜體字母)。用A7^KGenBankU40271的1829位核苷酸序列)和JW"I(pcDNA3的多克隆位點(diǎn))消化pcDNA3-hPTK7以除去1.6kb片段，用A7^I和AT6fll消化上述PCR聲物以分離出0.45kb片段，然后將所述0.45kb片段連接進(jìn)經(jīng)A7^I和AT6fll消化的pcDNA3-hPTK7中，從而獲得人sPTK7表達(dá)載體，將其命名為pcDNA3-hPTK7-Ext-His質(zhì)粒。通過雙向測(cè)序未在如此構(gòu)建的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。由于PTK7多肽的氨基酸1-30的氨基酸序列是ER信號(hào)肽，所以將質(zhì)粒pcDNA3-hPTK7-Ext-His引入真核細(xì)胞中導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于氨基酸31-703的整個(gè)PTK7胞外區(qū)以及His標(biāo)簽的表達(dá)。實(shí)施例3:人和小鼠sPTK7的表達(dá)和純化通過磷酸鉀法分別將實(shí)施例2中構(gòu)建的人sPTK7表達(dá)載體(pcDNA3-hPTK7-Ext-His)和小鼠sPTK7表達(dá)載體(pcDNA3.1-mPTK7隱Ext-His)(Jung，J.W.等，Gene328:75-84)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞中，并用1.2mg/mlG418處理所述細(xì)胞來篩選G418抗性細(xì)胞克隆。從所篩選的G418抗性細(xì)胞克隆中，使用抗五His單克隆抗體(Qiagen，Hilden,Germany)對(duì)表現(xiàn)出穩(wěn)定表達(dá)人sPTK7和小鼠sPTK7的細(xì)胞克隆進(jìn)行再次篩選。用70%飽和硫酸銨處理經(jīng)7天無血清培養(yǎng)的再次篩選克隆以沉淀蛋白質(zhì)。將所得到的沉淀溶于含有1mM苯曱基磺酰氯(PMSF)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)(137mMNaCl、10mMNa2HP04、2.7mMKC1、2mMKH2P04,pH7.4)中并針對(duì)所述PBS進(jìn)行透析。將經(jīng)透析的樣品上樣于Ni"-NTA瓊脂糖(Qiagen)上，用咪唑洗脫，并針對(duì)PBS再次進(jìn)行透析以獲得純化的人sPTK7和小鼠sPTK7。實(shí)施例4:sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的抑制作用將培養(yǎng)的HUVEC在含有1%FBS的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行6小時(shí)饑俄處理。用胰蛋白酶處理使所述細(xì)胞分離并分散于同樣的培養(yǎng)基中。將0.2ml培養(yǎng)基中2xl05HUVEC與不同濃度的sPTK7(0、0.5、1、2和4嗎/ml)預(yù)反應(yīng)30分鐘。向24孔板的每個(gè)孔中加入0.2ml的10mg/ml無生長因子MatrigelTM(BDBiosciences),隨后進(jìn)行聚合，向每個(gè)孔中加入sPTK7處理的HUVEC，然后加入20ng/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)。將所述24孔板在371C下孵育16小時(shí)，在光學(xué)顯微鏡(x60)下計(jì)數(shù)新形成的血管的數(shù)目。在該測(cè)定以及以后的測(cè)定中，使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，其中戶<0.05時(shí)視為不顯著。進(jìn)行三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，將所得所有數(shù)據(jù)值表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。圖2顯示sPTK7對(duì)VEGF謙導(dǎo)的HUVEC血管發(fā)生的作用。使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。針對(duì)未經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，"戶O.01;針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，*><0.01以及"><0.001。從圖2的結(jié)果可以看出，與未經(jīng)處理的HUVEC相比，在sPTK7不存在時(shí)僅用VEGF處理HUVEC所形成的管數(shù)目表現(xiàn)出45%的增加。然而，用sPTK7進(jìn)行預(yù)處理導(dǎo)致VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管發(fā)生以sPTK7劑量依賴性方式受到抑制。實(shí)施例5:sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用利用MTT測(cè)定來研究sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的細(xì)胞毒作用。將20nl的0.1%明膠溶液加入48孔板的每個(gè)孔中，隨后進(jìn)行干燥。