專利名稱：胰腺癌的免疫療法藥物以及免疫療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于胰腺癌患者的、使用了免疫療法藥物的免疫療法藥物以及免疫療 法。該免疫療法藥物以源自患者自身的外周血淋巴細(xì)胞所培養(yǎng)的活化淋巴細(xì)胞為主成分， 在活化淋巴細(xì)胞中包含高比率的⑶3TD56+NK細(xì)胞。
背景技術(shù)：
各種針對(duì)癌癥的免疫療法是公知方法。尤其是，過繼免疫療法，通過用抗體刺激患 者自身的外周血淋巴細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖，由此活化淋巴細(xì)胞。然后，活化淋巴細(xì) 胞作為所謂的免疫療法藥物對(duì)該患者進(jìn)行給藥?；罨馨图?xì)胞具有免疫應(yīng)答功能?；罨?巴細(xì)胞中包含對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞殺傷活性的T細(xì)胞和NKfcatural killer 自然殺傷細(xì) 胞)細(xì)胞。NK細(xì)胞是人的外周血淋巴細(xì)胞中含有10 20%的大顆粒淋巴細(xì)胞。活化的NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等具有非特異性的細(xì)胞殺傷活性或抗體依賴性細(xì)胞殺傷 活性(ADCC)。非特異性的NK細(xì)胞不需要像T細(xì)胞和B細(xì)胞那樣通過抗原來致敏。因而， NK細(xì)胞一被癌組織誘導(dǎo)就直接分子特異性地攻擊腫瘤細(xì)胞?；罨腘K細(xì)胞的表面表達(dá)出 能以腫瘤細(xì)胞為靶的 NKG2D、TRAIL(TNF Related Apoptosis Inducing Ligand 腫瘤壞死 因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)等表面受體。專利文獻(xiàn)1 4公開了選擇性地使外周血淋巴細(xì)胞中含有的各種細(xì)胞增殖的培養(yǎng) 方法。專利文獻(xiàn)1 3涉及以比較高的比例使NK細(xì)胞增殖的方法。專利文獻(xiàn)4涉及NK細(xì) 胞的比例極少或幾乎不含有NK細(xì)胞的方法。專利文獻(xiàn)1 日本特許第3056230號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開2002-45174號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開2006-340698號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本特許第3951350號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 =Heinemann V, et al. BMC Cancer (BMC 癌癥)2008,8 :82非專利文獻(xiàn)2 Tanaka T，et al Jpn J Clin Oncol (臨床腫瘤學(xué)雜志)2008，38 755非專利文獻(xiàn) 3 =Okusaka T, et al. Cancer Chemother Pharmacol 2008,61 :615# 專禾I」JC ^ 4 Strumberg D, et al. 2009 Gastrointestinal Cancers Symposium, Abstract#195非專利文獻(xiàn) 5 =Nakamura K, et al. Br J Cancer 2006,94 :1575非專利文獻(xiàn)6 =Ueno H, et al. 2007ASC0, Abstract#4550非專利文獻(xiàn)7 :Lee G, et al. 2008ASC0, Abstract#15577非專利文獻(xiàn)8 :Kim MY, et al. Jpn J Clin Oncol 2009,39 :49

