專利名稱：腦疾病的預(yù)防或治療用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦神經(jīng)疾病的預(yù)防或治療用組合物及認(rèn)知功能的改善用組合物，更具 體涉及含斯鈣素2作為有效成分神經(jīng)性疾病，尤其涉及腦疾病的預(yù)防或治療用組合物及認(rèn) 知功能的改善用組合物。
背景技術(shù)：
查看統(tǒng)計(jì)廳于2007年7月發(fā)表的韓國老齡人口比例，發(fā)現(xiàn)韓國在2000年65歲以 上的人口占總?cè)丝诘谋戎貫?.3%，已浸入高齡化社會(huì)，2007年為9. 3%，相比5年前提高了 2. 0%。如果照這樣的趨勢，預(yù)計(jì)韓國的老齡化指數(shù)(相比每100名0 14歲人口的65歲 以上的比例)在2050年會(huì)為429，會(huì)達(dá)到世界平均(82)的5倍，會(huì)成為全世界最高。此外， 受到這樣的老齡化的影響，韓國的80歲以上的超高齡人口比重在2005年為1. 4%，與世界 平均(1.3%)相近，但到了 2050年，預(yù)計(jì)會(huì)提高到14.5%，會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越發(fā)達(dá)國家(9.4%) 水平。隨著這樣的變化，如阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病及肌萎縮側(cè)索硬化的退行性 腦神經(jīng)疾病或者如中風(fēng)(尤其是缺血性中風(fēng))的缺血或再灌流所致的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷所 致的疾病等會(huì)成為死亡的主要原因。腦卒中是腦血管破裂或堵塞而帶來局部腦組織的功能異常的腦血管疾病，也常稱 為中風(fēng)，在韓國的死亡原因中排在前位。腦卒中可在腦的任何部位發(fā)生，因此可導(dǎo)致身體的 幾乎所有功能的障礙。醫(yī)學(xué)上，腦卒中可大分為腦血管堵塞而特定部位血液循環(huán)不暢而出 現(xiàn)的“缺血性腦卒中”和腦出血所致的“出血性腦卒中”，其中，與已知為成人病的原因的高 血壓、動(dòng)脈硬化密切相關(guān)的缺血性腦卒中的發(fā)生比例更高。缺血性腦卒中是從位于頸部的頸動(dòng)脈、脊椎基底動(dòng)脈至腦中的細(xì)動(dòng)脈，無 論何處血管堵塞就會(huì)發(fā)病，由此發(fā)生由該血管支配的腦組織死亡的現(xiàn)象，即“腦梗塞 (infarction) ”。一旦發(fā)生腦梗塞的部位，就無法再生其功能，因此腦梗塞所致的中樞神經(jīng) 系統(tǒng)障礙不恢復(fù)而永久破壞。因此，在腦卒中治療中最重要的是，已知為腦卒中發(fā)病危險(xiǎn) 因素的高血壓、糖尿病、高脂血癥等的預(yù)防法及對(duì)腦缺血本身的預(yù)防。此外，由于腦卒中發(fā) 病而發(fā)生腦梗塞時(shí)，將焦點(diǎn)放在減少腦部水腫，使缺血狀態(tài)處適宜循環(huán)，從而減少二次腦損 傷。目前用于保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞而使用的物質(zhì)有興奮性氨基酸拮抗劑(神經(jīng)節(jié)苷脂 (ganglioside)、尼莫地平(Nimodipine) )、GABA 激動(dòng)劑(氯美噻唑(clomethiazole))等， 硫酸鎂和甘氨酸拮抗劑及吡拉西坦(Piracetam)目前在進(jìn)行大規(guī)模臨床研究中。但是，目 前嘗試的神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)劑是作用于缺血進(jìn)行過程的各自不同的步驟的制劑，雖然需要開 發(fā)同時(shí)作用于這樣的各種過程的聯(lián)合療法，但有需要解決副作用及藥物相互干擾的問題的 課題。此外，缺血性腦卒中的癥狀無特別的預(yù)后而突然發(fā)作，所以與其期待通過腦缺血 發(fā)病當(dāng)時(shí)被施用的藥物來治療，認(rèn)為持續(xù)的缺血預(yù)防和抑制缺血后的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的功 能性食品的攝取更加有效。