將2.0x104HUVEC接種至每個(gè)孔中，培養(yǎng)24小時(shí)，然后在含有1%FBS的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行6小時(shí)饑俄處理。將不同濃度的人sPTK7和10ng/mlVEGF加入每個(gè)孔中并培養(yǎng)36小時(shí)，利用MTT測(cè)定對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(Lee,S.J.等,BiochemBiophysResCommun312:1196-1201)。從圖3的結(jié)果可以看出，與未經(jīng)VEGF處理的樣品相比，僅用VEGF處理表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)增加40.5%,而經(jīng)sPTK7處理的樣品以及經(jīng)VEGF和sPTK7共同處理的樣品的細(xì)胞數(shù)未表現(xiàn)出差異。因此，可見sPTK7對(duì)HUVEC的生存力或增殖沒有影響，sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的抑制作用并非由細(xì)胞毒性所致。實(shí)施例6:sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用細(xì)胞遷移和侵襲對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管形成是重要的。因此，使用趨化性運(yùn)動(dòng)測(cè)定在Transwell系統(tǒng)中測(cè)定細(xì)胞遷移(參見圖4)，并使用侵襲測(cè)定在Transwell系統(tǒng)中用無生長因子Matrigel包被后來測(cè)定細(xì)胞侵襲(參見圖5)。如下進(jìn)行細(xì)胞遷移定量分析和細(xì)胞侵襲測(cè)定。具體來說，用10pl的0.1%明膠包被Transwell下側(cè)，隨后進(jìn)行干燥。將HUVEC在含有1%FBS的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行6小時(shí)饑俄處理之后，用胰蛋白酶處理使該細(xì)胞分離并分散于同樣的培養(yǎng)基中。加入不同濃度的sPTK7使細(xì)胞密度達(dá)到1x106HUVEC/ml，隨后反應(yīng)30分鐘。將0.1ml如此處理的HUVEC加至Transwell的上室(upperchamber),將含有10ng/mlVEGF和1%FBS的M199培養(yǎng)基加至Transwell的下室(lowerchamber),隨后在37匸孵育4小時(shí)。用蘇木精和伊紅對(duì)遷移到濾膜(filter)下側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行染色。16同時(shí)，除了還用80nl的10mg/ml無生長因子Matrigel包被Transwell的上側(cè)并孵育24小時(shí)以外，細(xì)胞侵襲測(cè)定與細(xì)胞遷移是一樣的。孵育完成后，在光學(xué)顯微鏡(x200)下檢測(cè)遷移或侵襲至Transwe11下側(cè)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖4和圖5顯示sPTK7對(duì)VEGF謙導(dǎo)的HUVEC遷移和侵襲的作用。使用VEGF作為化學(xué)引誘劑(chemoattractant),在無生長因子Matrigel存在或不存在時(shí)，在Transwell系統(tǒng)中測(cè)定HUVEC的遷移(圖4)和侵襲(圖5)。使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。針對(duì)未經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，悄尸<0.001;針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，**><0.001。從圖4和圖5的結(jié)果可以看出，VEGF處理導(dǎo)致HUVEC遷移增加3.3倍，HUVEC侵襲增加5倍，但是sPTK7處理導(dǎo)致劑量依賴性的細(xì)胞遷移和侵襲的降低。因此，證實(shí)sPTK7以劑量依賴性方式抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移和侵襲。實(shí)施例7:sPTK7對(duì)體內(nèi)血管發(fā)生的抑制作用由于證實(shí)了sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞不具有細(xì)胞毒作用，并且抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲，因此sPTK7有望在體內(nèi)抑制血管發(fā)生。為了明確這一點(diǎn)，將不含任何添加、或含有200ng小鼠VEGF或者200ng小鼠VEGF和20嗎小鼠sPTK7再加上20單位肝素的0.6mlMatrigel注射到7周齡C57BL/6雌性小鼠的腹部內(nèi)皮和上皮之間。7天后，回收栓并拍照。為了定量測(cè)定血管發(fā)生水平，使用Drabkin試劑盒525(Sigma畫Aldrich，St.Louis,MO，USA)測(cè)定Matrigel栓中的血紅蛋白含量。