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題專利文獻(xiàn)1中記載了 3例使用培養(yǎng)的活化淋巴細(xì)胞的免疫療法。其對(duì)象是惡性黑 色素瘤或肝癌。專利文獻(xiàn)2中，使用培養(yǎng)時(shí)采用的增殖刺激用抗體，測(cè)定對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 殺傷活性。但是，并未記載對(duì)患者使用的實(shí)際的應(yīng)用例。另外，各種對(duì)癌癥的免疫療法中， 除了使用以NK細(xì)胞為主體的淋巴細(xì)胞的方法以外，也有使用以T細(xì)胞等為主體的淋巴細(xì)胞 的方法(專利文獻(xiàn)4)等。但是，對(duì)胰腺癌有效的免疫療法還未有人提出。胰腺癌是起因于胰腺的結(jié)構(gòu)，臟器 的上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的癌容易浸潤(rùn)至臟器外部，并且，容易轉(zhuǎn)移至全身的癌癥。因此，在診斷 為胰腺癌的時(shí)候經(jīng)常已發(fā)展成晚期癌癥。結(jié)果，與胃癌和大腸癌等相比，能夠切除的病例要 少兩成左右，手術(shù)后的生存率也低。順便說一下，非專利文獻(xiàn)1 8報(bào)告了對(duì)胰腺癌患者僅 用抗癌藥進(jìn)行治療時(shí)的診斷后1年中的生存率。這些生存率除了非專利文獻(xiàn)5中達(dá)到
以外，幾乎都在15 33%的范圍內(nèi)。胰腺癌是預(yù)后極差的代表性癌癥。這樣，由于胰腺癌發(fā)展極快，因此，即使是對(duì)胰臟以外的臟器的癌癥有效的免疫療 法，也不能說對(duì)胰腺癌是有效的。本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)胰腺癌有效的免疫療法藥物 以及免疫療法。解決問題的手段本發(fā)明的胰腺癌的免疫療法中使用的免疫療法藥物具有以下構(gòu)成。本發(fā)明的免疫療法藥物是通過利用抗CD3抗體和抗CD52抗體對(duì)胰腺癌患者的自 身外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激來培養(yǎng)得到的免疫療法藥物。本發(fā)明的胰腺癌的免疫療法具有通過利用抗CD3抗體和抗CD52抗體對(duì)胰腺癌患 者的自身外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激來培養(yǎng)得到免疫療法藥物的步驟；將得到的免疫療法藥 物對(duì)胰腺癌患者至少給藥4次的步驟。免疫療法每一次的給藥量包含至少15 X IO9個(gè)活化 淋巴細(xì)胞。這些活化淋巴細(xì)胞中⑶3TD56+NK細(xì)胞的比率至少是30%。此外，對(duì)處于以下 的(a) (d)所構(gòu)成的免疫低下狀態(tài)的組中的至少一個(gè)狀態(tài)的患者開始進(jìn)行免疫療法藥物 的給藥。(a)外周血中的淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于1000/μ 1。(b)外周血中的淋巴細(xì)胞中⑶3TD56+NK細(xì)胞的數(shù)量小于200/μ 1。(c)外周血中的⑶3XD56+NK細(xì)胞的活性小于30%。(d)外周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于400/μ 1。此外，對(duì)外周血中的⑶4+淋巴細(xì)胞與⑶8+淋巴細(xì)胞之比超過3的胰腺癌患者開始 給藥上述免疫療法藥物是合適的。另外，給藥的活化淋巴細(xì)胞的其余部分為⑶4+Τ細(xì)胞及⑶8+Τ細(xì)胞之中的任一種或 這兩種，這是合適的。另外，將免疫療法藥物與抗癌藥并用是合適的。發(fā)明效果發(fā)明人在專利文獻(xiàn)3中公開了由30ml左右的外周血來大量增殖⑶16+NK細(xì)胞的 培養(yǎng)技術(shù)。CD16+NK細(xì)胞與CD3—CD56+NK細(xì)胞等同。本發(fā)明的免疫療法中使用的免疫療法藥 物以通過基于該培養(yǎng)技術(shù)的大量培養(yǎng)方法所得到的活化淋巴細(xì)胞為主成分。該活化淋巴細(xì)胞與通常的外周血淋巴細(xì)胞相比，包含高比率的活化NK細(xì)胞，即⑶3XD56+NK細(xì)胞。無論有無手術(shù)，多數(shù)胰腺癌患者被施以利用抗癌藥的治療。僅使用抗癌藥的治療 的開始后ι年間的生存率(以下稱作“1年生存率”)，基本在15 33%的范圍內(nèi)(非專利 文獻(xiàn)1 8)。與此相對(duì)，實(shí)施了本發(fā)明的免疫療法的27個(gè)病例所構(gòu)成的實(shí)施例中，得到了 63%這樣的高的1年生存率。這對(duì)發(fā)展快速的胰腺癌來說是突破性的結(jié)果。這些實(shí)施例 中，從免疫療法開始后的生存期間來看，并用抗癌藥的病例與僅使用免疫療法的情況相比， 得到了更好的結(jié)果。