專利名稱：Pai-1功能的治療性抑制劑及其使用方法
PA1-1功能的治療性抑制劑及其使用方法發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及修飾的PAI-I蛋白和核酸。本發(fā)明也涉及哺乳動(dòng)物PAI-I配體和調(diào) 節(jié)劑。本發(fā)明具體涉及多肽、多肽組合物以及編碼PAI-I配體和/或調(diào)節(jié)劑多肽的多核苷 酸。本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)PAI-I活性的聚合配體(polyligand)，所述聚合配體是同質(zhì)聚合配 體(homopoIyligand)或異質(zhì)聚合配體(heteropolyligand)。本發(fā)明也涉及位于細(xì)胞區(qū)域 內(nèi)的配體和聚合配體。本發(fā)明也涉及可用于為PAI-I配體和聚合配體提供空間調(diào)控的定位 束縛子(tether)和啟動(dòng)子序列。本發(fā)明還涉及可用于為PAI-I配體和聚合配體提供時(shí)序 調(diào)控的可誘導(dǎo)基因開關(guān)。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法。本發(fā)明還涉及治 療或預(yù)防纖維化的方法。
背景技術(shù)：
纖溶酶原激活劑抑制劑-1 (PAI-I)是一種組織纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶 纖溶酶原激活劑(uPA)的絲氨酸蛋白酶抑制劑，這種制劑能將酶原纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖維 溶解酶纖溶酶。PAI-I對纖維蛋白溶解的調(diào)節(jié)是正常血管功能的重要控制點(diǎn)，因?yàn)槔w維蛋 白積累會(huì)導(dǎo)致血栓，而纖維蛋白過度減少會(huì)導(dǎo)致出血。PAI-I在組織纖維化中也發(fā)揮重要 作用，可滅活基質(zhì)金屬蛋白酶以及產(chǎn)生纖溶酶(Takeshita，K等，American Journal of Physiology, 2004 (2) :449-456)，調(diào)節(jié)動(dòng)物模型PAI-1表達(dá)的研究表明，PAI-I與化學(xué)或免 疫介導(dǎo)損傷后纖維化的發(fā)病有關(guān)(Weisberg. AD等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.， 2005,25 :365-371)。PAI-I也參與腎、肺、心血管和代謝疾病(Cale, JM禾口 Lawrence, DA. Curr Drug Targets, 2007,8 (9) :971-81)及癌癥的病理生理學(xué)過程。許多研究支持PAI-I在心 臟疾病的發(fā)展中具有作用。例如，藥理學(xué)抑制PAI-I證明能提供保護(hù)抵抗血管緊張素 (antiotensin)-II 誘導(dǎo)的主動(dòng)脈重塑(Weisberg. AD 等，Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.，2005，25 :365-371)。此外，與野生型小鼠相比，觀察到PAI-I缺陷小鼠心肌梗塞后 心臟纖維化發(fā)展減慢(Takesita，K 等，American Journal of Pathology, 2004,164 (2) 449-455)。一些研究(回顧 Sobel，BE 等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.，2003，23 1979-1989)提示，血管壁PAI-I表達(dá)的改變可能導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化。調(diào)節(jié)心臟PAI-I表達(dá)的新制劑和方法有助于研究其在心臟疾病中的作用。此外， 本領(lǐng)域需要能抑制PAI-I活性的新制劑、治療和方法。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供連接于定位束縛子的哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和 /或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供連接于組織特異性啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合 配體和/或調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供連接于可誘導(dǎo)基因開關(guān)的哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配 體和/或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/ 或調(diào)節(jié)劑的方法，該方法是將所述配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑連接于定位束縛子或組織 特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種實(shí)現(xiàn)時(shí)序調(diào)控哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/ 或調(diào)節(jié)劑的方法，該方法是將所述配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑連接于可誘導(dǎo)基因開關(guān)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供可與PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑一起使用以提 供空間調(diào)控的定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供可與PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑一起使用以提 供空間調(diào)控的組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供可與PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑一起使用以提 供時(shí)序調(diào)控的可誘導(dǎo)基因開關(guān)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多 核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供基因構(gòu)建物，其包含編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配 體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸和定位束縛子或組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑 的多核苷酸的載體。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑 的多核苷酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑 的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因生物。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑治療或 預(yù)防心血管疾病的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑治療或 預(yù)防纖維變性疾病的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是一種將編碼PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸 轉(zhuǎn)移到心血管組織內(nèi)的方法。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是提供一種評價(jià)PAI-I在不穩(wěn)定斑塊形成中所具功能的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用經(jīng)過修飾可表達(dá)纖維溶解途徑抑制劑的單核細(xì)胞治 療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用經(jīng)過修飾可表達(dá)纖維溶解途徑抑制劑的單核細(xì)胞治 療或預(yù)防纖維變性疾病的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種包含連接于降解決定子的PAI-I蛋白的融合蛋白。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種包含連接于定位信號(hào)的PAI-I的融合蛋白。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序 列任選連接于編碼定位信號(hào)的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供基因構(gòu)建物，其包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或定位信號(hào)的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含基因構(gòu)建物的載體，所述基因構(gòu)建物包含對載體插 入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或定位信 號(hào)的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有包含基因構(gòu)建物的載體的宿主細(xì)胞，所述基因構(gòu)建 物包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定 子和/或定位信號(hào)的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)基因生物，其包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或定位信號(hào)的多核苷酸序列。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供基因構(gòu)建物，其包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或定位信號(hào)的多核苷酸序列，包括 遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含基因構(gòu)建物的載體，所述基因構(gòu)建物包含對載體插 入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或定位信 號(hào)的多核苷酸序列，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有包含基因構(gòu)建物的載體的宿主細(xì)胞，所述基因構(gòu)建 物包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定 子和/或定位信號(hào)的多核苷酸序列，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因生物，所述基因構(gòu)建物包含對 載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任選連接于編碼降解決定子和/或 定位信號(hào)的多核苷酸序列，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種改變宿主細(xì)胞PAI-I表達(dá)的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種改變心臟組織PAI-I表達(dá)的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生PAI-I表達(dá)改變轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供連接于降解決定子的哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和 /或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供連接于定位信號(hào)的哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/ 或調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多 核苷酸，其任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供基因構(gòu)建物，其包含任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決 定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供包含基因構(gòu)建物的載體，所述基因構(gòu)建物包含任選連接 于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有包含基因構(gòu)建物的載體的宿主細(xì)胞，所述基因構(gòu)建 物包含任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配 體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)基因生物，其包含任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決 定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供基因構(gòu)建物，其包含任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決 定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，包括 遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有基因構(gòu)建物的載體，所述基因構(gòu)建物包含任選連接 于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配體和/ 或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有包含基因構(gòu)建物的載體的宿主細(xì)胞，所述基因構(gòu)建 物包含任選連接于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配 體、聚合配體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng) 子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因生物，所述基因構(gòu)建物包含任 選連接于表位、報(bào)道分子、降解決定子和/或定位信號(hào)的編碼哺乳動(dòng)物PAI-I配體、聚合配 體和/或調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，包括遍在的組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供抑制宿主細(xì)胞PAI-I的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供抑制心臟組織PAI-I的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生PAI-I活性降低轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?。多肽和多核苷酸序列的描述SEQ ID NO :1-30代表PAI-I配體和聚合配體及其編碼多核苷酸的例子。圖9所 示為各個(gè)以下配體和聚合配體的圖，顯示了它們各自的肽組成體系結(jié)構(gòu)。具體地說，SEQ ID NO 1的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO :2編碼，其中已為哺乳動(dòng) 物表達(dá)和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :1的PAI-I聚合配體是同質(zhì)聚合配體的一個(gè) 實(shí)施方式，在文中稱為PAI1-DCY-94-1。SEQ ID NO 3的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 4編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá)和 載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :3的PAI-I聚合配體是單體配體(monomeric ligand) 的一個(gè)實(shí)施方式，在文中稱為PAI1-DCY-94-2。SEQ ID NO 5的PAI-I聚合配體由SEQ ID NO 6編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá)和 載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :5的PAI-I聚合配體是同質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施方式， 在文中也稱為PAI1-DCY-94-3。SEQ ID NO 7的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 8編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá)和 載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :7的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施方式， 在文中也稱為PAI1-DCY-94-4。SEQ ID NO 9的PAI-I聚合配體由SEQ ID NO 10編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá)和 載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :9的PAI-I聚合配體是單體配體(monomeric ligand)的一個(gè)實(shí)施方式，在文中稱為PAI1-DCY-94-5。SEQ ID NO :11的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 12編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá)和 載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :11的PAI-I聚合配體是單體配體(monomeric ligand) 的一個(gè)實(shí)施方式，在文中稱為PAI1-DCY-94-6。SEQ ID NO 13的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 14編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO: 13的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-7。SEQ ID NO 15的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 16編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO: 15的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-8。SEQ ID NO 17的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 18編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子SEQ ID NO: 17的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施方 式,在文中也稱為PAI1-DCY-94-9。SEQ ID NO 19的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 20編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID N0:19的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-10。SEQ ID NO 21的PAI-I聚合配體由SEQ ID NO 22編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子SEQ ID NO :21的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施方 式,在文中也稱為PAI1-DCY-94-11。SEQ ID NO 23的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 24編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :23的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-12。SEQ ID NO 25的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 26編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :25的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-13。SEQ ID NO 27的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 28編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :27的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-14。SEQ ID NO 29的PAI-1聚合配體由SEQ ID NO 30編碼，其中已為哺乳動(dòng)物表達(dá) 和載體插入優(yōu)化了密碼子。SEQ ID NO :29的PAI-I聚合配體是異質(zhì)聚合配體的一個(gè)實(shí)施 方式，在文中也稱為PAI1-DCY-94-15。SEQ ID NO :31_36是用于構(gòu)建配體和聚合配體的全長蛋白質(zhì)的例子。SEQID N0: 31稱為智人(Homo sapiens)纖溶酶原激活劑的抑制劑1，其公共登錄號(hào)為AAA60009。SEQ ID N0:32稱為智人玻連蛋白，其公共登錄號(hào)為EAW51082。SEQ ID NO :33稱為智人激肽釋 放酶2，前列腺同工型1，其公共登錄號(hào)為NP_005M2。SEQ ID NO :34稱為智人組織纖溶酶 原激活劑，其公共登錄號(hào)為BAA00881。SEQ ID NO :35稱為智人toll樣受體3，其公共登錄 號(hào)為NP_003256。SEQ ID NO :36稱為智人尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)，其公共登錄號(hào)為 CAAO1390 οSEQ ID NO 37-51是單體配體肽的例子。SEQ ID NO 37-51中的每一個(gè)在圖9中
12表示為母體蛋白質(zhì)名稱或其縮寫名稱，隨后為母體蛋白質(zhì)的氨基酸范圍，再后為按照約定 表示的任何氨基酸取代突變，即X#Z，其中，X是被取代的氨基酸的單字母氨基酸代碼，#是 母體蛋白質(zhì)內(nèi)該氨基酸殘基的位置或編號(hào)，Z是新取代氨基酸的單字母氨基酸代碼。SEQ ID NO 37 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在圖 9 中表示為 iPAI 1354-368' SEQ ID NO :38 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在圖 9 中表示為 iPAI 1300-309' SEQ ID NO :39 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在圖 9 中表示為 ‘PAI1343-353，。SEQ ID N0:40是SEQ ID NO :32的部分序列，在圖9中表示為‘玻連蛋白20-63，。SEQ ID NO 41是SEQ ID NO 32的部分序列，包含F(xiàn)32L取代突變，在圖9中表示 為‘玻連蛋白20-63F32L，。SEQ ID NO 42是SEQ ID NO :32的部分序列，包含T29A取代突變，在圖9中表示 為‘玻連蛋白20-63T29A' SEQ ID NO :43是SEQ ID NO 32的部分序列，包含E42A取代突變，在圖9中表示 為‘玻連蛋白20-63E42A，。SEQ ID NO 44是SEQ ID NO 32的部分序列，包含L43A取代突變，在圖9中表示 為‘玻連蛋白20-63L43A，。SEQ ID NO 45 是 SEQ ID NO 45 的部分序列，包含 S23F、T52E、D53L、A56Y 和 E57Y 取代突變，在圖9中表示為‘玻連蛋白20-63突變體’。SEQ ID NO 46是SEQ ID NO :33的部分序列，在圖9中表示為‘激肽釋放酶 2(25-256)，。SEQ ID NO 47 是 SEQ ID NO 33 的部分序列，在圖 9 中表示為 hK2 (25-44)。SEQ ID NO :48是SEQ ID NO :33的部分序列，在圖9中表示為‘激肽釋放酶 2(47-256)，。SEQ ID NO 49 是 SEQ ID NO 34 的部分序列，在圖 9 中表示為 ‘tPA(301-308)，。SEQ ID NO 50 是 SEQ ID NO 35 的部分序列，包含 V55A、N57Y、T59N、S79K、D81K 和 G83E 取代突變，在圖 9 中表示為 Ioll 樣受體 329-121 (V55A，N57Y, T59N, S79K, D81K, G83E)，。SEQ ID NO 51 是 SEQ ID NO 36 的部分序列，包含 H224A、D275A 和 S376A 取代突 變，在圖9中表示為‘尿激酶纖溶酶原激活劑(179-415)H224A，D275A，S376A，。SEQ ID NO :52表示用于產(chǎn)生天然間隔片段的全長蛋白質(zhì)的例子。SEQ IDNO 524也稱為特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)外切葡聚糖酶-6A前體(外纖維二糖水解 酶6A) (1，4-β-纖維二糖水解酶6A) (β-葡聚糖纖維二糖水解酶6A)(微晶粉末纖維素酶 2 (Avicelase 2))，其公共登錄號(hào)為 Q9C1S9。SEQ ID NO :53表示天然間隔片段的一個(gè)例子。SEQ ID Ν0:53是SEQ IDNO 52的 部分序列，在圖9中表示為‘16aa接頭’。SEQ ID NO :54_56是人造間隔的例子。SEQ ID NO 57-76代表用于本發(fā)明1類定位束縛子多肽的例子。

圖14A-14B顯示 以下1類定位束縛子多肽各自的圖，顯示了它們各自的肽組成體系結(jié)構(gòu)。SEQ ID NO 57的1類定位束縛子多肽也稱為91_1。SEQ ID NO 58的1類定位束縛子多肽也稱為91_2。
SEQIDNO59的1類定位束縛子多肽也稱為91-3。
SEQIDNO60的1類定位束縛子多肽也稱為91-4。
SEQIDNO61的1類定位束縛子多肽也稱為91-5。
SEQIDNO62的1類定位束縛子多肽也稱為91-6。
SEQIDNO63的1類定位束縛子多肽也稱為91-7。
SEQIDNO64的1類定位束縛子多肽也稱為91-8。
SEQIDNO65的1類定位束縛子多肽也稱為91-9。
SEQIDNO66的1類定位束縛子多肽也稱為91-10。
SEQIDNO67的1類定位束縛子多肽也稱為91-11。
SEQIDNO68的1類定位束縛子多肽也稱為91-12。
SEQIDNO69的1類定位束縛子多肽也稱為91-13。
SEQIDNO70的1類定位束縛子多肽也稱為91-14。
SEQIDNO71的1類定位束縛子多肽也稱為91-15。
SEQIDNO72的1類定位束縛子多肽也稱為91-16。
SEQIDNO73的1類定位束縛子多肽也稱為91-17。
SEQIDNO74的1類定位束縛子多肽也稱為91-18。
SEQIDNO75的1類定位束縛子多肽也稱為91-19。
SEQIDNO76的1類定位束縛子多肽也稱為91-20。
SEQIDNO77--95是用于構(gòu)建1類定位束縛子的多肽片段的例子。