圖6和圖7顯示sPTK7對(duì)VEGF誘導(dǎo)的體內(nèi)血管發(fā)生的作用。向每個(gè)小鼠組(n=5)施加Matrigel本身、含小鼠VEGF的Matrigel或含小鼠sPTK7和VEGF的Matrigel。圖6顯示注射Matrigel7天后，從每個(gè)小鼠組取得的Matrigel栓中新血管(neovessel)的形成，圖7顯示Matrigel栓中血紅蛋白含量的測(cè)定結(jié)果用于量化新血管形成。使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，針對(duì)未經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，"><0.001;針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，"P<0.01。結(jié)果，僅含有VEGF的栓呈紅褐色，而含MatrigelTM本身或含有sPTK7和VEGF的栓呈淺黃色(參見圖6)。另外，僅含VEGF的栓顯示約7g/dl的血紅蛋白水平，而含有sPTK7和VEGF的栓顯示降低的血紅蛋白水平1.5g/dl(參見圖7)。這些結(jié)果證實(shí)了sPTK7在體內(nèi)抑制血管發(fā)生。實(shí)施例8:sPTK7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白活化的抑制作用本實(shí)施例旨在研究sPTK7通過抑制何種信號(hào)過程來抑制HUVEC的血管發(fā)生、遷移和侵襲。將亞匯合培養(yǎng)(subconfluent-cultured)的HUVEC在含有1%FBS的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行6小時(shí)饑俄處理。在饑俄處理完成30分鐘前，向培養(yǎng)基中加入4嗎/ml的sPTK7并培養(yǎng)細(xì)胞。此后，向培養(yǎng)基中加入10ng/mlVEGF并培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘(5分鐘用于KDR磷酸化測(cè)定)。用PBS清洗培養(yǎng)完畢的細(xì)胞，在350jil/100mm平皿的放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.0)、150mMNaCl、1%TritonX-100、0.1%SDS、0.5%脫氧膽酸鈉、25mMp國甘油磷酸鹽、50mMNaF、lmMNa3V04、lmMPMSF)中裂解20分鐘，隨后在4。C、12,000g下離心5分鐘以獲得上清液。對(duì)于免疫沉淀來說，向350m!上清液中加入1嗎抗體，隨后在4x:反應(yīng)12小時(shí)。將20Ml蛋白A瓊脂糖凝膠(50%漿狀懸液)加到每個(gè)反應(yīng)物中，反應(yīng)在4C進(jìn)行1小時(shí)，隨后離心以獲得沉淀。對(duì)于Western印跡分析來說，向得到的免疫沉淀物或細(xì)胞裂解上清液中加入SDS凝膠樣品緩沖液，然后將其煮沸來制備樣品。所述樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后進(jìn)行硝酸纖維素膜印跡并與抗體反應(yīng)。使用免疫沉淀在竟?fàn)幮訣LISA試劑盒(EchelonBiosciences,SaltLakeCity，UT，USA)中測(cè)定PI3激酶的活性。從圖8的結(jié)果可以看出，sPTK7抑制HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的KDR(VEGFR2)磷酸化和Akt磷酸化，并抑制激活A(yù)kt之PI3激酶的活性。由于具有增強(qiáng)血管發(fā)生細(xì)胞因子表達(dá)的活性，PI3激酶被認(rèn)為與血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲之間存在深度聯(lián)系(Brader，S.和Eccles，S.A.，Tumori90:2-8)。此外，已知Akt還有利于血管的成熟和滲透性以及內(nèi)皮細(xì)胞的生存力、增殖和遷移，因此在血管形成中發(fā)揮了重要作用(CheiLJ.等，NatMed，11:1188-1196;Manning,B.D.和Cantley,L.C.,Cell129:1261-1274)。綜上所述，可預(yù)期PI3激酶和Akt活性的抑制在sPTK7抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生中起重要作用。此外，sPTK7還抑制HUVEC中bFGF誘導(dǎo)的Akt磷酸化。因此，sPTK7有望通過阻斷由多種信號(hào)誘導(dǎo)劑(如VEGF或bFGF)激活的PI3激酶和Akt的胞內(nèi)信號(hào)過程來抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲。已知用VEGF處理內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致粘著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)和樁蛋白的酪氨酸磷酸化(Waltenberger,J.等，JBiolChem269:26988-26995;以及Abedi，H.和Zachary,I"JBiolChem272:15442-15451)。