專利名稱：用于改善瘤胃發(fā)酵的檸檬類黃酮混合物的制作方法
用于改善瘤胃發(fā)酵的檸檬類黃酮混合物描述本發(fā)明涉及檸檬類黃酮混合物用于改善瘤胃發(fā)酵的用途。MMVFA揮發(fā)性脂肪酸ACt擴(kuò)增循環(huán)的增加Δ Δ Ct相對于PCR中的對照樣品的擴(kuò)增循環(huán)的增加DGGE變性梯度凝膠電泳Μ. elsdenii 埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)ns不顯著PCR聚合酶鏈反應(yīng)S. bovis牛鏈球菌(Streptococcus bovis)哺乳動物不具有用于消化結(jié)構(gòu)性碳水化合物，即纖維素的合適的消化酶。因此，并 且為了獲取這樣重要的營養(yǎng)素來源，草食動物已經(jīng)構(gòu)筑了容納能夠消化或發(fā)酵這樣的營養(yǎng) 素的共生菌群的發(fā)酵隔室。這些隔室位于宿主中的酶消化之前(反芻動物)或之后(胃后 發(fā)酵物質(zhì)，即，馬科動物、兔子)。瘤胃的微生物僅僅部分地使用這些碳水化合物并釋放揮發(fā) 性脂肪酸(醋酸、丙酸和丁酸)，作為發(fā)酵產(chǎn)物，這些是反芻動物最重要的能量來源。在瘤胃 中增殖的微生物是能夠適應(yīng)區(qū)室條件和利用所攝入食物的那些。將不同的食物級分，碳水 化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵，并且通過瘤胃中產(chǎn)生的過剩的生物質(zhì)(這又是十二指腸中最終吸收 的蛋白質(zhì)的主要來源)補(bǔ)充VFA產(chǎn)生。纖維素發(fā)酵細(xì)菌(分解纖維素的)在6. 4-7的pH下最佳地生長，并且產(chǎn)生的醋酸 多于淀粉和糖發(fā)酵物質(zhì)(分解淀粉的)。最佳PH為約5. 5，并且當(dāng)這些水平下降時(shí)，存在乳 酸相對產(chǎn)生的增加。隨著反芻動物生產(chǎn)系統(tǒng)的加強(qiáng)，基于飼料的飼養(yǎng)已經(jīng)被給予用谷物配制的濃縮定 量食物配給替代，這提高了生長速率和降低了操作成本。然而，濃縮定量配給食物或由快速 發(fā)酵可溶性碳水化合物(淀粉)替代結(jié)構(gòu)性碳水化合物(纖維素)導(dǎo)致出現(xiàn)了一些消化功 能障礙，如酸中毒和timpanism。瘤胃酸中毒可以被定義為通過消化大量富含可發(fā)酵碳水化合物的食物產(chǎn)生的消 化改變，并且這是肥育的小牛中最常見的功能障礙之一。其可以通過使細(xì)菌群從革蘭氏陰 性變?yōu)楦锾m氏陽性、有利于如牛鏈球菌或埃氏巨型球菌這些物種的發(fā)育和改變VFA的比例 而導(dǎo)致死亡和發(fā)作。醋酸和丙酸的比例降低，而丁酸和乳酸增加。乳酸的增加影響了瘤胃 運(yùn)動性，由于不能消除所產(chǎn)生的氣體產(chǎn)生了腹中積氣。急性癥狀是厭食、黃綠色水樣糞便、 瘤胃張力缺乏、跛行、腹部縮回和脫水。亞急性形式包括頻繁腹中積氣、異常毛發(fā)和出現(xiàn)在 屠宰后發(fā)現(xiàn)的肝膿腫。timpanism和腹中積氣被定義為由發(fā)酵過量產(chǎn)生和累積氣體(二氧化碳和甲烷) 所引起的消化性改變，引起蜂窩胃-瘤胃的異常膨脹。通常，加入抗生素物質(zhì)(離子載體，如莫能菌素)使上述瘤胃功能障礙以潛在狀態(tài)存在。然而，這類作為生長增強(qiáng)劑的物質(zhì)逐漸取消導(dǎo)致了這些病癥的出現(xiàn)，引起高死亡率或 發(fā)病率，這對于利潤具有負(fù)面影響。這種對農(nóng)場生產(chǎn)力的影響非常重要，因此需要這些抗生 素物質(zhì)的可替換物。專利US4443471涉及M-139603的不同化學(xué)衍生物和M-139603反芻動物生長增強(qiáng) 劑，及其在降低由瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷量中的用途。專利US5196432涉及α _2腎上腺素受體拮抗劑在治療受乳酸酸中毒影響的反芻 動物中的用途。專利US5709894描述了用于反芻動物的食品添加劑，其含有谷氨酸和玉米發(fā)酵產(chǎn) 物，以提高瘤胃的發(fā)酵。專利申請US2003165487描述了基于米曲霉(Aspergillusoryzae)淀粉酶的方法 和組合物，以提高瘤胃的發(fā)酵效率和防止瘤胃乳酸濃度的有害增加，促進(jìn)有益的瘤胃微生 物的生長。專利申請US2004009209涵蓋了保持反芻動物的瘤胃健康的方法，由低濕度糖蜜 和緩沖劑的混合物組成。PCT申請W09119489描述了通過將琥珀酸和其他羧酸鹽給予喂養(yǎng)高能量配給的反 芻動物來調(diào)控瘤胃PH水平的方法。PCT申請W09325616涉及包膠于源自可溶性異源蛋白和還原糖的美拉德反應(yīng)的基 質(zhì)中的淀粉產(chǎn)品，以改善反芻動物瘤胃中的微生物發(fā)酵效率。PCT申請W02004009104涉及埃氏巨型球菌(M. elsdenii)的新菌株及其用途，包括 反芻動物的乳酸酸中毒的預(yù)防和治療。PCT申請W02005000035涉及改善瘤胃發(fā)酵的方法，特別是降低甲烷產(chǎn)生，其包括