SEQIDNO:96表示用作內(nèi)部運(yùn)載物(cargo)以構(gòu)建1類定位束縛子的表位標(biāo)簽的例子，在圖14A-14B中表示為‘TAG’。
SEQ ID NO :97-99是用于構(gòu)建1類定位束縛子的間隔的例子。
SEQIDNO=100-111代表用于本發(fā)明3類定位束縛子多肽的例子。圖15顯示以下3類定位束縛子多肽各自的圖顯示了它們各自的肽組成體系結(jié)構(gòu)。
SEQIDNO100 的3類定位束縛子多肽也稱為93-1。
SEQIDNO101 的3類定位束縛子多肽也稱為93-2。
SEQIDNO102 的3類定位束縛子多肽也稱為93-3。
SEQIDNO103 的3類定位束縛子多肽也稱為93-4。
SEQIDNO104 的3類定位束縛子多肽也稱為93-5。
SEQIDNO105 的3類定位束縛子多肽也稱為93-6。
SEQIDNO106 的3類定位束縛子多肽也稱為93-7。
SEQIDNO107 的3類定位束縛子多肽也稱為93-8。
SEQIDNO108 的3類定位束縛子多肽也稱為93-9。
SEQIDNO109 的3類定位束縛子多肽也稱為93-10。
SEQIDNO110 的3類定位束縛子多肽也稱為93-11。
SEQIDNO111 的3類定位束縛子多肽也稱為93-12。
SEQIDNO=112-129是用于構(gòu)建3類定位束縛子的多肽片段的例子。
SEQIDNO:130表示用作內(nèi)部運(yùn)載物(cargo)以構(gòu)建3類定位束縛子的表位標(biāo)簽
的例子，在圖15中表示為‘TAG’或‘TAG/IC’。
SEQ ID NO :131是用于構(gòu)建3類定位束縛子的合成TACE/ADAM17切割位點(diǎn)的例子。SEQ ID NO :132-139代表用于本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子序列的例子。SEQ ID NO 132是動(dòng)脈平滑肌特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為M0D5306，其結(jié) 構(gòu)描繪于圖10。SEQ ID NO :133是合成血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為MOD 5309，其結(jié)構(gòu)描繪于圖IlA0SEQ ID NO :134是合成血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為MOD 5312，其結(jié)構(gòu)描繪于圖11B。SEQ ID NO :135是合成血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為MOD 5315，其結(jié)構(gòu)描繪于圖11C。SEQ ID NO :136是內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為M0D4012-ESM1，其 結(jié)構(gòu)描繪于圖12A。SEQ ID NO :137是內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為M0D4399-FLT1，其 結(jié)構(gòu)描繪于圖12B。SEQ ID NO :138是合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為MOD 4790， 其結(jié)構(gòu)描繪于圖13A。SEQ ID NO :139是合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子，在文中也稱為MOD 4791， 其結(jié)構(gòu)描繪于圖13B。如本領(lǐng)域所共知，本文采用了三字母氨基酸代碼和單字母氨基酸代碼。附圖簡述圖1A-1F顯示了有或沒有間隔的同質(zhì)聚合配體的例子。圖2A-2J顯示了有或沒有間隔的異質(zhì)聚合配體的例子。圖3A-3H顯示了連接于定位信號(hào)的配體和聚合配體的例子。圖4A-4G顯示了連接于表位或報(bào)道分子的聚合配體的例子。圖5A-5I顯示了連接于定位信號(hào)以及表位或報(bào)道分子的聚合配體的例子。圖6A-6E顯示了包括任選連接于表位、報(bào)道分子和/或定位信號(hào)的配體或聚合配 體的基因構(gòu)建物的例子。圖7A-7D顯示了含配體基因構(gòu)建物的載體的例子。圖8顯示了用于組成型合成聚合配體的順序克隆方法的例子。圖9顯示了配體和聚合配體以及它們PAI-I抑制機(jī)制的例子。圖10顯示了動(dòng)脈平滑肌特異性啟動(dòng)子的例子。圖11A-11C顯示了合成的血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子。圖12A-12B顯示了內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子。圖13A-i;3B顯示了合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的例子。圖14A-14B顯示了 1類定位束縛子的例子。圖15顯示了 3類定位束縛子的例子。圖16顯示了 PAI-I配體和聚合配體的示例性抑制機(jī)制。圖17A-17H顯示了連接于降解決定子和/或定位信號(hào)的PAI-I的例子。圖18A-18I顯示了包含任選連接于降解決定子和/或定位信號(hào)的ULTRAVECTOR(UV)-能PAI-lcDNA的基因構(gòu)建物的例子。圖19A-19D顯示了含有ULTRAVECTOR(UV)-能PAI-I基因構(gòu)建物的載體的例子。圖20A-20J顯示了有或沒有間隔的連接于降解決定子的配體和同質(zhì)聚合配體的 例子。圖21A-21H顯示了有或沒有間隔的連接于降解決定子的異質(zhì)聚合配體的例子。圖22A-22F顯示了連接于降解決定子和定位信號(hào)的配體和聚合配體的例子。圖23A-23G顯示了包含任選連接于降解決定子和/或定位信號(hào)的配體或聚合配體 的基因構(gòu)建物的例子。發(fā)明詳述本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語具有本領(lǐng)域所理解的常規(guī)含義。例如，多核 苷酸可與核酸互換使用，包括單鏈和雙鏈DNA、RNA及其聚合類似物。術(shù)語嵌合表示由其天然狀態(tài)下不毗連的片段構(gòu)成。例如，嵌合型多核苷酸表示包 含其天然狀態(tài)下不毗連片段的多核苷酸。術(shù)語多肽、肽和蛋白質(zhì)可互換使用，代表氨基酸的聚合物。合成基因(或基因的一部分)是一種不同于野生型多核苷酸序列的非天然基因 (或基因的一部分)。合成基因(或基因的一部分)可包含一個(gè)或多個(gè)天然不毗連的核酸 序列(嵌合序列)，和/或可包含取代、插入和缺失以及它們的組合。非人生物包括非人靈長類、哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、植物以及包括酵母 和粘菌在內(nèi)的低等真核生物。限制性內(nèi)切酶是能在核酸分子內(nèi)的識(shí)別序列上切割核酸的酶。宿主細(xì)胞包括但不限于市售和非市售的細(xì)胞系，如從ATCC(馬納薩斯，弗吉尼亞 州)獲得的細(xì)胞、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血細(xì)胞、任何生物或組織的細(xì)胞。載體指用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的任何運(yùn)載體。載體可以是一 種復(fù)制子，其與另一 DNA區(qū)段相連可使所連區(qū)段復(fù)制。復(fù)制子指用作DNA體內(nèi)復(fù)制的自 主單元，即能在其本身控制下復(fù)制的任何遺傳元件(例如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病 毒)。術(shù)語載體包括用于在體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒運(yùn)載體。本 領(lǐng)域已知許多載體可用于操作核酸、將反應(yīng)元件和啟動(dòng)子摻入基因中，等等。可能的載體包 括，例如質(zhì)?；蛐揎椀牟《荆?，例如噬菌體，如λ衍生物，或質(zhì)粒，如pBR322或pUC質(zhì) 粒衍生物，或Bluescript載體?？捎糜诒景l(fā)明的載體的另一例子是如通過引用納入本文 的TO 2007/038276所述的弗吉尼亞州布萊克斯堡的英特列克星敦公司antrexon Corp., Blacksburg，VA)的UltraVector 產(chǎn)生系統(tǒng)。例如，可通過將合適DNA片段連接入具有互 補(bǔ)粘性末端的所選載體而實(shí)現(xiàn)將對應(yīng)于反應(yīng)元件和啟動(dòng)子的DNA片段插入合適載體中?；?者，可用酶修飾DNA分子的兩端，或者可將核苷酸序列(接頭)連接入DNA末端來產(chǎn)生任何 位點(diǎn)。可工程改造這種載體使之含有可選擇標(biāo)記基因以選擇標(biāo)記已摻入細(xì)胞基因組中的細(xì) 胞。這種標(biāo)記得以鑒定和/或選擇摻入了標(biāo)記并表達(dá)其所編碼蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已用于細(xì)胞以及活的動(dòng)物對象的各種基因遞送 應(yīng)用?？刹捎玫牟《据d體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘 病毒、單純皰疹病毒、E-B病毒、腺病毒、雙粒病毒和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括 質(zhì)粒、脂質(zhì)體、荷電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。除核酸外，載體還可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)域和/或用于選擇、檢測和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果(轉(zhuǎn)動(dòng)至何種組 織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間等)的可選擇標(biāo)記。術(shù)語質(zhì)粒指通常攜帶有基因的染色體外元件，它不是細(xì)胞中心代謝的一部分，通 常是環(huán)狀雙鏈DNA分子形式。這種元件可以是衍生自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，線 形、環(huán)狀或超螺旋形的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核 苷酸序列連接或重組入獨(dú)特構(gòu)建物中，該構(gòu)建物能將所選基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序 列連同合適的3’非翻譯序列一起引入細(xì)胞?？寺≥d體指復(fù)制子，它是單位長度的核酸，優(yōu)選DNA，能順序復(fù)制并包含復(fù)制起點(diǎn)， 例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，可將另一核酸區(qū)段與其相連從而復(fù)制該連接區(qū)段。克隆載體能在 一種細(xì)胞類型中復(fù)制，在另一種中表達(dá)(穿梭載體)?？寺≥d體可包含一條或多條序列而利 用其選擇包含該載體的細(xì)胞和/或一個(gè)或多個(gè)插入感興趣序列的多克隆位點(diǎn)。術(shù)語病毒載體指載體、質(zhì)粒或運(yùn)載體，其設(shè)計(jì)成能在轉(zhuǎn)化入宿主后表達(dá)所插入的 核酸序列?？寺〉幕?，即，插入的核酸序列通常置于調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子、最小啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子等的控制下?？捎糜隍?qū)動(dòng)核酸在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)或啟動(dòng)子種類 繁多，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。事實(shí)上，任何能驅(qū)動(dòng)這些基因表達(dá)的啟動(dòng)子都可用于表 達(dá)載體中，包括但不限于病毒啟動(dòng)子、細(xì)菌啟動(dòng)子、動(dòng)物啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、合成啟 動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、致病或疾病相關(guān)啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子、光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子；CYCU HIS3、GALU GAL4、GALlO, ADHU PGK、PH05、GAPDH、ADCU TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI、堿性磷酸酶啟動(dòng)子(用于在酵母菌中表達(dá))；AOXl啟動(dòng)子(用 于在畢赤酵母菌中表達(dá))；β-內(nèi)酰胺酶、1肌、￡1儀、切扒仕？、讓1^讓1 、17、切(3、和trc啟動(dòng) 子(用于在大腸桿菌中表達(dá))；光調(diào)節(jié)_、種子特異性_、花粉特異性_、子房特異性、花椰菜 花葉病毒35S、CMV 35S最低、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖1， 5- 二磷酸羧化酶、枝條-特異性、根特異性、殼多糖酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型、水稻東格魯桿狀病毒、 植物超級啟動(dòng)子、馬鈴薯亮氨酸氨肽酶、硝酸鹽還原酶、甘露堿合酶、胭脂堿合酶、泛素、玉 米蛋白和花青甙啟動(dòng)子(可用于在植物細(xì)胞中表達(dá))；本領(lǐng)域已知的動(dòng)物和哺乳動(dòng)物啟動(dòng) 子，包括但不限于SV40早期(SV40e)啟動(dòng)子區(qū)、勞斯肉瘤病毒(RSV)的3’長末端重復(fù)序列 (LTR)中所含的啟動(dòng)子、腺病毒(Ad)的ElA或主要晚期啟動(dòng)子(MLP)基因的啟動(dòng)子、巨細(xì)胞 病毒(CMV)早期啟動(dòng)子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子、桿狀病毒IEl啟動(dòng)子、 延伸因子la (EFl)啟動(dòng)子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動(dòng)子、泛素⑴be)啟動(dòng)子、白蛋白啟 動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-L啟動(dòng)子的調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、遍在啟動(dòng)子(HPRT、波形蛋白、 β-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等)、中間絲(索蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP等)的啟動(dòng)子、治療基 因(MDR、CFTR或VIII型因子等的)的啟動(dòng)子、致病或疾病相關(guān)啟動(dòng)子、和顯示組織特異性 及已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的啟動(dòng)子，例如在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控 區(qū)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)、在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因 調(diào)控區(qū)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒調(diào)控區(qū)；白蛋白基因、 在肝中有活性的Apo AI和Apo AII調(diào)控區(qū)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)、在肝中 有活性的α -抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因調(diào)控區(qū)、在 大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因調(diào)控區(qū)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕 鏈-2基因調(diào)控區(qū)、和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因調(diào)控區(qū)、丙酮酸激酶啟動(dòng)子、絨毛蛋白啟動(dòng)子、脂肪酸結(jié)合腸蛋白的啟動(dòng)子、平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子， 等等。此外，可通過加入增強(qiáng)子或調(diào)節(jié)序列等來修飾這些表達(dá)序列?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚 糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、利用基因槍或DNA載體運(yùn)輸?shù)鞍讓⑤d體引入所需 的宿主細(xì)胞中(參見，例如 Wu 等，J.Biol. Chem.洸7 :963(1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem.洸3 14621(1988)；和 Hartmut 等，加拿大專利申請?zhí)?2,012,311)。也可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)引入本發(fā)明的多核苷酸。在過去10年，用脂質(zhì)體體外包裹 和轉(zhuǎn)染核酸逐漸增多?？衫煤铣傻年栯x子脂質(zhì)制備用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因的脂質(zhì) 體，設(shè)計(jì)的陽離子脂質(zhì)能減少脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染遇到的困難和危險(xiǎn)(Feigner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027(1988)； 和Ulmer等，Science 259:1745(1993))。采用陽離子脂質(zhì)可促進(jìn)帶負(fù)電核酸的包裹，也 能促進(jìn)與帶負(fù)電細(xì)胞膜的融合(Feigner等，Science 337:387(1989))。W095/18863、 W096/17823和U. S. 5，459，127描述了轉(zhuǎn)運(yùn)核酸特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。采用脂質(zhì) 轉(zhuǎn)染將外源性基因體內(nèi)引入特定生物體具有一定的實(shí)用優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體分子可靶向特定細(xì)胞 代表了一類優(yōu)點(diǎn)。直接轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞類型顯然在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織，例如胰腺、肝臟、 腎臟和腦中特別優(yōu)選。為了靶向目的，可將脂質(zhì)與其它分子化學(xué)偶連(Mackey等，1988，同 上)?？蓪邢虻碾模缂に鼗蛏窠?jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)，例如抗體，或非肽分子化學(xué)偶聯(lián)于脂質(zhì) 體。也可采用其它分子來促進(jìn)核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(如W095/21931)、衍 生自DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的肽(如W096/25508)或陽離子聚合物(如W095/21931)。也可將載體作為裸DNA質(zhì)粒引入體內(nèi)(參見，美國專利號(hào)5，693，622、5，589，466 和5，580, 859)。還可采用受體介導(dǎo)的DNA遞送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147 (1992)；和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。術(shù)語轉(zhuǎn)染指細(xì)胞攝取外源或異源性RNA或DNA。當(dāng)這種RNA或DNA被引入細(xì)胞內(nèi) 時(shí)，稱該細(xì)胞被外源或異源性RNA或DNA轉(zhuǎn)染。當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA或DNA導(dǎo)致表型改變時(shí)，稱細(xì) 胞被外源或異源性RNA或DNA轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的RNA或DNA可以整合(共價(jià)相連)入構(gòu)成細(xì)胞 基因組的染色體DNA中。轉(zhuǎn)化指核酸片段轉(zhuǎn)移入宿主生物體的基因組中，從而導(dǎo)致遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳性。 含有被轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物稱為轉(zhuǎn)基因或重組生物或轉(zhuǎn)化生物。此外，包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體可包含它們要在其中擴(kuò)增或表達(dá)的細(xì)胞宿 主的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，標(biāo)記或可選擇標(biāo)記。術(shù)語可選擇標(biāo)記指一種可鑒定因子，通常是根據(jù)該標(biāo)記基因的作用而選擇抗生素 抗性或化學(xué)抗性基因(即抵抗抗生素、抵抗除草劑)、比色標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記等，可利用這 種作用來示蹤遺傳了感興趣核酸和/或鑒定已遺傳了該感興趣核酸的細(xì)胞或生物。本領(lǐng)域 已知并使用的可選擇標(biāo)記基因的例子包括提供氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、 潮霉素、雙丙氨磷除草劑、磺酰胺等抗性的基因；和可用作表型標(biāo)記物的基因，即花青苷調(diào) 節(jié)基因、異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因，等等。術(shù)語報(bào)道分子指編碼能依據(jù)報(bào)道分子的作用而得到鑒定的鑒定因子的核酸，可利 用這種來示蹤遺傳了感興趣核酸，鑒定已遺傳了感興趣核酸的細(xì)胞或生物，和/或檢測基因表達(dá)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已知并使用的報(bào)道分子的例子包括但不限于螢光素酶(Luc)、 熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡 糖醛酸糖苷酶(Gus)等?？蛇x擇標(biāo)記基因也可視作報(bào)道分子。啟動(dòng)子和啟動(dòng)子序列可互換使用，指能控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序 列。編碼序列通常位于啟動(dòng)子序列的3’端。啟動(dòng)子可以全部衍生自天然基因，或由衍生自 天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或者甚至可包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人 員知道不同啟動(dòng)子可指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型，或不同發(fā)育階段，或在對不同環(huán)境或生理 條件反應(yīng)時(shí)的基因表達(dá)?？蓪?dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中大部分時(shí)間內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子通常 稱為組成型啟動(dòng)子?？蓪?dǎo)致基因在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為細(xì)胞特異性啟動(dòng) 子或組織特異性啟動(dòng)子?？蓪?dǎo)致基因在發(fā)育或細(xì)胞分化特定階段表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為發(fā) 育特異性啟動(dòng)子或細(xì)胞分化特異性啟動(dòng)子。在與能誘導(dǎo)啟動(dòng)子的藥物、生物分子、化學(xué)品、 配體、光等接觸或用這些物質(zhì)處理細(xì)胞后，誘導(dǎo)和導(dǎo)致了基因表達(dá)，這種啟動(dòng)子通常稱為誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子或可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。還應(yīng)知道，由于在大多數(shù)情況中調(diào)控序列的確切邊界并不完 全明確，不同長度的DNA片段可具有相同的啟動(dòng)子活性。啟動(dòng)子序列在其3’末端通常結(jié)合有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并向前延伸(5’方向)而包含 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄水平超過背景而可檢測的所需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中可找到 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通過，例如核酸酶Sl圖譜不難確定)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。術(shù)語同源性指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分之間的相同性百分比?？捎帽绢I(lǐng)域已 知的技術(shù)測定一個(gè)部分的序列與另一部分的序列之間的對應(yīng)性。例如，可排列對比序列信 息并利用不難獲得的計(jì)算機(jī)程序來直接比較兩個(gè)多肽分子之間的序列信息從而測定同源 性?；蛘?，可在同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，然后用單鏈同源性核 酸酶消化并測定消化片段的大小來測定同源性。本文所用的術(shù)語同源的所有語法形式和拼寫變化形式指具有共同進(jìn)化起源的蛋 白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白質(zhì)和不同物種的同源 蛋白質(zhì)(例如，肌球蛋白輕鏈等)(Reeck等，Cell 50 :667 (1987))。序列高度相似反映了這 種蛋白質(zhì)(和它們的編碼基因)具有序列同源性。然而，在常規(guī)應(yīng)用和本申請中，當(dāng)術(shù)語同 源采用副詞(例如高度)修飾時(shí)，指序列相似性而不指共同的進(jìn)化起源。因此，術(shù)語序列相似性的所有語法形式指可能具有或不具有共同進(jìn)化起源的核酸 和蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間的相同性或?qū)?yīng)性程度(參見Reeck等，Cell50 :667(1987))。 在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)二條DNA序列在確定長度上有至少約50% (例如，至少約75^^90% 或95%)的核苷酸匹配時(shí)，稱這兩條DNA序列基本上同源或基本上相似?？衫靡延械男?