此外，有報(bào)道提示PI3激酶/Akt信號(hào)機(jī)制參與VEGF刺激的肌動(dòng)蛋白重纟且(reorganization)和內(nèi)皮細(xì)胞遷移(Morales-Ruiz,M.等，CircRes86:892-896;以及Radisavljevic，Z.等，JBiolChem275:20770-20774)。為了證實(shí)sPTK7對(duì)FAK和樁蛋白活化的作用，用sPTK7和VEGF處理HUVEC，這與先前實(shí)施例中所述的步驟類似，并用相應(yīng)的抗體對(duì)FAK和樁蛋白進(jìn)行免疫沉淀。然后，使用磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行Western印跡分析來測(cè)定FAK和樁蛋白的褲酸化。具體來說，對(duì)于免疫熒光顯微術(shù)來說，用sPTK7處理經(jīng)饑餓處理的HUVEC30分鐘，向細(xì)胞中加入VEGF然后培養(yǎng)1小時(shí)。用3.7%多聚甲醛固定所培養(yǎng)的細(xì)胞10分鐘，用0.5%TritonX-100處理5分鐘，并用3%BSA封閉1小時(shí)。然后，將所述細(xì)胞與樁蛋白抗體反應(yīng)2小時(shí)，并向其加入綴合有羅丹明的第二抗體和鬼筆環(huán)肽-FITC，隨后反應(yīng)1小時(shí)并使用共聚焦顯微鏡觀察。從圖9的結(jié)果可以看出，當(dāng)觀察sPTK7對(duì)FAK和樁蛋白活化的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)sPTK7抑制HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的FAK和樁蛋白的酪氨酸磷酸化。因此，可以預(yù)期sPTK7抑制粘著斑的形成和肌動(dòng)蛋白重組，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移。從這些結(jié)果可以預(yù)期，PTK7的功能性抑制將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞以及其它表達(dá)PTK7的細(xì)胞類型中細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞粘附的抑制。實(shí)施例9:確定人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的最小活性片段為了確定人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的最小活性區(qū)域，構(gòu)建了sPTK7的缺失突變體。具體來說，如圖l所示，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別突變pcDNA3.1-hPTK7-Igl3-His[表達(dá)從第一個(gè)Ig環(huán)至第三個(gè)Ig環(huán)和第四個(gè)Ig環(huán)的一部分(SEQIDNO:2氨基酸31-344的氨基酸序列)以及His標(biāo)簽、pcDNA3.1-hPTK7-Igl4-His[表達(dá)從第一個(gè)Ig環(huán)至第四個(gè)Ig環(huán)和第五個(gè)Ig環(huán)的一部分(SEQIDNO:2氨基酸31-436的氨基酸序列)以及His標(biāo)簽和pcDNA3.1-hPTK7-Igl5-His[表達(dá)從第一個(gè)Ig環(huán)至第五個(gè)Ig環(huán)和第六個(gè)Ig環(huán)的一部分(SEQIDNO:2氨基酸31-528的氨基酸序列)以及His標(biāo)簽]，使它們?cè)谧钅┟艽a子后帶有His標(biāo)簽密碼子和翻譯終止密碼子。如下構(gòu)建pcDNA3.1-hPTK7-Igl4-His。進(jìn)行PCR擴(kuò)增以使上述構(gòu)建的人sPTK7表達(dá)載體(pcDNA3-hPTK7-Ext-His)中包含與人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域第五個(gè)Ig環(huán)的前端部分第436位氨基酸連接的編碼His標(biāo)簽的序列和翻譯終止密碼子。針對(duì)第五個(gè)Ig環(huán)前端部分的PCR引物對(duì)是5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，(pcDNA3載體的863-882位核苷酸的T7啟動(dòng)子序列)和5，畫GC7T7Ma4TCAATGATGATGATGATGATGCTGGGTCAGGCAATCCAA-3，[SEQIDNO:1的1453-1470位核普酸序列、編碼His標(biāo)簽的序列(標(biāo)有下劃線的字母)、終止密碼子和AT^iI位點(diǎn)(斜體字母)。隨后，與實(shí)施例2類似地用和消化PCR產(chǎn)物并將其連接至經(jīng)和AT^iI消化的pcDNA3.1載體中，從而構(gòu)建表達(dá)人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)Ig環(huán)至第四個(gè)Ig環(huán)和第五個(gè)Ig環(huán)的一部^KSEQIDNO:2氨基酸1-436的氨基酸序列)以及His標(biāo)簽的pcDNA3.1-hPTK7-Igl4-His質(zhì)粒。以類似方法構(gòu)建其余的質(zhì)粒。