給予獲自新鮮苜蓿的可溶性苜蓿提取物。EP1323354描述了一種基于植物材料的天然飼料添加劑。已知將作物和食品加工工業(yè)的副產(chǎn)物飼喂給家畜。例如，柑橘副產(chǎn)物飼料可以用 作反芻動物飼料系統(tǒng)的成分。它們含有各種用于瘤胃微生物的能量物質(zhì)(Bampidis等， Animal Feed Science andTechnology (動物飼料科學(xué)技術(shù))，Elsevier，vol. 128，2006， 175-217)。JP-52 028922描述了其中含有苦味桔皮的藥物。將該藥物飼喂給馬、?；蚣仪?。本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了檸檬類黃酮(尤其是柚皮苷)、苦味的柑桔提取物和 海泡石的混合物能夠調(diào)節(jié)得自給予濃縮定量配給的微生物發(fā)酵過程、提高微生物發(fā)酵過程 的效率和限制某些直接涉及瘤胃酸中毒過程的物種，尤其是牛鏈球菌。因此，本發(fā)明涉及包含柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的混合物在改善反芻 動物中瘤胃發(fā)酵的用途。在本申請中，“反芻動物”包括牛、綿羊、山羊和駱駝(camelide)物種。該混合物相對于現(xiàn)有技術(shù)的狀況呈現(xiàn)出一系列優(yōu)勢，使其在反芻動物營養(yǎng)領(lǐng)域中 具有高價(jià)值。該優(yōu)勢是混合物中的所有成分是天然來源的產(chǎn)物，并且容易獲得。另一方面， 混合物易于操作并且可以根據(jù)本領(lǐng)域?qū)＜乙阎墓I(yè)配制方法來制備。該混合物還具有限 制涉及瘤胃酸中毒出現(xiàn)的某些物種(尤其是牛鏈球菌)生長的附加優(yōu)勢。因此，特別地，本 發(fā)明涉及所述混合物用于改善反芻動物發(fā)酵的用途，該反芻動物發(fā)酵受到瘤胃中天然細(xì)菌 叢不平衡的損害。本發(fā)明還涉及所述混合物用于防止瘤胃發(fā)酵損害的用途，這種瘤胃發(fā)酵損傷可能是由于瘤胃中天然細(xì)菌叢不平衡所引起的。特別的目的是使用本發(fā)明的混合物 來限制引起瘤胃酸中毒的細(xì)菌的生長，如乳桿菌屬(Lactobacillusspp)，例如嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus),以及尤其是牛鏈球菌。將混合物以100至300ppm濃度(100至300g/噸)的固體形式加入飼料中時(shí)是有 活性的。這是基于體外研究，其中在100至300ppm的劑量范圍下分析了天然混合物的作用。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明混合物中的柚皮苷含量為10%至25%重量，優(yōu)選15%至 25%重量，更優(yōu)選約20%重量。根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明混合物中的苦味柑桔提取物含量為10%至65%重量，優(yōu) 選20%至60%重量，更優(yōu)選約40%重量。注意到苦味的柑桔提取物包括柚皮苷，因此本發(fā) 明混合物中的柚皮苷總含量將高于以上所示的含量。根據(jù)第三個(gè)方面，柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的含量為混合物重量的 100%。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含10%至25%重量柚皮苷、10%至65%重量 苦味柑桔提取物和補(bǔ)足量至100% (混合物的補(bǔ)足)重量海泡石的混合物在改善反芻動物 中瘤胃發(fā)酵的用途。在源自以上的實(shí)施方案中，混合物包含15%至25%重量柚皮苷、20%至60%重量 的苦味柑桔提取物和補(bǔ)足量至100%的海泡石，更特別地為，20%重量的柚皮苷、40%重量 的苦味柑桔提取物和40%重量的海泡石。