列數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在(例如)特定系統(tǒng)所規(guī)定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行Southern雜交實(shí)驗(yàn)比 較序列，從而鑒定基本上同源的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定合適的雜交條件(參 見例如，Sambrook等，1989，同上)。本文所用的基本上相似，指核酸片段中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變導(dǎo)致一個(gè)或 多個(gè)氨基酸取代，但不影響該DNA序列所編碼蛋白質(zhì)的功能特性?；旧舷嗨?，也指核酸片 段中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變不影響該核酸片段(用反義或共-阻遏技術(shù)檢測)介導(dǎo) 基因表達(dá)改變的能力?；旧舷嗨?，還指本發(fā)明核酸片段的修飾，例如缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基不實(shí)質(zhì)性影響所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的功能特性。因此，應(yīng)該知道本發(fā)明包括多個(gè) 具體的示范性序列。提到的各種修飾是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)中所熟知，如測定編碼的產(chǎn)物是否 保留了生物學(xué)活性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還可通過在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下(0. IX SSC,0. 1% SDS,65°C 和用2X SSC, 0. 1% SDS，然后用0. IX SSC, 0. 1% SDS洗滌)能否與本文舉例的序列雜交來 確定本發(fā)明包括的基本上相似的序列。本發(fā)明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列與本 文報(bào)道的核酸片段的DNA序列有至少約70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。本文所用術(shù)語相對應(yīng)指相似或同源序列，而無論檢測相似性或同源性的分子某確 切位置是否相同或不同。核酸或氨基酸序列排列比對時(shí)可包括空格。因此，術(shù)語相對應(yīng)指 序列相似性，而不指氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號(hào)。氨基酸或核苷酸序列的實(shí)質(zhì)性部分包含足夠長的多肽氨基酸序列或基因核苷酸 序列，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過手工操作評價(jià)序列，或采用諸如BLAST (局部序列比對基本 檢索工具；Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403 (1993))；可從 ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 獲 得)等算法進(jìn)行計(jì)算機(jī)自動(dòng)序列比較和鑒定來推測性鑒定該多肽或基因。通常，10個(gè)或更 多個(gè)毗連的氨基酸或30個(gè)或更多個(gè)核苷酸的序列是推測性鑒定某多肽或核酸序列是否與 已知蛋白質(zhì)或基因同源所必需。此外，對于核苷酸序列，包含20-30個(gè)毗連核苷酸的基因特 異性寡核苷酸探針可用于基因鑒定(例如，Southern雜交)和分離(例如，細(xì)菌菌落或噬 菌體噬斑的原位雜交)的序列依賴性方法。另外，12-15個(gè)堿基的短寡核苷酸可用作PCR中 的擴(kuò)增引物以獲得包含該引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的實(shí)質(zhì)性部分應(yīng)包含足 夠長的序列以特異性鑒定和/或分離包含該序列的核酸片段。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種連接于降解決定子的PAI-I蛋白。降解決定子可 連接在PAI-I蛋白的氨基末端或羧基末端。降解決定子，或降解決定信號(hào)是本領(lǐng)域已知 的，是一種短的、通常為可誘導(dǎo)多肽降解的便攜式元件，它幾種例子描述于Garcin，D等， Journal of Virology, 2004, 78 (16) :8799-8811 以及(Gardner，RG 和 Hampton，RY，The EMBO Journal, 1999,18(21) :5994_6004。連接于降解決定子的 PAI-1 的例子見圖 17A、17B、17E、 I7F、17G 和 17H。本發(fā)明另一個(gè)方面是提供連接于定位信號(hào)的PAI-I蛋白。細(xì)胞定位信號(hào)的非限制 性例子有定位于肌質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞外基質(zhì)、線粒體、高爾基體、過氧化物酶體、溶酶體、核、 核仁、核內(nèi)體、外體、其他胞內(nèi)囊泡、胞質(zhì)膜、頂膜和基底外側(cè)膜的信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方式中， PAI-I通過例如美國臨時(shí)申請60/957，328中所述的那些非細(xì)胞特異性胞質(zhì)膜定位信號(hào)傳 遞到細(xì)胞外表面。在其他實(shí)施方式中，PAI-I通過細(xì)胞特異性定位信號(hào)，如成纖維細(xì)胞、內(nèi) 皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞肌膜的特異性定位信號(hào)，傳遞到細(xì)胞外表面。在 其他實(shí)施方式中，PAI-I通過胞外相關(guān)結(jié)構(gòu)域，例如膠原結(jié)合蛋白，傳遞到胞外基質(zhì)，或心肌 梗塞區(qū)富含的其他胞外組分。圖17C-17H顯示了連接于定位信號(hào)的PAI-I的其他例子。給 出的定位信號(hào)僅是舉例而不是限制。本發(fā)明一方面是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述多核苷酸為插入U(xiǎn)LTRAVECT0R(弗吉尼亞州布萊克斯堡的英特列克星敦公司 (Intrexon Corp. Blacksburg, VA)，US2004/0185556)質(zhì)粒載體已經(jīng)過優(yōu)化。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，通過除去以下內(nèi)部限制性位點(diǎn)NgoMIV、Xma I, Cla I, BamH I, BstB I, EcoR I、RcoR V,Pci I、Sac I、Stu I, ApaL I,Bgl II, Kpn I, Mfe I, Nde I, Nhe I, Nsi I, Asc I、 AsiS I,Bsiff I,Fse I,Mlu I,Not I,Pac I.Sal I,SbfI,SnaB I,Swa I,Rsr IIl、RsrII2、 BstXKSap I、BsmB I、Xba I、Xho I、Hpa I、Pml I、Sph I、Aar I、Bgl I、BsmB I、BspM I、 BstAP I、BstX I、Dra III, Ear I、Sap I、Blp I和BspE I，對插入載體的多核苷酸已進(jìn)行 了優(yōu)化。本發(fā)明一方面是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列連 接于降解決定子多核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述降解決定子序列連接于PAI-I多 核苷酸序列的5'端(例如，見圖18C和18H)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述降解決定 子序列連接于降解決定子多核苷酸序列的3'端(例如，見圖18B和18F)。本發(fā)明另一方面是提供對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列 連接于定位信號(hào)(例如見圖18D-18I)。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及選擇性調(diào)控載體插入優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列在 所需細(xì)胞、組織或生理狀態(tài)中表達(dá)的基因構(gòu)建物。所述基因構(gòu)建物可包括任選連接于降解 決定子和/或定位信號(hào)的PAI-I基因構(gòu)建物。示例性的基因構(gòu)建物見圖13A-13E、23A-23G 和18A-18I。所述基因構(gòu)建物的啟動(dòng)子部分可以是組成型啟動(dòng)子、非組成型啟動(dòng)子、組織特 異性啟動(dòng)子(組成型或非組成型)或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的組織特異性啟動(dòng)子 的非限制性例子是內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(White，SJ等，Gene Ther. 2007/11/8[印刷前 電子公開])，血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Ribault，S，Circ Res.，2001，88 (5) :468-75; Appleby, CE 等，Gene Ther. 2003，10 (18) :1616-22)，心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Xu, L 等，J Biol Chem.，2006，281 (45) =34430-40)，冠脈脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，以及心臟成纖維細(xì)胞 特異性啟動(dòng)子。組合的組織和狀態(tài)特異性啟動(dòng)子如心臟和缺氧特異性啟動(dòng)子(Su，H等，Proc Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 2004,101 (46) =16280-5)也可用于本發(fā)明?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子可用藥 物或其他因子激活。RHE0SWITCH是一種從馬薩諸塞州伊普斯威奇市新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室 (New England BioLabs, Ipswich,ΜΑ)購得的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)，可用于本發(fā)明。本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方式包括表達(dá)受可誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控的PAI-I基因構(gòu)建物。201本發(fā)明另一方面提供含基因構(gòu)建物的載體，以表達(dá)本文所述的為哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)和載體插入而優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列。載體可以是本文所述的病毒載體或非病 毒載體。這種載體的非限制性例子見圖19A-19D。圖19Α顯示了通用形式含載體插入優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列和任選的定位信號(hào) 和/或降解決定子的載體，其中的基因構(gòu)建物可作為一個(gè)單元從載體上釋放而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物。例如，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化使所述基因構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因從載體骨架釋放。然 后將釋放的轉(zhuǎn)基因注射到小鼠受精卵的原核中；或用該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞。圖19Α所 示的載體也可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子和密碼子為哺乳動(dòng)物表達(dá)已 進(jìn)行了優(yōu)化。圖19Β和19C描繪了用于遞送和控制PAI-I多肽體內(nèi)表達(dá)的基因治療載體的實(shí)施 方式。圖19Β和19C中連接于基因構(gòu)建物的多核苷酸序列包括基因組整合結(jié)構(gòu)域以利于轉(zhuǎn) 基因整合入病毒基因組和/或宿主基因組中。圖19D顯示了用于產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的含定位信號(hào)基因構(gòu)建物的載體。本發(fā)明另一方面提供了含有載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含基因構(gòu)建物，以表達(dá)本文所述的為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列。在一個(gè)實(shí) 施方式中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括人、非人靈長類、小鼠、牛、豬、羊、 馬、大鼠、兔、狗、貓和豚鼠細(xì)胞。宿主細(xì)胞的具體類型包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。本發(fā)明另一方面提供含有為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和載體插入而優(yōu)化的PAI-I多核 苷酸序列的轉(zhuǎn)基因生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因宿主是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基 因宿主包括非人靈長類、小鼠、牛、豬、羊、馬、大鼠、兔、狗、貓和豚鼠。將完整的轉(zhuǎn)基因注射 到受精卵母細(xì)胞的原核內(nèi)或胚胎干細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。完整的轉(zhuǎn)基因包括為哺乳 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和載體插入而優(yōu)化的PAI-I多核苷酸序列，任選連接于本文所述的降解決定 子、定位信號(hào)或組成型啟動(dòng)子、非組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子(組成型或非組成型) 或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。所述轉(zhuǎn)基因生物可用作動(dòng)物模型來確定PAI-I在心臟中的作用。本發(fā)明另一方面是改變宿主細(xì)胞PAI-I表達(dá)的方法，包括將包含編碼至少一個(gè) PAI-I拷貝的載體插入優(yōu)化的核酸分子的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，并在適合產(chǎn)生至少一個(gè) PAI-I拷貝的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面是改變對象心臟組織PAI-I表達(dá)的方法，包括將包含編碼至少一 個(gè)PAI-I拷貝的載體插入優(yōu)化的核酸分子的載體注射入對象的心臟組織。本發(fā)明另一方面是一種產(chǎn)生具有PAI-I表達(dá)改變的轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?，包括將?含編碼至少一個(gè)PAI-I拷貝的載體插入優(yōu)化的核酸分子的載體注射入受精卵或胚胎干細(xì) 胞中。本發(fā)明一個(gè)方面是通過截短和/或氨基酸取代修飾天然底物和/或調(diào)節(jié)劑從而提 供PAI-I活性的新型配體抑制劑。本發(fā)明另一個(gè)方面是通過將新型抑制劑及其變體連接在一起從而提供PAI-I活 性的模塊式聚合配體抑制劑。本發(fā)明又一方面是通過與降解決定子相連而限制PAI-I抑制 劑、配體或聚合配體的活性。本發(fā)明再一個(gè)方面是通過與定位信號(hào)相連而使PAI-I抑制劑、 配體或聚合配體細(xì)胞定位。本發(fā)明的一個(gè)方面包括抑制PAI-I作為預(yù)防心臟組織纖維化的方法。通過抑制 PAI-I將緩解對纖溶酶原激活劑的抑制，導(dǎo)致纖溶酶原活化成纖溶酶而破壞纖維蛋白。增強(qiáng) 患病心臟纖維蛋白的破壞是治療或預(yù)防II型糖尿病、高甘油酯血癥、高血壓、肥胖癥、煙草 接觸或其他原因所致心肌病的一種潛在方法。本發(fā)明其他方面包括用于任何組織的PAI-I抑制劑。本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括通過與靶向細(xì)胞某區(qū)域的定位信號(hào)相連而使PAI-I 抑制劑定位于不同細(xì)胞位置。本發(fā)明涉及PAI-I的多肽配體和聚合配體。PAI-I配體和聚合配體的各種實(shí)施方 式代表為SEQ ID NO :1-30和SEQ ID NO :37-51。更具體地說，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NO: 37-51中任何一個(gè)或多個(gè)的配體、同質(zhì)聚合配體和異質(zhì)聚合配體。此外，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO :31-36的一個(gè)或多個(gè)部分序列(截短片段)或其任一部分的配體和聚合配體。此 外，本發(fā)明涉及與包含SEQ IDNO 37-51中一個(gè)或多個(gè)或者其任一部分的聚合配體有至少 約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列相同性的聚合配體。此外，本發(fā)明涉 及與包含SEQ ID NO :31-36的一個(gè)或多個(gè)部分序列的聚合配體有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列相同性的聚合配體。聚合配體可以是同質(zhì)聚合配體或異質(zhì)聚合配體，是由兩個(gè)或多個(gè)單體多肽配體構(gòu) 成的嵌合配體。同質(zhì)聚合配體的例子見圖4A-4F。異質(zhì)聚合配體的例子見圖6A-6J。單體 配體的一個(gè)例子是SEQ ID NO :40所示的多肽。SEQ ID NO :40是從親本全長SEQ ID NO 32 中選出的部分序列。同質(zhì)聚合配體的一個(gè)例子是包含SEQ ID NO :37的二聚體或多聚體的 多肽。異質(zhì)聚合配體的一個(gè)例子是包含SEQ ID NO 37和SEQ ID NO :38-51之一或多個(gè)的 多肽。SEQ ID NO :37-51中的每一個(gè)代表了一個(gè)單體形式的多肽配體。SEQ ID NO 37-51 是選出的SEQID NO 31-36部分序列的例子，然而，SEQ ID NO :31-36的其他部分序列也可 用作單體配體。SEQ ID NO 31-36的單體部分序列可以與親本多肽如SEQ IDNO 40的一部 分相同。此外，SEQ ID NO :31-36的單體部分序列可含有氨基酸取代，如SEQ ID NO :41_45。 此外，單體配體和聚合配體與包含SEQ ID NO :37-51之一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列的配體的 序列相同性至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。此外，單體配體和聚 合配體與SEQ ID NO 31-36的部分序列的序列相同性至少約80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%禾口 99%。有許多方法可將SEQ ID NO :37_51并入同質(zhì)聚合或異質(zhì)聚合配體。此外，有許多 方法可將SEQ ID NO 31-36的其他部分序列相互合并和與SEQ IDNO :37-51合并得到聚合 配體。同質(zhì)聚合配體體系結(jié)構(gòu)的非限制性例子見圖1A-1F。異質(zhì)聚合配體體系結(jié)構(gòu)的非限 制性例子見圖2A-2J。本發(fā)明涉及同質(zhì)聚合配體和異質(zhì)聚合配體的所有可能組合，對此沒有 限制。本發(fā)明的配體和聚合配體被設(shè)計(jì)成能調(diào)節(jié)PAI-I的內(nèi)源功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體或聚合配體是本文所述的PAI-I配體或聚 合配體。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體或聚合配體與本文所述PAI-I配體或聚合 配體至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體或聚合配體是本文所述的PAI-I配體或聚 合配體，所述配體或聚合配體已經(jīng)過修飾而包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入、截短， 或它們的組合。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與SEQ ID NO :1_30中奇數(shù)編號(hào)序列所示多肽至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同的多月太。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與SEQ ID NO :1_30中偶數(shù)編號(hào)序列所示多核苷酸至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同的多核苷酸。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述PAI-I配體或聚合配體包含至少一個(gè)與SEQ ID NO 37-51 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 相同的肽。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述PAI-I配體或聚合配體具有以下抑制機(jī)制潛 伏狀態(tài)、將PAl轉(zhuǎn)變成底物、空間位阻tPA結(jié)合、空間位阻內(nèi)源玻連蛋白的、或直接競爭結(jié)合 位點(diǎn)的至少一種。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本文所述PAI-I配體或聚合配體的多核苷酸。本發(fā)明的聚合配體在諸單體之前、之后或之間任選包含間隔氨基酸(示例性的體 系結(jié)構(gòu)見圖1D-1F和圖2F-2J)。
本發(fā)明意圖包括同質(zhì)聚合配體和異質(zhì)聚合配體的所有組合，而不僅限于上下文給 出的例子。在本說明書中，術(shù)語“配體”包括單體配體、聚合配體、同質(zhì)聚合配體和/或異質(zhì) 聚合配體。術(shù)語配體還包括誘騙劑、抑制劑和調(diào)節(jié)劑。單體配體是一種多肽，所述多肽的至少一部分能夠被PAI-I識(shí)別。所述多肽能夠 被識(shí)別的這部分稱為識(shí)別基序。在本發(fā)明中，識(shí)別基序可以是天然的或合成的基序。識(shí)別 基序的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于天然產(chǎn)生的PAI-I底物、假底物基序以及PAI-I 調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白中存在的相互作用結(jié)構(gòu)域及其修飾形式。通常通過鑒定和分離假定的PAI-I相互作用結(jié)構(gòu)域識(shí)別基序來構(gòu)建基于天然 PAI-I相互作用伴侶的配體單體。示例性的天然PAI-I相互作用伴侶是本領(lǐng)域已知的，包 括纖維蛋白、組織纖溶酶原激活劑(SEQ ID NO :34表示的蛋白質(zhì))、尿激酶纖溶酶原激活劑 (SEQ ID NO :36表示的蛋白質(zhì))和玻連蛋白(SEQ IDNO :32表示的蛋白質(zhì))。其他單體包 括PAI-I識(shí)別基序以及鄰近和毗連PAI-I相互作用結(jié)構(gòu)域識(shí)別基序二側(cè)的氨基酸。因此， 單體配體可以是任何長度，只要該單體包括PAI-I識(shí)別基序即可。例如，單體可包括PAI-I 識(shí)別基序和至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、四、30或100個(gè)或更多個(gè)鄰近該識(shí)別基序的氨基酸。其他設(shè)計(jì)靈感來自配體 的三維模型以及與PAI-I結(jié)合相互作用的型模。根據(jù)這種模型，可能需要對配體或聚合配 體的一級序列進(jìn)行修飾。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的PAI-I抑制劑含有選自以下肽的至少一 個(gè)拷貝a)與包含SEQ ID NO 31的氨基酸殘基354-368相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；b)與包含SEQ ID NO 31的氨基酸殘基300-309相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；c)與包含SEQ ID NO 31的氨基酸殘基343-353相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；d)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；e)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基32相對應(yīng)的氨基酸殘基從苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?；f)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基四相對應(yīng)氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)楸彼?；g)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基42相對應(yīng)的氨基酸殘基從谷氨酸突變?yōu)楸彼?；h)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基43相對應(yīng)的氨基酸殘基從亮氨酸突變?yōu)楸彼幔?br> i)與包含SEQ ID NO 32的氨基酸殘基20_63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO :32的氨基酸殘基23相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，與SEQ ID NO 32的氨基酸殘基52相對應(yīng)的氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼?，與SEQ ID NO 32的氨基 酸殘基56相對應(yīng)的氨基酸殘基從丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，與SEQ ID NO :32的氨基酸殘基57 相對應(yīng)的氨基酸殘基從谷氨酸突變?yōu)槔野彼幔籮)與包含SEQ ID NO 33的氨基酸殘基25_256相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；k)與包含SEQ ID NO 33的氨基酸殘基25_44相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；1)與包含SEQ ID NO 33的氨基酸殘基47_256相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；m)與包含SEQ ID NO :34的氨基酸殘基301-308相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；η)與包含SEQ ID NO 35的氨基酸殘基四_121相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 35的氨基酸殘基55相對應(yīng)的氨基酸殘基從纈氨酸突變?yōu)楸彼?，與SEQ ID NO 35 的氨基酸殘基57相對應(yīng)的氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?，與SEQ ID Ν0:35的氨基 酸殘基59相對應(yīng)的氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)樘於０?，與SEQ ID Ν0:35的氨基酸殘基 79相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，與SEQ ID NO :35的氨基酸殘基81相對應(yīng) 的氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，與SEQ ID NO :35的氨基酸殘基83相對應(yīng)的氨基 酸殘基從甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔缓挺?與包含SEQ ID NO :36的氨基酸殘基179-415相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO :36的氨基酸殘基2Μ相對應(yīng)的氨基酸殘基從組氨酸突變?yōu)楸彼?，與SEQ ID NO 36 的氨基酸殘基275相對應(yīng)的氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔cSEQ ID Ν0:36的氨基 酸殘基376相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)楸彼?。文中，術(shù)語“相對應(yīng)于”和“與...相對應(yīng)”在涉及序列比對時(shí)，意指參比蛋白質(zhì) (如纖溶酶原激活劑的抑制劑1，ΑΑΑ60009, SEQ ID NO 31)中所列舉的位置以及與參比蛋 白位置比對的那些位置。因此，當(dāng)將目的肽的氨基酸序列與參比肽(如SEQ ID NO 31)的 氨基酸序列進(jìn)行排列對比時(shí)，目的肽序列中“相對應(yīng)于”參比肽序列某些列舉位置的氨基酸 就是與參比肽序列這些位置進(jìn)行對比的氨基酸，但不必須在參比序列的這些準(zhǔn)確編號(hào)位置 內(nèi)。排列對比序列以確定序列之間相對應(yīng)氨基酸的方法在下文中描述。在其他實(shí)施方式中，配體可以是單克隆抗體片段、噬菌體展示產(chǎn)物、PAI-I合成抑 制劑、或轉(zhuǎn)錄因子誘騙劑。單體配體是一種多肽，所述多肽的至少一部分能夠被PAI-I識(shí)別。所述多肽能夠 被識(shí)別的這部分稱為識(shí)別基序。在本發(fā)明中，識(shí)別基序可以是天然的或合成的基序。識(shí)別 基序的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于天然產(chǎn)生的PAI-I底物、假底物基序以及PAI-I 調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白中存在的相互作用結(jié)構(gòu)域及其修飾形式。