本發(fā)明的免疫療法，通過將含有高比率的活化NK細(xì)胞的免疫療法藥物，應(yīng)用于特 定的給藥量和特定的對(duì)象患者(處于特定的免疫低下狀態(tài)的胰腺癌患者)，實(shí)現(xiàn)了使其生 存率大幅度提高的效果。實(shí)現(xiàn)的生存率的高比率顯著超過胰腺癌以往預(yù)測(cè)的范圍。這里，對(duì)患者自身外周血進(jìn)行培養(yǎng)所得到的活化淋巴細(xì)胞數(shù)量及其中所含的NK 細(xì)胞的比率，存在個(gè)人差異非常大的問題。另外，即使活化淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及NK細(xì)胞的 比率相同，也存在其效果的個(gè)體差異大的問題。因而，難以表示出對(duì)每個(gè)人都能確實(shí)得到效 果的給藥條件的明確邊界值。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，設(shè)定以下的免疫療法的給藥條件和患者條件是有效的，S卩，不以個(gè)人 為單位而是在患者集體中以統(tǒng)計(jì)上的高概率得到良好結(jié)果的免疫療法的給藥條件和患者 條件。作為本發(fā)明免疫療法特征的給藥條件和患者條件，具有作為能以統(tǒng)計(jì)上的高概率大 幅延長(zhǎng)胰腺癌診斷后的總生存期的指標(biāo)的意義。在本發(fā)明中，基于包含27個(gè)病例的實(shí)施例的中位數(shù)，特別指定給藥條件和患者的 免疫狀態(tài)條件。上述的1年生存率為63%，這是由全部實(shí)施例得到的效果。因而，如果以 全部實(shí)施例的中位數(shù)以上的條件進(jìn)行免疫療法藥物的給藥的話，則能夠預(yù)期統(tǒng)計(jì)上得到更 高的1年生存率。另外，在全部實(shí)施例中，也包含不并用抗癌藥而僅應(yīng)用本發(fā)明的免疫療法 藥物的病例。因而，如果一定并用抗癌藥的話，則可預(yù)期能夠在統(tǒng)計(jì)上得到更高的1年生存 率?？梢哉f確保實(shí)現(xiàn)了 1年生存率至少是63%。在該意思中，本說明書中記載的本發(fā)明的“實(shí)施例”的概念與通常的實(shí)施例的概念 略微不同。通常，所說的實(shí)施例是符合專利權(quán)利要求保護(hù)范圍的必要條件的例子。但是，在 本發(fā)明中，基于“實(shí)施例”的中位數(shù)，將其中位數(shù)以上的條件設(shè)定為專利權(quán)利要求保護(hù)范圍 的必要條件。結(jié)果，本發(fā)明的“實(shí)施例”中，也包含未必符合專利權(quán)利要求保護(hù)范圍的必要 條件的例子(相當(dāng)于小于中位數(shù)的條件)。這些病例也許可說成是參考例，但也是為了確定 中位數(shù)而必要的病例。因此，在本說明書中，將為設(shè)定專利權(quán)利要求保護(hù)范圍的必要條件而 實(shí)施的全部病例稱作“實(shí)施例”。對(duì)于發(fā)展快的胰腺癌的癌組織或者對(duì)于免疫機(jī)能低下的生物體，需要給予很大的 免疫影響。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有效的做法是，在免疫療法中一次性地給藥盡量大量的活化淋巴細(xì) 胞，給藥的活化淋巴細(xì)胞至少含有30%的⑶3TD56+NK細(xì)胞，并且至少給藥4次。免疫療法 藥物的每一次的給藥量所含有的有效果的活化細(xì)胞數(shù)量至少是15X109個(gè)。這對(duì)于以往的 免疫療法而言，相當(dāng)于通常給藥的活化淋巴細(xì)胞數(shù)量的3倍以上。在被給藥的胰腺癌患者處于免疫狀態(tài)低于健康人的情況下，可看出免疫狀態(tài)的大 幅改善。所說的低的免疫狀態(tài)是指符合以下狀態(tài)中的至少一種狀態(tài)的情況(a)外周血中 的淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于1000/μ 1的狀態(tài)；(b)外周血中的淋巴細(xì)胞之中⑶3—CD56+NK細(xì)胞數(shù)量小于200/μ 1的狀態(tài)；(c)外周血中的CD3TD56+NK細(xì)胞的活性小于30%的狀態(tài)；(d)外 周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于400/μ 1的狀態(tài)。