以上所示的比例(％重量)是相對于混合物的總重。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用以上混合物調(diào)節(jié)由給予濃縮食品定量產(chǎn)生的微生物發(fā) 酵過程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用以上混合物限制引起瘤胃酸中毒的細(xì)菌(尤其是牛鏈 球菌)的生長。因此，本發(fā)明還涉及以上的混合物用于防止或治療瘤胃酸中毒的用途，包括 在此所述的急性和亞急性形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用以上混合物優(yōu)化反芻動物(尤其是牛)集約肥育中的 生產(chǎn)力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以上混合物的使用包括將其以重量計(jì)的10至2000ppm濃度 的固體形式加入飼料中，尤其是50至lOOOppm，更優(yōu)選100至300ppm。類黃酮是一類水溶性的植物色素，對其的醫(yī)學(xué)關(guān)注正在增長中。柚皮苷是一種獲 自柑桔類水果(葡萄柚(Citrus paradisi)和苦橙(Citrus aurantium)皮并在很大程度 上引起其苦味的類黃酮，特別是一種糖基化的黃烷酮。在果漿以及植物的葉、花和種子中也 發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)。一些研究表明和其他類黃酮相同，柚皮苷的生物合成受到環(huán)境和遺傳因素的影 響，這些因素決定了這些化合物濃度水平的不同，估算15至18g/kg新鮮葡萄柚皮為常見的 濃度值。皮中的含量也是不同的，未成熟的水果中高于成熟的水果。柚皮苷用于香料中以及給糖果、飲料和焙烤制品增加風(fēng)味，柚皮苷還因?yàn)槠淇寡?化和抗誘變特性而得到使用，并且作為油穩(wěn)定劑。苦味的柑桔提取物可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)操作(如提取、過濾、濃縮、沉淀、澄清 和最終的干燥)獲自碾碎的柑桔類水果(尤其是苦橙)?？梢栽诙逆溚榇?水系統(tǒng)中進(jìn)行提取處理，其中鏈烷醇選自甲醇、乙醇、丙醇等。優(yōu)選使用甲醇。典型的苦味柑桔提取物 將包含31. 5至71. 5%重量的總類黃酮，例如45至55%重量(如果通過HPLC測定)。特別 地，類黃酮包括柚皮苷、新桔皮苷和枸桔苷。通常，總類黃酮含量將包括(a)17.5至35. 重量的柚皮苷，例如，25至27%重量，(b)7. 7至16. 9%重量的新桔皮苷，例如，11至13%重 量和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷，例如，3至5%重量。隨后，海泡石是天然的含水硅酸鎂，其來源歸功于海洋化石的石灰質(zhì)沉積。其是白 色或淡黃色的粘土礦物。從遠(yuǎn)古時(shí)代開始就將其用作粉末狀牙膏。將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于遭受瘤胃發(fā)酵下降或處于遭受瘤胃發(fā)酵下降風(fēng)險(xiǎn)中的 反芻動物。特別地，這些反芻動物包括1)飼喂高濃度(谷物)膳食的反芻動物，例如，用于改善飼料轉(zhuǎn)化率和避免酮癥過 程的出現(xiàn)，尤其是如果反芻動物為a)在加強(qiáng)體系下肥育的動物；b)當(dāng)濃縮物供給達(dá)到最高比例時(shí)，處于泌乳高峰期的高泌乳產(chǎn)量的雌性；或c)帶有超過一只小羊的沉重懷孕的母羊或山羊，其攝入能力已經(jīng)受到限制。2)接受突然的膳食變化的反芻動物，尤其是該變化為a)從牧場(高_(dá)粗糧)改變至高濃縮定量；或b)從可消化性低的淀粉(高粱或玉米)改變至消耗性高的(小麥或大麥)。為了說明的目的，提供以下的實(shí)施例為更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例1 :100和300ppm劑量的混合物在牛中的效果基 于 Theodorou M K 等，Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p. 185-197，1994年8月提出的實(shí)驗(yàn)方案，分析了發(fā)酵動力學(xué)。