利用PCR將pcDNA3.1-hPTK7-Igl4s-His[表達(dá)從第一個(gè)Ig環(huán)至第四個(gè)Ig環(huán)(SEQIDNO:2氨基酸31-409)以及His標(biāo)簽的序列，其不含第五個(gè)Ig環(huán)的前端部分刪除來自質(zhì)粒pcDNA3.1-hPTK7-Igl4-His的SEQIDNO:1的1390-1470位核普酸。PCR的引物對(duì)是5，-CATCACTGTGGCCCATCATCATCATCATCATTGArC7MG^GGGCC-3，[SEQIDNO:1的1377-1389位核普酸序列、編碼His標(biāo)簽的序列(標(biāo)有下劃線的字母)、終止密碼子和Xbal位點(diǎn)(斜體字母)以及pcDNA3.1載體的997-1001位核苷酸序列(黑體字母)和5，-GATGATGATGATGGGCCACAGTGATGTTGACATCCTGTCTC-3，(編碼His標(biāo)簽之序列的一部分(標(biāo)有下劃線的字母)和SEQIDNO:1的1362-1389位核普酸序列)。用Dpnl處理該P(yáng)CR產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌林XL1-Blue。篩選并培養(yǎng)克隆以獲得帶有所需核苷酸缺失的質(zhì)粒。通過雙向測(cè)序未在所構(gòu)建的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。與實(shí)施例3類似地表達(dá)并純化本實(shí)施例中構(gòu)建的人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-hPTK7國Igl3-His、pcDNA3.1畫hPTK7-Igl4s-His、pcDNA3.1-hPTK7隱Igl4-His和pcDNA3.1-hPTK7-Igl5-His),從而得到如圖l所示的PTK7-Igl3-His(人PTK7的氨基酸31-344的氨基酸序列)、PTK7-Igl4s-His(人PTK7的氨基酸31-409的氨基酸序列)、PTK7-Igl4-His(人PTK7的氨基酸31-436的氨基酸序列)以及PTK7-Igl5-His(人PTK7的氨基酸31-528的氨基酸序列)。為了研究如此得到的PTK7-Igl3-His、PTK7-Igl4s-His、PTK7-Igl4-His和PTK7-Igl5-His是否影響細(xì)胞遷移，以與實(shí)施例6中同樣的方式測(cè)定細(xì)胞遷移。從圖10的結(jié)果可以看出，與未用VEGF和sPTK7或其片段進(jìn)行處理時(shí)相比，當(dāng)僅用VEGF處理細(xì)胞時(shí)HUVEC的遷移增加3.3倍。PTK7-Igl3-His并未以劑量依賴性方式降低細(xì)胞遷移，而PTK7國Igl4s國His、PTK7-Igl4誦His、PTK7畫Igl5畫His和sPTK7則表現(xiàn)出相似水平的劑量依賴性細(xì)胞遷移降低。使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，針對(duì)未經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，/><0.001。針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，PTK7-Igl3-His顯示尸<0.01;而針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照，PTK7國Igl4s-His、PTK7畫Igl4-His、PTK7-Igl5-His和sPTK7顯示i<0.001。因此，證實(shí)PTK7-Igl4s-His包含了人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的最小活性片段，并且存在完整形式的人PTK7胞外結(jié)構(gòu)域第四個(gè)Ig環(huán)(人PTK7氨基酸327-409的氨基酸序列)對(duì)于PTK7功能來說是重要的。實(shí)施例10:通過RNA干擾(RNAi)敲低PTK7來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生和Akt磷酸化本實(shí)施例意在證實(shí)，除了sPTK7處理以外，RNA干擾是否可用作另一種能夠阻斷PTK7功能的方法。具體來說，通過用PTK7的小干擾RNA(siRNA)處理或者用表達(dá)PTK7siRNA的PTK7小發(fā)夾RNA(shRNA)載體處理來誘導(dǎo)RNA干擾，從而敲低PTK7的表達(dá)，然后檢測(cè)PTK7敲低對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生和Akt磷酸化的作用。如下在HUVEC中使用PTK7siRNA進(jìn)行PTK7敲低。在6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HUVEC。將培養(yǎng)基用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEMI，Invitroge)替換之后，培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，以備使用Lipofectamine(Invitrogen)將100nMsiRNA(ON國TARGETplus系列J誦003167-13、J國003167-14、J國003167國15和J-003167-16,Dharmacon有售)或其混合物(參見圖11)轉(zhuǎn)染進(jìn)其中。