通過對(duì)患者的外周血采血并測(cè)定它 們的免疫狀態(tài)，能夠判定本發(fā)明的免疫療法的開始時(shí)期，即免疫療法藥物的給藥開始時(shí)期。尤其是在患者的免疫狀態(tài)低下，且達(dá)到上述(a) (d)中任一個(gè)范圍的邊界值的 時(shí)刻，開始治療是最理想的。在患者的免疫狀態(tài)被維持在與健康人相同程度的情況下，認(rèn)為 由給藥免疫療法藥物所引起的免疫影響少(其中，由于原本良好地維持免疫狀態(tài)，因此在 結(jié)果上，生存期間成為長(zhǎng)期的比例多)。另一方面認(rèn)為，伴隨著患者全身狀態(tài)的惡化而免疫 狀態(tài)較之邊界值大幅降低的情況下，開始免疫療法往往已經(jīng)過遲了。另外，外周血中的⑶4+淋巴細(xì)胞和⑶8+淋巴細(xì)胞之比超過3也是免疫低下狀態(tài)的 判斷指標(biāo)之一。此外，給藥的淋巴細(xì)胞的其余部分是⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞中的任一種或這兩 者，由此，可獲得與CD3—CD56+NK細(xì)胞協(xié)同的改善效果。這是因?yàn)?，具有?xì)胞殺傷活性的 NKG2D+淋巴細(xì)胞中，除了 NK細(xì)胞以外，也包含一部分⑶8+T細(xì)胞。


圖1是表示免疫療法中使用的本發(fā)明的免疫療法藥物即活化淋巴細(xì)胞的流式細(xì) 胞儀的測(cè)定結(jié)果的圖。圖2是就實(shí)施例和適合例分別對(duì)表7的給藥淋巴細(xì)胞數(shù)量繪圖而制得的圖。圖3是就實(shí)施例和適合例分別對(duì)表7的NK細(xì)胞比率繪圖而制得的圖；圖4是對(duì)表6的比較例(健康人)的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、表8的實(shí)施例(胰腺癌 患者總體)以及適合例(長(zhǎng)期生存者)的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行繪圖而制得的圖；圖5是對(duì)表6的比較例(健康人)的NK細(xì)胞數(shù)量、表8的實(shí)施例(胰腺癌患者總 體)以及適合例(長(zhǎng)期生存者)的NK細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行繪圖而制得的圖；圖6是對(duì)表6的比較例(健康人)的NK活性、表8的實(shí)施例(胰腺癌患者總體) 以及適合例(長(zhǎng)期生存者)的NK活性分別進(jìn)行繪圖而制得的圖；圖7是對(duì)表6的比較例(健康人)的NKG2D+細(xì)胞數(shù)量、表9的實(shí)施例(胰腺癌患 者總體)以及適合例(長(zhǎng)期生存者)的NKG2D+細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行繪圖而制得的圖；圖8是對(duì)表6的比較例(健康人)的⑶4/⑶8比、表9的實(shí)施例(胰腺癌患者總 體)以及適合例(長(zhǎng)期生存者)的⑶4/⑶8比分別進(jìn)行繪圖而制得的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的免疫療法藥物含有的主成分是對(duì)胰腺癌患者自身的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn) 行培養(yǎng)增殖而得到的活化淋巴細(xì)胞。使用該免疫療法藥物進(jìn)行免疫治療?；罨馨图?xì)胞之 中含有活化NK細(xì)胞。這些活化NK細(xì)胞通過⑶3_和⑶56+的表面標(biāo)記被識(shí)別。對(duì)外周血淋 巴細(xì)胞應(yīng)用專利文獻(xiàn)3中記載的培養(yǎng)增殖方法，由此，能夠以高比率獲得⑶3XD56+NK細(xì)胞。圖1表示一個(gè)實(shí)施例中使用的免疫療法藥物的流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果。橫軸 FLl-H表示表面標(biāo)記⑶3的熒光強(qiáng)度，縱軸FL2-H表示表面標(biāo)記⑶56的熒光強(qiáng)度。用圓 圍住的部分表示CD3TD56+NK細(xì)胞的存在。該測(cè)定結(jié)果中，活化淋巴細(xì)胞包含約45 %的 ⑶3XD56+NK細(xì)胞。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后的活化淋巴細(xì)胞所含有的⑶3XD56+NK細(xì)胞比率中，存在較大的個(gè)體差異。