所用的接種物是來自商業(yè)強(qiáng) 化育肥操作的牛的瘤胃液體。將本發(fā)明的混合物(20 %重量柚皮苷、40 %重量苦味柑桔提取 物和40%重量海泡石)接種接種物和以常用比例(80 20濃縮物秸稈)補(bǔ)充谷物秸稈 的商業(yè)牛飼料(600mg)。在含有800ml接種物稀釋物的密封瓶子中以兩批(2頭牛)重復(fù)三 份培養(yǎng)該混合物劑量。測試持續(xù)48小時(shí)，在2、4、6、12、24、36和48h時(shí)記錄瓶內(nèi)的壓力。從壓力值建立 氣體的產(chǎn)生。在培養(yǎng)10小時(shí)后，將一個(gè)瓶子分開，并將其內(nèi)含物取樣，用于測定VFA和DNA 分離，用于分子遺傳測試。通過QIAamp DNAStool Mini 試劑盒(Qiagen Ltd，Carwley，West Sussex,UK)
進(jìn)行DNA提取。通過分光光度計(jì)(NanoDrop )測定dna濃度和純度(總dna)，在260和 280nm處測量吸光度。通過實(shí)時(shí)PCR使用ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)將細(xì)菌和牛鏈球菌DNA定量， Ir (Maeda H^, FEMS Immunology andMedicalMicrobiology, 39 (1), p. 81-86, 2003
年 10 月)和牛鏈球菌(TajimaK 等，Applied and Environmental Microbiology, 67 (6), p. 2766-2774,2001年6月)使用了特定的引物。作為用于計(jì)算培養(yǎng)基中總細(xì)菌濃度的參 考，我們使用了通過瘤胃液體的差速離心(500g，10分鐘，接著20.000g，20分鐘)獲得的 細(xì)菌樣品的DNA濃縮物。使用Livak K J等，Methods (圣地亞哥，加利福尼亞)，25 (4)， p. 402-408,2001年12月所述的Δ Δ Ct表達(dá)，相對于總細(xì)菌的來表示牛鏈球菌的豐度。通過DGGE 使用特定的引物(NUbel U 等，Journal ofBacteriology, 178(19),p. 5636-5643，1996年10月)進(jìn)行了細(xì)菌生物多樣性。電泳使用了 8%丙烯酰胺凝膠，其具 有50% -65%變性脲/甲酰胺梯度，在80V下持續(xù)16小時(shí)。使用Amersham Biosciences (瑞 典)試劑盒將凝膠染色，并且在掃描后，使用UPGMA (UnweightedPair-Group Method Arithmetic averages)程序分析條帶模式。根據(jù)2X2(混合物X劑量)因子設(shè)計(jì)分析混合物對瘤胃發(fā)酵的效果，考慮了將動 物認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)?zāi)K。MM1.-氣體產(chǎn)牛在之前所述的體外條件下，培養(yǎng)基中包含混合物對VFA產(chǎn)生或總VFA產(chǎn)生的動力 學(xué)沒有效果。實(shí)驗(yàn)處理也沒有影響最重要的VFA的摩爾比例，其顯示出60%醋酸、29%丙酸 和9%丁酸的平均比例。2.-通過PCR的實(shí)時(shí)細(xì)菌定量表1顯示了通過分光光度測定(260nm)獲得的總DNA濃度，并且我們可以看到培 養(yǎng)基中的DNA濃度是怎樣沒有受到包含混合物改變的。然而，通過更特異性的程序(實(shí)時(shí) PCR)的細(xì)菌DNA量的測定表明混合物的包含使得細(xì)菌DNA明顯增加，表明細(xì)菌生長增加。 由于混合物的存在引起的微生物生長的明顯差異的存在(在氣體(C02+NH3)產(chǎn)生或更高的 VFA釋放中沒有發(fā)現(xiàn)所述差異)表明混合物對微生物合成效率具有積極作用。同一表格還顯示了牛鏈球菌的特定DNA序列拷貝的濃度，已經(jīng)鑒定該細(xì)菌為乳酸 的主要生產(chǎn)者之一，并因此涉及由瘤胃酸中毒引起的狀況。加入混合物使得培養(yǎng)基中該 物種濃度得到非常明顯的限制，所述濃度表示為相對于細(xì)菌DNA拷貝總數(shù)的對應(yīng)于牛鏈 球菌(2(ACt)*1000)的DNA拷貝的數(shù)量或相對于對照培養(yǎng)基的拷貝數(shù)量的百分比減少 (2(Δ ACt))。表1 通過實(shí)時(shí)PCR計(jì)算的培養(yǎng)基中的不同DNA類型的濃度；作為細(xì)菌生物多樣性指標(biāo)的培養(yǎng)基中的DNA 16S拷貝數(shù)量 當(dāng)我們分析混合物的劑量對以上參數(shù)的作用時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)使用該濃度的混合物沒 有顯著的差異。因此，所獲得的結(jié)果表明100和300ppm的初始濃度超過了所述化合物對瘤 胃發(fā)酵過程的活性極限。另一方面，盡管研究混合物改變了牛鏈球菌的濃度，但其沒有改變 群體的生物多樣性。這證實(shí)了所述物質(zhì)對某些微生物群的選擇性作用。3. ~結(jié)論和優(yōu)點(diǎn)