用含有20%(重量/體積)FBS、3ng/mlbFGF(UpstateBiotechnology)和5單位/ml肝素的M199培養(yǎng)基(Invitrogen)替換培養(yǎng)基，并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的HUVEC48小時(shí)。從HUVEC中PTK7敲低程度的測(cè)定結(jié)果可見，與陰性對(duì)照相比，相應(yīng)的PTK7-siRNA(即J-003167-14、J-003167-15、J-003167-16和PTK7siRNA混合物)導(dǎo)致PTK7表達(dá)降低70%或以上，因此表明這些PTK7siRNA的敲低效率很高(參見圖12)'同時(shí)，如下使用PTK7shRNA載體在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行PTK7敲低。4吏用磷酸釣法，用5pgMissionTRCshRNA載體(MissionTRCshRNA文庫TRCN0000006431、TRCN0000006432、TRCN0000006433、TRCN0000006434和TRCN0000006435，Sigma-Aldrich有售，參見圖13)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6cm培養(yǎng)皿上的HEK293細(xì)胞。12小時(shí)后，用含有10%FBS、100單位/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素的DMEM(Invitrogen)替換培養(yǎng)基，并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞48小時(shí)。從用相應(yīng)的PTK7shRNA載體在HEK293細(xì)胞中的PTK7敲低程度的測(cè)定結(jié)果可見，與陰性對(duì)照相比，尤其是TRCN0000006433和TRCN0000006434顯示出PTK7表達(dá)降低70%或以上，因此表明這些PTK7shRNA載體的PTK7敲低效果很好(參見圖14)。與上述類似地，使用PTK7siRNA混合物來測(cè)定PTK7敲低對(duì)細(xì)胞功能的作用。圖15顯示PTK7敲低對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管發(fā)生的作用。將PTK7敲低的HUVEC置于無生長因子Matrigel上培養(yǎng)16小時(shí)，隨后對(duì)新形成的血管進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用Studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，針對(duì)未經(jīng)VEGF處理的對(duì)照(模擬轉(zhuǎn)染)，"戶<0.01以及悄戶<0.001;針對(duì)經(jīng)VEGF處理的對(duì)照(模擬+VEGF),"》<0.001。從圖15的結(jié)果可以看出，用VEGF處理模擬轉(zhuǎn)染的HUVEC顯示出血管發(fā)生增加45%，對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC也表現(xiàn)出與模擬轉(zhuǎn)染HUVEC水平22相似的VEGF所誘導(dǎo)的血管發(fā)生，而PTK7敲低的HUVEC表現(xiàn)出對(duì)VEGF所誘導(dǎo)血管發(fā)生的抑制。在類似于血管發(fā)生測(cè)定的Akt磷酸化測(cè)定中，用VEGF處理模擬轉(zhuǎn)染的HUVEC也導(dǎo)致Akt磷酸化增強(qiáng)，并且對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC也表現(xiàn)出與模擬轉(zhuǎn)染HUVEC水平相似的Akt磷酸化，而PTK7敲低的HUVEC表現(xiàn)出對(duì)VEGF所資導(dǎo)Akt磷酸化的抑制。通過觀察，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中PTK7敲低顯示出與sPTK7處理同樣的作用，證實(shí)sPTK7阻斷內(nèi)源性PTK7的功能從而抑制細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生。實(shí)施例11:利用PTK7抗體功能性抑制PTK7從而在血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制Akt磷酸化本實(shí)施例意在證實(shí)，除了sPTK7之外，PTK7抗體是否可用作另一種能夠阻斷PTK7功能的方法。如先前實(shí)施例所示，當(dāng)通過sPTK7處理抑制PTK7的功能時(shí)，降低了細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生并減少了Akt磷酸化。為此，使用sPTK7抗體進(jìn)行處理，并測(cè)定了sPTK7抗體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化的作用。