聚合型配體(聚合配體)包含兩個(gè)或多個(gè)單體配體。同質(zhì)聚合配體是一種聚合配體，其組成的各個(gè)單體配體的氨基酸序列都相同，除 了一個(gè)或多個(gè)單體配體中的可去磷酸化的殘基如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸可被取代或修飾 外。修飾包括但不限于取代偽磷酸化的殘基(酸性氨基酸)或取代天然殘基。異質(zhì)聚合配體是一種聚合配體，其組成的一些單體配體的氨基酸序列不相同。本發(fā)明的配體任選連接于能提供表位標(biāo)簽、報(bào)道分子和/或細(xì)胞定位信號(hào)的額其 它分子或氨基酸。細(xì)胞定位信號(hào)可使配體靶向細(xì)胞的某個(gè)區(qū)域。表位標(biāo)簽和/或報(bào)道分子 和/或定位信號(hào)可以是相同的分子。表位標(biāo)簽和/或報(bào)道分子和/或定位信號(hào)也可以是不 同分子。本發(fā)明還包括包含配體、同質(zhì)聚合配體和異質(zhì)聚合配體編碼核苷酸序列的多核苷 酸。本發(fā)明的核酸任選連接于編碼具有其他特征，如表位標(biāo)簽、報(bào)道分子和/或細(xì)胞定位信 號(hào)多肽的其它核苷酸序列。所述多核苷酸任選側(cè)接包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和限制性核 酸內(nèi)切酶活性所需其他核苷酸的的核苷酸序列。所述側(cè)翼序列任選在載體內(nèi)提供獨(dú)特的克 隆位點(diǎn)并任選提供亞序列克隆取向。此外，可任選將本發(fā)明的核酸摻入載體多核苷酸中。本 發(fā)明的配體、聚合配體和多核苷酸可用作檢索工具和/或治療。本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括基于假定或真實(shí)PAI-I相互作用伴侶的單體(如上所 述)。此外，如果底物或結(jié)合蛋白含有一個(gè)以上的識(shí)別基序，則可將其鑒定為一個(gè)以上的單 體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包含編碼配體肽至少一個(gè)拷貝的多核苷酸序列的核酸 分子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是核酸分子，其中的多核苷酸序列編碼一個(gè)或多個(gè)肽配體 的一個(gè)或多個(gè)拷貝。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是核酸分子，其中的多核苷酸序列編碼至少2、3、4、5、6、7、 8、9或10個(gè)肽拷貝。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包含編碼配體或聚合配體至少一個(gè)拷貝的核酸分子的 載體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包含載體的重組宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼配體或聚 合配體至少一個(gè)拷貝的核酸分子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是一種抑制宿主細(xì)胞PAI-I的方法，包括將包含編碼配體 或聚合配體至少一個(gè)拷貝的核酸分子的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，并在適合產(chǎn)生配體或聚合配 體至少一個(gè)拷貝的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面是一種抑制對象心臟組織PAI-I的方法，包括將包含編碼PAI-I 配體或聚合配體至少一個(gè)拷貝的核酸分子的載體注射入對象的心臟組織中。本發(fā)明另一方面是一種產(chǎn)生PAI-I活性降低轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?，包括將包含編碼 PAI-I配體或聚合配體至少一個(gè)拷貝的核酸分子的載體注射入受精卵或胚胎干細(xì)胞中。本發(fā)明還涉及與參比抑制劑至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的修飾的抑制劑?！靶揎椀囊种苿庇糜谥缚赏ㄟ^添加、刪 除或取代蛋白或多肽抑制劑一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而產(chǎn)生的肽。 “修飾的識(shí)別基序”是通過添加、刪除或取代該基序一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而經(jīng)過修飾的天然形成的PAI-I識(shí)別基序。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”和“肽”在本 文中可互換使用。參比抑制劑不必是野生型蛋白或其一部分。因此，參比抑制劑可以是之 前已對其序列進(jìn)行修飾而不同于野生型蛋白的蛋白質(zhì)或肽。參比抑制劑可以是或不是特定 生物的野生型蛋白質(zhì)。某多肽的氨基酸序列與參比氨基酸序列至少，例如約95% “相同”應(yīng)理解為該多 肽的氨基酸序列與參比序列相同，除了編碼參比肽的參比氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸中 可包括至多約5個(gè)修飾外。換句話說，為獲得氨基酸序列與參比氨基酸序列至少約95%相 同的肽，至多約5%的參比序列氨基酸殘基可缺失或被其他氨基酸取代，或者可在參比序列 中插入占參比序列總氨基酸數(shù)至多約5%的氨基酸。對參比序列的這些修飾可發(fā)生在參比 氨基酸序列的N-末端或C-末端位置，或者那些末端位置之間的任何位置，可各自分散在參 比序列的氨基酸中，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連基團(tuán)分散在參比序列中。本文所用“相同性”表示核苷酸序列或氨基酸序列與參比核苷酸或氨基酸序列 的相同性。通常，排列序列以獲得最高級別的匹配。“相同性”本身具有本領(lǐng)域已知的含 義，可采用公開的技術(shù)來計(jì)算。(參見，例如，Computational Molecular Biology(計(jì)算分 子生物學(xué))，Lesk, A.M.編，牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)，紐約(1988)； Biocomputing Informatics and Genome Projects (生物計(jì)算信息禾口基因組項(xiàng)目)， Smith, D. W.編，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),紐約(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析)，第I部分，Griffin, Α. Μ.和Griffin, H. G.編， 休瑪効β 出版社(Humana Press),新澤西州(1994) ；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物學(xué)的序列分析)，von Heinje, G.編，學(xué)術(shù)出版社(1987) JPkquence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，Μ.和Devereux，J.編，斯托克頓出版社， 紐約(1991))。盡管現(xiàn)已有幾種方法可測量兩個(gè)多核苷酸或多肽序列之間的相同性，但 術(shù)語“相同性”是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的(Carillo, H. &Lipton, D.，Siam J Applied Math 48 :1073(1988))。通常用來確定兩個(gè)序列之間相同性或類似性的方法包括但不限 于，Martin J. Bishop編的Guide to Huge Computers (巨型計(jì)算機(jī)指南)，學(xué)術(shù)出版社，圣 地亞哥(1994)以及 Carillo，H.和 Lipton, D.，Siam J Applied Math 48 :1073(1988)中 披露的方法。計(jì)算機(jī)程序也可包含計(jì)算相同性和類似性的方法和算法。確定兩個(gè)序列之 間相同性和類似性的計(jì)算機(jī)程序方法的例子包括但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等， Nucleic Acids Researchl2 (i) :387(1984)), BLASTP，ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.等，J Molec Biol 215 :403(1990))和FASTDB。測定相同性和類似性方法的例子討論 見 Michaels, G.禾口 Garian, R. , Current Protocols in Protein Science (蛋白質(zhì)禾斗學(xué)實(shí)驗(yàn) 指南)，第一卷，約翰威利父子公司(John Wiley &S ons, he.) (2000)，該書納入本文作為 參考。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，用于測定兩個(gè)或多個(gè)多肽之間相同性的算法是BLASTP。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，用于測定兩個(gè)或多個(gè)多肽之間相同性的算法是 FASTDB,該方法基于 Brutlag 等的算法(Comp. App. Biosci. 6 :237-245 (1990)，納入本文作 為參考)。在FASTDB序列對比中，查詢和對象序列是氨基酸序列。序列比對結(jié)果為相同性 百分比。可用于氨基酸序列FASTDB比對計(jì)算相同性百分比的參數(shù)包括但不限于矩陣= PAM，k-元組=2，錯(cuò)配罰分=1，連接罰分=20，隨機(jī)組長度=0，截?cái)嘀?1，缺口罰分=5， 缺口大小罰分0. 05，窗口大小=500或?qū)ο蟀被嵝蛄械拈L度，取較短的值。
如果對象序列比查詢序列長或短是因?yàn)镹-末端或C-末端添加或缺失而不是因?yàn)?內(nèi)部添加或缺失，則可進(jìn)行手工糾正，因?yàn)楫?dāng)計(jì)算相同性百分比時(shí)FSTDB程序不考慮對象 序列N-末端和C-末端的截短或添加。對于相對于查詢序列兩端都截短的對象序列，可計(jì) 算與參比序列不匹配/對齊的查詢序列N-和C-末端的堿基數(shù)占查詢序列堿基總數(shù)的百分 比，而糾正相同性百分比。FASTDB序列比對的結(jié)果決定了匹配/對齊。然后從上述FASTDB 程序用特定參數(shù)計(jì)算出的相同性百分比減去對齊百分比可得到最終的相同性百分比評分。 可用這種糾正評分來確定對齊部分是如何相互“對應(yīng)”的，以及確定相同性百分比。可分別 考慮查詢(對象)序列或參比序列中延伸超過參比或?qū)ο笮蛄蠳-或C-末端的殘基以便手 工校正相同性百分比評分。也就是說，當(dāng)手工校正相同性百分比評分或?qū)R數(shù)目時(shí)可計(jì)算 出與對比序列N-或C-末端不匹配/對齊的殘基數(shù)目。例如，可將90個(gè)氨基酸殘基的對象序列與100個(gè)殘基的參比序列排列對比以確 定相同性百分比。因此，當(dāng)對象序列的N-末端發(fā)生缺失時(shí)，F(xiàn)ASTDB比對不會(huì)顯示N-末端 前10個(gè)殘基的匹配/對齊程度。這10個(gè)不相配的殘基占序列的10% (N-和C-末端不匹 配的殘基數(shù)/查詢序列的殘基總數(shù))，因此要將FASTDB程序算出的相同性百分比評分減去 10%。如果其余90個(gè)殘基完美匹配，則最終的相同性百分比為90%。在另一個(gè)例子中，將 90個(gè)殘基的對象序列與100個(gè)殘基的參比序列進(jìn)行比較。此時(shí)的缺失是內(nèi)部缺失，因此對 象序列的N-或C-末端沒有與查詢序列不匹配/對齊的殘基。此時(shí)無需手工糾正FASTDB 算出的相同性百分比。本發(fā)明的聚合配體可在諸單體之前、之后或之間任選包含間隔氨基酸。間隔物的 長度和組成可不同。間隔物的一個(gè)例子是谷氨酸、丙氨酸、多聚谷氨酸或多聚丙氨酸。有時(shí) 考慮采用脯氨酸作為間隔物以打斷多肽的二級結(jié)構(gòu)。間隔氨基酸可以是任何氨基酸，不限 于丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸。間隔物的例子提供于SEQ ID N0:53-56。本發(fā)明涉及含有或 沒有間隔物的同質(zhì)聚合配體和異質(zhì)聚合配體的所有組合，而不僅限于上下文給出的例子。本發(fā)明的配體和聚合配體可任選連接于將配體定位于細(xì)胞某區(qū)域的信號(hào)。細(xì)胞定 位信號(hào)的非限制性例子有定位于肌質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞外基質(zhì)、線粒體、高爾基體、過氧化物酶 體、溶酶體、核、核仁、核內(nèi)體、外體、其他胞內(nèi)囊泡、胞質(zhì)膜、頂膜和基底外側(cè)膜的信號(hào)。在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述配體和聚合配體通過如美國臨時(shí)申請60/957，328中所述的那些非細(xì) 胞特異性胞質(zhì)膜定位信號(hào)遞送到細(xì)胞外表面。在其他實(shí)施方式中，所述配體和聚合配體通 過細(xì)胞特異性定位信號(hào)，例如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞肌 膜的特異性定位信號(hào)遞送到細(xì)胞外表面。在其他實(shí)施方式中，所述配體和聚合配體通過胞 外相關(guān)結(jié)構(gòu)域，如膠原結(jié)合蛋白，或心肌梗塞區(qū)中富含的其他胞外組分遞送到胞外基質(zhì)。圖 3A-3H、5A-5I、11A-1 II和22A-22F顯示了連接于定位信號(hào)的配體和聚合配體的示例性體系 結(jié)構(gòu)。給出的定位信號(hào)僅是舉例而不是限制。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式是連接于1類定位束縛子的配體或聚合配體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是連接于2類定位束縛子的配體或聚合配體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是連接于3類定位束縛子的配體或聚合配體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是本文所述的1類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與本文所述1類定位束縛子至少60^^65^^70%, 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 1 類定位束縛子。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是已經(jīng)過修飾的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入、 截短，或它們的組合的本文所述1類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與SEQ ID NO 57-76 至少 60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的1類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包含至少一個(gè)與SEQ ID NO :77_95之一至少60 %、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同肽的 1 類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本文所述1類定位束縛子的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是本文所述的2類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本文所述2類定位束縛子的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是本文所述的3類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與本文所述3類定位束縛子至少60^^65^^70%, 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 3 類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是已經(jīng)過修飾包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入、截 短，或它們的組合的本文所述3類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與SEQ ID NO 100-111至少60 %、65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 3 類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包含至少一個(gè)與SEQ ID NO :112-1 之一至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同肽的 3 類定位束縛子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本文所述3類定位束縛子的多核苷酸。本發(fā)明的配體和聚合配體也可連接于降解決定子以限制它們的活性。圖21A-21H 和22A-22F顯示了連接于降解決定子的配體和聚合配體的幾種非限制性例子。此外，本發(fā)明的配體和聚合配體任選連接于可提供表位標(biāo)簽或報(bào)道分子的其它分 子或氨基酸(見圖4A-4G)。表位標(biāo)簽的非限制性例子是FLAGTM、HA(血凝素)、c-Myc和 His6。報(bào)道分子的非限制性例子是堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、過氧化物酶、螢光素酶和熒光 蛋白。給出的表位和報(bào)道分子僅是舉例而不是限制。表位標(biāo)簽和/或報(bào)道分子可以是相同 分子。表位標(biāo)簽和/或報(bào)道分子也可以是不同分子。可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)通過化學(xué)方法或重組方法合成配體和聚合配體以及與其 連接的任選氨基酸?；瘜W(xué)合成技術(shù)包括但不限于通常用自動(dòng)化肽合成儀進(jìn)行的肽合成。也 可用本領(lǐng)域已知的非自動(dòng)化肽合成方法來合成肽。重組技術(shù)包括將配體編碼核酸插入表達(dá) 載體，其中用細(xì)胞因子和加工合成核酸表達(dá)產(chǎn)物。細(xì)胞定位信號(hào)、表位標(biāo)簽或降解決定子與配體或聚合配體的連接可包括與配體共 價(jià)連接或可酶解連接。當(dāng)定位信號(hào)包括多肽之外的材料如脂質(zhì)或碳水化合物時(shí)，可采用化 學(xué)反應(yīng)來連接分子。此外，也可用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及用脂質(zhì)、碳水化合物、磷酸或其他分子 修飾的氨基酸作為肽合成的前體。本發(fā)明的配體含有或沒有定位信號(hào)時(shí)都有治療作用。然 而，連接有定位信號(hào)的配體可用作亞細(xì)胞工具或治療劑。圖6A-6E、13A-13E和23A-23G顯示了含PAI-1配體的基因構(gòu)建物的例子。如本文 所述，含PAI-I配體的基因構(gòu)建物可通過病毒或非病毒載體遞送。圖7B和7C描繪了用于遞送和調(diào)控多肽體內(nèi)表達(dá)的基因治療載體的實(shí)施方式。圖7B和7C中的連接于基因構(gòu)建物 的多核苷酸序列包含基因組整合結(jié)構(gòu)域有利于轉(zhuǎn)基因整合入病毒基因組和/或宿主基因 組中。AttP和AttB序列是基因組整合序列的非限制性例子。圖7A顯示了含PAI-I配體基因構(gòu)建物的載體，其中所述配體基因構(gòu)建物可作為一 個(gè)單位從載體釋放以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化使載體骨架釋放 所述配體基因構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因，。然后將釋放的轉(zhuǎn)基因注射到受精小鼠卵的原核中；或用該 轉(zhuǎn)基因來轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞。圖7A所示的含配體基因構(gòu)建物的載體也可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基 因，其中所述轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子和密碼子已按照宿主生物進(jìn)行了優(yōu)化。圖7A的含配體基因構(gòu) 建物的載體也可用于在適應(yīng)了小規(guī)?；虼笠?guī)模制造的可發(fā)酵生物中重組表達(dá)多肽，其中所 述轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子和密碼子已按照發(fā)酵宿主生物進(jìn)行了優(yōu)化。圖7D顯示了用于產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的含PAI-I配體基因構(gòu)建物的載體。本發(fā)明還包括包含編碼配體和聚合配體核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷 酸任選連接于編碼降解決定子、定位信號(hào)或報(bào)道分子的其它核苷酸序列。此外，可任選將本 發(fā)明的核酸摻入載體多核苷酸中。所述多核苷酸任選側(cè)接包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和限 制性核酸內(nèi)切酶活性所需其他核苷酸的的核苷酸序列。側(cè)翼序列任選在載體內(nèi)提供克隆位 點(diǎn)。限制性位點(diǎn)可包括但不限于大多數(shù)市售克隆載體中的任何一個(gè)常用位點(diǎn)。為此目的也 可使用被包括歸巢內(nèi)切核酸酶在內(nèi)的其他限制性酶切割的位點(diǎn)。多核苷酸側(cè)翼序列還任選 可為亞序列克隆提供取向。優(yōu)選5’和3’的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)彼此不同，從而可使雙 鏈DNA定向克隆入克隆載體中相應(yīng)的互補(bǔ)位點(diǎn)。也可采用重組技術(shù)合成含有或沒有降解決定子、定位信號(hào)、表位或報(bào)道分子的配 體和聚合配體。制備包含所需組分的多核苷酸表達(dá)構(gòu)建物將其插入表達(dá)載體中。然后將表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并表達(dá)和分離多肽產(chǎn)物。通過重組DNA技術(shù)制得的配體可用作研究工具 和/或治療劑。下面是如何制造編碼配體和聚合配體的多核苷酸的一個(gè)例子。合成編碼配體和側(cè) 翼序列的互補(bǔ)寡核苷酸并退火。用本領(lǐng)域已知技術(shù)將所得雙鏈DNA分子插入克隆載體中。 當(dāng)配體和聚合配體框內(nèi)被置于鄰近翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物序列時(shí)，它們在細(xì)胞 或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)表達(dá)形成融合蛋白的一部分。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及選擇性調(diào)控PAI-I配體或聚合配體在所需細(xì)胞、組織 或生理狀態(tài)中表達(dá)的基因構(gòu)建物。示例性的基因構(gòu)建物體系結(jié)構(gòu)見圖6A-6E。所述基因 構(gòu)建物的啟動(dòng)子部分可以是組成型啟動(dòng)子、非組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子(組成型 或非組成型)或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性例子是內(nèi) 皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(White, SJ等，Gene Ther. 2007/11/8 [在公布前電子公開])，血管 平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Ribault，S，Circ Res.，2001，88 (5) :468-75 ；Appleby, CE 等， Gene Ther. 2003,10(18) 1616-22)，心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Xu，L等，J Biol Chem. ,2006, 281(45) :34430-40)，冠脈脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，以及心臟成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。由 于組合的組織和狀態(tài)特異性啟動(dòng)子如心臟和缺氧特異性啟動(dòng)子(Su，H等，Proc Natl. Acad. Sci.U. S. Α. ,2004,101(46) :16280-5)能夠在心肌梗塞區(qū)表達(dá)配體或聚合配體，因此尤其 適用于本發(fā)明。可用藥物或其他因子激活可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。RHE0SWITCH是一種從馬薩諸塞州 伊普斯威奇市新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England BioLabs, Ipswich, ΜΑ)購得的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)，可用于本發(fā)明。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式包括表達(dá)受可誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)控制的配體 或聚合配體基因構(gòu)建物。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式是編碼連接于組織特異性啟動(dòng)子的配體或聚合配體的多核 苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼連接于動(dòng)脈平滑肌特異性啟動(dòng)子的配體或聚合配 體的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼連接于血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的配體或聚 合配體的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼連接于內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的配體或聚合配體 的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼連接于合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的配體或聚 合配體的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本文所述組織特異性啟動(dòng)子的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是已經(jīng)過修飾的包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、取代、插入、 截短，或它們組合的編碼本文所述組織特異性啟動(dòng)子的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼與本文所述組織特異性啟動(dòng)子至少60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的組織特異性啟動(dòng)子的多