在后述的實(shí)施例中，⑶3TD56+NK細(xì)胞比率分散于10 70%的范 圍內(nèi)。對(duì)各患者來看，培養(yǎng)后的⑶3XD56+NK細(xì)胞比率比該患者的培養(yǎng)前的NK細(xì)胞比率有 所增高。圖1的流式細(xì)胞儀中的中央下側(cè)的另一點(diǎn)群表示活化T細(xì)胞?；罨疶細(xì)胞主要由 ⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞構(gòu)成。本發(fā)明的免疫療法藥物也可以在胰腺癌診斷之后單獨(dú)應(yīng)用。但是，已經(jīng)明確的是， 通過并用本發(fā)明的免疫療法藥物和抗癌藥，能得到更大的效果。每一次的給藥量所含有的活化淋巴細(xì)胞的數(shù)量?jī)?yōu)選至少為15X IO9個(gè)。這相當(dāng)于 在通常的免疫療法中給予的細(xì)胞數(shù)量的3倍以上。后述的實(shí)施例中的最高值約為18X109 個(gè)。給藥的活化淋巴細(xì)胞中，優(yōu)選至少含有30%的⑶3TD56+NK細(xì)胞。給藥次數(shù)至少為4次 才是有效的。此外，本發(fā)明的免疫療法藥物，對(duì)處于由以下的(a) (d)構(gòu)成的免疫低下狀態(tài)的 組中至少一種狀態(tài)的胰腺癌患者進(jìn)行給藥，是合適的。(a)外周血中的淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于1000/μ 1 ；(b)外周血中的淋巴細(xì)胞之中⑶3TD56+NK細(xì)胞數(shù)量小于200/μ 1 ；(c)外周血中的⑶3XD56+NK細(xì)胞的活性小于30% ；(d)外周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于400/μ 1。在后述的實(shí)施例中確認(rèn)為，上述(a) (d)的免疫低下狀態(tài)可以說是免疫機(jī)能比 健康人顯著低的狀態(tài)。對(duì)處于免疫低下狀態(tài)的患者，一次給藥大量的CD3—CD56+NK細(xì)胞，由 此，能夠?qū)Φ拖碌拿庖邫C(jī)能給予大的影響。包括后述的27個(gè)病例的實(shí)施例中，1年生存率為63%。該1年生存率63%較之以 往的胰腺癌的1年生存率是非常良好的效果。在本發(fā)明的免疫療法中，基于全部實(shí)施例的 中位數(shù)，分別設(shè)定每一次給藥量所含的活化淋巴細(xì)胞數(shù)量和CD3TD56+NK細(xì)胞比率。S卩，分 別設(shè)定中位數(shù)以上的范圍。因而，如果以這些中位數(shù)作為最低值來應(yīng)用本發(fā)明的免疫療法 的話，則可以預(yù)期得到比全部實(shí)施例得到的63%更高的1年生存率。這里，中位數(shù)原本是 測(cè)定值，因此，應(yīng)該嚴(yán)密地考慮有效數(shù)字。但是，在本發(fā)明中，作為用于得到更高的生存率的 “指標(biāo)”而采用了中位數(shù)，因此，與有效數(shù)字無關(guān)而采用概算的數(shù)值。此外，對(duì)外周血中的⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞之比超過3的患者給藥是合適的。 CDS+T細(xì)胞的減少也是免疫低下狀態(tài)的指標(biāo)之一。因而，在胰腺癌患者中，具有CD4+T細(xì)胞 和⑶8+T細(xì)胞之比的數(shù)值比健康人大的傾向。在長(zhǎng)期生存者(免疫療法開始后生存10個(gè)月以上)中，可以看出在給藥前后，外 周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。此外，也可以看出外周血中的淋巴細(xì)胞數(shù)量的 增加、NK細(xì)胞數(shù)量的增加、NK活性的增大以及CD4/CD8比的降低。在短期生存者(免疫療 法開始后5個(gè)月內(nèi)死亡)中，在給藥前后這些參數(shù)沒有顯著性差異。從這些事實(shí)推測(cè)出，通 過免疫療法藥物的給藥使得患者從免疫低下狀態(tài)快速地增強(qiáng)免疫機(jī)能，這與生存期間的延 長(zhǎng)相關(guān)。除了末期狀態(tài)的患者，由免疫療法所帶來的免疫機(jī)能的快速增強(qiáng)的程度，存在較 大的個(gè)體差異。因而，難以示出每個(gè)人確實(shí)得到效果的給藥條件和患者的免疫狀態(tài)條件的 明確的邊界值。