專利名稱：淋巴管內(nèi)化療藥物載體的制作方法
淋巴管內(nèi)化療藥物載體
背景技術(shù)：
本發(fā)明要求2008年1月30日提交的美國臨時申請?zhí)枮?1/024，837的權(quán)益，該申 請在此通過具體的全面引用而結(jié)合。癌是疾病的一類，其中，一組細(xì)胞顯示出超出正常限度的不受控制的增長和分裂， 侵入和破壞相鄰的組織，且有時通過淋巴管或血管轉(zhuǎn)移將癌蔓延到身體內(nèi)的其它位置。這 些癌的惡性性質(zhì)與良性腫瘤的區(qū)別在于，良性腫瘤是自我限制的、不侵入或轉(zhuǎn)移的。大多數(shù) 的癌形成腫瘤，但有些像白血病不會。癌可以侵襲任何年齡的人，即使是胎兒，但是，大多數(shù) 種類的癌的患病風(fēng)險隨年齡而增加。由癌引起的死亡占死亡總數(shù)的大約13%。根據(jù)美國癌 癥學(xué)會的報道，2007年間，美國760萬人死于癌。癌可以侵襲所有的動物。幾乎所有的癌都是由變態(tài)細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的變異而引起的。這些變異可能歸因于 致癌物質(zhì)的影響，如煙草煙霧、放射線、化學(xué)藥品、或傳染性試劑。其它的癌-促進(jìn)遺傳變 性可能是通過DNA復(fù)制出錯而偶然獲得、或是通過遺傳并因此從出生起存在于所有的細(xì)胞 中。癌的遺傳力通常受致癌物質(zhì)和宿主染色體組之間復(fù)雜的相互作用影響。診斷通常需要病理學(xué)家對一個組織活檢標(biāo)本的組織學(xué)檢查，盡管惡性腫瘤的初始 跡象可能是癥狀或放射照相成像異常。大多數(shù)的癌可以被治療，其中一些可被治愈，取決于 其具體的種型、位置和階段。一旦確診，癌通常用外科手術(shù)、化療、和放療綜合治療。隨著研 究的進(jìn)展，治療方法對于不同的種類的癌來說變得更為具體。在靶向治療藥物發(fā)展的過程 中，已有重要的進(jìn)步，該藥物定向作用在特定腫瘤的可檢測的分子變異處，使其對正常細(xì)胞 的損害最小化。癌癥病人的預(yù)后受癌癥種類、階段或疾病程度的影響最大。此外，組織學(xué)的 分階段和特異的分子標(biāo)示的存在在確立預(yù)后，以及確定個體的治療中也非常有用。順氯氨鉬(即，順-二氯二氨鉬或⑶DP)已成為很多實體瘤的重要化療劑。然而， 新出現(xiàn)的鉬藥物已被發(fā)現(xiàn)具有更小的副作用，這些藥物可能成為重要的化療劑。順氯氨鉬 和其它化療藥物或潛在化療藥物的一個缺點在于其顯著的毒性。由于器官毒性妨礙化療，腫瘤學(xué)家已經(jīng)發(fā)展了一種將化療藥物限制在疾病區(qū)域的 化療方法，該方法是通過暫時性地從體循環(huán)中獎感染組織或器官隔離起來并用化療藥物灌 注該感染組織或器官。例如，高劑量化療藥物的動脈內(nèi)經(jīng)皮骨盆灌注可以為晚期子宮宮頸 癌提供一個具有低副作用的治療優(yōu)勢。然而，這些治療方法是高度入侵的，需要專業(yè)技能和 僅為大型藥物研究中心所擁有的設(shè)備。此外，在很多情況下組織隔離是不可能的，包括已顯 著侵入淋巴組織的局部晚期乳腺癌。如果化療被集中到乳房淋巴管，且對于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的治療保持足夠的系統(tǒng)水平，局 部晚期乳腺癌的治療方法可被改進(jìn)。對于局部晚期乳腺癌(LABC)的最新輔助系統(tǒng)化療是 規(guī)范的，但在治療后癌一般在其變成系統(tǒng)性疾病前首先通過具有小基質(zhì)侵染(的淋巴管蔓 延開。早期乳腺癌的外科治療包括原發(fā)腫瘤的切除，以及引流前哨淋巴結(jié)和進(jìn)一步的淋巴 管切除，如果需要的話。然而，該方法可能忽略了淋巴結(jié)上納米范圍的轉(zhuǎn)移，如果完全的免 疫組織化學(xué)分析不是習(xí)慣性地在前哨淋巴結(jié)標(biāo)本上實施，其估計具雙倍的復(fù)發(fā)風(fēng)險(與真 實的淋巴結(jié)陰性對照相比)。對乳房和淋巴管的局部放療加之全身系統(tǒng)的化療減少了復(fù)發(fā)的風(fēng)險，但這些治療方法會導(dǎo)致健康組織的巨大損傷。不考慮病因，很多癌是通過淋巴系統(tǒng)(例如乳房、卵巢、黑素瘤)來轉(zhuǎn)移。淋巴管 是身體的排泄系統(tǒng)，用于清理組織中的廢物，轉(zhuǎn)移的癌跟隨該排泄系統(tǒng)首先“定植”于局部 淋巴管中。外科手術(shù)和化療可以破壞這些早期轉(zhuǎn)移中的很多，但對病人來說具有很大的損 失(例如，毒副作用和痛苦的淋巴水腫)。因此，在癌癥早期通過將化療藥物直接輸送到腫 瘤組織以避免這些具有副作用的化療將是有益的。此外，化療藥物優(yōu)先地定向進(jìn)入淋巴管， 從而避免對身體內(nèi)別處正常細(xì)胞的副作用，摧毀在外科手術(shù)和全身化療之后可能導(dǎo)致復(fù)發(fā) 的“種子”的化療方法也將是有益的。

發(fā)明內(nèi)容
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明包括一種化療組合物，其被配置成經(jīng)皮注射局部 給藥。該組合物包括一種藥物可接受的載體；和一種納米共軛物，其被配置成在經(jīng)皮(其 中，經(jīng)皮指的是皮下、皮內(nèi)、瘤周、粘膜下層或透過皮膚起作用的)給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi) 積累。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明包括一種納米共軛物，其包括一種配置成在經(jīng)皮 或間隙給藥之后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米載體；和大量耦合到該納米載體的化療劑。該 納米共軛物可以具有大約IOnm到大約SOnm的尺寸。此外，該納米共軛物可負(fù)載有大約10% 到大約50% w/w的化療劑。該納米載體可以是一種大約20kDa到大約150kDa的透明質(zhì)烷 (HA)聚合物。做為選擇，該納米載體可以是一種樹枝狀大分子。該化療劑選自順氯氨鉬、其 它的鉬化療藥物、苯丙氨酸氮芥、魏菲靈A、絲裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道諾霉 素、及其組合等等。在一個具體實施方式
中，該化療劑通過一個生物可降解的連接器被耦合到該納米 載體，例如，該生物可降解的連接器是酸不穩(wěn)定的或可降解的。在一個具體實施方式
中，該化療組合物和/或納米共軛物基本上無PEG、HPMA、 polyglutames 禾口 / 或銀。在一個具體實施方式
中，該化療劑以一個有效治療的量存在以便提供一個與該化 療劑的標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射給藥相比較高的淋巴管AUC和一個較低的淋巴液Cmax。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明包括一個用于治療和/或抑制癌的方法。這種方 法可以包括經(jīng)皮的給藥一種組合物，該組合物具有一個藥物可接受的載體和一個配置為在 皮下注射給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米共軛物。該納米共軛物可以是本文描述的任一具體實施方式
。本發(fā)明的這些及其它具體實施方式
和特征參照下列說明和附加的權(quán)利要求更完 全的展現(xiàn)，或者可通過下文的闡述而了解。


為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明的上述及其他的優(yōu)點和特征，一個更詳細(xì)的發(fā)明說明將參 考附圖中圖解的具體實施方式
而給出?？梢岳斫獾氖牵@些附圖描繪僅僅用于圖解本發(fā)明 的具體實施方式
，而非用于限制其范圍。通過使用附圖，本發(fā)明將用附加的特征和細(xì)節(jié)被描 述和說明，其中
附圖1A-1B為圖解該化療劑在組織和血漿中的濃度的圖表。附圖IA是一個示出 了在靜脈注射順氯氨鉬或皮下注射HA-順氯氨鉬(3. 3mg/kg順氯氨鉬-基)進(jìn)入右乳房頰 脂墊之后，同側(cè)(右)腋下結(jié)點和對側(cè)(左)腋下結(jié)點的鉬的組織濃度的圖表。附圖IB是 一個濃度-時間的藥物動力學(xué)圖表，其示出了在靜脈注射順氯氨鉬(3. 3mg/kg)或皮下注射 HA-順氯氨鉬(3. 3mg/kg)進(jìn)入右乳房頰脂墊之后的順氯氨鉬的血漿濃度。附圖2A-2B示出了在單劑量皮下注射HA-順氯氨鉬進(jìn)入右乳房頰脂墊之后，隨著 時間的推移，肌氨酸酐在尿中的濃度的圖標(biāo)。附圖2A示出了那些接受3.3mg/kg含銀或不 含銀的HA-順氯氨鉬的動物的尿肌氨酸酐濃度的圖。附圖2B示出了那些接受的1.0mg/kg 含銀或無銀HA-順氯氨鉬的動物的尿肌氨酸酐濃度圖。在附圖2A中，較低的尿肌氨酸酐正 如所看到的用含銀的高劑量樣品，是腎損害的一個信號，而在附圖2B中，在低劑量時兩個 劑型之間沒有顯著差異。附圖3A-3F是腎組織單次藥物化合物注射和用蘇木精和曙紅著色30天后的成像。 附圖3A示出了接受皮下注射HA的動物具有正常組織(對照)。附圖3B示出了接受3. 3mg/ kg靜脈注射順氯氨鉬的動物具有退行性病變?nèi)缭谄べ|(zhì)延髓管狀細(xì)胞中的固縮核。附圖3C 示出了接受皮下注射3. 3mg/kg無銀HA-順氯氨鉬的動物具有清楚地正常外觀，除了較少的 在皮質(zhì)延髓接點管狀細(xì)胞壞死的點。附圖3D示出了接受1. Omg/kg皮下注射含銀HA-順氯 氨鉬的動物具有廣泛分布在骨髓管狀上皮細(xì)胞中的固縮核。附圖3E示出了接受1. Omg/kg 靜脈注射順氯氨鉬的動物在骨髓管狀上皮細(xì)胞中具有固縮核，暗紫色著色的增加暗示核染 色和細(xì)胞程序死亡傳播。附圖3F示出了接受1. Omg/kg皮下注射HA-順氯氨鉬的動物具有 正常的外觀，除了極少的腎管狀細(xì)胞腫大和退化。附圖4A-4F是單次藥物注射和用H&E著色30天后的肝臟組織的成像。附圖4A示 出了接受皮下注射HA的動物具有正常的組織(對照)。附圖4B示出了接受3.3mg/kg順 氯氨鉬的動物具有適度的壞死。附圖4C示出了接受3. 3mg/kg皮下注射HA-順氯氨鉬的動 物具有清楚地正常外觀，除了非常輕微的退化。附圖4D示出了接受1. Omg/kg含銀HA-順 氯氨鉬的動物具有清楚地正常外觀，除了非常輕微的退化。附圖4E示出了接受1. Omg/kg 靜脈注射順氯氨鉬的動物具有清楚地正常外觀，除了非常輕微的退化。附圖4F示出了接受 1. Omg/kg皮下注射HA-順氯氨鉬的動物具有正常外觀。附圖5A-5F是單次藥物注射和用H&E著色的30天后的腦組織的成像。接受皮下 注射HA (對照)和所有研究化合物(例如，靜脈注射順氯氨鉬3. 3mg/kg，皮下注射HA-順氯 氨鉬3. 3mg/kg,皮下注射含銀HA-順氯氨鉬lmg/kg，靜脈注射順氯氨鉬lmg/kg，皮下注射 HA-順氯氨鉬lmg/kg)的動物具有正常所見。附圖6A-6F是單次藥物注射和用H&E著色的30天后的淋巴組織的成像。接受皮 下注射HA (對照)和所有研究化合物(例如，靜脈注射順氯氨鉬3. 3mg/kg，皮下注射HA-順 氯氨鉬3. 3mg/kg,皮下注射含銀HA-順氯氨鉬lmg/kg，靜脈注射順氯氨鉬lmg/kg，皮下注射 HA-順氯氨鉬lmg/kg)的動物具有正常所見。附圖7A-7D是單次注射30天后的注射部位的下層組織成像。接受皮下注射HA (對 照)和所有研究化合物(例如，皮下注射HA-順氯氨鉬3. 3mg/kg,皮下注射含銀HA-順氯氨 鉬lmg/kg，HA-順氯氨鉬lmg/kg)的動物具有正常所見。附圖8A-8H是圖解在靜脈注射順氯氨鉬(3. 3mg/kg順氯氨鉬基)或皮下注射HA-順氯氨鉬(3.3mg/kg順氯氨鉬基)進(jìn)入右乳房頰脂墊之后的鉬的組織濃度圖。附圖8A 是膀胱的，附圖8B是腦的，附圖8C是心臟的，附圖8D是腎的，附圖8E是肝的，附圖8F是肺 的，附圖8G是肌肉的，附圖8H是脾的。附圖9是一個淋巴管內(nèi)化療藥物的合成和其在化療上的作用的示意圖。附圖10A-10B是圖解在皮下注射之后藥物總量的圖。附圖IOA示出了右腋下淋巴 結(jié)(RLN)和左腋下淋巴結(jié)(LLN)在皮下注射順氯氨鉬或順氯氨鉬-HA(3. 3mg/kg順氯氨鉬 基)進(jìn)入右乳房頰脂墊之后的順氯氨鉬的組織濃度。附圖IOB示出了在相同方法下的順氯 氨鉬在血漿中的濃度。值得注意的是，用于靜脈注射順氯氨鉬的血清Cmax大于4微克/毫 升，而對于HA-順氯氨鉬，其小于3微克/毫升。高Cmax順氯氨鉬與耳毒性、腎毒性和與此 藥物有聯(lián)系的周圍神經(jīng)病直接關(guān)聯(lián)。此數(shù)據(jù)支持了 HA-順氯氨鉬可能比靜脈注射順氯氨鉬 更少中毒。