核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是與SEQ ID NO :132-139所示多核苷酸至少60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸。聚合配體的性質(zhì)是模塊。本發(fā)明一個(gè)方面是所述聚合配體的組合模塊。本發(fā)明另 一個(gè)方面是制造這些模塊聚合配體的簡單易行方法。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式 包括模塊克隆基因表達(dá)組分的方法。當(dāng)重組合成配體、同質(zhì)聚合配體、異質(zhì)聚合配體和任選 的氨基酸表達(dá)組分時(shí)，可考慮將每個(gè)可克隆的元件作為模塊。為快速方便地克隆，需要制備 粘性末端相容易于依次插入和克隆的模塊元件。這可通過利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)識(shí)別和切 割的天然特性而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明一個(gè)方面包括模塊側(cè)翼序列，位于模塊一端的側(cè)翼序列可用 于限制性酶消化一次，而位于另一端的側(cè)翼序列需要時(shí)可用于限制性酶多次消化。換句話 說，可利用并破壞位于模塊一端的限制性位點(diǎn)以便順序克隆模塊元件。側(cè)接編碼區(qū)模塊的 限制性位點(diǎn)的一個(gè)例子是限制性酶NgoM IV和Cla I;或XmaI和Cla I所識(shí)別的序列。用 NgoM IV和Cla I切割第一環(huán)狀DNA產(chǎn)生含有5 ‘ NgoM IV突出端和3' Cla I突出端的 線性DNA ；用Xma I和Cla I切割第二環(huán)狀DNA產(chǎn)生含有5' Cla I突出端和3' Xma I突 出端的線性DNA，從而得到含有相容粘性末端的第一和第二 DNA片段。當(dāng)將這些第一和第 二 DNA片段混合在一起、退火并連接形成第三環(huán)狀DNA片段時(shí)，第一 DNA中的NgoM IV位點(diǎn) 和第二 DNA中的Xma I位點(diǎn)在第三環(huán)狀DNA中被破壞。此時(shí)DNA的該殘留區(qū)受到保護(hù)不會(huì) 被Xma I或NgoM IV消化，但第三環(huán)狀DNA保留的側(cè)翼序列仍含有完整的5' NgoM IV和 3' Cla I位點(diǎn)?？芍貜?fù)該過程多次以實(shí)現(xiàn)定向的順序模塊克隆。內(nèi)切核酸酶NgoM IV、Xma I和Cla I所識(shí)別的限制性位點(diǎn)是一組用作側(cè)翼序列時(shí)可順序克隆的位點(diǎn)。除了環(huán)狀DNA，另一種直接依次裝配編碼區(qū)模塊的方法是采用線性DNA。例如，與 上述順序克隆過程相似，編碼區(qū)模塊側(cè)接的限制性位點(diǎn)是限制性酶NgoM IV和Cla I ；或Xma I和Cla I所識(shí)別的序列。用NgoM IV和Cla I切割第一環(huán)狀DNA產(chǎn)生含有5' NgoM IV突出端和3' Cla I突出端的線性DNA。通過PCR擴(kuò)增或者合成并退火互補(bǔ)寡核苷酸產(chǎn) 生第二線性雙鏈DNA。此第二線性DNA含有5' Cla I突出端和3' Xma I突出端，是與線 性化第一 DNA相容的粘性末端。當(dāng)將這些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并連接形 成第三環(huán)狀DNA片段時(shí)，第一 DNA中的NgoM IV位點(diǎn)和第二 DNA中的Xma I位點(diǎn)在第三環(huán) 狀DNA中被破壞。第三環(huán)狀DNA內(nèi)保留的側(cè)接序列仍含有完整的5' NgoM IV和3' Cla I 位點(diǎn)?？芍貜?fù)多次該過程以實(shí)現(xiàn)定向的順序模塊克隆。內(nèi)切核酸酶NgoM IV、Xma I和Cla I所識(shí)別的限制性位點(diǎn)是一組用作側(cè)接序列時(shí)可順序克隆的位點(diǎn)。該過程的描述見圖8。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白，可如上所述順序直接克隆其他限制性位點(diǎn)。選擇限制 性內(nèi)切核酸酶的優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)是選擇一對可產(chǎn)生相容粘性末端但其位點(diǎn)在相互連接后被破壞 的內(nèi)切核酸酶。選擇第三內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是不會(huì)產(chǎn)生與前兩個(gè)位點(diǎn)之一相容 的粘性末端。當(dāng)將該標(biāo)準(zhǔn)用于順序直接克隆體系時(shí)，可按照需要將配體、聚合配體以及其他 編碼區(qū)或或表達(dá)組分組合裝配在一起。同樣的順序過程可用于表位、報(bào)道分子、降解決定子 和/或定位信號(hào)。描述了聚合配體以及調(diào)節(jié)PAI-I活性聚合配體的制備方法。療法包括將含有或沒 有定位信號(hào)的純化的配體或聚合配體遞送給細(xì)胞?；蛘撸赏ㄟ^病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物， 如采用腺病毒、慢病毒、腺伴隨病毒的構(gòu)建物或能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的其他病毒或 逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物，來遞送含有或沒有定位信號(hào)的配體和聚合配體。所述PAI-I配體或聚合配體、編碼PAI-I配體和聚合配體的核酸、以及含有編碼 PAI-I配體和聚合配體核酸的載體可用于治療患纖維變性疾病的對象或者有發(fā)生纖維化風(fēng) 險(xiǎn)的對象。所述對象可以是患天然發(fā)生的纖維變性疾病或手術(shù)誘導(dǎo)的、化學(xué)誘導(dǎo)的、遺傳誘 導(dǎo)的或其他實(shí)驗(yàn)因素誘導(dǎo)的纖維變性疾病的動(dòng)物。纖維變性疾病的原因可以是糖尿病或因 化學(xué)接觸、飲食原因、遺傳原因、肥胖或自然成熟誘導(dǎo)的高血糖癥。纖維變性疾病的原因也 可能是高血壓、缺血、壞死、免疫介導(dǎo)的損傷、接觸煙草煙霧、接觸化學(xué)物質(zhì)、接觸纖維、病毒 或細(xì)菌感染，或者特發(fā)原因。所述PAI-I配體或聚合配體、編碼PAI-I配體和聚合配體的核 酸、以及含有編碼PAI-I配體和聚合配體核酸的載體可用于治療心臟、血液、腎臟、肝臟、肺 和卵巢的纖維化和其他PAI-I相關(guān)疾病。所述PAI-I配體或聚合配體、編碼PAI-I配體和 聚合配體的核酸、以及含有編碼PAI-I配體和聚合配體核酸的載體可用于治療表達(dá)PAI-I 的各種癌癥。。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是將編碼配體或聚合配體的多核苷酸轉(zhuǎn)移到本文所述心 血管組織內(nèi)的方法。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是將編碼配體或聚合配體的多核苷酸轉(zhuǎn)移到心血管組織 內(nèi)的方法，包括以下之一局部注射腺病毒、離體轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞、或直接注射入主動(dòng)脈。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是評價(jià)PAI-I在本文所述不穩(wěn)定斑塊形成中的功能的方法。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是評價(jià)PAI-I在不穩(wěn)定斑塊形成中的功能的方法，包括建 立胰島素抗性小鼠模型的步驟。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)空間或時(shí)序調(diào)控本文所述的配體或聚合配體的方法。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體 或聚合配體連接于組織特異性啟動(dòng)子的步驟。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體 或聚合配體連接于定位束縛子的步驟。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)時(shí)序調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體 或聚合配體連接于可誘導(dǎo)基因開關(guān)的步驟。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是治療、預(yù)防或緩解心血管疾病的方法，包括以下步驟a)鑒定患有心血管疾病或有發(fā)生心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；和b)給予該對象PAI-I配體或聚合配體。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是治療、預(yù)防或緩解纖維變性疾病的方法，包括以下步 驟a)鑒定患有纖維變性疾病或有發(fā)生纖維變性疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；和b)給予該對象PAI-I配體或聚合配體?？蓪⒓兓腜AI-I配體制成供口服或腸胃外給藥、局部給藥、或片劑、膠囊或液體 形式、鼻內(nèi)或吸入氣溶膠、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、或其他注射方式，靜脈內(nèi)輸 液；或任何其他給藥途徑。此外，可將編碼該配體的核苷酸序列摻入設(shè)計(jì)用來遞送和在細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物的載體中。這種載體包括質(zhì)粒、粘粒、人造染色體和修飾的病毒。可體內(nèi)或 離體遞送給真核細(xì)胞。離體遞送方法包括分離預(yù)定為受者的細(xì)胞或供者細(xì)胞并將載體遞送 給那些細(xì)胞內(nèi)，然后用該細(xì)胞治療受者。本發(fā)明另一方面是治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸引入所 述單核細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；和d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。333本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及制備向?qū)ο筮f送纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的修飾 細(xì)胞的方法，包括在所述對象的單核細(xì)胞內(nèi)引入至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途 徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方 式中，所述啟動(dòng)子是巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是泡 沫細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。與治療動(dòng)脈粥樣硬化的現(xiàn)有局部遞送方法，如用導(dǎo)管遞送涂布藥物的支架或氣囊 血管成形術(shù)介導(dǎo)的通過病毒向內(nèi)皮和/或血管平滑肌細(xì)胞遞送相比，本發(fā)明具有一些優(yōu) 勢。除了與器械介導(dǎo)遞送方法相關(guān)的困難外，血管細(xì)胞的類型是難以轉(zhuǎn)導(dǎo)且轉(zhuǎn)基因表達(dá)差 的細(xì)胞，這使得向這些細(xì)胞局部遞送轉(zhuǎn)基因困難得難以置信。因此這些方法的效率大打折 扣。本發(fā)明采用了一種循環(huán)細(xì)胞類型，單核細(xì)胞，該細(xì)胞會(huì)回巢于血管損傷區(qū)域，因此不需 要使用器械介導(dǎo)的局部遞送蛋白質(zhì)治療劑。在血管損傷部位單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。巨 噬細(xì)胞一旦出現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣化局部環(huán)境中將進(jìn)一步分化為泡沫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的大多數(shù)階段都有作用。因此它們是遞送轉(zhuǎn)基因、表達(dá)纖維溶解途徑調(diào)節(jié)劑、定位于粥樣硬化損傷的一種有用細(xì)胞類型。這些損傷可發(fā)生在 所有脈管系統(tǒng)內(nèi)。已顯示纖維溶解途徑在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中有關(guān)鍵作用，此外在 止血中也有關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明考慮該途徑的時(shí)空調(diào)控調(diào)節(jié)劑，以防止不良反應(yīng)，如全 身給藥可能造成的潛在失控性出血。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，時(shí)空調(diào)控通過采用可誘導(dǎo) 基因開關(guān)而實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明另一方面是治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將以下多核苷酸引入所述細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的多核苷 酸，所述基因開關(guān)包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼化學(xué) 配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多 核苷酸，所述啟動(dòng)子可用所述化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化；d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象；和e)將所述化學(xué)配體引入對象以激活啟動(dòng)子。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種制備向?qū)ο筮f送纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的修 飾細(xì)胞的方法，包括將以下多核苷酸引入所述細(xì)胞的多核苷酸以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(a)編 碼基因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn) 錄因子序列編碼化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(b)至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解 途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述啟動(dòng)子可用所述化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述纖維溶解途徑調(diào)節(jié)劑是本文所述的PAI-I配體或聚合配 體。然而，所述治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法不限于本文所述的PAI-I配體或聚合配體， 還包括采用纖維溶解途徑的任何多肽調(diào)節(jié)劑。例如，可用于本發(fā)明方法的纖維溶解途徑調(diào) 節(jié)劑可包括其他多肽PAI-I抑制劑；天然纖溶酶原激活劑如美國專利5，830，849中描述的 那些；突變纖溶酶原激活劑如美國專利5，866，413中描述的那些；或纖溶酶原激活劑片段 如美國專利5，039，791中描述的那些。本發(fā)明還考慮采用巨噬細(xì)胞特異性調(diào)控元件來控制可誘導(dǎo)基因開關(guān)以限制轉(zhuǎn)基 因只在巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。此時(shí)可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的空間和時(shí)序調(diào)控，從而使表達(dá)僅限 于巨噬細(xì)胞和/或動(dòng)脈粥樣化內(nèi)巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞。巨噬細(xì)胞特異性調(diào)控元件可用 于可誘導(dǎo)基因開關(guān)系統(tǒng)，以加入化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)特定細(xì)胞類型內(nèi)纖維溶解途徑調(diào)節(jié)劑的表 達(dá)。在離體情況下將基因表達(dá)程序轉(zhuǎn)導(dǎo)入巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，如單核細(xì)胞，再引入體內(nèi) 以治療動(dòng)脈粥樣硬化。用于本發(fā)明的巨噬細(xì)胞特異性調(diào)控元件的例子有，Gough，P.J.和 Ε. W. Raines, Blood 101(2) =485-91(2003)所述的巨噬細(xì)胞限制性CD68基因的調(diào)控元件。例如，本發(fā)明另一方面是治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將以下多核苷酸引入所述細(xì)胞產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的多核苷 酸，所述基因開關(guān)包含至少一個(gè)連接于巨噬細(xì)胞特異性調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所 述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的 編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述啟動(dòng)子可用所述化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化；d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象；和e)將所述化學(xué)配體引入對象以激活啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及制備向?qū)ο筮f送多肽配體或聚合配體的修飾細(xì) 胞的方法，包括將以下多核苷酸引入所述對象的單核細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(a)編碼基 因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個(gè)連接于巨噬細(xì)胞特異性調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄因 子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(b)至少一個(gè) 與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述啟動(dòng)子可用所述化學(xué)配體 依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化。在其他實(shí)施方式中，在單核細(xì)胞內(nèi)弓丨入編碼其他治療蛋白如載脂蛋白的其它多核 苷酸。本發(fā)明考慮通過靶向其他巨噬細(xì)胞群來治療其他組織內(nèi)涉及纖維化的其他疾病。 例如，通過纖維溶解調(diào)節(jié)劑的特異性啟動(dòng)子或其他定向表達(dá)方法靶向其他固定的巨噬細(xì) 胞，如肺泡巨噬細(xì)胞，從而有可能治療肺纖維化。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的其他固定巨噬細(xì)胞以 及它們在組織內(nèi)的定位包括結(jié)締組織的組織細(xì)胞、肝臟的枯氏細(xì)胞、神經(jīng)組織的小神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞、肉芽腫的上皮樣細(xì)胞、骨骼的破骨細(xì)胞、脾竇狀隙襯里細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞。本 發(fā)明考慮通過靶向表達(dá)纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑來治療任何涉及這些和其他巨噬細(xì)胞亞 型的纖維變性疾病。本發(fā)明另一個(gè)方面是治療、預(yù)防或緩解涉及固定巨噬細(xì)胞群的纖維變性疾病的方 法，包括以下步驟a)鑒定患有纖維變性疾病的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將至少一個(gè)與固定巨噬細(xì)胞群特異性調(diào)控元件相連的編碼纖維溶解途徑多肽 調(diào)節(jié)劑的多核苷酸引入所述單核細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；和d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。本發(fā)明還考慮通過采用美國專利6，875，612描述的單核細(xì)胞特異性載體使纖維 溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑在體內(nèi)單核細(xì)胞來源的細(xì)胞內(nèi)靶向表達(dá)的方法。方法結(jié)果獲自證明成功調(diào)節(jié)心血管組織內(nèi)纖維溶解活性的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的綜合數(shù) 據(jù)將證明局部PAI-I抑制對患病心血管組織具有治療功效。在II型糖尿病患者中，產(chǎn)生 PAI-I誘騙劑的臨床意義是降低不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的形成。目的目標(biāo)是開發(fā)一種利用可誘導(dǎo)組織特異性表達(dá)PAI-I的誘騙劑的腺病毒基因 療法，所述誘騙劑靶向患病血管的細(xì)胞外表面膜和/或胞外微環(huán)境。構(gòu)成這種療法的各組 分描述如下。各組分--PAI-1誘騙劑纖溶酶原激活劑的抑制劑-1 (PAIl)是一種參與調(diào)節(jié)纖 維蛋白溶解的絲氨酸蛋白酶抑制劑(絲抑蛋白)。其目標(biāo)包括組織纖溶酶原激活劑(tPA) 和尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)。PAIl在自殺性抑制劑反應(yīng)中結(jié)合其靶標(biāo)，在僅緩慢清除 的中間體階段共價(jià)結(jié)合(不在復(fù)合體正常清除之前)。PAIl單獨(dú)存在于溶液中的半衰期很 短，小于2小時(shí)。它自發(fā)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成無功能的潛伏形式。由于玻連蛋白含有其他胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的結(jié)合域，因此PAIl與玻連蛋白結(jié)合可大大增強(qiáng)該分子的活性壽命并使 之靶向胞外基質(zhì)的特定部位。設(shè)計(jì)誘騙劑可綜合多種方式抑制PAI-1，包括扣留該分子、通 過造成構(gòu)象轉(zhuǎn)變的肽下調(diào)和蛋白水解該分子。PAI-I誘騙劑的空間和時(shí)序調(diào)控PAI-1誘騙劑在組織和細(xì)胞水平的正確空間定 位是使PAI-I誘騙劑功效最大毒性最小所必需的。在組織水平上，可通過采用組織特異性 啟動(dòng)子調(diào)控PAI-I誘騙劑的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。而在細(xì)胞水平上，這將通過利用與PAI-I誘騙劑 融合的定位束縛子而實(shí)現(xiàn)。組織特異性啟動(dòng)子為使PAI-I誘騙劑的表達(dá)僅限于靶器官，已設(shè)計(jì)了組織特異 性啟動(dòng)子使轉(zhuǎn)基因定向表達(dá)于特定的血管細(xì)胞類型，包括血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。采 用I^heoSwitch技術(shù)工程改造時(shí)序調(diào)控以便用驗(yàn)證過的組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行可誘導(dǎo)表 達(dá)。定位束縛子為在細(xì)胞水平進(jìn)行空間調(diào)控，設(shè)計(jì)出了定位束縛子，當(dāng)與PAI-I誘騙 劑融合時(shí)能將其運(yùn)送到正確部位實(shí)現(xiàn)治療效益?？赡苄枰獙χ委熣T騙劑進(jìn)行一些體內(nèi)優(yōu)化 以獲得對粥樣硬化斑塊的最大治療效果。例如，如果治療誘騙劑的濃度梯度淺而寬，這種基 因療法靶向的細(xì)胞可能產(chǎn)生最佳效果-也許擴(kuò)散得遠(yuǎn)而且廣泛從而甚至產(chǎn)生某些精細(xì)的 內(nèi)分泌效果(第2類)。另一方面，也可能需要限制誘騙劑的濃度梯度使其主要存在于被轉(zhuǎn) 染細(xì)胞的表面；該方法將治療區(qū)域限制于一個(gè)小得多的范圍(第1類)。第3類，此小結(jié)的 主題，試圖“沿中間道路前進(jìn)”，在損傷正在愈合的情況下(即蛋白水解微環(huán)境)能夠旁分泌 擴(kuò)散誘騙劑。范圍除了成功整合這些單獨(dú)組分外，開發(fā)了經(jīng)過驗(yàn)證的誘騙劑、Ioc和啟動(dòng)子組 分以開發(fā)用于臨床前研究的基因療法。