給研究混合物補(bǔ)充來自在商業(yè)強(qiáng)化育肥條件下給予的濃縮食物定量的接種物使 得瘤胃發(fā)酵過程產(chǎn)生了顯著變化。混合物的存在沒有改變氣體或VFA產(chǎn)生水平。然而，其對接種物中的不同微生物 群具有顯著的作用。盡管促進(jìn)了種群合成水平的顯著提高，但其顯著抑制了牛鏈球菌生長。
權(quán)利要求
包含10％至25％重量的柚皮苷、10％至65％重量的苦味柑桔提取物和補(bǔ)足量至100％重量的海泡石的混合物在改善反芻動物瘤胃發(fā)酵中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中混合物包含15%至25%重量的柚皮苷、20%至60%重量的 苦味柑桔提取物和補(bǔ)足量至100%的海泡石。
3.權(quán)利要求2的用途，其中混合物包含20%重量的柚皮苷、40%重量的苦味柑桔提取 物和40%重量的海泡石。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的用途，其中苦味柑桔提取物包含31.5%至71. 5%重量的總 類黃酮。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的用途，其中苦味柑桔提取物包含44至55%重量的總類黃酮。
6.權(quán)利要求4或5的用途，其中總類黃酮包含(a)17. 5至35. 重量的柚皮苷，(b) 7. 7 至16. 9%重量的新桔皮苷和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷。
7.權(quán)利要求4或5的用途，其中總類黃酮包含(a)25至27%重量的柚皮苷，(b)ll至 13%重量的新桔皮苷和(c) 3至5%重量的枸桔苷。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的用途，其中所述改善調(diào)節(jié)了給予濃縮食物定量的反芻動物 中的微生物發(fā)酵過程。
9.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的用途，其中所述改善包括限制引起瘤胃酸中毒的細(xì)菌的生長。
10.權(quán)利要求9的用途，其中引起瘤胃酸中毒的細(xì)菌是牛鏈球菌(Streptococcus bovis)ο
11.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的用途，其中所述改善優(yōu)化了反芻動物在強(qiáng)化育肥中的生產(chǎn)力。
12.權(quán)利要求11的用途，其中反芻動物是牛。
13.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的用途，其包括以10至2000ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
14.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的用途，其包括以50至IOOOppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
15.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的用途，其包括以100至300ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及柚皮苷、苦味柑桔提取物和海泡石的混合物用于改善反芻動物瘤胃發(fā)酵的用途。
文檔編號A61K31/35GK101909616SQ200980102006
公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
發(fā)明者F·J·克雷斯波, F·埃雷迪亞, J·巴爾塞爾斯, M·D·M·塞拉 申請人:艾克斯奎姆股份有限公司