附圖11A-11H是不同組織(例如，附圖IlA是膀胱，附圖IlB是腦，附圖IlC是心 臟，附圖IlD是腎，附圖IlE是肝，附圖IlF是肺，附圖IlG是肌肉，和附圖IlH是脾)在皮 下注射順氯氨鉬-HA(10mg/kg順氯氨鉬基)進(jìn)入右乳房頰脂墊后的順氯氨鉬濃度的組織濃 度圖。附圖12是一個圖解通過用順氯氨鉬和順氯氨鉬-HA抑制人類癌細(xì)胞生長72小時 之后的細(xì)胞活力圖。要指出的是，HA自身顯示出了在該測驗濃度(達(dá)到10mg/mL，數(shù)據(jù)未示 出)下沒有毒性。該圖證明了，共軛HA到CDDP上對順氯氨鉬活體外的抗癌效果沒有產(chǎn)生 不利影響，因為所有細(xì)胞系表現(xiàn)出了類似的IC50水平。附圖13A-13C是顯示在對患有用綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)標(biāo)示的MDA-MB-468乳房 淋巴管腫瘤的裸鼠皮下注射之后的淋巴管內(nèi)載體的定位照片。附圖13A示出了該鼠在被德 克薩斯紅-HA 6皮下注射左乳房頰脂墊時的乳房淋巴管腫瘤4。在5小時和18小時后(分 別為附圖13B和附圖13C)，該照片示出了在引流結(jié)點的顯著的HA局部化和共同定位腫瘤 (GFP通道為綠色，用4標(biāo)記；德克薩斯紅通道為紅色，用6標(biāo)記，藍(lán)色箭頭2是注射部位)。附圖14A-14C是納米共軛物的合成框圖。附圖15A是圖解該樹枝狀大分子的合成框圖。附圖15B是圖解靶向藥劑和納米共軛物共軛的框圖。附圖17A-17B示出了陰性對照組相比，通過HA-順氯氨鉬治療法，腫瘤生長被推遲 5周，與常規(guī)的順氯氨鉬治療法相比。附圖18示出了阿霉素的釋放與pH之間的關(guān)系。其釋放半衰期在pH為7. 4時為 167小時，pH為6. O時為107，pH為5. O時為45。附圖19示出了通過納米載體-DOX治療兩周劑量后，在第三和第五周腫瘤生長被 暫停，與標(biāo)準(zhǔn)的靜脈注射阿霉素(紫色線)相比是一個顯著的效力改善。附圖20A圖解了一種磷酸酯-HA。附圖20B圖解了用磷酸酯-HA進(jìn)行納米共軛物合成的框圖。附圖21A是一個圖解了皮下注射HA-順氯氨鉬給藥體內(nèi)效力的圖。附圖21B-21C是圖解了標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞活力與藥物濃度的曲線圖，通過MTS試驗比較活 體外標(biāo)準(zhǔn)的CDDP藥劑(附圖21B)和HA-順氯氨鉬(附圖21C)對兩個人的頭和頸鱗狀細(xì) 胞癌細(xì)胞系(JMAR和MDA-1986)抗增殖的特性。值得注意的是，兩個藥物的IC50水平是非常類似的，其表示了 HA的再共軛沒有對CDDP在活體外的抗癌活性產(chǎn)生不利影響。附圖22A-22F是表示在單次注射進(jìn)入鼠右乳房頰脂墊之后的HA-阿霉素分布的照 片。阿霉素具有天生的熒光性，該藥物_載體共軛物的分布和壽命可被很好的觀察用于計 時評價。值得注意的是，大部分藥物_載體被輸送到腋淋巴結(jié)，其經(jīng)過一個9天的間隔緩慢 地釋放藥物，即使在9天之后，仍然有殘余活性。橢圓形標(biāo)記在乳房中的注射部位，最深的 濃度(紅色)在腋下。附圖23是一個表示腫瘤響應(yīng)的圖，即使是在一個相當(dāng)晚期乳腺癌腫瘤體內(nèi)一個 單次晚期瘤周HA-阿霉素治療之后。附圖24A-24E是表示HA-阿霉素體內(nèi)運(yùn)動的照片，其在一個Maestro多通道熒光 成像系統(tǒng)上成像。即使在注射4天后，進(jìn)入局部區(qū)域組織和鼠乳房淋巴結(jié)的藥物和載體的 細(xì)微的攝取，其很好的停留在該淋巴管。
具體實施例方式一般地，本發(fā)明涉及新的化療劑、含有該化療劑的藥物組合物、制備該化療劑的方 法、和使給藥的化療劑以某種形式優(yōu)先在淋巴系統(tǒng)積累的方法。該化療劑包括一種納米載 體，當(dāng)給藥基本上進(jìn)入身體內(nèi)的任何一個間隙位置內(nèi)時，其優(yōu)先確定路線進(jìn)入該淋巴系統(tǒng) 之內(nèi)，如鄰近于腫瘤或皮下，但不是全身地給藥。也就是說，該藥劑不通過靜脈注射給藥而 施行。因此，該化療劑優(yōu)先地瞄準(zhǔn)任何尺寸的腫瘤、癌細(xì)胞、或其它淋巴系統(tǒng)內(nèi)的惡性腫瘤。 這樣一種方式可以有效地抑制癌細(xì)胞從一個最初的癌蔓延到身體的另一部分。該化療劑的設(shè)計，其為一種納米共軛物，允許從注射/給藥的部位通過淋巴系統(tǒng) 遷移以防引起升高的有毒性的全身濃度峰值。常規(guī)的給藥途徑，如靜脈注射，通常會通過藥 劑的首過藥物動力學(xué)而產(chǎn)生有毒性的且應(yīng)避免的高的全身濃度峰值。因此，該化療劑優(yōu)先 遷移進(jìn)入該淋巴系統(tǒng)之內(nèi)，并可以治療該淋巴系統(tǒng)內(nèi)的癌細(xì)胞，其包括可能是在淋巴結(jié)內(nèi) 存在的細(xì)胞。該遷移模式隨著從原位初始蔓延出來的許多癌細(xì)胞的路線而確定，從而可用 于治療或抑制癌細(xì)胞通過局部轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行的蔓延。該化療劑包括一種尺寸最佳化的納米載體和會被優(yōu)先遷移進(jìn)入淋巴系統(tǒng)之內(nèi)而 非系統(tǒng)地蔓延和濃縮的組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)烷聚合載體和一些樹枝狀的載體，如文中 描述的，具有如選擇性的移位特征進(jìn)入該淋巴系統(tǒng)之內(nèi)。例如，該化療劑可以被沉積鄰近于 皮膚癌和進(jìn)入與該癌細(xì)胞相似的淋巴系統(tǒng)。順氯氨鉬是一種最廣泛使用的用于實體瘤的化療藥劑，然而，它的毒性和耐藥性 嚴(yán)重地限制了它在很多病人上的劑量和使用。系統(tǒng)內(nèi)的順氯氨鉬進(jìn)入淋巴管內(nèi)的滲透性 可能是較差的(小于注入藥劑的1-5% )，且用于局部癌的備選治療(例如，外科的切除或 放射)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用如感染和淋巴水腫。因此，一種治療或抑制該癌細(xì)胞在淋巴 管內(nèi)積累的方法是可取的，且現(xiàn)在可以通過在皮下的或間隙給藥一種優(yōu)先移位到該局部區(qū) 域組織和淋巴管的納米共軛物來實現(xiàn)。該納米共軛物可包括一種美國食品與藥物管理局 (FDA)批準(zhǔn)的與化療藥劑(例如，順氯氨鉬)耦合在一起的生物相容載體的納米載體。該納 米共軛物與常規(guī)的順氯氨鉬靜脈注射療法相比還可以降低全身的毒性。當(dāng)淋巴管參與到從 早期到晚期的癌轉(zhuǎn)移時，該納米共軛物可用于許多對順氯氨鉬敏感的癌如乳腺癌、非小細(xì) 胞肺癌、卵巢癌、和頭和頸鱗狀細(xì)胞癌的治療、抑制和/或預(yù)防。此處的順氯氨鉬在實施例和附圖中也稱為⑶DP和Pt。先前，已有報道，靶向和納米載體策略增加了到達(dá)帶有腫瘤的細(xì)胞組織的順氯氨 鉬的劑量，而使正常細(xì)胞組織免于受中毒劑量的毒。這些技術(shù)可被分類成非靶向或被動靶 向載體(例如，非受體)和主動靶向載體(例如，抗體)。在非靶向載體中，如聚合膠束制 劑(例如，NC-6004)已經(jīng)證明減少了在臨床前研究的非特定的毒性，并已經(jīng)發(fā)展到早期臨 床試驗。在第一階段試驗，一個N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)和鉬(例如，AP5280) 的非靶向線性共軛聚合物已經(jīng)證明了鉬在人體內(nèi)較高的持續(xù)的血漿鉬水平，與靜脈注射順 氯氨鉬相比，具有最小的毒性。該非靶向載體依賴提高的滲透率和滯留效應(yīng)(EPR)以改進(jìn) 該藥劑的腫瘤積累，但在非高度血管化的腫瘤內(nèi)，該Era效應(yīng)大大減少，非靶向納米載體具 有更小地優(yōu)點。因此，被動靶向性在具有低血管質(zhì)的腫瘤的治療上不是有效的，這樣的癌細(xì) 胞在該淋巴系統(tǒng)中可被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在，利用本發(fā)明，非血管化的癌細(xì)胞，如在淋巴系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，可通過在該腫瘤 部位皮下注射而在該腫瘤的局部轉(zhuǎn)移區(qū)域淋巴管內(nèi)有選擇地積累一種化療劑而被治療或 抑制，允許化療劑被沿著很可能是該腫瘤初始轉(zhuǎn)移的淋巴管通道輸送。這可使用一種生物 相容的納米載體與化療劑的納米共軛物進(jìn)行，其中，該納米載體使無載體難以輸送的藥劑 能夠局部選擇性積累。該可在淋巴管內(nèi)細(xì)胞組織積累的納米共軛物的皮下給藥對治療很多癌是有好處 的，如乳腺癌。例如，一旦它們從該原發(fā)腫瘤傳播，乳腺癌典型地蔓延到區(qū)域淋巴結(jié)，由此， 該腋下淋巴結(jié)在早期患病時足夠的評價和治療是重要的。當(dāng)前治療的一個顯著的問題是化 療劑系統(tǒng)地產(chǎn)生的單獨或合并發(fā)生的副作用。。本發(fā)明的納米共軛物是優(yōu)越的，因為它們， 令人驚訝和出人意料地，可以在存在于淋巴系統(tǒng)和/或淋巴管內(nèi)的細(xì)胞組織內(nèi)的癌細(xì)胞中 積累，從而作用于淋巴轉(zhuǎn)移但沒有發(fā)生不希望的全身毒性。該納米共軛物可被皮下給藥用 于在淋巴管內(nèi)細(xì)胞組織積累。因此，該納米共軛物可用于治療乳腺癌，優(yōu)先治療風(fēng)險區(qū)域的 淋巴結(jié)并避免全身的毒性。本發(fā)明可包括一種多聚糖透明質(zhì)烷(HA)和化療劑(例如，順氯氨鉬或其它的鉬) 的納米共軛物、與類似的特別是那些與用于實現(xiàn)治療淋巴管內(nèi)局部化和無毒系統(tǒng)濃度皮下 注射相關(guān)藥物組合物和方法。該HA納米共軛物在HA的分子量/尺寸上進(jìn)行了構(gòu)思，所選 的HA分子量能夠有效地使順氯氨鉬集中到乳房淋巴管和減少具毒性的峰點血漿濃度。本 文中順氯氨鉬作為一種代表性的化療劑使用，其它的證明在化療方面有效的藥劑可以被共 軛到本發(fā)明的納米共軛物。同樣，HA被用作一種代表性的納米載體；然而，其它的具有相同 或相似的生理輸送外形和性質(zhì)如樹枝狀的納米載體，也可被使用。順氯氨鉬在此處被使用 和描述，是由于其易于通過原子吸收光譜確定在器官、細(xì)胞組織和淋巴管的鉬沉積。因此， 順氯氨鉬在給藥之后的沉積是其它可被共軛到該納米載體的化療藥劑的代表。在一個具體實施方式
中，該化療藥物是順氯氨鉬，其已被證明是一種用于很多實 體瘤的極好的抗癌劑，但順氯氨鉬的標(biāo)準(zhǔn)藥劑已經(jīng)顯示出其具有顯著的全身毒性。現(xiàn)在， 順氯氨鉬的納米共軛物已經(jīng)顯示出能夠作為一個局部區(qū)域輸送系統(tǒng)被皮下給藥以增加淋 巴管內(nèi)的鉬水平，其中，早期轉(zhuǎn)移很可能發(fā)生在該淋巴管內(nèi)，同時減少了全身的毒性。該順 氯氨鉬納米共軛物令人驚訝和出人意料地，也可提供合適的全身濃度即在沒有顯著的全身 毒性的條件下有效治療。如在該申請附圖中證明的，HA-順氯氨鉬能夠提供血清和全身的AUCs，其可有效的治療而無標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射CDDP的有毒的高Cmax水平。能夠通過皮下注射 給藥(例如，鄰近腫瘤)局部輸送用于得到在治療上有效的淋巴管內(nèi)積累和系統(tǒng)濃度和具 有毒性較低的緩釋特性的組合使其比標(biāo)準(zhǔn)的CDDP更為有利。例如，順氯氨鉬可被共軛到一種生物相容的聚合物如透明質(zhì)烷，共軛度大約為 20w/w%。該納米共軛物可通過皮下注射(例如，進(jìn)入鼠類的乳房組織)輸送得到在治療上 有效的淋巴管內(nèi)積累和全身濃度。該HA-順氯氨鉬納米共軛物表現(xiàn)出與標(biāo)準(zhǔn)順氯氨鉬藥劑 在體外人類乳腺癌上相似的抗增殖效力。該納米共軛物與正常的順氯氨鉬相比增加了 2.7 倍血漿弧線下區(qū)域(AUC)，但具有一個減少的血漿峰值水平(Cmax)，其對減少系統(tǒng)毒性是 有好處的。該納米共軛物與順氯氨鉬相比增加了 3. 8倍身體同側(cè)淋巴結(jié)AUC。接受該納米 共軛物治療的動物病理學(xué)研究顯示出了腦和淋巴結(jié)正常的外觀，與靜脈注射順氯氨鉬給藥 相比在腎和肝臟具有更小地壞死和炎癥。因此，該納米共軛物證明了用透明質(zhì)烷基化療藥 物淋巴管內(nèi)施藥可以比靜脈注射治療允許較低的藥物劑量水平和更小的毒性，而在該腫瘤 負(fù)擔(dān)最高的局部區(qū)域組織骨盆提供了一個提高的化療藥物劑量。通常，該納米載體可以被共軛到肽、抗體(單克隆和多克隆)、干擾素、包括苯丁酸 氮芥的苯丙氨酸氮芥和其它的氮芥類藥物、乙胺碘呋酮、托泊替康、魏菲靈A、包括17-AAG 的HSP90抑制劑、VEGF抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制劑、和任何包括紫杉酚、紫杉醇、紫杉 萜等的紫杉烷類。可被共軛到該納米共軛物的藥物的一些例子包括順氯氨鉬、其它鉬藥物、 苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道諾霉素、苯丁酸氮芥、5FU、紫杉醇、 長春新堿、Her2抗體和肽、EGFR抗體和肽、雷帕霉素、mTOR抑制劑、魏菲靈A、HDAC抑制劑、 SAHA, Hsp90 抑制劑、17-AAG 和 17-DMAG。在一個具體實施方式