成功完成這些實(shí)驗(yàn)將證明，在代謝病模型中，通過局 部抑制PAI-I來調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解可降低脈管系統(tǒng)中不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的形成。臨床前模型用胰島素抗性臨床前小鼠模型的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展來評價(jià)PAI-I在 不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。在小鼠中評價(jià)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)以便用于向靶組織遞送基因。胰島素抗性小鼠模型-開發(fā)小鼠模型的全面計(jì)劃實(shí)驗(yàn)1)用FFA、甘油三酯 和胰島素試驗(yàn)證實(shí)，在10周齡具有胰島素抗性的胰島素抗性小鼠(IRSl+/-ApoE-/-和 IRS2+/-ApoE-/")以及對照W57BL6)非胰島素抗性小鼠和胰島素抗性PAI-I缺陷小鼠 (IRS1 +/-ApoE-/-PAI-1 +/-and IRS2+/-ApoE-/-PAI-1 +/-)中誘導(dǎo)了動(dòng)脈粥樣硬化和心肌 梗塞；當(dāng)動(dòng)物達(dá)到12周齡時(shí)進(jìn)行高分辨超聲波心臟詢問，并評價(jià)16周齡時(shí)的心臟收縮和舒 張功能；和評價(jià)10周齡時(shí)做過冠狀動(dòng)脈閉塞的16周齡小鼠心臟左心室的梗塞面積、纖維化 程度以及PAI-I含量和定位；幻描繪不同小鼠品系纖維化程度與按梗塞面積標(biāo)準(zhǔn)化的左心 室功能伴隨病損之間的關(guān)系；3)將PAI-I缺陷動(dòng)物與過表達(dá)PAI-I的胰島素抗性動(dòng)物雜交 并進(jìn)行以上1和2所述相同的研究，以消除PAI-I在冠狀動(dòng)脈閉塞后發(fā)生心臟纖維化以及 誘導(dǎo)梗死形成中的潛在作用；和4)用細(xì)胞成像技術(shù)特征分析主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。心血管組織的基因轉(zhuǎn)移盡管已經(jīng)嘗試對血管組織基因轉(zhuǎn)導(dǎo)做過多次研究，但都 沒能明確適合臨床基因治療的理想載體和給藥途徑。全身給藥將導(dǎo)致腺病毒被快速清除以 及肝臟附著/感染。曾經(jīng)報(bào)道過對心血管組織的局部轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然心肌細(xì)胞易被腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)， 但內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)則不易。VSMC對2和5血清型腺病毒介導(dǎo)的基 因轉(zhuǎn)移極頑固。這是由于病毒進(jìn)入差和轉(zhuǎn)基因本身的傳統(tǒng)遍在啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄無效。SMC表面的柯薩奇腺病毒受體(CAR)表達(dá)有限很好地解釋了病毒進(jìn)入差的原因，這導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)水平大 大低于感染相同劑量(病毒)上皮細(xì)胞所得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平[(BeckJramoto等2004)，見參 考文獻(xiàn)]。局部注射腺病毒推薦方法之一是通過心尖進(jìn)行心室內(nèi)注射，注射到左心室腔內(nèi)。 該方法證明能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在主動(dòng)脈內(nèi)皮中表達(dá)(Jimn，Lee等2001)。雖然采用該方法未觀 察到VSMC表達(dá)，但這可能是由于轉(zhuǎn)基因的無效轉(zhuǎn)錄所致。CMV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)在VSMC 中無效，因此證明包含VSMC特異性啟動(dòng)子會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)表達(dá)升高(Akyurek，Yang等2000 ； Akyurek, Nallamshetty 等 2001 ；Appleby，Kingston 等 2003)。因此，采用該技術(shù)，聯(lián)用強(qiáng) VSMC啟動(dòng)子與高效價(jià)病毒可能導(dǎo)致VSMC表達(dá)。此外，在注射期間夾緊輸出血管有可能增加 病毒與靶細(xì)胞接觸。這也將導(dǎo)致經(jīng)冠狀動(dòng)脈的心臟灌注(Roth，Lai等2004)概述-局部注射腺病毒該方法適合心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。然而， 根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的發(fā)現(xiàn)，由于EC屏障和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，VSMC中不可能有強(qiáng)表達(dá)。單核細(xì)胞離體轉(zhuǎn)導(dǎo)另一種推薦方法是采用離體方法。巨噬細(xì)胞在血管壁動(dòng)脈粥 樣硬化發(fā)展的全部階段都有作用。募集的單核細(xì)胞粘附于血管損傷部位并分化成巨噬細(xì) 胞。此外，它們還具有很強(qiáng)的生物合成能力(Beck，toamoto等2004)。不難分離獲得骨髓 細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)和返還動(dòng)物以進(jìn)行離體基因遞送。曾用該方法將治療基因遞送到動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域。在該方法的大多數(shù)例子中，利 用表達(dá)的ApoE來促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(Hasty, Linton等1999 ；Van Eck, Heri jgers等 2000 ；Ishiguro, Yoshida 等 2001 Juan, Lee 等 2001 ；Yoshida, Hasty 等 2001 ；Gough 和 Raines 2003)。此外，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞在對MI的炎性反應(yīng)中具有作用。因此該方 法也可用于MI模型以降低梗死區(qū)PAI-I的活性。概述-單核細(xì)胞離體轉(zhuǎn)導(dǎo)該方法的主要缺點(diǎn)是，單核細(xì)胞對Ad5血清型有抗性 (Burke, Sumner等2002 ；Burke 2003)。Adllp和Ad;35血清型以及慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體容易感染血液生成細(xì)胞類型，包括髓細(xì)胞類型如單核細(xì)胞Gegerman,Lindman等2006)。直接注射入主動(dòng)脈另一種方法是直接動(dòng)脈內(nèi)注射入升主動(dòng)脈的斑塊區(qū)域。這是 一種常用于心肌基因轉(zhuǎn)移的方法，然而，我們不能確保該方法用于主動(dòng)脈基因轉(zhuǎn)移是否可 行。綜述-心血管組織的基因轉(zhuǎn)移根據(jù)對已報(bào)道的各種基因轉(zhuǎn)移策略的評價(jià)，通過 注射到左心室腔，鉗閉肺動(dòng)脈和主動(dòng)脈內(nèi)遞送轉(zhuǎn)導(dǎo)的單核細(xì)胞或冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送，都可能 提供用于多種心血管細(xì)胞類型的可行基因轉(zhuǎn)移方法。實(shí)驗(yàn)框架誘騙劑-計(jì)劃11.用！fepG2細(xì)胞體外驗(yàn)證PAI-1的作用a.抗原b.活性2.用VSMC體外驗(yàn)證PAI-I的作用a.抗原b.活性3.用VSMC遷移試驗(yàn)體外驗(yàn)證
a.人 VSMCb. /Jn VSMC定位束縛子-計(jì)劃21.用VSMC體外驗(yàn)證a.培養(yǎng)液和細(xì)胞(膜)裂解液中的抗原b.通過熒光顯微鏡定位2.用EC體外驗(yàn)證a.培養(yǎng)液和細(xì)胞(膜)裂解液中的抗原b.通過熒光顯微鏡定位3.單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞體外驗(yàn)證a.培養(yǎng)液和細(xì)胞(膜)裂解液中的抗原b.通過熒光顯微鏡定位啟動(dòng)子-計(jì)劃34.用VSMC體外驗(yàn)證a. VSMC和非VSMC中的報(bào)道分子活性b. VSMC和非VSMC中的可誘導(dǎo)報(bào)道分子活性5.用EC體外驗(yàn)證a. EC和非EC中的報(bào)道分子活性b. EC和非EC中的可誘導(dǎo)報(bào)道分子活性6.單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞體外驗(yàn)證a.單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及非單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞類型中的報(bào)道分子活性b.單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及非單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞類型中的可誘導(dǎo)報(bào)道分子 活性定位誘騙劑-計(jì)劃41.被轉(zhuǎn)導(dǎo)VSMC的體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))2.被轉(zhuǎn)導(dǎo)EC的體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))3.用被轉(zhuǎn)導(dǎo)VSMC遷移試驗(yàn)體外驗(yàn)證a. Avsmcb.小鼠 VSMC4.被轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))具有可誘導(dǎo)/組織特異性報(bào)道分子表達(dá)的病毒-計(jì)劃51. VSMC體外驗(yàn)證2. EC體外驗(yàn)證3.單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞體外驗(yàn)證病毒基因療法-計(jì)劃61.用VSMC體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))2.被轉(zhuǎn)導(dǎo)EC的體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))3.用被轉(zhuǎn)導(dǎo)VSMC遷移試驗(yàn)體外驗(yàn)證a.人 VSMC
b. /Jn VSMC4.被轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的體外驗(yàn)證(表達(dá)和定位試驗(yàn))體外數(shù)據(jù)的編譯報(bào)告-計(jì)劃71.計(jì)劃1-6的編譯數(shù)據(jù)臨床前模型-計(jì)劃81.誘導(dǎo)有或沒有PAI-I缺陷的胰島素抗性(IR)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。2.特征分析無PAI-I小鼠、胰島素抗性(IR)小鼠的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。3.驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)移模型a.離體轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞b.在阻塞或不阻塞輸出血管情況下心肌內(nèi)注射c.直接注射入主動(dòng)脈
實(shí)施例實(shí)施例PAI-1誘騙劑和抑制策略PAI-I誘騙劑的示例性抑制機(jī)制描繪于圖16。在幾乎每種情況下，以下示例性誘騙劑設(shè)計(jì)包括了多種抑制機(jī)制。每種示例性誘 騙劑設(shè)計(jì)及其抑制機(jī)制的示意圖見圖9。圖9描繪的并在以下實(shí)施例中描述的誘騙劑設(shè)計(jì) 可作為本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文所述的具體實(shí)施方式
，許多等價(jià)設(shè)計(jì)和抑制策略也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。參見“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性PAI-I誘騙劑的相對應(yīng) SEQ ID NO.。PAI-I誘騙劑1-3 天然PAIl在溶液中的半衰期很短不到2小時(shí)。它自發(fā)經(jīng)歷構(gòu)象 轉(zhuǎn)變成為非抑制性的潛伏形式。最鄰近蛋白酶切割位點(diǎn)(R346-M347)的反應(yīng)中心環(huán)(RCL) 肽在轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲问綍r(shí)插入到PAIl結(jié)構(gòu)存在的β片層中。基于該RCL序列的肽可阻斷 PAIl蛋白酶的抑制活性。據(jù)此，PAI-I誘騙劑1-3可利用此RCL序列來抑制該分子。基于該序列的重組肽 已顯示可抑制PAIl作用，其作用原理與天然RCL極其相同，但時(shí)間較短。評價(jià)各單獨(dú)序列、 多個(gè)序列以及被間隔物隔開的多個(gè)序列(有可能與PAIl分子聚合)。這種序列將模擬天 然RCL肽的作用。這些DCY將幾乎明確抑制，目的是鑒定哪種類型的構(gòu)建物將最有效地抑 制以及可能與下面的其他設(shè)計(jì)聯(lián)用。PAI1-DCY-94-1 用RCL肽的4種串聯(lián)重復(fù)序列來抑制正常的PAIl自殺反應(yīng)。比 較該 DCY 與 PAI1-DCY-94-2 和 PAI1_DCY_94_3 的相對效率。PAI1-DCY-94-2 用單個(gè)RCL來抑制正常的PAI1自殺反應(yīng)。比較該DCY與 PAI1-DCY-94-1 和 PAI1-DCY-94-3 的相對效率。PAI1-DCY-94-3 用RCL肽的4種串聯(lián)重復(fù)序列(被間隔物隔開以增強(qiáng)其與多個(gè) PAIl分子的相互作用)來抑制正常的PAIl自殺反應(yīng)。比較該DCY與PAI1-DCY-94-1和 PAI1-DCY-94-2的相對效率。PAI-I誘騙劑4和5 與幾種絲氨酸蛋白酶(例如，tPA、uPA、凝血酶)之一結(jié)合后， PAIl在切割過程顯著的構(gòu)象變化從而導(dǎo)致自殺性抑制反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，這種結(jié)構(gòu)重排是抑制機(jī)制的重要部分。延遲這種構(gòu)象變化能使切割反應(yīng)進(jìn)行完全從而將PAIl轉(zhuǎn)變成不 同于正常底物。在活性PAIl結(jié)構(gòu)中無序存在的反應(yīng)中心環(huán)(RCL)肽插入β片層。出于以下兩個(gè)潛在目的之一，嘗試使PAI-I誘騙劑4和5與活性ρΑΙ 1的RCL相互 作用1)減緩RCL插入PAIl結(jié)構(gòu)中以使PAIl被靶標(biāo)絲氨酸蛋白酶自然切割，或2)通過空 間干擾阻止與靶標(biāo)蛋白酶結(jié)合在一起。RCL肽與PAIl的β片層相互作用。利用該片層的 序列約束天然RCL。PAI1-DCY-94-4 該DCY的目的是穩(wěn)定RCL同時(shí)使其仍舊獨(dú)立于片層而允許切割反 應(yīng)進(jìn)行。利用構(gòu)成片層部分插入了 RCL的β鏈為RCL肽提供另一結(jié)合表面。PAIl的兩個(gè) 反向平行β鏈將被用來產(chǎn)生其中插入并結(jié)合RCL的天然β片層部分。構(gòu)成該DCY的兩條 鏈在序列中不毗連，因此可利用形成β轉(zhuǎn)角的四個(gè)殘基結(jié)合它們并得到合適的二級結(jié)構(gòu)。PAI1-DCY-94-5 該DCY的目的是穩(wěn)定RCL同時(shí)使其仍舊獨(dú)立于片層并允許切割反 應(yīng)進(jìn)行。RCL肽實(shí)際插入在PAIl結(jié)構(gòu)的兩條平行β鏈之間。這兩條鏈在天然結(jié)構(gòu)序列中 不毗連，但它們是PAIl這種β片層的順序成員。富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)是見于幾種蛋白質(zhì)，包括胞外基質(zhì)蛋白核心蛋白聚 糖和雙糖鏈蛋白聚糖以及Toll樣受體中的基序。該基序包含β鏈的微凹表面以及螺旋或 半螺旋結(jié)構(gòu)的凸面。這些基序反復(fù)堆疊形成螺線管結(jié)構(gòu)，含有一系列平行β鏈形成凹片 層。該序列關(guān)鍵部分的亮氨酸提供了內(nèi)部口袋，允許面朝外的殘基有巨大變異。這種基序 穩(wěn)定，尤其是當(dāng)連續(xù)重復(fù)時(shí)。來自Toll樣受體3胞外域的幾個(gè)LRR將被用作支架以再形成 其中插入了 RCL的天然片層結(jié)構(gòu)部分。由于平行鏈的堆疊，使LRR理想地模擬了 PAIl β片 層結(jié)構(gòu)部分。由于PAIl中片層的大小，它們將在LRR支架上再產(chǎn)生兩個(gè)區(qū)段。PAI-I誘騙劑6和7 激肽釋放酶2 (hK2)是一種前列腺正常表達(dá)的絲氨酸蛋白酶， 可用作前列腺癌的標(biāo)記物。它對Pl切割位點(diǎn)Arg顯示有強(qiáng)特異性。它能切割和隨后滅活 PAI1，效率高于其他蛋白酶。該蛋白的表達(dá)狀況結(jié)合其特異性，使其成為實(shí)際切割和滅活 PAIl的良好候選物。如果靶向存在PAIl的區(qū)域，它能夠切割并因此有效滅活PAI1。PAI-I誘騙劑6和7可利用活性蛋白酶激肽釋放酶2 (hK2)來消化PAI1。hK2是一 種通常見于前列腺的絲氨酸蛋白酶。其表達(dá)狀況特殊已被用作前列腺癌的標(biāo)記物。其底物 特殊已顯示出能特異性消化PAIl而不是被其抑制。這些構(gòu)建物之一具有帶電環(huán)，能模擬天 然tPA序列，顯示對PAI1結(jié)合至關(guān)重要。PAI1-DCY-94-6 可制得激肽釋放酶2的潛在突變體以增強(qiáng)其結(jié)合特異性。存在于 tPA中的環(huán)含有幾個(gè)對tPA-PAIl結(jié)合至關(guān)重要的帶電殘基?？赏蛔僪K2中相應(yīng)的環(huán)使之匹 配該序列并可能增強(qiáng)對PAIl的結(jié)合特異性。PAI1-DCY-94-7 激肽釋放酶2 (hl^)是一種前列腺正常表達(dá)的絲氨酸蛋白酶，可 用作前列腺癌的標(biāo)記物。它對Pl切割位點(diǎn)Arg顯示有強(qiáng)特異性。它能切割和隨后滅活 PAI1，效率高于其他蛋白酶。該蛋白的表達(dá)狀況結(jié)合其序列特異性使其成為DCY實(shí)際切割 和滅活PAIl的良好候選物。已證明組織纖溶酶原激活劑(tPA)表面帶正電荷的環(huán)對PAIl結(jié)合至關(guān)重要。據(jù) 認(rèn)為它能與PAIl的RCL肽附近的一系列酸性殘基相互作用。獲得該區(qū)域以代替hK2中較 短的環(huán)。加入該序列導(dǎo)致較高的結(jié)合親和力和更有效地切割。PAI-I誘騙劑8-12 纖溶酶原激活劑的抑制劑_1 (PAIl)是一種參與調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解的絲氨酸蛋白酶抑制劑。其靶標(biāo)包括組織纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶纖溶酶原激 活劑(uPA)。PAIl在自殺性抑制劑反應(yīng)中結(jié)合其靶標(biāo)，僅在極緩慢切割的酰基酶中間體階 段共價(jià)結(jié)合(不在復(fù)合體被清除之前)。PAIl在溶液中的半衰期很短不到2小時(shí)。它自發(fā) 經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變成為無功能的潛伏形式。最鄰近切割位點(diǎn)的反應(yīng)中心環(huán)(RCL)肽插入PAIl 結(jié)構(gòu)上已有的β片層中?；谠揜CL序列的肽可阻斷PAIl蛋白酶的抑制活性。玻連蛋白是一種結(jié)合多個(gè)ECM伴侶的胞外基質(zhì)(ECM)分子。它以高親和力結(jié)合 PAIl并顯著延長其半衰期，從而能與tPA、uPA和其他絲氨酸蛋白酶相互作用并抑制。與 PAIl的相互作用發(fā)生在玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B(SMB)結(jié)構(gòu)域中。結(jié)合是特異性的親和力 高(Kd 約 InM)。PAI-I誘騙劑8-12利用玻連蛋白與PAIl相互作用并使其與RCL抑制肽結(jié)合。玻 連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B (SMB)結(jié)構(gòu)域以高親和力結(jié)合PAIl并可顯著延長其有效半衰期。一 些論文顯示，該結(jié)合表面的酪氨酸突變可完全消除結(jié)合。盡管我們的目的不是消除結(jié)合，而 是使SMB結(jié)合的穩(wěn)定作用最小同時(shí)保留至少部分結(jié)合親和力。制備一系列保守性突變以探 測結(jié)合表面。SMB突變與RCL肽結(jié)合將賦予DCY相當(dāng)大的抑制特性。將會(huì)發(fā)現(xiàn)使結(jié)合最大 同時(shí)使穩(wěn)定性最小的構(gòu)建物，無論其是天然的SMB結(jié)構(gòu)域或是突變構(gòu)建物之一。SMB的高結(jié) 合親和力將RCL肽有效束縛于PAI1，應(yīng)能促進(jìn)更迅捷的相互作用。PAI l-DCY-94-8 =DCY將利用玻連蛋白的SMB結(jié)構(gòu)域以高親和力和特異性靶向PAI1 結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨赑AIl的RCL多個(gè)重復(fù)抑制肽。最初的SMB結(jié)合將使該肽非 常接近并插入β片層，導(dǎo)致抑制作用，并可能導(dǎo)致SMB結(jié)構(gòu)域分離。RCL肽可能以順式或反 式起作用，影響附近的含有這些多個(gè)結(jié)合域和抑制域的PAIl分子。PAI1-DCY-94-9 該誘騙劑將利用玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域以高親和力和 特異性靶向PAIl結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨赑AIl的RCL多個(gè)重復(fù)抑制肽。最初的SMB 結(jié)合將使肽非常接近并插入β片層，導(dǎo)致抑制作用，并可能導(dǎo)致SMB結(jié)構(gòu)域分離。RCL肽可 能以順式或反式起作用，影響附近的含有這些多個(gè)結(jié)合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 結(jié)構(gòu)域?qū)⒈煌蛔?。這種突變將有可能降低玻連蛋白對PAIl的穩(wěn)定作用但將維持有效靶向 RCL肽的充足親和力。PAI1-DCY-94-10 該誘騙劑將利用玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域以高親和力和 特異性靶向PAIl結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨赑AIl的RCL多個(gè)重復(fù)抑制肽。最初的SMB 結(jié)合將使肽非常接近并插入β片層，導(dǎo)致抑制作用，并可能導(dǎo)致SMB結(jié)構(gòu)域分離。RCL肽可 能以順式或反式起作用，影響附近的含有這些多個(gè)結(jié)合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 結(jié)構(gòu)域?qū)⒈煌蛔?。這種突變將有可能降低玻連蛋白對PAIl的穩(wěn)定作用但將維持有效靶向 RCL肽的充足親和力。一些研究文章證明，突變消除了結(jié)合，尤其是在結(jié)合界面的T — A突 變。本發(fā)明的目的不是消除結(jié)合，而是盡可能消除玻連蛋白結(jié)合PAIl的二級穩(wěn)定作用。PAI1-DCY-94-11 該誘騙劑將利用玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域以高親和力和 特異性靶向PAII結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨赑AIl的RCL多個(gè)重復(fù)抑制肽。最初的SMB 結(jié)合將使肽非常接近并插入β片層，導(dǎo)致抑制作用，并可能導(dǎo)致SMB結(jié)構(gòu)域分離。RCL肽可 能以順式或反式起作用，影響附近的含有這些多個(gè)結(jié)合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 結(jié)構(gòu)域?qū)⒈煌蛔儭＿@種突變將有可能降低玻連蛋白對PAIl的穩(wěn)定作用但將維持有效靶向 RCL肽的充足親和力。