但是，如果按照上述給藥條件和患者免疫狀態(tài)條件來給藥免疫療法藥物的話，在統(tǒng)計(jì)上以概率來計(jì)，可預(yù)期得到比63%高的1年生存率。這是因?yàn)?，就上述給藥條件 和患者免疫狀態(tài)條件而言，是將表示1年生存率63%的實(shí)施例的集體中的中位數(shù)設(shè)定成了 最低值。實(shí)施例(1)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)增殖方法通過以下工序，進(jìn)行胰腺癌患者的自身外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)增殖。工序1:使抗 CD3 抗體(0. 1 μ 1/ml, Orthoclone 0KT3,可從 JANSSENPHARMACEUTICAL K. K.購(gòu)得)和抗 CD52 抗體 QO 40 μ 1/ml，MABCAMPATH，可從拜 耳公司購(gòu)得)溶解于磷酸緩沖液(PBS) 20ml中。工序2 將工序1的溶液裝入225cm2的燒瓶中，在4°C靜置一夜。工序3 對(duì)固相化的抗⑶3抗體和抗⑶52抗體用PBS洗滌2次。工序4:從胰腺癌患者身上采取加肝素的外周血30ml，通過采用安瑪西亞 (Ficoll-Paque Plus)(可從安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham PharmaciaBiotech)有限 公司購(gòu)得)作為介質(zhì)的密度梯度離心法，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。工序5 使工序4中分離的PBMC以0. 5 1 X 106/ml的濃度懸浮于含有IL-2 (500 單位/ml，可從Chiron公司購(gòu)得)的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基KBM-NKCGM-1 (可從K0HJINBI0公司 購(gòu)得)，進(jìn)一步加入患者血漿2 10%，制成培養(yǎng)液。在該階段，培養(yǎng)液為60 120ml。將 該培養(yǎng)液添加于對(duì)工序3中得到的處理過固相化抗體的培養(yǎng)燒瓶。然后，在5% CO2培養(yǎng)器 內(nèi)，37°C的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。這里，患者血漿也可以用由健康人獲得的血清來代替。工序6 從培養(yǎng)開始后的第3 5天，確認(rèn)出生成多個(gè)集落，母細(xì)胞化(blast化)， 進(jìn)一步追加20 100%的培養(yǎng)液，添加500單位/ml的IL-2。通常，這個(gè)時(shí)期是培養(yǎng)開始 后的第3天。工序7 在工序6中追加培養(yǎng)液后進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期的第1 3天(多數(shù)是第1天)， 向KBM-NKCGM-1B ( 一升裝的包)中注入包含活化淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液。通常，將其分注于2 3包。分注后間隔3 4天，在每包中添加100 300ml的KBM-NKCGM-1以及10 20萬單 位的IL-2。工序8 在培養(yǎng)開始第14 21天(由于22天以上時(shí)往往活性降低)，將培養(yǎng)液從 包中移至離心管，在600G下將其離心10分鐘。從離心管中抽吸上清液，殘留顆粒。然后， 對(duì)顆粒加入PBS進(jìn)行洗滌，再次進(jìn)行離心操作。該操作重復(fù)2 3次，充分洗滌培養(yǎng)的淋巴 細(xì)胞。最后，收集顆粒，使其懸浮于生理鹽水IOOml中，在其中添加2 4%的人血清白蛋 白。最后，確認(rèn)無菌檢測(cè)和內(nèi)毒素檢測(cè)為陰性。(這里，得到的淋巴細(xì)胞懸浮液，在制備后4小時(shí)以內(nèi)，用30 60分鐘從患者的外 周靜脈給藥。)工序9 (成分解析)對(duì)于懸浮于生理鹽水的淋巴細(xì)胞，將規(guī)定數(shù)量的細(xì)胞取入到 Eppendorf管(微量離心管)中，在其中加入規(guī)定的標(biāo)記抗體，用常規(guī)方法對(duì)細(xì)胞染色。染 色后的細(xì)胞直接用流式細(xì)胞儀解析，求出CD3—CD56+NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比率 (參照?qǐng)D1)。(2)培養(yǎng)增殖后的活化淋巴細(xì)胞的特征培養(yǎng)增殖后的活化淋巴細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀，得到如下結(jié)果。