中，該納米載體是一個透明質(zhì)烷(HA)聚合物，該透明質(zhì)烷 (HA)聚合物是一個具有高度生物相容性的聚合物，現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)，其會隨著淋巴管從該組織 間隙排泄，如從皮下注射給藥。該HA和順氯氨鉬的納米共軛物可以通過非共價共軛或通過 生物可降解的鍵如酯或胼鍵形成。該納米共軛物可被在身體的任何地方進(jìn)行皮下注射。例 子包括注入女性上部乳房頰脂墊用于治療乳腺癌。透明質(zhì)烷(HA)聚合物是一個D-葡糖醛酸和N-乙酰D-葡糖胺交替的多聚糖，在 軀體的結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)并首先通過淋巴系統(tǒng)(12-72小時半衰期轉(zhuǎn)換)清理。在進(jìn)入淋巴 管后，HA被輸送到淋巴結(jié)，在那兒，它被通過受體介導(dǎo)的胞吞作用和溶酶體老化發(fā)生分解代 謝。若干研究已將增加HA合成和攝取與癌癥發(fā)展和潛在轉(zhuǎn)移相互關(guān)聯(lián)。眾所周知，乳腺癌 細(xì)胞比正常的組織具有更大的HA攝取，需要HA用于對多耐藥性的主要貢獻(xiàn)者高P-糖蛋白 的表達(dá)。此外，入侵的乳腺癌細(xì)胞過分表達(dá)⑶44，⑶44為HA的主要的受體，該乳腺癌細(xì)胞 依賴于高濃度的CD44-內(nèi)在化HA用于擴(kuò)散。因此，帶有HA的化療藥物納米共軛物可以有 效的對抗淋巴管轉(zhuǎn)移。相應(yīng)地，HA-藥物納米共軛物可被導(dǎo)向到該淋巴系統(tǒng)，通過與在淋巴結(jié)表面和 ⑶-44受體被過分表達(dá)的癌細(xì)胞上的⑶-44受體綁定而在淋巴結(jié)上積累。透明質(zhì)烷也是一 種用于⑶44受體的配體，主要通過該淋巴系統(tǒng)清理，其中，它在該結(jié)點通過⑶44受體介導(dǎo) 的胞吞作用繼之以溶酶體老化被分解代謝。這允許該納米共軛物內(nèi)的藥物被輸送到初始腫 瘤傳播部位，在該淋巴結(jié)集中其效力。通過與全身吸收相反的淋巴管攝取，與目前的裸露藥 物化療輸送技術(shù)相比，該HA納米共軛物提供了較低的器官和全身的毒性。
該HA的分子量可以是不同的，但在攝取進(jìn)入該淋巴系統(tǒng)從而影響該淋巴管藥物 濃度方面具有顯著的影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)烷在35kDa具有優(yōu)越的性能，但也可以在75 和150kDa使用用于給藥。由于炎癥性的反應(yīng)，少于IOkDa可能是可行的，由于高粘度，超過 700kDa可能不是實際的。相應(yīng)地，HA的分子量可被優(yōu)化到大約20kDa到大約150kDa，更優(yōu)選地，大約25kDa 到大約IOOkDa,最優(yōu)選地，大約30kDa到大約75kDa。根據(jù)該藥物的負(fù)載和該納米共軛物在 淋巴系統(tǒng)內(nèi)的積累，較低分子量的HA聚合物可被進(jìn)一步精制。例如，30kDA到50kDa分子量 和大約35kDa的聚合物都是有益的。這些HA聚合物是充分可溶的，以便能夠輸送共軛其上 的藥物進(jìn)入淋巴系統(tǒng)。此外，該納米載體可以是一個樹枝狀大分子。該樹枝狀大分子的代可被選擇 用于優(yōu)化淋巴管對毛細(xì)管攝取的比率。樹枝狀大分子納米顆粒具有極端明確的尺寸 和表面電荷，取決于材料的生成和終端基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)。例如包括PAMAM樹枝狀大分子 (polyamidoamine)，)、磷酸酯樹枝狀大分子、雙(3_羥丙基)膦酸酯樹枝狀大分子、羧基酯 樹枝狀大分子、氨基酸樹枝狀大分子、超樹枝狀聚合物(例如，樹枝狀的聚胺酸類、樹枝狀 的聚酯、樹枝狀的聚磷酸酯)、聚糖(透明質(zhì)烷、右旋糖苷及其磺化衍生物、纖維素)等等。該納米共軛物可被配制用于瘤周和皮下注射，用于優(yōu)先移位進(jìn)入該淋巴系統(tǒng)，由 此全身的暴露被限制。該納米共軛物可為大約10到大約30nm以避免帶有中性的或負(fù)電荷 的毛細(xì)管攝取以最大化淋巴管的快速攝取量，優(yōu)選大約15到25nm，最優(yōu)選大約20nm。對于 淋巴管攝取皮下注入顆粒而言具有一個最佳粒度范圍大于IOOnm的顆粒將大量地被保持 限制在注射部位，IO-SOnm的顆粒通過該淋巴管吸收，小顆粒和分子(< 20kDa)將被毛細(xì) 血管網(wǎng)絡(luò)吸收進(jìn)入全身循環(huán)。大于IOOnm或少于5nm的納米共軛物不是非常可行的。優(yōu)選 地，該納米共軛物可以在10到SOnm之間，更優(yōu)選在15到50之間，最優(yōu)選在20到40nm之 間。先前的報道已經(jīng)證明HA具有與鉬藥物形成穩(wěn)定共軛物的能力，然而，本發(fā)明的納 米共軛物具有不同的特性，如HA的分子量、藥物負(fù)載和配置用于皮下注射給藥的配方。以 前從來沒有HA-藥物共軛物被設(shè)計和配制用于皮下注射給藥用于淋巴管沉積和滯留以及 提供合適的全身濃度。此外，在皮下注射進(jìn)入該乳房頰脂墊之后，皮下注射的HA納米共軛 物現(xiàn)在已被發(fā)現(xiàn)被排放到鼠類的腋下骨盆。因此，該組合物可被配置用于直接注入腫瘤和 /或皮下注射用于在淋巴系統(tǒng)積累以治療那些在淋巴系統(tǒng)如在淋巴結(jié)可能發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移。例如，皮下注射包含達(dá)到0. 25w/w順氯氨鉬的順氯氨鉬-HA納米共軛物，其在鹽水 中釋放藥物的半衰期為10小時。順氯氨鉬-HA納米共軛物在活體外具有與游離順氯氨鉬 相似的高抗腫瘤活性順氯氨鉬-HA IC507 μ g/mL在MCF7和MDA-MB-231人類乳房癌細(xì)胞 (游離順氯氨鉬IC507 μ g/mL)。嚙齒類對順氯氨鉬-HA共軛物也有良好的耐受性，，在96 小時之后沒有注射部位致病或主要器官中毒的征兆，。在注射順氯氨鉬-HA后在軸向淋巴 結(jié)的順氯氨鉬AUC與正常的順氯氨鉬相比增加74%。通過該納米共軛物輸送的化療藥物的全身濃度足夠高到可以實現(xiàn)對任何轉(zhuǎn)移的 或全身的癌細(xì)胞進(jìn)行有效的治療，并且其濃度足夠低到基本無毒。先前，在化療中加入裸露 的鉬藥物與一些包括白血球減少癥、惡心、毛發(fā)損失、急性腎中毒、慢性神經(jīng)中毒、和貧血風(fēng) 險增加的毒性有關(guān)。因此，一個用于限于乳房和腋下癌癥的局部區(qū)域治療方法可以大大改進(jìn)鉬藥物在乳腺癌化療的利用。為此目的，透明質(zhì)烷可以是一種使順氯氨鉬在淋巴結(jié)局部 化的理想載體。在一個具體實施方式
中，該納米載體通過一個生物可降解的連接器被共軛到該化 療藥物。即，該連接器可以被配置用于降解以便在臨近癌細(xì)胞或在癌細(xì)胞內(nèi)釋放該化療藥 物。在HA的情況下，該連接器可以是一個酸可降解的連接器。一個酸可降解的連接器可以 用于HA，由于HA具備被內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和移位到溶酶體的能力，該溶酶體酸化和降解該 連接器。此外，圍繞癌細(xì)胞的含氧量低的微觀環(huán)境可以降解這些連接器。其釋放藥物直接 進(jìn)入內(nèi)在化HA納米共軛物的癌細(xì)胞內(nèi)。酸可降解的連接器的例子包括腙、酯、縮醇、可生物降解的聚合物連接器、聚交酯、 聚乙醇酸交酯、及其共聚物和組合物等等。除了酸可降解的二硫化物、1，6消除連接器、磷酸 酯連接器，酶可裂解的連接器包括但不限于在腫瘤內(nèi)和周邊組織、淋巴管和淋巴結(jié)通過酶 辨別的短肽序列，其在這些組織中比在大多數(shù)非目標(biāo)組織中可以被以高水平表達(dá)。在一個具體實施方式
中，納米共軛物未被聚乙二醇化。因此，該納米共軛物可以基 本沒有PEG。此外，該納米共軛物可以沒有HPMA或polyglutames。該納米共軛物可以不被 裝入膠囊而配制。皮下給藥該納米共軛物和在該淋巴系統(tǒng)提供局部化療的能力允許不同癌癥的治 療。更特別的是，它允許那些已經(jīng)通過淋巴系統(tǒng)開始轉(zhuǎn)移的早期癌癥的治療。因此，該給藥 路線和在該淋巴系統(tǒng)內(nèi)的積累允許該納米共軛物提供對各種癌癥如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、 非小細(xì)胞肺、黑素瘤、頭和頸癌(例如，頭和頸鱗狀細(xì)胞癌)、卵巢癌和淋巴瘤以及其它的局 部化治療。順氯氨鉬與一個銀激活的順氯氨鉬納米共軛物直接注入鼠乳房組織被研究，即使 局部的順氯氨鉬注射由于組織損傷是不適宜的。另外，腫瘤研究表明該被銀激活的納米共 軛物導(dǎo)致過早的動物死亡。因此，本發(fā)明的納米共軛物被發(fā)展，它不需要利用銀(即，該納 米載體不是被銀激活的)，從而本發(fā)明的納米共軛物沒有與銀有關(guān)的毒副作用。該用無銀納 米共軛物化療藥物(例如，HA-順氯氨鉬納米共軛物)在皮下注射給藥后的局部化化療，就 主要的響應(yīng)于不同治療器官的病理學(xué)方面，被與標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射給藥順氯氨鉬進(jìn)行了比較。 納米共軛物的皮下注射給藥提供了局部化納米共軛物化療，與全身治療相比具有顯著增加 的淋巴組織濃度和減少的包括鼠類腎中毒的器官毒性。先前，透明質(zhì)烷在與順氯氨鉬共軛之前被用硝酸銀活化，因為據(jù)報道這會提高共 軛效率。然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，它很難從該共軛產(chǎn)物中全部刪除痕量銀，即使在對水進(jìn)行多次延 伸透滲析之后。在治療中，銀的存在導(dǎo)致很多動物死于銀誘發(fā)毒性，這已通過病理檢查被確 定。這在人類治療中是不可接受的，并導(dǎo)致了該配方模式的改變以從該共軛方法中消除銀。 該耦合反應(yīng)然后被再設(shè)計無銀活化以獲得最高的共軛效率，其歸根結(jié)底不會削弱該HA-鉬 共軛物的形成。這在臨床研制方面是一個顯著的進(jìn)步，因為順氯氨鉬和HA兩個都被美國食 品與藥物管理局批準(zhǔn)用于人類，且不需要附加的物質(zhì)用于該復(fù)合體的形成。該納米共軛物 產(chǎn)物在體外對多乳腺癌仍然具有極好的抑制增殖活性，表明該配方的改變不影響基于細(xì)胞 的藥物效力。納米共軛物的藥物動力學(xué)和組織分布表明，HA-順氯氨鉬納米共軛物的淋巴管輸 送與定量靜脈注射順氯氨鉬相比提高了局部淋巴骨盆的藥物水平。在一個鉬的等效劑量，HA-順氯氨鉬載體大大增加了淋巴結(jié)骨盆濃度，表明該載體能夠通過該淋巴管比靜脈注射 藥物給藥路線更加有效地輸送鉬到該淋巴結(jié)。此外，HA-順氯氨鉬納米共軛物看起來能在 體內(nèi)足夠久的保持其穩(wěn)定性以在釋放其共軛藥物之前輸送或局部化進(jìn)入該淋巴管之內(nèi)。該在淋巴系統(tǒng)優(yōu)先積累的納米共軛物與靜脈內(nèi)輸送順氯氨鉬相比減少了暴露于 鉬的全身組織，但該HA-順氯氨鉬納米共軛物由于其持續(xù)釋放的特性(例如，選擇性的移位 和連接器的選擇性的老化)，事實上在大多數(shù)組織內(nèi)與靜脈注射順氯氨鉬相比平均增加了 200%的鉬AUC。這可能是由于鉬(從該HA-順氯氨鉬皮下注射輸送)從一個更加持續(xù)釋放 外形的超時積累，與通過一個靜脈注射丸劑注入的急速衰退和消除相比。該增加的組織水 平同時具有兩個優(yōu)點(1)僅需要較低劑量的鉬以實現(xiàn)相同的組織效力，由此，該HA-順氯 氨鉬劑量可以減少50%且仍然保持當(dāng)量組織水平；(2)保持藥物的治療學(xué)全身水平是重要 的，對于利用該藥物作為一個輔助的治療，既然已經(jīng)知道大多數(shù)患乳腺癌的病人如果不是 全身范圍轉(zhuǎn)移的話已經(jīng)微量轉(zhuǎn)移到局部區(qū)域淋巴結(jié)。