PAI1-DCY-94-12 該誘騙劑將利用玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域以高親和力和 特異性靶向PAIl結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨赑AIl的RCL多個(gè)重復(fù)抑制肽。最初的SMB 結(jié)合將使肽非常接近并插入β片層，導(dǎo)致抑制作用，并可能導(dǎo)致SMB結(jié)構(gòu)域分離。RCL肽可 能以順式或反式起作用，影響附近的含有這些多個(gè)結(jié)合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 結(jié)構(gòu)域?qū)⒈煌蛔?。這種突變將有可能降低玻連蛋白對PAIl的穩(wěn)定作用但將維持有效靶向 RCL肽的充足親和力。PAI-I誘騙劑13和14 玻連蛋白是一種結(jié)合多個(gè)ECM伴侶的胞外基質(zhì)(ECM)分 子。它以高親和力結(jié)合PAIl而顯著延長其半衰期，使之能與tPA、uPA和其他絲氨酸蛋白酶 相互作用并抑制。與PAIl的相互作用發(fā)生在玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B(SMB)結(jié)構(gòu)域中。結(jié) 合有特異性親和力高(Kd約InM)。激肽釋放酶2(hK2)是一種前列腺正常表達(dá)的絲氨酸蛋白酶，可用作前列腺癌的 標(biāo)記物。它對Pl切割位點(diǎn)Arg顯示出強(qiáng)特異性。它能切割和隨后滅活PAI1，效率高于其他 蛋白酶。該蛋白的表達(dá)狀況結(jié)合其序列特異性使其成DCY實(shí)際切割和滅活PAIl的良好候 選物。PAI-I誘騙劑13-14也利用SMB結(jié)構(gòu)域來提高對PAIl的結(jié)合親和力，此時(shí)與能夠 結(jié)合并隔離PAIl的滅活蛋白酶結(jié)合，或與能將其消化的激肽釋放酶2結(jié)合。PAI1-DCY-94-13 尿激酶-型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種參與激活纖維溶解途 徑以及通過其受體參與信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的絲氨酸蛋白酶。uPA是PAIl的靶標(biāo)。該酶將被截 短成僅含催化結(jié)構(gòu)域，催化殘基將被突變而消除活性。這種滅活的酶將連接于玻連蛋白的 SMB結(jié)構(gòu)域?yàn)镻AIl提供結(jié)合平臺(tái)。PAIl將被隔離不能與其他絲氨酸蛋白酶相互作用并抑 制。與PAI1-DCY-94-7和PAI1-DCY-94-14不同，這種DCY將不會(huì)在靶區(qū)域引入任何新的酶 活性。PAI1-DCY-94-14 該誘騙劑將利用玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域以高親和力和 特異性靶向PAIl結(jié)合。SMB結(jié)構(gòu)域?qū)⒏街诨钚约る尼尫琶?分子以高親和力和特異性靶 向PAIl并將其切割，從而使其滅活。PAI-I誘騙劑15 玻連蛋白是一種結(jié)合多個(gè)ECM伴侶的胞外基質(zhì)(ECM)分子。它 以高親和力結(jié)合PAIl并顯著延長其半衰期，從而能與tPA、uPA和其他絲氨酸蛋白酶相互作 用并抑制。與PAIl的相互作用發(fā)生在玻連蛋白的生長調(diào)節(jié)素B(SMB)結(jié)構(gòu)域中。結(jié)合有特 異性親和力高(Kd約InM)。PAI-I誘騙劑15是SMB結(jié)構(gòu)域的又一組突變。SMB的結(jié)構(gòu)就其骨架而言幾乎是對 稱的。PAIl結(jié)合表面和面對結(jié)合位點(diǎn)的表面二者的螺旋和環(huán)取向幾乎相同。在許多方面， 5個(gè)突變將在SMB分子上再產(chǎn)生第二個(gè)PAIl結(jié)合位點(diǎn)。雖然背面螺旋和環(huán)之間的間隔略小 于天然結(jié)合位點(diǎn)的間隔，但該螺旋區(qū)域能提供以一定親和力結(jié)合第二個(gè)PAIl分子的充足 相互作用。如果確實(shí)結(jié)合兩個(gè)PAIl分子，可連接RCL肽以能與兩個(gè)結(jié)合的PAIl分子相互 作用。與天然結(jié)合位點(diǎn)相對的表面具有與結(jié)合位點(diǎn)類似的骨架。該表面的突變能部分復(fù) 制PAIl結(jié)合位點(diǎn)?？梢肴舾赏蛔円愿爬⊿MB的大多數(shù)PAIl結(jié)合表面。突變諸殘基的α 碳附加上0. 99埃的RMS，而螺旋結(jié)構(gòu)域的α碳附加上0. 49埃的RMS。這樣可能導(dǎo)致PAIl分子以面對面方式二聚化。存在至少兩種可能該分子的RCL肽可能相互干擾，可能有實(shí)質(zhì)性空間位阻而影響PAIl的抑制性能。為增強(qiáng)PAIl的抑制作 用，可使能結(jié)合從而抑制PAIl的外源RCL肽連接于該突變的SMB結(jié)構(gòu)域成為重復(fù)的四聚 體。實(shí)施例組織特異性啟動(dòng)子參見“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性組織特異性啟動(dòng)子的相 對應(yīng) SEQ ID NO。MOD 5306-動(dòng)脈平滑肌特異性啟動(dòng)子(示于圖10)-原理結(jié)蛋白基因編碼骨骼、 心臟和平滑肌細(xì)胞中存在的中間絲蛋白。用于本文的該啟動(dòng)子區(qū)域含有能結(jié)合血清反應(yīng)因 子和Oct-樣因子的CArG/八聚體重疊元件；它還含有最小啟動(dòng)子(用啟動(dòng)子預(yù)測工具確 定)；該區(qū)域在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中具有活性，但在靜脈平滑肌細(xì)胞或體內(nèi)心臟中沒有活性。合成啟動(dòng)子的MOD原理分析啟動(dòng)子區(qū)域并收集血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表達(dá)的基 因提供了與VSMC特異性表達(dá)相關(guān)的幾種調(diào)控元件列表。在以下合成的啟動(dòng)子構(gòu)建物融 合于平滑肌收縮蛋白SM22ci基因片段的腎母細(xì)胞瘤過表達(dá)的(Nov)最小啟動(dòng)子區(qū)域中采 用了一組這種調(diào)控元件的組合。SM22ci是一種已建立的VSMC分化標(biāo)記物。其最小啟動(dòng)子 顯示能指導(dǎo)不同轉(zhuǎn)基因的動(dòng)脈平滑肌特異性表達(dá)。近年報(bào)道了成年大鼠主動(dòng)脈有非常高的 Nov表達(dá)。本發(fā)明示例性合成的血管平滑肌啟動(dòng)子包括M0D 5309-合成的VSMC特異性啟動(dòng) 子1(示于圖11A)，M0D 5312-合成的VSMC特異性啟動(dòng)子2 (示于圖11B) JnMOD 5315-合 成的VSMC特異性啟動(dòng)子3 (示于圖11C)MOD原理分析啟動(dòng)子區(qū)域并收集血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表達(dá)的基因，提供了與 VSMC特異性表達(dá)相關(guān)的幾種調(diào)控元件列表。在以下合成的啟動(dòng)子構(gòu)建物融合于人肌球蛋 白重鏈11，平滑肌啟動(dòng)子區(qū)域的平滑肌收縮蛋白SM22ci基因片段中采用了一組這種調(diào)控 元件的組合。SM22ci是一種已建立的VSMC分化標(biāo)記物。該大鼠最小啟動(dòng)子顯示能指導(dǎo)不 同轉(zhuǎn)基因的動(dòng)脈平滑肌特異性表達(dá)。類似地，MYHll也是平滑肌特異性。MOD 4012-ESM1,內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(示于圖12A)_Mod原理該基因編碼一種 主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的分泌蛋白。該基因的啟動(dòng)子可用于需要內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)治療 /誘騙分子的基因療法。MOD 4399-FLT1，內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(示于圖12B)_M0D原理人跨膜fms-樣 受體酪氨酸激酶Flt-I是誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖和血管通透性的血管內(nèi)皮生長因子的受體之一。 Flt-I在內(nèi)皮中特異性表達(dá)。Flt-I啟動(dòng)子可用作將引入的外源基因靶向內(nèi)皮表達(dá)的工具。MOD 4790-合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子1 (示于圖13A)和MOD 4791-合成的內(nèi) 皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子2 (示于圖13B)-M0D原理基因療法的主要目的是將感興趣的基因引 入所需細(xì)胞類型。內(nèi)皮細(xì)胞系實(shí)際上覆蓋所有大的血管因此直接接觸循環(huán)系統(tǒng)。有可能通 過內(nèi)皮細(xì)胞遞送的基因產(chǎn)物包括激素，血漿中發(fā)現(xiàn)的蛋白因子，如胰島素、生長激素、因子 VIII，以及分別用于治療局部缺血或新生血管疾病的血管生成分子或血管抑制分子。檢查 內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域揭示，大多數(shù)具有特異性和非特異性轉(zhuǎn)錄因子二者的結(jié) 合位點(diǎn)。這種設(shè)計(jì)的目的是構(gòu)建合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性小啟動(dòng)子。將位于許多內(nèi)皮細(xì)胞特 異性mRNA轉(zhuǎn)錄物5'端的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的序列連接于人ICAM2最小啟動(dòng)子，從而 產(chǎn)生了合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子1和2。
實(shí)施例定位束縛子參見“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性定位束縛子的相對應(yīng)SEQ ID NO.。脂質(zhì)修飾的束縛子，整合于胞質(zhì)膜，胞外束縛子(示于圖 14A-14B)設(shè)計(jì)的1類定位束縛子可將運(yùn)載物錨定在胞質(zhì)膜的細(xì)胞外表面。所設(shè)計(jì)的它們 具有心臟、骨骼或成纖維細(xì)胞組織記憶力。大部分構(gòu)建物利用羰基磷脂酰肌醇(GPI)脂質(zhì) 修飾而錨定于膜。GPI生物合成發(fā)生于在ER內(nèi)翻譯之后。該蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)識(shí)別疏水 基序，隨后將其切除。切除后該蛋白質(zhì)加入完整的GPI部分。GPI錨的結(jié)構(gòu)和組成多種多 樣，可以是蛋白質(zhì)或組織特異性。一旦位于細(xì)胞表面，GPI錨可被磷脂酶切除。GPI切割的 動(dòng)力學(xué)取決于脂質(zhì)長度、膜表面電荷以及膜雙層自身的生理化學(xué)特性。如此，設(shè)計(jì)中采用了 不同的GPI錨以提供各種表面保留時(shí)間。設(shè)計(jì)的91-1到91-4包含血幼素(hemojuvelin，HJV)GPI-錨切割/添加結(jié)構(gòu)域。 選擇HJV是因?yàn)樗诠趋兰?nèi)表達(dá)，并且如果加入正確的GPI錨就具有組織特異性，從而可 提供用于肌肉組織的理想結(jié)構(gòu)域。91-1是基礎(chǔ)信號(hào)肽/運(yùn)載物/GPI基序的藍(lán)圖。91-2在 運(yùn)載物與脂質(zhì)錨之間加入了一個(gè)接頭可增加運(yùn)載物的移動(dòng)范圍。91-3含有包含突變的HJV 的較長C-末端區(qū)域，可防止HJV與神經(jīng)發(fā)生素結(jié)合，但已被證明能適當(dāng)?shù)剡\(yùn)輸?shù)侥ぁ?1-4 與91-2相同，但加入在MAGPl微纖維蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。當(dāng)GPI錨被切除時(shí)，設(shè)計(jì)的該構(gòu) 建物可結(jié)合周圍的微纖維基質(zhì)。這能保持運(yùn)載物非常接近基質(zhì)修飾蛋白。設(shè)計(jì)的91-5和91-6可利用Thy-IGPI切割/添加位點(diǎn)。選擇Thy-I是由于經(jīng)研 究并確認(rèn)其保留時(shí)間長于其他的GPI錨定蛋白。Thy-I錨的結(jié)構(gòu)可造成磷脂酶空間位阻而 減慢其切割速率。91-7基于91-6構(gòu)建，加入了腱糖蛋白-X(TNX)基質(zhì)結(jié)合域。該結(jié)構(gòu)域應(yīng) 將切割的GPI-錨定蛋白靶向I型膠原微纖維。91-8也含有基質(zhì)結(jié)合域，但不是靶向基質(zhì)框 架，這種ApoB結(jié)構(gòu)域能結(jié)合葡糖胺基葡聚糖(9637699).設(shè)計(jì)的91-9到91-11具有相同的設(shè)計(jì)原理，但利用了磷脂酰肌醇聚糖_1的GPI 基序。磷脂酰肌醇聚糖-1是一種定位于膜筏(raft)和小凹的GPI-I錨定蛋白聚糖。它在 不同組織中廣泛表達(dá)，在這種MDR中提供可能不同于其他GPI的保留時(shí)間。91-12到91-16 具有類似的原理，但含有MT-MMP6GPI切割/添加位點(diǎn)以及不同組合的接頭與基質(zhì)結(jié)合域。設(shè)計(jì)91-17和91-18試圖產(chǎn)生能適當(dāng)運(yùn)輸呈遞運(yùn)載物于細(xì)胞外表面的一種跨膜 LOC，。MTl-MMP C-末端尾和跨膜區(qū)域除了假定的運(yùn)輸信息沒有已知功能。91-18加入了 糖基化胞外結(jié)構(gòu)域，以在91-17不存在于膜中時(shí)幫助運(yùn)輸。91-19和91-20能將運(yùn)載物置 于C-末端。蛋白裂解酶(matriptase)是一種II型絲氨酸蛋白酶。其蛋白酶結(jié)構(gòu)域位于 C-末端區(qū)域，在這些構(gòu)建物中被除去。剩余部分可能被糖基化而介導(dǎo)胞質(zhì)膜遞送。總之，設(shè)計(jì)91-1到91-16試圖得到不同的膜保留時(shí)間以獲得適合所加入的誘騙劑 的理想運(yùn)載物呈遞。一些設(shè)計(jì)包含基質(zhì)結(jié)合域以增強(qiáng)遞送位點(diǎn)的運(yùn)載物在基質(zhì)中的活性。 設(shè)計(jì)91-17到91-20試圖獲得不具有內(nèi)在活性的可能是最簡單的設(shè)計(jì)。所有設(shè)計(jì)的潛在缺 陷將是胞質(zhì)膜運(yùn)輸缺陷。2類定位束縛子-可分泌和/或胞外束縛子，可溶性這些定位模塊的意圖是通過 調(diào)節(jié)型分泌途徑或組成型細(xì)胞膜釋放途徑，使攜帶的運(yùn)載物通過細(xì)胞進(jìn)入胞外空間。一旦 到達(dá)細(xì)胞外，結(jié)合序列將允許肽附著于細(xì)胞質(zhì)膜外部小葉并在此處合成，或者附著于形成胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)。為了分泌，采用了三種策略。第一種，利用細(xì)胞的調(diào)節(jié)型分泌途徑，使脂質(zhì)或蛋白 質(zhì)聚集和/或結(jié)合于顆粒內(nèi)表面。第二種，利用組成型分泌途徑，使常規(guī)信號(hào)進(jìn)入這些囊 泡。第三種，利用上述兩種途徑。這是由于在患理狀態(tài)下，上述一種或另一種途徑可能會(huì) “超載”，而利用兩種功能不同的信號(hào)(肽)應(yīng)不會(huì)阻止肽活性完全消失。當(dāng)利用與分泌顆 粒內(nèi)表面的結(jié)合時(shí)，將選擇對PH或鈣水平變化敏感的結(jié)合，而有助于肽的細(xì)胞表面釋放。一旦該肽從囊泡釋放到表面，預(yù)計(jì)會(huì)與結(jié)合在細(xì)胞外部小葉表面的蛋白質(zhì)(即 uPAR或膜聯(lián)蛋白)結(jié)合，或與包含胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)(即纖維蛋白)結(jié)合。在一些構(gòu)建物 中，利用了已知會(huì)在梗死區(qū)過度表達(dá)從而“暴露” “隱藏的”ECM結(jié)合基序的那些酶的蛋白酶 (識(shí)別)位點(diǎn)。采用這種方法試圖防止運(yùn)載物被健康組織區(qū)域內(nèi)的蛋白質(zhì)捕獲和激活。換 句話說，位點(diǎn)的安置方式應(yīng)使定位肽主體釋放運(yùn)載物時(shí)僅將其自身釋放到胞外基質(zhì)中。預(yù) 計(jì)與ECM結(jié)合將使運(yùn)載物具有“逗留能力”，而與膜蛋白質(zhì)維持結(jié)合將允許我們的肽翻轉(zhuǎn)。3類定位束縛子-條件性可溶性胞外束縛子(示于圖15)本設(shè)計(jì)的基本模塊元件 如下預(yù)計(jì)活性較低的跨膜蛋白(或前蛋白)，熟知的信號(hào)肽，脂質(zhì)膜附著基序(GPI和棕櫚 酰基)，以及條件性可切割的蛋白水解位點(diǎn)(用于TACE/ADAM17、MTl-MMP、uPA/tTPA或多種 蛋白酶切割)。在11種設(shè)計(jì)和1種可能的陽性對照中這些組分不相同。這些設(shè)計(jì)作為一個(gè) 整體試圖破壞不同風(fēng)險(xiǎn)因素(實(shí)驗(yàn)的和實(shí)際的)之間的平衡。L0C-93-1 本身就是一類。其基于前 _ 原 _TGF_ α (pre-pro-TGF-alpha)，但在該 設(shè)計(jì)中，刪除了分泌和加工的生長因子，代之以治療誘騙劑、標(biāo)簽或熒光蛋白。為了使該設(shè) 計(jì)能“工作”，必需用與成熟TGF-α非常類似的方法處理該誘騙劑。前-原-TGF-α大部 分被腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)切割和激活，該酶也參與各種促炎細(xì)胞因子 如TNF-α的“屏蔽”。TACE由促炎微環(huán)境誘生，可用佛波酯處理人為誘生。TACE大量存在 于心臟損傷、組織重塑和腫瘤微環(huán)境區(qū)域內(nèi)，可在細(xì)胞表面或者甚至在分泌之前在分泌小 泡內(nèi)被激活。該組中采用TACE(或預(yù)測的TACE共有序列)的其他設(shè)計(jì)是L0C-93-2、-3、-4 和_9。然而，預(yù)計(jì)這些共有位點(diǎn)通過不同方式定位到表面。L0C-93-2、_3、_4、_5、_6、_7和_12(對照)利用了一種稱為TMlO的少許不明確 的多肽，即Opalin(—種功能未知的腦特異性蛋白)的人同源物。通過檢索EMBL-GFP(海 德堡，德國)定位數(shù)據(jù)庫計(jì)劃中小的(即小于200個(gè)氨基酸)跨膜蛋白鑒定到這種蛋白質(zhì)。 它不含明顯的信號(hào)肽、配體受體或激酶結(jié)構(gòu)域，其141氨基酸序列的BLAST檢索顯示無密切 同源物。盡管LOCATE數(shù)據(jù)庫稱TMlO是一種II型膜蛋白，但對該序列進(jìn)行的多次分析揭 示，毫無例外它實(shí)際上明確是I型膜蛋白(含有通過LOCATE相連的分析位點(diǎn))。在完成這 些設(shè)計(jì)之后，Kippert等最近Q008/4/25 ； 18439243)對TMlO (TMEMlO)進(jìn)行了定性，實(shí)驗(yàn)證 明為I型，具有很強(qiáng)的胞質(zhì)膜定位功能和可能的肌動(dòng)蛋白結(jié)合功能。采用小的致密跨膜LOC 信號(hào)肽(transmembraneLOCsig)的理由幾乎不言而喻，因?yàn)檫@種例子的許多肽體積較大很 可能參與多效性信號(hào)傳導(dǎo)一這對治療有潛在危害。心臟治療采用少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性多肽 的理由是，腦特異性蛋白質(zhì)干擾心臟特異性過程的可能性很小。通過實(shí)驗(yàn)比較將L0C-93-2、_3和_4歸為一組。將合成的嵌合TACE底物(基于 TGF- α TACE位點(diǎn)+TNF- α的兩個(gè)取代基，側(cè)接短間隔殘基)與TMlO的N-末端融合，形成 TAG/DCY與LOC之間的連接。L0C-93-3通過包含EGFR的η-末端信號(hào)肽將93_2轉(zhuǎn)變?yōu)椤皟?nèi)部運(yùn)載物”；這測試了信號(hào)肽是否增強(qiáng)了向表面的遞送。L0C-93-4在L0C-93-3中添加了 C-末端棕櫚酰附著位點(diǎn)；這種添加進(jìn)而可測試C-末端脂化是否增強(qiáng)了細(xì)胞表面的定位和/ 或保留。也通過比較不同的蛋白水解位點(diǎn)將L0C-93-3、-5、-6、_7 —起歸入另一組。所述 蛋白水解切割位點(diǎn)可以是TACE/ADAM17、uPA/tPA、MTl-MMP的切割位點(diǎn)，或者是更不穩(wěn)定的 可被多種蛋白酶(即α -2巨球蛋白)靶向的位點(diǎn)。L0C-93-8、_9、-10和-11的設(shè)計(jì)如下。其構(gòu)型為信號(hào)肽(來自前-磷脂酰 肌醇聚糖)后接內(nèi)部運(yùn)載物，終止于C-末端的假定GPI錨定位點(diǎn)(來自MMP 25)。與 L0C-93-3、-5、-6和-7類似，這些測試顯示蛋白酶切割位點(diǎn)的四種變化。然而，在本文中， 膜附著是困難的，因?yàn)椴皇峭ㄟ^跨膜，而是通過單一脂化模式。L0C-93-12是胞質(zhì)膜定位的一種潛在陽性對照物，已由EMBL-海德堡的GFP-LOC計(jì) 劃以及最近的Kippert等的論文Q008/4/25 ； 18439243)定性。本發(fā)明還提供了以下非限制性實(shí)施方式。El. 一種分離的多肽配體，其中所述配體調(diào)節(jié)PAI-I活性。E2. 一種分離的多肽異質(zhì)聚合配體，其中所述異質(zhì)聚合配體調(diào)節(jié)PAI-I活性。E3. 一種分離的多肽同質(zhì)聚合配體，其中所述同質(zhì)聚合配體調(diào)節(jié)PAI-I活性。E4. 一種分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含母體蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段，所 述母體蛋白含有至少一個(gè)假想的PAI-I相互作用結(jié)構(gòu)域識(shí)別基序。E5.如E4所述的分離的融合蛋白，其中所述母體蛋白是纖維蛋白、組織纖溶酶原 激活劑、尿激酶纖溶酶原激活劑或玻連蛋白。E6.如E1-E5所述的多肽，還包含降解決定子、定位信號(hào)、表位或報(bào)道分子的一個(gè) 或多個(gè)。E7. 一種分離的多核苷酸，其包含編碼E1-E7各項(xiàng)所述多肽的核苷酸序列。E8. 一種載體，其包含E7所述多核苷酸。E9. 一種宿主細(xì)胞，其包含E7所述多核苷酸。E10. 一種非人生物，其包含E7所述多核苷酸。Ell.任選連接于啟動(dòng)子的E7所述的多核苷酸。E12.如Ell所述的任選連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng) 子、非特異性啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。E13.如E12所述的任選連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是 內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、冠脈脂肪 細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或心臟成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。E14.如E9所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。E15.如E14所述宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌 細(xì)胞、冠脈脂肪細(xì)胞或心臟成纖維細(xì)胞。E16.如ElO所述非人生物，其中所述生物是非人靈長類、小鼠、牛、豬、羊、馬、大 鼠、兔、狗、貓或豚鼠。E17. 一種抑制細(xì)胞PAI-I的方法，包括用E8所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并在適合產(chǎn)生 至少一個(gè)所述多肽拷貝的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
E18組織中。
E19卵中。
E20
E21
E22
-種分離的多核苷酸，其包含編碼E20-E22各項(xiàng)所述多肽的核苷酸序列。 -種分離的多核苷酸，其包含對載體插入已經(jīng)過優(yōu)化的編碼PAI-I的核苷酸
-種抑制對象心肌組織PAI-I的方法，包括將E8所述載體注射到對象的心臟
-種產(chǎn)生PAI-I活性降低轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?，包括將E8所述載體注射到受精
-種分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含與降解決定子相連的PAI-1。 -種分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含與定位信號(hào)相連的PAI-1。 -種分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含與降解決定子和定位信號(hào)相連 的 PAI-I。E23.E24. 序列的多核苷酸。E25.如EM所述的分離的多核苷酸，其中所述載體是ULTRAVECT0R。E26. 一種載體，其包含E23-E25所述多核苷酸。E27. 一種宿主細(xì)胞，其包含E23-E25所述多核苷酸。E28. 一種非人生物，其包含E23-E25所述多核苷酸。E29.任選連接于啟動(dòng)子的E23-E25所述的多核苷酸。E30.如E^所述的任選連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng) 子、非特異性啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。E31.如E^所述的任選連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是 內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、冠脈脂肪 細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或心臟成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。E32.如E27所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。E33.如E32所述宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌 細(xì)胞、冠脈脂肪細(xì)胞或心臟成纖維細(xì)胞。E34.如似8所述非人生物，其中所述生物是非人靈長類、小鼠、牛、豬、羊、馬、大 鼠、兔、狗、貓或豚鼠。E35. 一種改變宿主細(xì)胞內(nèi)PAI-I表達(dá)的方法，包括將E^所述載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì) 胞并在適合產(chǎn)生至少一個(gè)PAI-I拷貝的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。E36. 一種改變對象心臟組織PAI-I表達(dá)的方法，包括將E^所述載體注射到對象 的心臟組織中。E37. 一種產(chǎn)生PAI-I表達(dá)改變的轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒ǎ▽^所述載體注射到 受精卵中。上述實(shí)施例和實(shí)施方式僅作為列舉性實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明 不限于本文所述的具體實(shí)施方式
，許多等價(jià)設(shè)計(jì)也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)Akyurek, L. Μ. , S. Nallamshetty 等.(2001). “ Coexpression of guanylate kinase with thymidine kinase enhances prodrug cell killing in vitro and suppresses vascular smooth muscle cell proliferation in vivo (鳥 1Q1 酸激 禾口月匈 苷激酶共表達(dá)體外增強(qiáng)了前藥的細(xì)胞殺傷并抑制體內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞增殖).“Mol Ther3 (5 第 1 部分)779-86.Akyurek, L. M.，Z. Y. Yang 等.(2000). ‘‘ SM22alpha promoter targets gene expression to vascular smooth muscle cells in vitro and in vivo (SM22 α 啟動(dòng)子在 體外和體內(nèi)使基因表達(dá)靶向血管平滑肌細(xì)胞).“Mol Med 6(11) :983-91.Appleby, C. Ε. , P. A. Kingston ^ . (2003). ‘‘ A novel combination of promoter and enhancers increases transgene expression in vascular smooth muscle cells in vitro and coronary arteries in vivo after adenovirus-mediated gene transfer(jp 動(dòng)子和增強(qiáng)子的新型組合提高了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移后體外血管平滑肌細(xì)胞和體內(nèi)冠 狀動(dòng)脈中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)).“Gene Ther 10(18) :1616-22.Beck, C. , H. Uramoto 等.(2004). “ Tissue-specific targeting for cardiovascular gene transfer. Potential vectors and future challenges (