為了觀察sPTK7抗體對(duì)HUVEC中Akt磷酸化的作用，在饑俄處理完成30分鐘前添加2fig/mlsPTK7抗血清并培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后添加10ng/mlVEGF并培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘。通過將如實(shí)施例10純化的sPTK7注射兔子來構(gòu)建PTK7抗血清，并在證實(shí)其特異性識(shí)別PTK7之后使用。用PBS洗滌培養(yǎng)完畢的細(xì)胞，與實(shí)施例8的步驟類似地用120pi/60mm平板的免疫沉淀測(cè)定緩沖液裂解細(xì)胞，隨后離心以獲得上清液。然后，對(duì)細(xì)胞裂解上清液進(jìn)行Western印跡。圖16顯示PTK7抗血清對(duì)HUVEC中VEGF所誘導(dǎo)Akt磷酸化的作用。觀察到所述sPTK7抗血清抑制VEGF資導(dǎo)的Akt磷酸化。所述sPTK7抗血清表現(xiàn)出與sPTK7處理中相似的作用，從而表明sPTK7抗血清包含PTK7中和性多克隆抗體，從而抑制PTK7的功能。因此，PTK7中和性單克隆抗體以及PTK7中和性多克隆抗體抑制PTK7的功能，所以它們可作為細(xì)胞遷移、侵襲和血管發(fā)生的抑制方法。通過本發(fā)明實(shí)施例可以看出，除了sPTK7處理、PTK7敲低和PTK7中和抗體處理外，替代性的方法(例如抑制PTK7功能的sPTK7表達(dá)、PTK7中和適配體處理等)也可抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲，并可以阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能來抑制血管發(fā)生。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲或血管發(fā)生的抑制劑可用于治療多種與細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管發(fā)生有關(guān)的疾病(包括轉(zhuǎn)移性癌)。靶細(xì)胞不僅限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，所以本發(fā)明適用于多種表達(dá)PTK7的細(xì)胞來抑制細(xì)胞遷移、侵襲和粘附。權(quán)利要求1.抑制PTK7功能的細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求l的抑制劑，其中所述抑制劑包含具有PTK7胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性PTK7片段。3.根據(jù)權(quán)利要求2的抑制劑，其中所述可溶性PTK7片段包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或者排除氨基酸殘基1-30之外的SEQIDNO:2的衍生序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2的抑制劑，其中所述可溶性PTK7的最小活性片段是SEQIDNO:2之人PTK7的氨基酸31-409或氨基酸327-409的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求l的抑制劑，其中所述抑制劑包含介導(dǎo)對(duì)編碼PTK7之信使RNA(mRNA)發(fā)生特異性RNA干擾(RNAi)的小RNA序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5的抑制劑，其中所述小RNA序列是與編碼PTK7的mRNA序列形成互補(bǔ)鍵以抑制PTK7mRNA表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)，或者是包含所述siRNA序列的小發(fā)夾RNA(shRNA)。7.根據(jù)權(quán)利要求l的抑制劑，其中所述抑制劑是與PTK7特異性結(jié)合從而抑制PTK7活性的PTK7中和抗體。8.才艮據(jù)權(quán)利要求7的抑制劑，其中所述中和抗體識(shí)別SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求2的抑制劑，其中所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及利用功能性抑制PTK7的細(xì)胞遷移、侵襲或血管發(fā)生的抑制劑。本發(fā)明涉及PTK7的功能性抑制，由此抑制了VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞粘附，以及抑制了PI3激酶和Akt的活化。此外，本發(fā)明能夠通過抑制FAK和樁蛋白的活化而在體內(nèi)有效抑制血管發(fā)生、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲。文檔編號(hào)A61K38/16GK101678075SQ200980000012公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2009年3月16日優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日發(fā)明者孟龍善,權(quán)寧根,李升澤,申元湜申請(qǐng)人:延世大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)