因此，該治療可以被采用代替日常的 全身靜脈注射療法，至此，利用一個更小入侵和更小頻率的劑量安排，例如一周一次定量皮 下注射，與當(dāng)前日常的靜脈注射輸注治療相比較，而同時提供了給藥到該局部區(qū)域腫瘤骨 盆和淋巴管的局部“促進(jìn)”。該較大的HA-順氯氨鉬AUC還可以增加腫瘤細(xì)胞死亡的速率， 由于延長的順氯氨鉬亞毒性水平與單次高劑量相比可以實質(zhì)的提高腫瘤細(xì)胞的死亡。由于順氯氨鉬越多嚴(yán)重的副作用可能是因為在靜脈注射給藥之后直接經(jīng)歷的高 的血漿峰濃度(Cmax)，近來的申請包括有節(jié)制的定量療程已經(jīng)顯示出降低了毒性，盡管它 們增加了病人的不便和成本。因此，局部給藥納米共軛物防止了高峰水平，其原因在于，由 于藥物從該載體的緩釋，與標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射順氯氨鉬藥劑的一個小時相比其在鹽水中的半衰 期為10小時；以及在其從該載體釋放之后，順氯氨鉬需要時間從該組織或淋巴擴(kuò)散進(jìn)入該 全身循環(huán)之內(nèi)。皮下注射HA-順氯氨鉬與靜脈注射順氯氨鉬相比具有一個低得多的血漿峰 濃度(圖1A-1B)，盡管總的血漿鉬AUC遠(yuǎn)大于靜脈注射順氯氨鉬。在皮下HA-順氯氨鉬注 射之后，在血漿鉬到達(dá)高點之前有一個2小時的延遲，然后趨于平穩(wěn)最后停留在一個恒定 的水準(zhǔn)。該釋放曲線與一個延遲的和從該淋巴組織持續(xù)的釋放是一致的。附圖2A-2B示出了肌氨酸酐水平表明靜脈注射順氯氨鉬和局部化納米共軛物之 間腎毒性沒有重大差別，盡管納米共軛物鉬的AUC更高。高劑量銀配方導(dǎo)致在第一周內(nèi)尿 肌氨酸酐水平降低和動物死亡，其是不適宜的。銀配方的嚴(yán)重體內(nèi)毒性表明，銀配方稍微更 大的活體外抗增殖活性(表1)可能起因于非特異性的銀中毒。盡管沒有檢測到損壞，肌氨 酸酐測試可能不是足夠靈敏的以發(fā)覺在單次適度劑量之后較小的腎損害，所以，我們實施 了為更多鉬毒性直接證據(jù)的病理檢查。因此，在一個具體實施方式
中，一個納米共軛物配方 基本上是無銀的。單次劑量順氯氨鉬注射后30天的病理檢查顯示，在皮下注射HA-順氯氨鉬和靜脈 注射順氯氨鉬配方之間存在有顯著的腎和肝的區(qū)別。盡管HA-順氯氨鉬的腎的鉬AUC是順 氯氨鉬的兩倍，在該HA-順氯氨鉬治療的動物中，腎細(xì)胞壞死的較低發(fā)病率和更小的嚴(yán)重 性表明比其靜脈注射順氯氨鉬提高了耐藥性。腎內(nèi)更大的HA-順氯氨鉬的鉬AUC似乎將反 駁該觀察到的較低的毒性，但可能起因于其與靜脈注射順氯氨鉬相比較低的通過腎過濾的 峰血清藥物水平(Cmax)。肝臟病理學(xué)顯示了 HA-順氯氨鉬與順氯氨鉬相比降低的毒性，沒有動物在3. 3mg/kg順氯氨鉬具有正常病理。順氯氨鉬誘發(fā)的肝臟毒性已知是由于反應(yīng)性氧氣種類的產(chǎn)生而 發(fā)生。透明質(zhì)烷在肝臟內(nèi)新陳代謝，氨基多糖是已知的具有肝保護(hù)效應(yīng)的抗氧化劑，所以該 HA納米共軛物可以防止鉬造成肝臟中毒。相應(yīng)地，一個具體實施方式
包括一個HA和順氯氨鉬納米共軛物，其在皮下注射進(jìn) 入乳房頰脂墊之后將順氯氨鉬集中在該乳房淋巴管。這些納米共軛物具有持續(xù)釋放的特 征，導(dǎo)致較高的淋巴管AUC和較低的血漿Cmax，與標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射順氯氨鉬相比。該納米共軛 物不會導(dǎo)致實質(zhì)的器官毒性，如腎、肝、神經(jīng)或腎中毒；且在病理檢查上看起來與標(biāo)準(zhǔn)靜脈 注射順氯氨鉬相比具有較低的器官毒性。該納米共軛物不會導(dǎo)致注射部位或淋巴結(jié)中毒。 該優(yōu)先的淋巴管內(nèi)移位和該納米共軛物的積累提供了用其它化療藥物合并治療乳腺癌的 優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明，該納米共軛物可以有效地輸送順氯氨鉬以單獨或作為聯(lián)合治療的一 部分使用，具有顯著地更小的毒性。該使用納米共軛物的淋巴管內(nèi)輸送模式不僅在局部區(qū) 域結(jié)組織顯著地增加了高于標(biāo)準(zhǔn)順氯氨鉬配方的藥物濃度(高出74%的AUC)，而且它也顯 示了允許更低Cmax水平的維持釋放的動力學(xué)，其能夠長時間保持低器官毒性。僅有的顯著 的不同組織水平是同側(cè)腋淋巴結(jié)對該藥物注射。這轉(zhuǎn)換幾乎加倍使用納米共軛物皮下注射 直接進(jìn)入該乳房內(nèi)穿過該局部區(qū)域節(jié)點的順氯氨鉬的濃度。因此，優(yōu)先移位到該淋巴管的 納米共軛物顯著地促進(jìn)了藥物濃度以治療和/或抑制淋巴管內(nèi)局部區(qū)域腫瘤細(xì)胞發(fā)育。此外，該納米共軛物可以成功治療和/或抑制癌癥的傳播，由于化療藥物的淋巴 管內(nèi)輸送到達(dá)腋下使用透明質(zhì)烷作為一個靶向納米載體。該優(yōu)先的淋巴管內(nèi)輸送可以在風(fēng) 險區(qū)域的淋巴結(jié)優(yōu)先治療和避免與靜脈注射或口服藥物給藥有聯(lián)系的全身毒性。該優(yōu)先的 淋巴管內(nèi)輸送降低了全身濃度但保持在一個適當(dāng)?shù)乃接糜谥委熀?或抑制癌細(xì)胞的傳 播即傳播進(jìn)入全身循環(huán)。因此，該納米共軛物可以提供一個用于具有包含通常不會被提供 淋巴結(jié)分解的納轉(zhuǎn)移的前哨淋巴結(jié)的病人的治療。該納米共軛物比標(biāo)準(zhǔn)治療提供了足夠的 全身藥物水平在一個更維持釋放的模式下，且它也提供了對處于風(fēng)險的不能通過結(jié)分解去 除的隱藏腫瘤細(xì)胞的局部區(qū)域結(jié)組織更加需要的促進(jìn)作用。另外，該納米共軛物能被作為 一個用于局部晚期乳腺癌的最新輔助治療，并可以治療或抑制退化。在一個具體實施方式
中，一個具有該納米共軛物的藥物配方不是為用于下列輸送 路線而配制口服、系統(tǒng)、透過皮膚起作用、鼻內(nèi)、栓劑、靜脈注射、或管腔內(nèi)給藥。該藥物可被配置用于經(jīng)皮膚、皮內(nèi)、粘膜或粘膜下層、皮下、間隙、脂肪內(nèi)、瘤周、肌 肉注射粘膜、瘤周、吸入和滴注。本發(fā)明的納米共軛物在皮下注射或間隙給藥后優(yōu)先移位到淋巴系統(tǒng)是令人驚訝 和出乎意外的。在某種程度上，這是由于在皮下注射或空隙給藥之后，在該淋巴系統(tǒng)優(yōu)先的 移位和積累，例如進(jìn)入乳房組織?；熕幬锶珥樎劝便f與HA或樹枝狀大分子的納米共軛物 也提供了一個治療學(xué)系統(tǒng)的劑量，其AUC與標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射藥劑(例如，順氯氨鉬和阿霉素) 相同或有時偏高，但具有較低的Cmax濃度。該綜合的發(fā)現(xiàn)允許這些藥物作為用于具有局部 區(qū)域疾病的病人的高級輔助治療，由于Cmax較低其具有能夠治療它們?nèi)砑膊〉念~外益 處和具有更小的毒性，這毒性與順氯氨鉬和和阿霉素的毒性是有關(guān)的。也令人驚訝的是，在 通過OAEs和通過腎病理學(xué)分析評價證明，局部注射部位、腎、和耳毒性方面，HA納米共軛物 基本上比標(biāo)準(zhǔn)順氯氨鉬或阿霉素具有更小的毒性。該較低的毒性允許直接注射進(jìn)入、相鄰的或接近地進(jìn)入組織或組織間隙，而不會損壞該健康的組織。因此，該納米共軛物可提供對 原發(fā)腫瘤、淋巴管內(nèi)癌細(xì)胞和全身癌細(xì)胞的治療?？傊?，該納米載體輸送系統(tǒng)優(yōu)越于標(biāo)準(zhǔn)藥物配方在于(1)用于治療動物癌癥的 效力和能力；(2)較低的毒性輪廓；和(3)較長的定量間隔(一周一次或兩周一次對每天一 次靜脈注射藥劑)。該皮下注射相比攜帶藥物溢出風(fēng)險的靜脈注射輸液泵提供給病人一個 微創(chuàng)的治療選擇。該納米共軛物可被歸入一種具有可接受的載體的藥物組合物，配制該納米共軛物 用于適當(dāng)給藥如皮下注射。適當(dāng)?shù)闹苽溆糜谄は伦⑸浣o藥主要是具有水溶形式活性成分的 水溶液如水溶鹽，和另外的活性成分懸浮體，如使用適當(dāng)?shù)挠H油溶劑或載體如脂肪油、芝麻 油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯的合適的油的注射懸浮體，或包含粘度增加物質(zhì) 如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或右旋糖苷和必要時的穩(wěn)定劑的水注射懸浮體。根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的組合物可通過注射而給藥，通過漸次的超時輸注或 通過任一其它的醫(yī)學(xué)上可接受的模式。任一醫(yī)學(xué)上可接受的方法可被用來給藥該組合物到 病人。具體的模式選擇當(dāng)然依賴于各種因素如具體的藥物選擇、要治療的病狀態(tài)的嚴(yán)重性、 或為治療效能需要的劑量。本發(fā)明的方法，一般而言，可以使用任一醫(yī)學(xué)上可接受的的給藥 模式，意思是指任何可以使該活性組合物達(dá)到的有效水平且沒有引起臨床上不受歡迎的的 副作用的模式。對于注射，該納米共軛物可通過在一個水或非水溶劑如植物或其它類似的油類、 合成脂肪酸甘油酯、較高的脂肪酸酯或丙二醇內(nèi)溶解、懸浮或乳化而配制，如果需要，可包 括傳統(tǒng)的添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、和防腐劑。優(yōu)選地，該納米共軛 物可在水溶液中配制，優(yōu)選在生理學(xué)兼容的緩沖劑如Hank’ s溶液、格林氏溶液(Ringer' s solution)或生理鹽水緩沖劑中。該納米共軛物可被配制用于通過注射皮下給藥，例如，通過彈丸注射或連續(xù)輸注。 用于注射的配方可以以單位劑型存在，例如在安瓿或在多劑量容器中，具有附加的防腐劑。 該組合物可采取在油或水載體中的懸浮體、溶液或乳狀液的形式，且可以包含配方試劑如 懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。本發(fā)明的組合物無菌注射劑可以是水狀的或基本上為脂肪族懸浮體狀的。這些懸 浮體可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖櫇駝┖蛻腋┡渲?。該無菌注射劑配制 也可以是一個無菌注射劑溶液或懸浮體，在一個無毒的腸外接受的稀釋劑或溶劑中，如作 為在1，3_ 丁二醇中的溶液。在可接受的載體和可采用的溶劑之中，為水、格林氏溶液和等 滲氯化鈉溶液。此外，無菌的、脂肪油通常作為溶劑或懸浮介質(zhì)而采用。為此目的，任一刺 激性少的脂肪油可被采用，包括合成的單或二甘油酯。脂肪酸如油酸和它的甘油酯衍生物 可用于血管注射劑的制備，以及天然的藥物可接受的油類如橄欖油或蓖麻油、特別是它們 的聚氧乙烯體。這些油劑或懸浮體可同時包含一個長鏈醇稀釋劑或分散劑。淋巴系統(tǒng)被卷入乳腺癌轉(zhuǎn)移已經(jīng)確立，然而沒有有效的非外科治療以克服淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移和疾病發(fā)展。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移化療最大的挑戰(zhàn)實際上是使被保持在該淋巴結(jié)上的藥劑的量 最大化，同時避免全身的吸收和中毒。在乳腺癌治療中，本發(fā)明提供給局部淋巴管化療一個創(chuàng)新的飛躍。用于化療藥物 的HA或樹枝狀大分子納米載體可以局部地治療晚期乳腺癌，同時利用靶向的和淋巴管輸送途徑。用于乳腺癌淋巴管內(nèi)給藥的淋巴管靶向納米載體的利用是高度創(chuàng)新的和迄今為止 從來沒有實施的。通過增加比標(biāo)準(zhǔn)化療藥物可達(dá)到的藥物局部區(qū)域AUC，該技術(shù)在局部地晚 期乳腺癌提供了顯著的最新輔助治療。另外，包含具有更好的滯留和持續(xù)從該淋巴管釋放 藥物的靶向途徑應(yīng)該降低了藥物的全身毒性，該藥物全身毒性的降低導(dǎo)致更好的腫瘤效力 和更低的毒性。本發(fā)明可用其它的沒有脫離其精神和本質(zhì)特征的具體形式體現(xiàn)。所描述的具體實 施方式僅僅作為說明性的與非限制性的在各個方面予以考慮。因此，本發(fā)明的范圍是，通過 附加的權(quán)利要求而非通過上述說明表明。所有在權(quán)利要求等價意義和范圍內(nèi)的變化均在其 范圍之內(nèi)，此處所有的引用和/或描述均通過具體參考的形式予以結(jié)合。