性靶向心血管的基因轉(zhuǎn)移。潛在的載體和未來挑戰(zhàn)).“Curr Gene Ther 4(4) :457-67.Burke, B. (2003). “ Macrophages as novel cellular vehicles for gene therapy(巨噬細(xì)胞是基因治療的新型運(yùn)載細(xì)胞).‘‘Expert Opin Biol Ther 3(6) 919-24.Burke, B. , S. Sumner ^ . (2002). “ Macrophages in gene therapy :cellular delivery vehicles and in vivo targets (巨噬細(xì)胞在基因療法中的應(yīng)用細(xì)胞輸送載體 和體內(nèi)靶標(biāo))· “ T Leukoc Biol 72(3) :417-28.Gough, P. J. and Ε. W. Raines (2003). “ Gene therapy of apolipoprotein E-deficient mice using a novel macrophage-specific retroviral vector(; 用新 型巨噬細(xì)胞-特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因治療載脂蛋白E-缺陷小鼠)."Mood 101(2) 485-91.Hasty, Α. H. , Μ. F. Linton ^ . (1999). ‘‘ Retroviral gene therapy in ApoE-deficient mice :ApoE expression in the artery wall reduces early foam cell lesion formation(Apo-E缺陷小鼠的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因療法動(dòng)脈壁ApoE表達(dá)降低了早期 泡沫細(xì)胞損傷的形成).“Circulation 99(19) :2571-6.Ishigurο, H. , H. Yoshida 等.(2001). “ Retrovirus-mediated expression of apolipoprotein A-I in the macrophage protects against atherosclerosis in vivo(逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞載脂蛋白A-I表達(dá)體內(nèi)保護(hù)免于動(dòng)脈粥樣硬化).“J Biol Chem 276(39) :36742-8.Juan，S. H.，Τ· S. Lee 等· (2001). ” Adenovirus-mediated heme oxygenase-lgene transfer inhibits the development of atherosclerosis in apolipoprotein Ε-deficient mice (腺病毒介導(dǎo)的血紅素加氧酶_1基因轉(zhuǎn)移抑制了載脂蛋白E缺陷小鼠動(dòng) 脈粥樣硬化的發(fā)展).“Circulation 104 (13) :1519-25.Lu, Ζ. Ζ. , F. Ni 等· (2006). " Efficient gene transfer into hematopoietic cells by a retargeting adenoviral vector system with a chimeric fiber of adenovirus serotype 5and lip (用含腺病毒血清型5和lip嵌合纖維的再靶向腺病毒載 體系統(tǒng)將基因有效轉(zhuǎn)移給造血細(xì)胞).“Exp Hematol 34(9) :1171-82.Nilsson,M. , S. Karlsson等· (2004). “ Functionally distinct subpopulationsof cord blood CD34+cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5or 35tropism(用含血清型5或35向性的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)臍帶血⑶34+細(xì)胞的不同功能亞 群)· 〃 Mol Ther 9(3) :377-88.Ophorst, 0. J. , S. Kostense 等.(2004). “ An adenoviral type 5vector carrying a type 35fiber as a vaccine vehicle :DC targeting, cross neutralization, and immunogenicity (攜帶35型纖維的腺病毒5型載體作為疫苗運(yùn)載體 DC靶向、交叉中和以及免疫原性).“Vaccine 22(23-24) :3035-44.Roth, D. Μ. , N. C. Lai ^ . (2004). ‘‘ Indirect intracoronary delivery of adenovirus encoding adenylyl cyclase increases left ventricular contractile function in mice (間接冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送編碼腺苷酸環(huán)化酶的腺病毒增強(qiáng)了小鼠的左心室 收縮功能).“Am T Physiol Heart Circ Physiol 287(1) :Η172_7·Segerman,A.，Κ· Lindman等· (2006). " Adenovirus types lip and 35attach to and infect primary lymphocytes and monocytes, but hexon expression in T-cells requires prior activation (lip和35型腺病毒能附著感染原代淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，但 在T細(xì)胞中的六鄰體表達(dá)要求預(yù)先活化).“ViroloRY 349(1) :96-111.Shayakhmetov, D. M.，T. Papayannopoulou 等.(2000). “ Efficient gene transfer into human CD34 (+) cells by a retargeted adenovirus vector (通過再革巴向 的腺病毒載體將基因有效轉(zhuǎn)移人⑶；34(+)細(xì)胞).“T Virol 74(6) :2567-83.Van Eck, Μ. , N. Herijgers 等.(2000). “ Effect of macrophage-derived mouse ApoE, human ApoE3_Leiden, and human ApoE2(Arg 158—> Cys)on cholesterol levels and atherosclerosis in ApoE-def icient mice (巨噬細(xì)胞-產(chǎn)生的小鼠 ApoE、人 ApoE3-Leiden和人ApoE2(Argl58— > Cys)對ApoE-缺陷小鼠膽固醇水平和動(dòng)脈粥樣硬化 的影響)· “ Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(1) :119-27.Yoshida, H. , A. H. Hasty φ . (2001). “ Isoform-specif ic effects of apolipoprotein E on atherogenesis :gene transduction studies in mice (載月旨蛋 白E對動(dòng)脈粥樣硬化形成的同種型特異性效應(yīng)小鼠的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究).“Circulation 104(23) :2820-5.
權(quán)利要求
1.一種本文所述的PAI-I配體或聚合配體。
2.一種與本文所述的PAI-I配體或聚合配體至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的PAI-I配體或聚合配體。
3.一種已經(jīng)過修飾的本文所述的PAI-I配體或聚合配體，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺 失、取代、插入、截短，或它們的組合。
4.一種與SEQ ID NO :1-30中奇數(shù)編號(hào)序列所示多肽至少60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多肽。
5.一種包含至少一個(gè)與 SEQ ID NO :37-51 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的PAI-I配體或聚合配體。
6.一種具有以下抑制機(jī)制潛伏狀態(tài)、將PAl轉(zhuǎn)變成底物、空間位阻tPA結(jié)合、空間位 阻內(nèi)源玻連蛋白、或直接競爭結(jié)合位點(diǎn)至少一種的PAI-I配體或聚合配體。
7.一種包含SEQ ID NO :31-36中所示母體蛋白至少一個(gè)片段的PAI-配體或聚合配體， 其中所述片段任選包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入，截短，或它們的組合。
8.—種PAI-I抑制劑，其包含選自以下肽的至少一個(gè)拷貝a)與包含SEQID NO :31的氨基酸殘基354-368相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；b)與包含SEQID NO :31的氨基酸殘基300-309相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的肽；c)與包含SEQID NO :31的氨基酸殘基343-353相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；d)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；e)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基32相對應(yīng)的氨基酸殘基從苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔籪)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基四相對應(yīng)的氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)楸彼?；g)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽，其中所述SEQ ID NO: 32的氨基酸殘基42相對應(yīng)的氨基酸殘基從谷氨酸突變?yōu)楸彼幔籬)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基43相對應(yīng)的氨基酸殘基從亮氨酸突變?yōu)楸彼?；i)與包含SEQID NO :32的氨基酸殘基20-63相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 32的氨基酸殘基23相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，與SEQ ID NO 32 的氨基酸殘基52相對應(yīng)的氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼?，與SEQ ID N0:32的氨基酸 殘基56相對應(yīng)的氨基酸殘基從丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔cSEQ ID NO 32的氨基酸殘基57相對應(yīng)的氨基酸殘基從谷氨酸突變?yōu)槔野彼?；j)與包含SEQ ID NO :33的氨基酸殘基25-256相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；k)與包含SEQ ID NO :33的氨基酸殘基25-44相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；1)與包含SEQ ID NO :33的氨基酸殘基47-256相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%, 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；m)與包含SEQ ID NO :34的氨基酸殘基301-308相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；η)與包含SEQ ID NO :35的氨基酸殘基四-121相對應(yīng)氨基酸殘基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO 35的氨基酸殘基55相對應(yīng)的氨基酸殘基從纈氨酸突變?yōu)楸彼?，與SEQ ID NO 35的 氨基酸殘基57相對應(yīng)的氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?，與SEQ ID N0:35的氨基酸 殘基59相對應(yīng)的氨基酸殘基從蘇氨酸突變?yōu)樘於０?，與SEQ ID NO :35的氨基酸殘基79 相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，與SEQ ID NO :35的氨基酸殘基81相對應(yīng)的 氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，與SEQ ID NO :35的氨基酸殘基83相對應(yīng)的氨基酸 殘基從甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?；和?與包含SEQ ID NO 36的氨基酸殘基179-415相對應(yīng)的氨基酸殘基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述與 SEQ ID NO :36的氨基酸殘基2M相對應(yīng)的氨基酸殘基從組氨酸突變?yōu)楸彼幔cSEQ ID NO 36 的氨基酸殘基275相對應(yīng)的氨基酸殘基從天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，與SEQ ID NO :36的氨基 酸殘基376相對應(yīng)的氨基酸殘基從絲氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> 9.一種編碼如權(quán)利要求1-8所述多肽的多核苷酸。
10.一種與SEQ ID NO :1-30中偶數(shù)編號(hào)序列所示多核苷酸至少60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸。
11.一種連接于1類定位束縛子的配體或聚合配體。
12.一種連接于2類定位束縛子的配體或聚合配體。
13.一種連接于3類定位束縛子的配體或聚合配體。
14.一種編碼如權(quán)利要求11-13所述多肽的多核苷酸。
15.一種本文所述的1類定位束縛子。
16.一種與本文所述1類定位束縛子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的1類定位束縛子。
17.—種已經(jīng)過修飾的本文所述1類定位束縛子，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取 代、插入、截短，或它們的組合。
18.一種與 SEQ ID NO :57-76 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%相同的1類定位束縛子。
19.一種包含至少一個(gè)與 SEQ ID NO :77-95 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的1類定位束縛子。
20.一種編碼權(quán)利要求15-19所述多肽的多核苷酸。
21.一種本文所述的2類定位束縛子。
22.—種編碼權(quán)利要求21所述多肽的多核苷酸。
23.一種本文所述的3類定位束縛子。
24.一種與本文所述3類定位束縛子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的3類定位束縛子。
25.—種已經(jīng)過修飾的本文所述的3類定位束縛子，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取 代、插入、截短，或它們的組合。
26.—種與 SEQ ID NO :100-111 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%相同的3類定位束縛子。
27.一種包含至少一個(gè)與 SEQ ID NO :112-1 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的3類定位束縛子。
28.—種編碼權(quán)利要求23-27所述多肽的多核苷酸。
29.一種連接于組織特異性啟動(dòng)子的編碼配體或聚合配體的多核苷酸。
30.一種連接于動(dòng)脈平滑肌特異性啟動(dòng)子的編碼配體或聚合配體的多核苷酸。
31.一種連接于血管平滑肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的編碼配體或聚合配體的多核苷酸。
32.一種連接于內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的編碼配體或聚合配體的多核苷酸。
33.一種連接于合成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的編碼配體或聚合配體的多核苷酸。
34.一種編碼本文所述組織特異性啟動(dòng)子的多核苷酸。
35.一種已經(jīng)過修飾的編碼本文所述組織特異性啟動(dòng)子的多核苷酸，其包含一個(gè)或多 個(gè)核苷酸缺失、取代、插入、截短，或它們的組合。
36.一種編碼與本文所述組織特異性啟動(dòng)子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的組織特異性啟動(dòng)子的多核苷酸。
37.一種與 SEQ ID NO :132-139所示多核苷酸至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸。
38.一種將編碼配體或聚合配體的多核苷酸轉(zhuǎn)移到本文所述心血管組織的方法。
39.一種將編碼配體或聚合配體的多核苷酸轉(zhuǎn)移到本文所述心血管組織的方法，所述 方法包括以下之一種局部注射腺病毒、離體轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞、或直接注射入主動(dòng)脈內(nèi)。
40.一種評價(jià)PAI-I在本文所述不穩(wěn)定斑塊形成中所具功能的方法。
41.一種評價(jià)PAI-I在不穩(wěn)定斑塊形成中所具功能的方法，所述方法包括建立胰島素 抗性小鼠模型的步驟。
42.一種實(shí)現(xiàn)空間或時(shí)序調(diào)控本文所述配體或聚合配體的方法。
43.一種實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體或聚合配體連接于組 織特異性啟動(dòng)子的步驟。
44.一種實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體或聚合配體連接于定 位束縛子的步驟。
45.一種實(shí)現(xiàn)時(shí)序調(diào)控配體或聚合配體的方法，包括將所述配體或聚合配體連接于可 誘導(dǎo)基因開關(guān)的步驟。
46.一種治療、預(yù)防或緩解心血管疾病的方法，包括以下步驟a)鑒定患有心血管疾病或有發(fā)生心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；和b)給予該對象PAI-I配體或聚合配體。
47.一種治療、預(yù)防或緩解纖維變性疾病的方法，包括以下步驟a)鑒定患有纖維變性疾病或有發(fā)生纖維變性疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；和b)給予該對象PAI-I配體或聚合配體。
48.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，該方法包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸引入所述單 核細(xì)胞中產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；和d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。
49.一種制備向?qū)ο筮f送纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的修飾細(xì)胞的方法，所述方法包括 在所述對象的單核細(xì)胞內(nèi)引入至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的 多核苷酸而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。
50.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，該方法包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)在所述單核細(xì)胞內(nèi)引入(1)編碼基因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2) 至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述啟動(dòng)子可被所述 化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化，從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象；和e)將所述化學(xué)配體引入對象以激活啟動(dòng)子。
51.一種制備向?qū)ο筮f送纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的修飾細(xì)胞的方法，所述方法包括 在所述對象的單核細(xì)胞中引入(a)編碼基因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(b) 至少一個(gè)與啟動(dòng)子相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述啟動(dòng)子可被所述 化學(xué)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化，從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子序列連接于巨噬細(xì)胞特異 性調(diào)控元件。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子序列連接于巨噬細(xì)胞特異 性調(diào)控元件。
54.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑是權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的PAI-I配體或聚合配體。
55.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑是PAI-I抑制劑。
56.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑是天然纖溶酶原激活劑。
57.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑是突變纖溶酶原激活劑。
58.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑是纖溶酶原激活劑片段。
59.一種治療、預(yù)防或緩解涉及固定巨噬細(xì)胞群的纖維變性疾病的方法，包括以下步驟a)鑒定患有纖維變性疾病或有發(fā)生纖維變性疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將至少一個(gè)與固定巨噬細(xì)胞群特異性調(diào)控元件相連的編碼纖維溶解途徑多肽調(diào)節(jié) 劑的多核苷酸引入所述單核細(xì)胞而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；和d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。
60.如權(quán)利要求48、50、52或59中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟b)和d)可以 省略，且其中所述多核苷酸可通過單核細(xì)胞特異性載體而體內(nèi)引入單核細(xì)胞。
61.一種權(quán)利要求9、10、14或20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
62.一種權(quán)利要求四-37中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
63.一種包含權(quán)利要求61所述多核苷酸的載體。
64.一種包含權(quán)利要求62所述多核苷酸的載體。
65.如權(quán)利要求63所述的載體，其特征在于，所述載體是單核細(xì)胞特異性載體。
66.一種包含權(quán)利要求61所述多核苷酸的宿主細(xì)胞。
67.一種包含權(quán)利要求62所述多核苷酸的宿主細(xì)胞。
68.如權(quán)利要求66或67所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
69.如權(quán)利要求66所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 或泡沫細(xì)胞。
70.如權(quán)利要求66或67所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是動(dòng)脈平滑肌細(xì) 胞、血管平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。
71.如權(quán)利要求66所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是心肌細(xì)胞、冠脈脂肪 細(xì)胞或心臟成纖維細(xì)胞。
72.一種包含權(quán)利要求61或62所述多核苷酸的非人生物。
73.如權(quán)利要求72所述的非人生物，其特征在于，所述生物是非人靈長類、小鼠、牛、 豬、羊、馬、大鼠、兔、狗、貓或豚鼠。
74.—種包含權(quán)利要求9或10所述多核苷酸的載體。
75.—種制造PAI-I配體或聚合配體多肽的方法，所述方法包括將權(quán)利要求74所述的 載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞并在適合于產(chǎn)生至少一個(gè)PAI-I配體或聚合配體多肽拷貝的條件下 培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
76.一種抑制對象心肌組織PAI-I的方法，包括將權(quán)利要求74所述載體注射到對象的 心臟組織內(nèi)。
77.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，該方法包括a)鑒定患有血管損傷或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將權(quán)利要求74所述載體轉(zhuǎn)染入所述單核細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；和d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。
78.一種治療、預(yù)防或緩解涉及固定巨噬細(xì)胞群的纖維變性疾病的方法，包括以下步驟a)鑒定患有纖維變性疾病或有發(fā)生纖維變性疾病風(fēng)險(xiǎn)的對象；b)分離所述對象的單核細(xì)胞；c)將權(quán)利要求74所述載體轉(zhuǎn)染入所述單核細(xì)胞，其中，權(quán)利要求8或9所述的多核苷 酸連接于固定巨噬細(xì)胞群的特異性調(diào)控元件，從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞；d)將所述修飾的細(xì)胞引入所述對象。
79.—種產(chǎn)生PAI-I活性降低的轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮姆椒?，包括將?quán)利要求74所述載體注射 到受精卵中。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物PAI-1配體和調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明具體涉及多肽、多肽組合物以及編碼PAI-1配體和/或調(diào)節(jié)劑多肽的多核苷酸。本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)PAI-1活性的聚合配體(polyligand)，所述聚合配體是同質(zhì)聚合配體(homopolyligand)或異質(zhì)聚合配體(heteropolyligand)。本發(fā)明也涉及位于細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的配體和聚合配體。本發(fā)明也涉及可用于為PAI-1配體和聚合配體提供空間調(diào)控的定位束縛子(tether)和啟動(dòng)子序列。本發(fā)明還涉及可用于為PAI-1配體和聚合配體提供時(shí)序調(diào)控的可誘導(dǎo)基因開關(guān)。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防纖維化的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102123721SQ200980108863
公開日2011年7月13日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
發(fā)明者B·L·梅倫涅克, C·C·瑞德, C·L·貝爾, E·塔舍瓦, J·卡森, J·馬扎瑞利索普琴斯基, R·E·彼得森, T·D·瑞德 申請人:英特瑞克斯頓股份有限公司