活化淋巴細(xì)胞所含有的NK細(xì)胞以及T細(xì)胞的細(xì)胞表面上，發(fā)現(xiàn)了 CXCR3趨化因子 受體、NKG2D、TRAIL的高表達(dá)。NK細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了特異性的活化受體NKp30、NKp44、NKp46 的表達(dá)。另外，發(fā)現(xiàn)了在癌癥患者中低下或陰性化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子⑶3 ζ鏈、DAP12、Fc ε Rl 的再表達(dá)。另外，NK細(xì)胞中IFNy持續(xù)產(chǎn)生，至少3周的培養(yǎng)期內(nèi)，可維持較高的細(xì)胞殺傷 活性(通過以Κ562為靶的常用方法)。具體而言，從第21天的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中純化NK細(xì) 胞，測(cè)定該細(xì)胞殺傷活性時(shí)，50% lysis的E/T比為1. 07，為高活性(越是低的值，表示越是 高活性)。順便提一下，用CD3抗體培養(yǎng)的活化T淋巴細(xì)胞，是71. 45。(3)對(duì)胰腺癌患者的給藥方法上述淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)增殖方法的工序8之后，在4個(gè)小時(shí)以內(nèi)，將懸浮于生理鹽水 的淋巴細(xì)胞，用30 60分鐘從患者的外周靜脈給藥。(4)通過免疫療法治療胰腺癌患者的治療效果(4-1)總生存期和治療后生存期的結(jié)果表1的上欄表示應(yīng)用本發(fā)明的免疫療法的胰腺癌患者(實(shí)施例)的總生存期和1 年生存率的結(jié)果。以從胰腺癌的最初診斷后至2009年4月時(shí)的全部病例的診療記錄為基 礎(chǔ)。所有病例都進(jìn)行4次以上的免疫療法藥物的給藥。就給藥3次以下的其他病例而言， ECOG PS (Eastern Cooperative Oncology Groupperformance status (美國(guó)東部月中瘤協(xié)作 組體力狀態(tài))，以下簡(jiǎn)記為“PS”)為3 4，全身狀態(tài)差，是末期狀態(tài)，因此在開始免疫療法 2個(gè)月之內(nèi)死亡，所以，這樣的病例不包含于實(shí)施例中。實(shí)施例的27個(gè)病例中，有21個(gè)病例 并用了抗癌藥。6個(gè)病例沒有用抗癌藥，而僅用本發(fā)明的免疫療法進(jìn)行治療。表1的下欄的8個(gè)比較例，表示僅用抗癌藥治療的胰腺癌患者的總生存期和1年 生存率的結(jié)果(分別記載于非專利文獻(xiàn)1 8)。在比較例中使用的抗癌藥是鹽酸吉西他濱 (GEM)或S-I，或者兩者并用。如表1所示，實(shí)施例(27病例)的總生存期的中位數(shù)是14.0個(gè)月，1年生存率是 63%。與此相對(duì)，在比較例中，多數(shù)的1年生存率是在15 33%的范圍內(nèi)，最高值為 的僅有1例。在實(shí)施例27個(gè)病例中，對(duì)“有抗癌藥并用”、“無胰腺切除”、“無胰腺切除且PS 為0 1，，、“PS為2 3”以及“有轉(zhuǎn)移(stageIVb)，，的各亞組，分別算出總生存期和1年 生存率后，都得到比比較例良好的結(jié)果。由該結(jié)果證實(shí)了，通過本發(fā)明的免疫療法，以及適 當(dāng)?shù)夭⒂妹庖忒煼ê涂拱┧帲沟门c單獨(dú)給藥抗癌藥相比，可延長(zhǎng)總生存期，提高1年生存 率。
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權(quán)利要求