試驗來自微生物發(fā)酵的透明質(zhì)烷(HA)以透明質(zhì)酸鈉的形式購買自Lifecore Biomedical (明尼蘇達(dá)州查斯卡(Chaska MN))，無需進(jìn)一步提純而使用。肝素溶液購買自 AbraxisPharmaceutical Products (伊利諾斯州紹姆堡(Schaumburg IL)) 所有其它試劑 購買自 FisherScientific (賓夕法尼亞州匹茲堡(Pittsburgh, PA))或 Sigma Aldrich (密 蘇里州圣路易斯(St. Louis，MO))，其為ACS級或更高級。Milli-Q水用于所有的試驗。 MDA-MB-468LN細(xì)胞系通過Ann Chambers (倫敦保健科學(xué)中心，安大略省倫敦市(London， Ontario))提供，而MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞從美國組織培養(yǎng)收集中心(ATCC，弗吉尼亞 洲馬納薩斯(Manassas，VA))獲得。動物方法被堪薩斯州立大學(xué)動物關(guān)心和使用委員會批 準(zhǔn)、Sprague-Dawley鼠購買自Charles River實驗室(馬薩諸塞州威爾明頓(Wilmington， MA))。1. HA-順氯氨鉬共軛物合成順氯氨鉬根據(jù)早先報道的方法(S.Cai，Y. Xie, T. Bagby，M. S. Cohen, and Μ.L.Forrest.Intralymphatic chemotherapy using a hyaluronan—cisplatin conjugate. J. Surg. Res. 147 247-252 (2008) ；Y. I. Jeong, S. T. Kim, S. G. Jin, H. H. Ryu, Y. H. Jin, T.Y.Jung, I. Y. Kim, and S. Jung. Cisplatin-incorporated hyaluronic acid nanoparticles based on ion-complex formation. J Pharm Sci. (Epub.) (2008))被共 軛到HA(35000g/mol)，分別加入和不加入作為活性劑的硝酸銀。一般地，HA(IOOmg)和順 氯氨鉬(45mg)溶于水(20mL)，在黑暗和氬存在的條件、在環(huán)境溫度(大約25°C )下攪拌 四天。反應(yīng)混合物在4°C避光被過濾(0. 2μπι尼龍膜)和透析出水(10000MWC0 ;PierCe， Rockford, IL)48小時。接著透滲析，半成品被濃縮和在4°C儲存。順氯氨鉬取代的程度由 原子吸收光譜學(xué)(AAS)(具有石墨熔爐的Varian SpectrAA GTA-110)決定。熔爐程序如 下斜面25-80°C，保持2s ；斜面達(dá)到120°C，保持IOs ；斜面達(dá)到1000°C，保持5s ；斜面達(dá)到 27000C，保持2s ；經(jīng)過20s冷卻到25°C。石墨分隔管每40個樣品通過在2800°C烘焙7s進(jìn)行 清理。氬被用作注入和載體氣體。產(chǎn)物共軛物稱為HA-順氯氨鉬、順氯氨鉬-HA、HA-CDDP、 HA-Pt，盡管該共軛物是[PtCl (H20) (NH3) 2] 00C0-HA (附圖 9)。順氯氨鉬的結(jié)構(gòu)有助于與聚羧基聚合物形成復(fù)合物，由于一個或多個該氯化物可 被置換以允許形成一個不穩(wěn)定的連接該聚合物的酯鍵。順氯氨鉬被高度共軛到HA，具有典 型的0.20W/V鉬/復(fù)合體(大約65%順氯氨鉬共軛效率)的共軛度。在先前的研究中，順 氯氨鉬共軛物首先通過用AgN03活化HA;然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，省去這些步驟不會顯著地減少共軛且其減少了潛在的銀中毒。AAS在10-450ng/mL(R2 = 0.999)范圍內(nèi)作出了一個線性曲 線，其具有5ng/ml的檢出限。濃縮樣品在分析之前用水稀釋使其進(jìn)入該直線分析的范圍之 內(nèi)。HA的熒光共軛物通過德克薩斯紅酰胼對HA的凝結(jié)而形成。HA(35000MW，IOOmg) 在IOmL的30%的H20:Et0H中用2-氯-1-甲基吡啶碘化物(33mg)和三乙胺(35 μ L)活 化。在加入德克薩斯紅酰胼(AnaSpec Inc.，San Jose, CA) (2mg在0. 4mLDMS0 二甲亞砜) 之后，該混合物被回流24小時。通過在環(huán)境溫度對水透滲析48小時進(jìn)行檢查，繼之以冷凍 干燥。共軛效率用81800M-lcm-l在λ 588nm的摩爾消光系數(shù)決定。順氯氨鉬被高度共軛到HA，具有典型的0. 25w/w順氯氨鉬/復(fù)合體的共軛度，起 始比率為0.5w/w順氯氨鉬/HA。達(dá)到0.75W/V順氯氨鉬/復(fù)合體被嘗試，但效率降低(表 4)。2.體內(nèi)細(xì)胞毒性淋巴轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468LN被保存在改性的阿爾法Eagle介質(zhì)中 (modified Eagle，s medium alpha)，補(bǔ)充有 10%胎牛血漿、1 % L-谷氨酰胺和 0. 4mg/mL G418 (遺傳霉素)。附加的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7根據(jù)ATCC提供的規(guī)程被維 持。先于增殖研究，細(xì)胞被胰蛋白酶化和種入96-孔板(5000細(xì)胞/孔)。24小時之后，順 氯氨鉬、HA-順氯氨鉬(用或者不用銀活化)、或HA被加入(η = 12;濃度7)，加入72小時 后，刃天青藍(lán)在10 μ 1磷酸緩沖鹽水被加入每一孔(最后濃度為5mM)。4小時之后，孔熒 T^^ffl^cTfeTfeiSif (SpectraMax Gemini ；Molecular Devices, Sunnyvale, CA) IlJM (λ ex 560nm, λ em 590nm)。IC50由每個板的鹽溶液(陽性的)的中點和無細(xì)胞(陰性的)對照 之間的中點來確定。當(dāng)細(xì)胞增殖減少經(jīng)過72小時后，細(xì)胞毒性被確定。含和不含銀的HA-順氯氨鉬共 軛物對細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的游離藥物具有相同的細(xì)胞毒性(表1)。在使用三個不同人類乳腺癌細(xì) 胞系的順氯氨鉬和HA-順氯氨鉬之間沒有發(fā)現(xiàn)看得出的毒性區(qū)別(表1)。HA表明在IOmg/ ml時沒有毒性，在所有細(xì)胞系中的測試上限與鹽水對照相比較(數(shù)據(jù)未示出)。3.藥物動力學(xué)和組織分布在異氟烷條件下，將導(dǎo)管插入Sprague-Dawley鼠(雌性，200_250g)左頸靜脈，允 許整夜恢復(fù)。動物然后被靜脈注射順氯氨鉬(ι. O或3. 3mg/kg ；η = 5)或皮下注射HA-順 氯氨鉬(1. 0或3. 3mg/kg當(dāng)量順氯氨鉬；η = 5)，在異氟烷麻醉的條件下。在該動物最上的 右乳房頰脂墊皮下注射。在給藥后的0、5分鐘、0.5、1、2、4、6、12、24、48和96小時時從該插 管中抽全血(100 μ 1)，然后投入2ml預(yù)先用肝素處理的離心管。該插管在抽出前后被鹽水 洗滌，然后用肝素鎖定。該全血被在17000Xg離心5分鐘，血漿在-80°C冷凍直至分析。動 物在治療96小時后被無痛致死。右同側(cè)腋下結(jié)點(治療側(cè))、左對側(cè)腋下結(jié)點(控制側(cè))、 和主要的器官(肝臟、腎、心臟、脾、肺、腦、肌肉、膀胱)被切除；用0. 9%的鹽水洗；在-80°C 儲存直至分析。組織樣品使用早先報道的方法(S.Cai，Y. Xie, Τ. Bagby, Μ. S. Cohen, and Μ. L.Forrest. Intralymphatic chemotherapy using a hyaluronan-cisplatin conjugate. J. Surg. Res. 147 =247-252(2008))制備。一般地，50mg組織樣品用 1. 5ml 6. 7% 的硝酸在80°C消化2小時。在消化之后，樣品被均化(Tissue Tearor ；BioSpec Products Inc.，Bartlesville, OK)和離心。上層清液和血漿樣品用合成部分描述的AAS進(jìn)行分析。在Sprague-Dawley鼠上，對皮下注射HA-順氯氨鉬和靜脈注射順氯氨鉬的藥物動力學(xué)進(jìn)行 比較。HA-順氯氨鉬在引流同側(cè)的腋淋巴結(jié)比靜脈注射順氯氨鉬更優(yōu)先積累(圖1A)；優(yōu) 先積累在注射48小時后仍然很明顯，即使活體外順氯氨鉬從HA分裂的半衰期為10小時。 局部注射的HA-順氯氨鉬同側(cè)腋下結(jié)點AUC0-96小時比靜脈注射順氯氨鉬(ρ < 0. 001)大 3. 8倍，HA-順氯氨鉬結(jié)點峰濃度(Cmax)比靜脈注射順氯氨鉬大6. 2倍。最顯著的，順氯氨鉬治療的劑量限制的毒性是腎中毒，繼之以神經(jīng)中毒，兩者都受 血漿峰濃度的強(qiáng)烈影響。靜脈注射順氯氨鉬的血漿峰濃度比皮下注射HA-順氯氨鉬大3. 1 倍。順氯氨鉬釋放進(jìn)入全身循環(huán)是緩慢的，HA-順氯氨鉬產(chǎn)生的血漿AUC比靜脈注射順氯 氨鉬大3. 9倍，這與納米載體HA-順氯氨鉬較長的淋巴管滯留是一致的(圖1B，表2)。所 有組織的濃度圖見附圖(圖8A-8H)。另外，Sprague-Dawley鼠(200_250g，雌性，Charles River)被放置在異氟烷麻醉 條件下，將順氯氨鉬-HA或在0. 9%鹽水中的順氯氨鉬(3. 5mg/kg當(dāng)量順氯氨鉬)(η = 5) 皮下注射(IOOyL)入右乳房頰脂墊。動物被允許用食物和水進(jìn)行恢復(fù)。在注射1、4、12、 24,48和96小時后，動物通過過度劑量的異氟烷被無痛致死。器官和組織用0. 9%鹽水洗和 冷凍(_80°C )直至分析。血漿通過離心作用從全血中分離和冷凍(_80°C )。順氯氨鉬共軛 到HA影響順氯氨鉬在引流淋巴結(jié)的局部濃度，具有對系統(tǒng)濃度較小的影響(附圖10A-10B， 表5)。經(jīng)過96小時試驗時間，在右淋巴結(jié)(RLN)內(nèi)的順氯氨鉬-HA共軛物弧線下的區(qū)域 (AUC)，其排泄注射部位，比鹽水(p = 0. 0001)中的順氯氨鉬大74%，經(jīng)過測驗周期，RLN具 有增加的組織濃度(附圖10A)。順氯氨鉬-HA在非排泄左淋巴結(jié)(LLN)的AUC與順氯氨鉬 在鹽水(P = 0. 12)中的沒有顯著的區(qū)別。游離順氯氨鉬的突然釋放顯示在血漿濃度曲線上(附圖10B)，而順氯氨鉬-HA顯 示了一個較長的、持續(xù)的釋放進(jìn)入血漿。這是重要的，因為順氯氨鉬治療的劑量限制毒性受 血漿峰濃度的強(qiáng)烈影響。順氯氨鉬-HA和順氯氨鉬(P = 0. 13)之間在血漿AUC上沒有顯 著差異。因此，用順氯氨鉬-HA局部化治療可以產(chǎn)生足夠的血清濃度用于治療遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn) 移，同時對乳房淋巴管提供一個促進(jìn)的治療。順氯氨鉬在其它的器官的分布在研究周期內(nèi) 沒有顯著的區(qū)別(附圖11，表5)。4.長期的毒性Sprague-Dawley鼠(35個雌性)被隨機(jī)地分成每5只動物一組的7個研究組 1. Omg/kg皮下注射HA-順氯氨鉬(含銀和無銀；鉬相當(dāng)于1. Omg/kg順氯氨鉬)、3. 3mg/kg 皮下注射HA-順氯氨鉬(含銀和無銀)、靜脈注射順氯氨鉬1. 0和3. 3mg/kg、以及皮下注射 HA(對照；HA相當(dāng)于3.3mg/kg HA-Pt)。在30天研究周期的開始，每個動物被單次給藥單 次劑量。在研究的開頭兩周內(nèi)，每天收集尿樣品，在研究的第三和第四周內(nèi)，每隔三日收集 尿樣品(除了給藥3.3mg/kg含銀HA-順氯氨鉬的那組)。為了減少動物的壓力，試驗對象 被放在代謝蘢內(nèi)12小時以收集大約5ml的尿，然后放回有墊草的籠直至下一個收集期。尿 樣品在17000Xg離心5分鐘，在80°C儲存冷凍直至肌酸酐分析。尿肌氨酸酐用QuantiChrom 肌氨酸酐測定器材根據(jù)廠商規(guī)程(BioAssay Systems, Hayward, CA)分析。如下計算樣品的肌酸酐濃度，(0D樣品5-0D樣品1)/(ODSTD 5-0DSTD l)x[STD] (mg/dL)。OD 樣品 5、OD 樣品 1、0DSTD5 和 ODSTDl 分別為在 5 分鐘和 1 分鐘時樣品的0D510nm值和標(biāo)準(zhǔn)的0D510nm值。