美國專利第6，245，757號(hào)公開了孕酮(progestin)用于治療缺血所致的細(xì)胞損傷 的用途，美國專利第6，380，193號(hào)公開了含聚(腺苷5’ - 二磷酸酯-核糖)聚合酶抑制劑 的腦卒中治療用組合物。此外，美國專利第6，288，041號(hào)公開了含唾液酸衍生物的腦卒中 治療用組合物，美國專利第5，580，866號(hào)公開了含1，4-硫氮雜卓作為有效成分的腦卒中治 療用組合物。帕金森病(Parkinson' s disease, PD)是引起運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知障礙的退行性腦神經(jīng) 疾病，于1817年由詹姆斯·帕金森首先報(bào)告。此疾病的發(fā)病率在美國報(bào)告為在10萬名人 口中有100 150名左右，即約75萬 100萬名的患者，并以每年新診斷6萬余名的趨 勢增加，預(yù)計(jì)在韓國，也會(huì)隨著人口的老齡化，其發(fā)病率及患病率將繼續(xù)增加。從組織病 理學(xué)角度看，以位于黑質(zhì)(substantia nigra)的多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的消失為特征出現(xiàn)， 作為其神經(jīng)纖維的投射部位的尾狀核(caudatenucleus)和殼核(putamen)的多巴胺減 少而出現(xiàn)特征性的震顫(tremor)、運(yùn)動(dòng)遲緩(bradykinesia)、僵硬(rigidity)、姿勢障礙 (disturbance of posture)等運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能障礙。帕金森病中使用的主要的治療藥物是補(bǔ)充腦中變得不足的多巴胺的功能的藥劑 或此外以預(yù)防或延緩神經(jīng)元細(xì)胞的破壞為目的或用于調(diào)節(jié)其他抑郁癥等的多種癥狀的藥 物治療等。開發(fā)的代表性的藥物有多巴胺前體物質(zhì)左旋多巴(levodopa，L-dopa)成分的 美多巴(Madopar)、多巴胺受體激動(dòng)劑(agonist)成分的bromidine、利舒脲(Iisuride)、 及抗乙酰膽堿藥物安坦(artane)、苯扎托品(cogentin)等的多種神經(jīng)藥理學(xué)補(bǔ)償性治療 法。其中多巴胺的前體左旋多巴由于可補(bǔ)充不足的腦內(nèi)多巴胺的濃度，在改善帕金森病的 癥狀中最有效果而被使用，但如果長期施用3 5年以上，則出現(xiàn)藥物有效時(shí)間漸漸變短 (wearing-off)，對(duì)藥物效果的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能的變動(dòng)加深的現(xiàn)象(οη-ο 現(xiàn)象)、及出現(xiàn)異 常運(yùn)動(dòng)癥(diskinesia)等的副作用(Freed et. al.，N. Engl. J. Med. 327 1549-55 (1992))。此外，作為帕金森病的外科治療法，施行著丘腦切開術(shù)(thai amotomy)和蒼白 球切開術(shù)(pallidotomy)、深部腦刺激術(shù)(de印brain stimulation)、神經(jīng)元細(xì)胞移植術(shù) (Neuronal cell transplantation)等。但治療效果的持續(xù)期隨患者表現(xiàn)出大的差異，隨手 術(shù)罕見地伴隨發(fā)聲過弱(hypophonia)、構(gòu)音障礙(dysarthria ；構(gòu)音困難)、記憶力減退等 的副作用(Ondo et. al. , Neurology 50:266-270(1998) ；Shannon et. al. , Neurology 50: 434-438(1998))。對(duì)阿爾茨海默病的最近治療趨勢著眼于阿爾茨海默病源于在大腦皮質(zhì)(cerebral cortex)和海馬(hippocampus)中功能損傷的膽堿能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及傳遞(cholinergic signaling and transmission)白勺 可 能 個(gè)生(Bartus et al. , Science.217 (4558) 408-14(1982))；及 Coyle etal.，Science. 219 (4589) 1184-90 (1983))。由于這樣的腦 區(qū)域與記憶及智能連接，腦的這些部分的功能缺陷會(huì)給對(duì)記憶及判斷的著實(shí)的損傷，并 使智力喪失。雖然神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(neuronal signaling)形成損傷的正確過程成為爭 論對(duì)象，但認(rèn)為老年斑(senile plaque)及神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle NFT)被認(rèn)為是病理學(xué)主要現(xiàn)象。淀粉樣β蛋白(Αβ)的蓄積所致的老年斑是此病的最 大特征，阿爾茨海默病只有通過尸體解剖才可確診(Khachaturian，Arch. Neurol. 42 (11) 1097-105(1985))。