1.一種胰腺癌的免疫療法藥物，通過對(duì)胰腺癌患者的自身外周血淋巴細(xì)胞利用抗CD3 抗體和抗CD52抗體進(jìn)行刺激來培養(yǎng)得到，其特征在于，對(duì)所述胰腺癌患者至少給藥4次，每一次的給藥量中所含的活化淋巴細(xì)胞的數(shù)量至少 是15 X IO9個(gè)，所述活化淋巴細(xì)胞中⑶3XD56+NK細(xì)胞的比率至少是30 %，并且，對(duì)處于以下 的(a) (d)所構(gòu)成的免疫低下狀態(tài)的組中的至少一個(gè)狀態(tài)的所述胰腺癌患者開始給藥，(a)外周血中的淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于1000/μ1，(b)外周血中的淋巴細(xì)胞中CD3—CD56+NK細(xì)胞的數(shù)量小于200/μ1，(c)外周血中的⑶3TD56+NK細(xì)胞的活性小于30%，(d)外周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于400/μ1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌的免疫療法藥物，其特征在于，對(duì)外周血中的CD4+淋 巴細(xì)胞和⑶8+淋巴細(xì)胞之比超過3的患者給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌的免疫療法藥物，其特征在于，給藥的所述淋巴細(xì)胞 的其余部分是⑶4+Τ細(xì)胞和⑶8+Τ細(xì)胞中的任一種或這兩者。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌的免疫療法藥物，其特征在于，與抗癌藥并用。
5.一種胰腺癌的免疫療法，其特征在于，具有通過利用抗CD3抗體和抗CD52抗體對(duì)胰 腺癌患者的自身外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激來培養(yǎng)得到免疫療法藥物的步驟，以及將所述免 疫療法藥物對(duì)所述胰腺癌患者至少給藥4次的步驟，所述免疫療法藥物的每一次的給藥量中，含有至少15 X IO9個(gè)活化淋巴細(xì)胞，該活化淋 巴細(xì)胞中⑶3XD56+NK細(xì)胞的比率至少是30%，并且，對(duì)處于以下的(a) (d)所構(gòu)成的免 疫低下狀態(tài)的組中的至少一個(gè)狀態(tài)的所述胰腺癌患者開始該免疫療法藥物的給藥，(a)外周血中的淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于1000/μ1，(b)外周血中的淋巴細(xì)胞中CD3—CD56+NK細(xì)胞的數(shù)量小于200/μ1，(c)外周血中的⑶3TD56+NK細(xì)胞的活性小于30%，(d)外周血中的NKG2D+淋巴細(xì)胞的數(shù)量小于400/μ1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胰腺癌的免疫療法，其特征在于，對(duì)外周血中的CD4+淋巴細(xì) 胞和⑶8+淋巴細(xì)胞之比超過3的患者給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胰腺癌的免疫療法，其特征在于，給藥的所述淋巴細(xì)胞的其 余部分是⑶4+Τ細(xì)胞和⑶8+Τ細(xì)胞中的任一種或這兩者。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胰腺癌的免疫療法，其特征在于，與抗癌藥并用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種延長(zhǎng)胰腺癌患者的生存期的免疫療法藥物以及免疫療法。本發(fā)明的特征在于，具有通過利用抗CD3抗體和抗CD52抗體對(duì)胰腺癌患者的自身外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激來培養(yǎng)得到免疫療法藥物的步驟，以及將得到的免疫療法藥物對(duì)胰腺癌患者至少給藥4次的步驟，每一次的給藥量中，含有至少15×109個(gè)活化淋巴細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞中CD3-CD56+NK細(xì)胞的比率至少是30％，并且，對(duì)處于特定的多個(gè)免疫低下狀態(tài)中的至少一個(gè)狀態(tài)的胰腺癌患者開始給藥。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102083448SQ200980000388
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者益山純一 申請(qǐng)人:株式會(huì)社賽力克斯, 益山純一