在研究(30天)的結(jié)尾，動物被無痛致死，肝、兩側(cè)的腎、脾、肺、心臟、右(同側(cè)) 及左(對側(cè))腋下的結(jié)點、以及腦被完整的切除，儲存在80%的乙醇甲醛溶液過夜用于在載 片裝配前定置。Veterinary Lab Resources (Kansas City, KS)實施了使用蘇木精與曙紅 (H&E)著色的安裝。病理檢查由委員會認(rèn)可的未參與本項目的獸醫(yī)病理學(xué)家(University of Kansas Medical Center，Kansas City, KS)實施。尿肌氨酸酐水平是腎功能和腎毒性的一個間接指示，肌酸酐排泄減少對應(yīng)于腎功 能降低和可能的腎中毒或損壞。在動物中觀察的重要的腎毒性產(chǎn)生于高劑量銀(3.3mg/ kg)，3天肌酸酐排泄減少30%，4天減少70%。該組中的所有動物在治療1周內(nèi)死亡，由于 與藥物相關(guān)的惡病質(zhì)。相反，無銀高劑量HA-順氯氨鉬沒有表現(xiàn)出高毒性，肌酸酐水平在整 個研究期間保持接近用藥前水平。類似的腎功能情況出現(xiàn)在下列兩組中當(dāng)動物被低劑量 (1. Omg/kg)給藥含銀HA-順氯氨鉬或無銀HA-順氯氨鉬治療(P > 0. 05，1到30天)(圖 2A-2B)。在30天毒性研究結(jié)束時，動物被無痛致死，并實施了完全的病理檢查。所有研究 組的腦組織和注射部位的基礎(chǔ)組織(underlying tissue)是正常的，沒有微觀的改變。對于 高劑量靜脈注射順氯氨鉬和皮下注射無銀配制的HA-順氯氨鉬而言，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)有非常輕 微的改變。密集的幾乎沒有小囊結(jié)構(gòu)的小淋巴細(xì)胞顯示低劑量皮下注射含銀HA-順氯氨鉬 的淋巴組織具有正常外表(圖6A-6F)。對于接受小劑量順氯氨鉬靜脈注射和小劑量HA-順 氯氨鉬皮下注射的動物而言，觀察到的肝的非常細(xì)微的變化也被在該竇狀隙上輕微炎癥得 到證明(圖4A-4F)。對于接受高劑量靜脈注射順氯氨鉬和高劑量皮下注射HA-順氯氨鉬治 療的動物而言，觀察到輕微的退化伴隨著一些竇狀隙的壞死，在靜脈注射順氯氨鉬組中，壞 死更嚴(yán)重。另外，60%的接受低劑量靜脈注射順氯氨鉬的動物觀察到具有輕微的腎壞死，包 括溢血進(jìn)入腎小管以及管狀的浮腫(圖3A-3F)。相反，接受低劑量皮下注射HA-順氯氨鉬 的動物均沒有腎壞死。同樣地，五分之四(80%)的接受高劑量靜脈注射順氯氨鉬的動物與 五分之一(20%)的接受高劑量皮下注射HA-順氯氨鉬的動物相比，確診具有輕微的腎壞死 (表3)?？傊?，病理學(xué)研究證明，無銀HA-順氯氨鉬共軛物證明了腎和肝中毒的更低的發(fā)病 率，與傳統(tǒng)的靜脈注射順氯氨鉬治療在所有劑量范圍內(nèi)相比。另外，在治療的動物中，沒有 觀察到腦中的神經(jīng)中毒或基礎(chǔ)肌肉組織的局部注射部位中毒(圖5A-5F和7A-7D)。5.活體外藥物釋放在活體外，在有和沒有鹽水的磷酸鹽緩沖液中，確定順氯氨鉬從順氯氨鉬-HA的 釋放速度。順氯氨鉬-HA被加入到3500MWC0滲析袋(Pierce)和被放入一個磷酸鹽-緩沖 劑水浴(PH 7.4，37°C )或生理鹽水(140mM)中。樣品在預(yù)定時間點從該滲析袋中提取，并 保存在由AAS決定的順氯氨鉬濃度。順氯氨鉬從復(fù)合物中的釋放速度有其所處的磷酸鹽緩 沖溶液和水決定。鹽溶液中的Cl-被期望更快地置換順氯氨鉬，增加釋放速度。藥物的釋 放顯示了接近第一級釋放動力學(xué)，在水中具有42小時的釋放半衰期和在生理鹽水中為10 小時。AAS制出了一個從10到450ng/mL(R2 = 0. 9998)的線性濃度曲線，其具有5ng/mL的 檢測限和lOng/mL的量化限(5%標(biāo)準(zhǔn)偏差)。順氯氨鉬從順氯氨鉬-HA加標(biāo)物組織的回收 是血漿，82士4% (士STD)；淋巴結(jié)，92士2%;膀胱，88士 1%;腦，94士0.3% ；心臟，97士 1%; 腎，98士 ；肝臟，100士 ；肺，94士 ；肌肉，95士 ；脾，97士 1%。順氯氨鉬從順氯氨 鉬加標(biāo)組織的回收是血漿，80士3% ；淋巴結(jié)，92士6% ；膀胱，86士3% ；腦，93士 10% ；心臟，93士5% ；腎，100士2% ；肝臟，100士7% ；肺，95士8% ；肌肉，100士5% ；脾，96士9%。附圖16示出了在活體外，HA-順氯氨鉬在37°C對水和PBS溶液的釋放速度。表6 示出了相關(guān)的半衰期。6.活體外細(xì)胞毒性細(xì)胞系被種入DMEM介質(zhì)中的96孔孔板(5000細(xì)胞/孔孔)，補(bǔ)充有5% FBS和1 % 青霉素/鏈霉素。在24小時后，順氯氨鉬、順氯氨鉬-HA、或HA被加入(n= 12，濃度7)，在 加入72小時后，在10 μ L PBS中的reazurin孔藍(lán)被加入每個孔(最后濃度5mM)。4小時 之后，測量孑L焚光(入 ex 560nm, Xem 590nm) (SpectraMax Gemini, Molecular Devices), IC50由鹽水(陽性的)和無細(xì)胞的(陰性的)對照之間的中點確定。順氯氨鉬-HA共軛物在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中具有與游離順氯氨鉬相同的毒性。毒性在高度 轉(zhuǎn)移性的人類乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB-231中評估(附圖12)。在兩個細(xì)胞系，在順氯 氨鉬-HA(IC507y g/mL，順氯氨鉬基)和順氯氨鉬(IC507 μ g/mL)之間沒有看得出的毒性區(qū) 別。HA在測驗的濃度范圍(達(dá)到10mg/mL，數(shù)據(jù)未示出)內(nèi)對人類細(xì)胞的無毒性。表7示 出了 IC50的值。7.原子吸收光譜(AAS)在活體外，釋放樣品(η = 3)和血漿樣品(η = 5)分別被稀釋200倍和10倍，用 0. 的硝酸分析。通過在80°C在1. 5mL 6. 7%的硝酸中消化50mg組織1小時制備組織樣 品(除了淋巴結(jié))。淋巴結(jié)采用IOmg組織用上述類似方法制備。在消化之后，樣品被均化 (Tissue Tearor，BioSpec Products Inc.，Bartlesville，OK)。所有的樣品被離心(17000x g，20分鐘)，上層清液被用來分析。分析在一個帶有石墨熔爐和分隔管子的Varian SpectrAA GTA-110上實施。樣品 (21 μ L)使用自動取樣器被注入，繼之以19μ L的0. 的硝酸。每10個樣品在150、300 和450ng/mL通過檢定用基準(zhǔn)被分級，每5個樣品一個質(zhì)量控制樣品(150或300ng/mL)。在 0.1%硝酸(10濃度)中從1到450ng/mL制備一個完整的校準(zhǔn)曲線。順氯氨鉬的回收通過 順氯氨鉬或順氯氨鉬-HA(50 μ g/g)的標(biāo)記的組織空白和上述方法確定。該熔爐程序如下 斜面25到80°C，保持2s ；斜面達(dá)到120°C，保持IOs ；斜面達(dá)到1000°C，保持5s ；斜面達(dá)到 2700°C，保持2s ；經(jīng)過20s冷卻到25°C。石墨分割管每40樣品通過后在2800°C烘焙7s而 被清理。氬被用作注入和載體氣體。8.活體內(nèi)成像為了使納米載體輸送抗癌藥到乳房局部區(qū)域淋巴管內(nèi)納和微轉(zhuǎn)移瘤，載體應(yīng)該從 該乳房區(qū)域排出到患病的淋巴結(jié)。為了核實陰離子納米載體的移動，我們通過35kDa透明 質(zhì)烷與德克薩斯紅酰胼(AnaSpec，San Jose, CA)的耦合構(gòu)造了一個熒光陰離子納米載體， 使用EDAC作為媒介的酰胺耦合繼之以透滲析以去除游離染料(0. 1% w/w染料/載體，利 用分光設(shè)備確定)。我們在帶有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的異種移植的乳頭之下皮下注射熒光納米微粒 (0. 25yg 在 50yL 鹽水中)。熒光在IOnm帶通段從520到720nm進(jìn)行測量，使用一個冷卻的帶自動曝光的CXD 攝像機(jī)。成像是光譜未混合的，使用自動的反濾波工具(Maestro ver. 2. 4)以限制食物內(nèi) 葉綠素導(dǎo)致的皮膚和腸自身熒光。根據(jù)Chambers及其合作者的方法，淋巴管乳房腫瘤轉(zhuǎn)移在裸鼠內(nèi)被誘導(dǎo)，他們非常友善的提供了淋巴管轉(zhuǎn)移性的乳房腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-468LN。裸鼠(25_30g，雌性， CharlesRiver)被用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，100 μ L MDA-MB_468LN(107 細(xì)胞/mL)通過 一個小切口被正位的注射進(jìn)入左二胸乳房頰脂墊，該切口隨后用一個創(chuàng)傷夾封口。在4-5 周后，腫瘤是明顯的(100-300mm3)。在成像之前，鼠被麻醉。德克薩斯紅-HA(10mg/mL在 鹽水中，20μ L)被皮下注射到左乳房頰脂墊。輕輕地按摩注射面積5分鐘，在5到18小時 后，熒光成像(CRI Maestro Flex, CRI Inc.，Woburn ΜΑ)，使用 445 到 490nm 濾光的鹵素激 發(fā)燈和515nm的長傳輻射濾光器。注射四小時后，熒光成像(λ ex480，λ em 500-720nm，光譜濾波)示出了陰離子納 米微粒在一個區(qū)域其腋下結(jié)點組一致的積累(圖13A)。在該早期時間點，許多載體仍然處 于接近注射部位，盡管一些輸送到腋淋巴結(jié)腫瘤是明顯的。這些成像被去重(濾波)，所以 重疊的GFP和德克薩斯紅信號沒有顯示出黃色。該軟件包括一個共區(qū)域化工具證實德克薩 斯紅在該腫瘤區(qū)域內(nèi)。德克薩斯紅標(biāo)記納米載體的積累在該冠狀物觀察中更為明顯(圖 13B)。在注射18小時后，納米載體在環(huán)繞該腫瘤的腋下的結(jié)點集中(圖13C)。值得注 意的，在該注射部位，沒有載體熒光出現(xiàn)，與很高的腋下結(jié)點水平相比，沒有明顯蔓延到肝 臟。載體繞該腫瘤定位的明顯區(qū)域在該冠狀物觀察中出現(xiàn)。Kobayashi等注意到，陽離子的 PAMAM納米微粒沒有進(jìn)入淋巴管腫瘤，而是圍繞它們輸送。然而，陰離子載體具有一個更長 的滯留時間，可能允許該載體及其抗癌藥物進(jìn)入腫瘤。附圖13A-13C示出了帶有MDA-MB-468乳房淋巴管腫瘤用綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP) 表達(dá)的裸鼠在皮下注射后的淋巴管內(nèi)載體定位。附圖13A示出了鼠在左乳房頰脂墊被皮下 注射德克薩斯紅-HA 6時的乳房淋巴管腫瘤4。在5小時和18小時之后(分別為附圖13B 和附圖13C)，照片示出了在引流結(jié)點顯著的HA局部化和與該腫瘤的共同定位(GFP通道為 綠色，用4表示；德克薩斯紅通道為紅色，用6表示；藍(lán)色箭頭2是注射部位)。9.活性阿霉素共軛到該納米載體沒有顯著地影響其在乳腺癌細(xì)胞中抗癌活性。10% w/w 的共軛物被用于細(xì)胞，72小時后，使用Alamar藍(lán)色試驗(Invitrogen Corp.)確定細(xì)胞增 殖。在三個侵蝕性的人類乳房癌細(xì)胞系中，共軛物和游離阿霉素之間抗癌活性沒有靜態(tài)地 顯著差異。同樣地，順氯氨鉬共軛物被用于乳房癌細(xì)胞培養(yǎng)物。72小時后，順氯氨鉬共軛物 與游離順氯氨鉬沒有顯著地的不同?？傊?，抗癌藥共軛到納米載體的共軛物沒有減少其在 活體外的抗增殖效果。這可能是由于抗癌藥從納米載體釋放進(jìn)入該培養(yǎng)基，繼之以與游離 藥物一樣的攝取。然而，顯微學(xué)攝取研究暗示，即使共軛到一個陰離子載體，藥物也許具有 活性。10.合成方案附圖14A示出了樹枝狀大分子-順氯氨鉬共軛物的合成。該樹枝狀大分子的雙羥 丙基磷酸鹽末端被轉(zhuǎn)化為羧酸，其然后與順氯氨鉬通過該氯化物的置換形成復(fù)合物。得到 的復(fù)合物在生理條件下慢慢地釋放有效的DNA交聯(lián)劑順式[Pt (NH3) 2C1 (H20) ] +。在初始的 研究中，我們通過氯化鉬與一個載體羧酸的置換形成順氯氨鉬對透明質(zhì)烷載體的共軛物， 形成-C( = 0) OO-PtCl (NH3) 2共軛物。一個類似的方案可用于共軛順氯氨鉬到陰離子樹枝 狀大分子載體。該樹枝狀大分子的雙羥丙基磷酸鹽末端通過與Dess-Martin periodinane,(DMP)、IBX或IBA的輕微還原被轉(zhuǎn)化為羧酸，和臭氧化成羧酸。做為選擇，氫氧根可被轉(zhuǎn)化 成羧酸，通過與琥珀酸酐/DMAP的處理，盡管這將延伸該末端四個碳原子和擴(kuò)大該納米載 體。復(fù)合物可通過透滲析或交聯(lián)葡聚糖提純，納米載體上的藥物數(shù)量通過石墨熔爐原子吸 收光譜確定。順氯氨鉬共軛物最佳的量在大約10% -50%取代，更優(yōu)選地大約20% -40%, 最優(yōu)選地大約25% -35% .。例如，達(dá)到25% w/w共軛物在活體內(nèi)具有允許的主要的淋巴 攝取Pt (II)-透明質(zhì)烷納米微粒。附圖14B示出了樹枝狀大分子-表柔比星共軛物的合成。該樹枝狀大分子的雙羥 丙基磷酸鹽末端被轉(zhuǎn)變?yōu)轷ｋ?，其然后與該表柔比星形成一個PH靈敏的腙。得到的復(fù)合物 將響應(yīng)于細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)吞噬容器(endocytic vessels)內(nèi)減少的pH值而釋放表 柔比星。納米載體共軛物可以大大增加積累在癌細(xì)胞上的蒽環(huán)類的量。該pH靈敏的共軛物通過在蒽環(huán)類13-羰基和納米載體上的接枝酰胼之間使用腙 連接器而形成。該酰胼連接器通過使用文獻(xiàn)記載的方法圖示一個乙二酰阱到該羧酸殘留 物而形成，但一個更直接的方案可轉(zhuǎn)化該納米載體氫氧根末端直接成為酰胼，其將保持該 樹枝狀大分子的尺寸。胺末端被期待增加該載體的陽離子的特性，而低PKa酰胼(大約pH 4.5)將最小化在細(xì)胞外的效果。此外，該氫氧根末端的部分的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生足夠的酰胼以 共軛該預(yù)定藥物負(fù)載。在將該樹枝狀大分子的雙羥丙基磷酸鹽末端轉(zhuǎn)化成羧酸之后，用胼 實施活化，形成酰胼末端。該表柔比星共軛物通過該載體和表柔比星在PH 6. 5時的培養(yǎng)而 形成，形成可逆的腙連接器繼之以透滲析或交聯(lián)葡聚糖檢查以去除非共軛的藥物。表柔比 星共軛物最佳的量在大約5% -20%，更優(yōu)選大約8-15%，最優(yōu)選大約10% -12%。附圖14C示出了樹枝狀大分子-紫杉萜共軛物的合成。該紫杉萜被轉(zhuǎn)化成一個 受保護(hù)的蘋果酸，該新羧酸直接與該樹枝狀大分子的雙羥丙基磷酸鹽末端通過一個酯鍵連 接。該產(chǎn)生的復(fù)合物將保護(hù)組織免收紫杉萜毒性直至共軛物響應(yīng)于吞噬容器(endocytic vessels)和內(nèi)生的酯酶內(nèi)的減少的pH而釋放紫杉萜。紫杉萜可以被共軛到該樹枝狀大分 子未改性的雙羥丙基磷酸鹽末端，通過使用一個使用酯鍵嫁接于紫杉萜C2位置的蘋果酸 連接器。該紫杉萜C2-0H可以用1，2-0-異亞丙基-蘋果酸冷凝，形成一個受保護(hù)的紫杉萜 的蘋果酸。用乙酸脫保護(hù)將產(chǎn)生該蘋果酸，其可以被直接耦合到該樹枝狀大分子的氫氧根 臂上。得到的共軛物可以響應(yīng)于酸性的PH或酸性容器中內(nèi)生的酯酶而釋放紫杉萜。注射 后預(yù)期的半衰期期望大于4小時，根據(jù)我們對陰離子淋巴管納米載體的初步研究，其允許 淋巴管有足夠的時間攝取。紫杉萜共軛物的最佳的量可以在大約5% -20%之間，更優(yōu)選大 約8-15%，最優(yōu)選大約10%-12%。附圖15A示出了基于本發(fā)明的樹枝狀大分子的合成，并示出了我們實驗室的一個 總的合成方案，盡管我們正在測驗附加的基團(tuán)和取代基以進(jìn)一步的提高攝取量。從一個多 支臂芯體，我們正在通過碳二亞胺耦合繼之以脫保護(hù)側(cè)羥基而制造多代聚酯芯體。更多代 的生成從這些側(cè)羥基建立。在2-4代后，我們轉(zhuǎn)化成一個亞磷酸鹽支化單元(P3)。四唑被用 來耦合該P(yáng)3枝到該側(cè)氫氧根，繼之以硒轉(zhuǎn)化成該磷酸硒。當(dāng)脫保護(hù)時，“缺陷”枝狀物(紅 色星號)被有選擇地包括以產(chǎn)生被離子化的基團(tuán)，由此在該芯體之內(nèi)集成被離子化的基團(tuán) 以限制聚集和增加溶解度。電位可通過改變?nèi)毕葜钗锏谋嚷识欢ㄖ?。?-3代后，聚 磷酸硒酯枝狀物用有機(jī)過氧化物完全氧化，使用標(biāo)準(zhǔn)方法末端羥基被轉(zhuǎn)化為用于順氯氨鉬 共軛物的羧酸或用于阿霉素共軛物的腙。
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我們的初步研究確定，雙核心方案可以促進(jìn)合成。磷酸基可以被硒保護(hù)，否則，該 磷酸鹽是充分反應(yīng)性的以在共軛期間分裂支臂基團(tuán)；然而，在后代中，該內(nèi)磷酸硒被為了脫 保護(hù)氧化的后代所阻礙。為了克服這個問題，我們引入一個羧基酯核，其改進(jìn)了生物降解性 并縮小了空間擁擠，在該外部的磷酸鹽基團(tuán)氧化期間。完全地羧酸樹枝狀大分子已經(jīng)很成 熟，但如果用疏水的藥物高度取代時這些不是水溶的。我們使用該抗癌藥順氯氨鉬和阿霉 素，因為它們是用于多種包括頭和頸癌癥(HNC)和乳腺癌的癌癥的高效的第一線治療。附圖15B示出了靶向樹枝狀大分子的合成。該樹枝狀大分子的雙羥丙基磷酸鹽末 端用丙炔酸冷凝以形成炔_樹枝狀大分子?？蛇x擇地，COOH或C0NHNH2可以用炔丙基冷凝 以形成炔_樹枝狀大分子。用一個“click”方法，該樹枝狀大分子和EGF的該疊氮化物在 含水條件下耦合。該方案可被用于其他的靶向試劑如HER2抗體，EGFR抗體，PSMA,等等。該納米共軛物可通過該表皮生長因子受體(EGFR)瞄準(zhǔn)乳腺癌細(xì)胞，其被具有差 預(yù)測的侵蝕性乳房癌過分表達(dá)。此外，EGFR被吞噬并可用于內(nèi)在化納米載體共軛物到EGF。 盡管EGFR在下層通過其他的組織表達(dá)，該納米載體被動定位到該淋巴管將最小化非特異 的內(nèi)反應(yīng)。不同于全身的納米載體，該靶向部分可改進(jìn)細(xì)胞攝取，因為物理性質(zhì)只身可在該 淋巴結(jié)局部化陰離子納米載體。表皮生長因子(EGF)是一個具有賴氨酸殘留物的6054-Da蛋白質(zhì)，其可被用于連 接納米微粒而不降低與細(xì)胞之間的相互作用。由于該樹枝狀大分子的末端基團(tuán)取決于該樹 枝狀大分子是否用于順氯氨鉬(COOH)、紫杉萜(OH)或表柔比星(C = 0NHNH2)，很容易使用 一個“click”類型連接器，如此，所有的化學(xué)反應(yīng)可在水溶液中實施，并作為最終步驟。EGF 用疊氮基PEG-NHS酯(Quanta Biodesign Ltd. , Powell, OH)功能化。做為選擇，其它的靶 向試劑通過形成各自的疊氮化物可被容易的加入。炔可用DCC/DMAP試劑和炔丙醇(C00H末 端)或丙炔酸(0H和C = 0NHNH2末端)加入到該樹枝狀大分子末端。得到的靶向性炔-樹 枝狀大分子與含有少量銅催化劑的EGF疊氮化物混合以形成共軛物，繼之以交聯(lián)葡聚糖或 者透滲析提純以去除無束縛的EGF。11.腫瘤反應(yīng)無胸腺的裸鼠(nu/nu mice)被用1x106細(xì)胞(MDA-MB-468LN人類乳房癌細(xì)胞) 注入乳房頰脂墊，大約4周以后，一個100-200mm3的腫瘤在腋淋巴結(jié)外殼形成。動物被隨 機(jī)分成每組五個動物的共四個試驗組靜脈注射鹽水、皮下注射HA、靜脈注射順氯氨鉬、或 皮下注射HA-順氯氨鉬。此時，劑量給藥該動物們。在HA-順氯氨鉬和HA組，HA-順氯氨 鉬(3. 3mg/kg,以Pt含量為基準(zhǔn))或HA(3. 3mg/kg)被溶于IOOmcL鹽水，被瘤周皮下注射。 在順氯氨鉬和鹽水組，順氯氨鉬(3. 3mg/kg, Pt基)在IOOmcL鹽水中或僅僅鹽水被通過尾 部靜脈靜脈注射。在所有的研究組，1周之后第二劑量給藥。腫瘤體積使用卡尺和公式一周 測量一次體積=0. 52x(寬2*長)。當(dāng)腫瘤體積超出1000mm2或身體評分指數(shù)降到2之 下時，動物被無痛致死。附圖17A-17B示出了，HA-順氯氨鉬治療與陰性對照組相比腫瘤生長被推遲5周， 和與傳統(tǒng)的順氯氨鉬治療相比腫瘤生長被推遲2周。HA-順氯氨鉬配方與順氯氨鉬相比延遲腫瘤生長5周，且在HA-順氯氨鉬治療動物 中未觀察到毒性?？梢灶A(yù)期的是，HA-順氯氨鉬可能與靜脈注射順氯氨鉬具有類似的效力， 出乎意外的和重要的是HA-順氯氨鉬導(dǎo)致最初腫瘤生長較長時間的延遲，表明較高濃度的藥物到達(dá)該腫瘤以在初步治療周期內(nèi)更有效地抑制腫瘤的生長。這提供了使人信服的支持 性的佐證，HA-順氯氨鉬皮下給藥，在該乳房癌活體內(nèi)模式下，具有至少與標(biāo)準(zhǔn)順氯氨鉬配 方相同或比其更好的效力。12.阿霉素釋放HA用乙二酰阱(ADH)冷凝，在HA中的葡萄糖酸的羧基上。首先，ADH和HA (每等 量HA 二糖1等量ADH)與2等量的N-3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺氫氯化物 (EDAC)在水中混合，用HCl調(diào)節(jié)到pH 4. 7，最終的HA濃度為大約w/w。在20分鐘后， 該混合物使用13000MWC0透析管對水透析2天。產(chǎn)品然后在pH 6. 5的磷酸鹽緩沖液(2等 量HA 二糖每1等量D0X)中在黑暗中被共軛到阿霉素(DOX) 24小時。該混合物然后對pH 6. 5的磷酸鹽緩沖液透析2天。在使用前，最終的材料被冷凍干燥和在鹽水中重新組成。對 于釋放試驗，重新組成的HA-DOX或DOX被置于透析管內(nèi)和被放入一個包含pH 5、6. 0或7. 4 的磷酸鹽緩沖液且處于37deg C的水浴中。樣品從該透析管中提取，整個剩余的藥劑通過 具有熒光檢測器的HPLC使用標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線確定。附圖18表明阿霉素的釋放是pH的函數(shù)。釋放半衰期在pH 7. 4時為167小時，pH 6. 0時為107小時，pH 5. 0時為45小時。HA-DOX提供了十足的持續(xù)釋放，依賴于其環(huán)境的pH。它們可以提供實質(zhì)的利益， 如實性腫瘤的內(nèi)部已知是含氧量低的和具有低的PH，由此，與正常細(xì)胞組織相比，DOX從 HA-DOX的釋放可在腫瘤組織內(nèi)被提高。為了評價皮下注入鼠乳房的HA-阿霉素共軛物的效力，與靜脈注射阿霉素相比， 下列試驗被實施。MDA-MB-468LN腫瘤細(xì)胞如所述的進(jìn)入裸鼠，分成每5個動物一組的四組。 3周后，HA-DOX被注入瘤周3. 3mg/kg(D0X為基準(zhǔn))，DOX在鹽水中通過尾部靜脈被注入，HA 被注入瘤周，鹽水通過尾部靜脈被注入。動物在注入5周后被給予一個第二劑量。附圖19表明，通過納米載體-DOX治療，在第三和第五周兩周劑量后，腫瘤生長被 暫停。而可以預(yù)期的是，HA-阿霉素可能具有與靜脈注射阿霉素相同的效力，出乎意外的 和重要的是HA-阿霉素通過治療導(dǎo)致腫瘤生長完整的阻止，表明較高濃度的藥劑到達(dá)該腫 瘤，允許它在治療周期內(nèi)更有效地的抑制腫瘤生長。這提供了有說服力的證據(jù)，HA-阿霉素 皮下給藥與標(biāo)準(zhǔn)的阿霉素配方相比，在活體內(nèi)乳腺癌型時，在效力上是顯而易見的優(yōu)越的。HA-DOX與靜脈注射DOX或HA和鹽水對照相比，大幅延遲了腫瘤在動物體內(nèi)的生 長。在注入6周后，DOX和HA和鹽水對照組的腫瘤體積大于300mm3，而HA-DOX治療組的腫 瘤小于50mm3。該效應(yīng)是一個驚奇，DOX-HA不僅提供有效的腫瘤生長局部化控制，而且防止 了新局部的、區(qū)域的、或遠(yuǎn)的生長的出現(xiàn)。HA-DOX動物沒有顯示出由于劑量引起的任何一種 毒性。HA-DOX可以提供出色的局部區(qū)域控制作為一個“提高”劑量到該腫瘤的局部區(qū)域淋 巴管和細(xì)胞組織，緩慢的藥劑釋放也許能取代對很多多劑量的需要。另外，與靜脈注射DOX 相比，HA-DOX可以提供藥劑持續(xù)的血漿水平，由此代替對附加全身治療的需要。再次，持續(xù) 的藥劑釋放可以減少重復(fù)劑量的需要。因為局部化化療不被期望提供足夠的藥劑血漿水平 以提供遠(yuǎn)的腫瘤控制，因此這個結(jié)果是令人驚奇的。13.磷酸酯透明質(zhì)烷納米載體附圖20A舉例說明一個高度水溶性的和生物可降解的磷酸酯透明質(zhì)烷(phHA)納米載體。這些納米載體可如此處描述的被使用。附圖20B舉例說明PhHA-藥物共軛物的合成。phHA可被功能化以形成不穩(wěn)定的具 有抗癌藥物順氯氨鉬(頂部)、表柔比星(中間)和紫杉萜(底部)的共軛物(例如酯或 腙)。產(chǎn)生的復(fù)合物將保護(hù)細(xì)胞組織免于中毒直到共軛物由于吞噬容器和內(nèi)生酯酶中降低 的PH而釋放藥物為止。phHA通過AP在該淋巴管內(nèi)的脫磷將促進(jìn)該淋巴管內(nèi)共軛物積累和 持續(xù)釋放藥物。HA(30-50kDa，相當(dāng)于10_20nm)的羧基可被保護(hù)(例如，使用NMM/CDMT加入DMT)。 HA的初級醇可被轉(zhuǎn)化成一個磷酸酯(例如，使用1 1的H3P04和高錸酸溶液)。為了與 順氯氨鉬共軛，該DMT能被給予羧酸的酸從phHA中去除。對于表柔比星和紫杉萜，DMT可 被強(qiáng)親核試劑如乙二酰阱(ADH)取代以允許pH敏感的不穩(wěn)定的含有藥物的腙形成。phHA鈉可使用初始研究HA的方法中的相同的過程與順氯氨鉬共軛，通過與順氯 氨鉬(20-40% w/w)整夜的反應(yīng)，并對水透滲析提純。共軛的程度可通過石墨熔爐AAS確 定。蒽環(huán)類(阿霉素、表柔比星和柔紅霉素)可用于形成PH敏感的在結(jié)構(gòu)上與阿霉素 相似的共軛物，在蒽環(huán)類13-羰基和接枝酰胼之間在HA上使用腙連接器。該酰胼phHA(如 上所述)可通過在PH 5培育被共軛到表柔比星，繼之以透滲析提純。包括紫杉萜和紫杉醇的紫杉烷類現(xiàn)在可以被制備成一個無聚山梨酸酯配方。這可 通過形成與該納米載體耦合的無C7的酯實現(xiàn)，不損害抗癌性。紫杉萜可使用一個不穩(wěn)定的 蘋果酸連接器嫁接于紫杉萜的C2位置而被共軛到該phHA的C00H。14.活體內(nèi)HA-順氯氨鉬的效力HA-順氯氨鉬在活體內(nèi)的效力被研究。一旦動物HNSCC腫瘤達(dá)到100mm3體積，所 有的治療即開始。著手治療3周。所有動物的左側(cè)頰的口腔粘膜被提供5xlO~5MDA-1986 細(xì)胞(這是一個我今年研究成功的新的正位的HNSCC型)，在，腫瘤在2-3周后發(fā)育。附圖21A包括雌性無胸腺裸鼠(Nu/Nu)用自載的HA(皮下注射)、對照(鹽水皮 下注射)治療的效果圖，5只鼠用HA-順氯氨鉬每周劑量3. 3mg/kg皮下注射3周，3只鼠用 靜脈注射順氯氨鉬(每周劑量3.3mg/kg靜脈注射3周)。該圖表明，在所有5只動物中， HA-順氯氨鉬延遲了腫瘤生長，其中2只(HA-順3和HA-順4)在重要參數(shù)上的速率是相似 的，順氯氨鉬(對照)延遲了生長大約3周。然而在另一個3只動物中，2只動物對治療具 有完全的反應(yīng)，第三只(HA-順1)在它死前對治療具有部分反應(yīng)?？傊?，這顯示出了在活體 內(nèi)治療頭和頸鱗狀上皮細(xì)胞癌方面與標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射順氯氨鉬相比提高了的效力。為了評價該抗癌劑，特別是抗增殖性，將HA-順氯氨鉬在活體外在兩個人類頭和 頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(JMAR和MDA-1986)的效果與標(biāo)準(zhǔn)的CDDP相比，標(biāo)準(zhǔn)的MTS試驗被按 照廠商的說明規(guī)程被實施。一旦75%匯合，細(xì)胞被胰蛋白酶化(0.25%胰蛋白酶)，計數(shù)和放置在96-孔微量 滴定板(Costar，Cambridge, MA, USA) (1X103細(xì)胞/孔)，在100L的生長培養(yǎng)基中。在一 個整夜的粘附周期后，細(xì)胞被暴露在單獨和組合的不同濃度的KU135和17-AAG中三天。所 有的研究被實施三遍，獨立地至少重復(fù)三次。在3天的治療期之后，活細(xì)胞的數(shù)量用一個 比色的細(xì)胞增殖試驗(細(xì)胞滴定96含水非放射性的細(xì)胞增殖試驗，Promega, Madison WI, USA)確定，其測量該MTS 3-[4，5_ 二甲基噻唑-2yl]-5-[3-羧基甲氧苯基]-2-[4-磺苯基]-2H 四唑)(3- [4, 5-dimethylthiazol-2yl] -5- [3-carboxymethoxyphenyl] -2- [4-sul fophenyl]-2H tetrazolium)的生物還原，通過代謝的活性細(xì)胞的脫氫酶進(jìn)入可溶性甲臢 染料(soluble formazon product)，在電子耦合試劑PMS (甲硫酸吩嗪)存在的條件下。 為了實施該試驗，在緩沖劑(0. 2g/L KCl,8. Og/L NaCl，0. 2g/L KH2P04，1. 15g/L，133mg/mL CaCl2-2H20,100mg/mL，MgC12. 6H20，pH7. 35)中的包含 2mg/mL MTS 和 150M PMS 的 20L MTS/ PMS組合溶液被加入到每個孔，然后在37°C在一個加濕5%的C02環(huán)境下經(jīng)過3小時的培養(yǎng) 之后，在微板讀出器測量在490nm的吸光度。具有預(yù)定細(xì)胞數(shù)量的三倍的孔與試樣一起經(jīng) 受上述試驗，以標(biāo)準(zhǔn)化吸光度讀取；這也提供了內(nèi)在的證明，試驗在測量的吸光度和細(xì)胞數(shù) 量范圍內(nèi)是線性的。數(shù)據(jù)以％生命力從對照(細(xì)胞生命力)對藥物濃度(X軸)的函數(shù)繪 制。50%的細(xì)胞被阻止生長(IC50水平)的藥物濃度確定為標(biāo)準(zhǔn)吸光度-濃度曲線上的折 點ο附圖21B示出了細(xì)胞生命力對藥物濃度的百分率曲線，對于標(biāo)準(zhǔn)順氯氨鉬對兩個 細(xì)胞系在72小時藥物治療之后，藥物濃度從IOnM到100微摩爾濃度改變。附圖21C示出 了細(xì)胞生命力對藥物濃度的百分率曲線，對于HA-順氯氨鉬對兩個細(xì)胞系在72小時藥物治 療之后，藥物濃度從IOnM到100微摩爾濃度改變。IC50濃度從這些圖中作為折點被計算， 其中50%的細(xì)胞生長被抑制。值得注意的是，在⑶DP和HA-順氯氨鉬之間的IC50水平在 任一個細(xì)胞系中沒有顯著差異，表明在活體外，HA共軛物沒有不利地影響順氯氨鉬抑制癌 細(xì)胞生長和生命力的能力。15.活體內(nèi)阿霉素的釋放附圖22A-22F是顯示在一個鼠的右乳房頰脂墊單次注射之后HA-阿霉素分布的照 片。阿霉素具有天生的熒光，該藥物載體共軛物的分布和壽命可在評價期被很好的觀察。值 得注意的是，大部分藥物載體被輸送到腋淋巴結(jié)，其中，藥物經(jīng)過9天的間隔緩慢的釋放， 即使在9天之后，仍具有一些殘余活性。橢圓形標(biāo)記出在該乳房的注射部位，最深的濃度 (紅色)在腋下。附圖23是一個顯示腫瘤反應(yīng)的圖，即使在活體內(nèi)嚴(yán)重的晚期乳房癌腫瘤單次晚 期瘤周用HA-阿霉素治療后。附圖24A-24E是活體內(nèi)HA-阿霉素運(yùn)動的照片，在Maestro多通道熒光成像系統(tǒng) 上成像。進(jìn)入該鼠乳房的局部區(qū)域組織和淋巴結(jié)的藥物和載體被很好的攝取，即使在注射 4天后，其在該淋巴管內(nèi)很好的停留。表格表1示出了在人類乳房癌細(xì)胞系MDA-MB-468LN、MDA-MB-231和MCF-7上的順氯氨 鉬IC50的值。以順氯氨鉬相當(dāng)?shù)腜t基給出了 HA載體的IC5Qs。表權(quán)利要求
一種配置用于經(jīng)皮膚、皮內(nèi)、粘膜、粘膜下層、皮下、間隙、脂肪內(nèi)、瘤周、或肌肉注射給藥的化療組合物，該組合物包括一種藥物可接受的載體；和一種配置用于在皮下注射給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米共軛物；該納米共軛物包括一種配置用于在皮下或間隙給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米載體；和大量耦合到該納米載體的化療劑。
2.如權(quán)利要求1所述的化療組合物，其中，該納米共軛物具有大約IOnm到大約50nm的 尺寸。
3.如權(quán)利要求2所述的化療組合物，其中，該納米共軛物負(fù)載有大約10%到大約50% w/w的化療劑。
4.如權(quán)利要求3所述的化療組合物，其中，該納米載體是一種大約3kDa到大約50kDa 的透明質(zhì)烷聚合物。
5.如權(quán)利要求3所述的化療組合物，其中，該納米載體是一種樹枝狀大分子。
6.如權(quán)利要求3所述的化療組合物，其中，該化療劑選自順氯氨鉬、其它鉬藥物、苯丙 氨酸氮芥、絲裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道諾霉素、肽、單克隆抗體和多克隆抗體、 干擾素、氮芥類藥物、苯丁酸氮芥、乙胺碘呋酮、托泊替康、魏菲靈A、HSP90抑制劑、17-AAG、 VEGF抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制劑組蛋白脫乙?；敢种苿?、紫杉烷類、紫杉酚、紫杉 醇及其組合。
7.如權(quán)利要求3所述的化療組合物，其中，該化療劑通過一種生物可降解的連接器被 耦合到該納米載體。
8.如權(quán)利要求7所述的化療組合物，其中，該生物可降解的連接器是酸不穩(wěn)定的。
9.如權(quán)利要求7所述的化療組合物，其中，該組合物和/或納米共軛物基本上缺乏 PEG、HPMA, polyglutames 和 / 或銀。
10.如權(quán)利要求9所述的化療組合物，其中，該化療劑以一種有效治療的量存在，以 便提供一個與該化療劑的標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射給藥相比較高的淋巴管AUC和一個較低的淋巴液 Cmax0
11.一種用于治療和/或抑制癌癥的方法，該方法包括皮下給藥一種組合物，該組合 物具有一種藥物可接受的載體；和一種配置用于在皮下注射給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米共軛物；該納米共軛物包括一種配置用于在皮下或間隙給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米載體；和 大量耦合到該納米載體的化療劑。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，該納米共軛物具有大約IOnm到大約50nm的尺寸。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，該納米共軛物負(fù)載有大約10%到大約50%w/w 的化療劑。
14.如權(quán)利要求13的所述方法，其中，該納米載體是一種大約3kDa到大約50kDa的透明質(zhì)烷聚合物。
15.如權(quán)利要求13的所述方法，其中，該納米載體是一種樹枝狀大分子。
16.如權(quán)利要求13的所述方法，其中，該化療劑選自順氯氨鉬、其它鉬藥物、苯丙氨酸 氮芥、絲裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道諾菌素、肽、單克隆抗體和多克隆抗體、干擾 素、氮芥類藥物、苯丁酸氮芥、乙胺碘呋酮、托泊替康、魏菲靈A、HSP90抑制劑、17-AAG、VEGF 抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制劑、紫杉烷類、紫杉酚、紫杉醇及其組合。
17.如權(quán)利要求13的所述方法，其中，該化療劑通過一種生物可降解的連接器被耦合 到該納米載體。
18.如權(quán)利要求17的所述方法，其中，該生物可降解的連接器是酸不穩(wěn)定的。
19.如權(quán)利要求17的所述方法，其中，該組合物和/或納米共軛物基本上無PEG、HPMA、 polyglutames 禾口 / 或銀。
20.如權(quán)利要求19的所述方法，其中，該化療劑以一種有效治療的量存在，以便提供一 個與該化療劑的標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射給藥相比較高的淋巴管AUC和一個較低的淋巴液Cmax。
全文摘要
一種化療組合物可被配置用于皮下注射給藥并優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累，其也提供一種無毒的治療學(xué)系統(tǒng)濃度。該組合物可包括一種藥物可接受的載體，和一種配置用于在皮下注射給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米共軛物；該納米共軛物可包括一種配置用于在皮下或間隙給藥后優(yōu)先在淋巴管內(nèi)積累的納米載體，和大量耦合到該納米載體的化療劑。該納米共軛物具有大約10nm到大約50nm的尺寸，該納米共軛物負(fù)載有大約10％到大約50％w/w的化療劑。該納米載體可以是一種大約3kDa到大約50kDa的透明質(zhì)烷聚合物。做為選擇，該納米載體可以是一種樹枝狀大分子。
文檔編號A61K47/30GK101965201SQ200980108315
公開日2011年2月2日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者爽·蔡, 雷爾德·弗里斯特, 馬克·科恩 申請人:堪薩斯大學(xué)