阿爾茨海默病的情況下，提示有為可抑制膽堿能神經(jīng)傳遞的損傷而增加乙酰膽堿的量，使乙酰膽堿可長期存在或乙酰膽堿更加有效地作用于神經(jīng)元細(xì)胞的傳遞的藥物及治 療法，提高阿爾茨海默病患者的乙酰膽堿活性的多種化合物被使用。目前，最有效的接近方 法是在突觸使乙酰膽堿快速分解而阻斷神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制乙酰膽堿酯酶的活性的方 法。實(shí)際上這樣的抑制劑(例如他克林，多奈哌齊，加蘭他敏及利斯的明)目前已作為經(jīng) FDA認(rèn)證的阿爾茨海默病治療藥物而在市場上流通。多種情況下，所述藥物在緩和病的進(jìn)行 中有效，但不太適用于完全治愈。某些化合物旨在隨著改善神經(jīng)的一般健康狀態(tài)的細(xì)胞的功能的正常維持。例如， 如NGF和雌激素的幾種藥物發(fā)揮減緩神經(jīng)退化的神經(jīng)保護(hù)作用，如抗氧化劑的其他藥物通 過減少細(xì)胞氧化來減少以正常的老化結(jié)果出現(xiàn)的有害的細(xì)胞損傷增加。如果淀粉樣β蛋 白肽蓄積的多，則阿爾茨海默病變得嚴(yán)重，認(rèn)為如果降低神經(jīng)炎空間(neuritic space)中 淀粉樣β蛋白的蓄積，就會(huì)減緩阿爾茨海默病的進(jìn)行。認(rèn)為淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein :APP)與如α-、β-、γ -分泌酶的細(xì)胞內(nèi)蛋白分解酶組合而以多種形 態(tài)進(jìn)行。但是，因?yàn)榈矸蹣应碌鞍椎男纬蛇^程實(shí)際未科學(xué)地完全闡明，所以調(diào)節(jié)淀粉樣β 蛋白的形成仍然不可能。淀粉樣β蛋白的蓄積導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的過程不明確。如果APP被異常切 斷而淀粉樣β蛋白大量生成而蓄積在神經(jīng)炎，則誘發(fā)斑形成。因此，與這樣的切斷反應(yīng)相 關(guān)的多種其他要素(例如炎癥反應(yīng)等)增加τ (tau)蛋白的磷酸化，增加NFT和雙股螺旋 形細(xì)絲(pairedhelical filament =PHF)的蓄積，而最終增加神經(jīng)損傷。這樣的要素均誘發(fā) 神經(jīng)的功能障礙，最終加速阿爾茨海默型癡呆的進(jìn)行。雖然對(duì)為減少阿爾茨海默病的影響的治療方法的開發(fā)大量進(jìn)行，至今仍只是提供 暫時(shí)的癥狀改善?？傊?，目前阿爾茨海默病治療不是逆轉(zhuǎn)病的進(jìn)行過程，而是著眼于改善病 的癥狀。雖然對(duì)病的生物學(xué)知識(shí)知之甚多，但臨床適用結(jié)果還不成功。美國專利第5，532，219號(hào)公開了含4，4’_ 二氨基二苯砜等的阿爾茨海默病治療用 組合物，美國專利第5，506，097號(hào)公開了含對(duì)氨基二苯基甲磺酰氟或抑脂酶免疫酮A的阿 爾茨海默病治療用組合物，美國專利第6，136，861號(hào)公開了含二環(huán)[2，2，1]庚烷的阿爾茨 海默病治療用組合物。另一方面，壓力成為現(xiàn)代社會(huì)的重要的健康問題，在韓國20歲以上的成人中，1/3 以上平時(shí)受到多種壓力，10來歲的情況下，女人比男人感到更多壓力，且年齡越高，越感到 更多壓力。壓力雖然隨著個(gè)人的性格、興趣、消解法、周圍環(huán)境、控制能力等而其強(qiáng)度不同， 但大部分伴隨抑郁癥。抑郁癥是也可由壓力發(fā)病的精神疾病，有時(shí)導(dǎo)致如自殺的極端結(jié)果， 且由于高復(fù)發(fā)率及快的患者發(fā)生率而被認(rèn)為是非常重要的疾病。抑郁癥的原因已被闡明為 如腎上腺素、多巴胺或5-羥色胺等的腦神經(jīng)遞質(zhì)的障礙，也伴隨海馬部位的萎縮及成人神 經(jīng)生成的抑制等的腦損傷。作為代表性的抑郁癥治療劑之一的三環(huán)抗抑郁劑(tricyclic antidepressant =TCA)具有副作用大的缺點(diǎn)。尤其是阿米替林等雖然在韓國廣泛被開處 方，但具有多種副作用等多個(gè)問題點(diǎn)。80年代美國開發(fā)出了選擇性5-羥色胺攝取抑制劑
(selective serotonin re-uptake inhibitor :SSRI)-氣西汀(fluoxetine)，其克月艮了
TCA的副作用而大大提高了藥物順應(yīng)度，且可降低治療失敗率，甚至在1996年度世界20大 銷售藥品中排到7位。但是，SSRI在效果方面與TCA相比，不表現(xiàn)出大的差異，且此外具有 藥物相互干擾嚴(yán)重的問題點(diǎn)。
此外，壓力所致的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂被持續(xù)誘發(fā)，因?yàn)槟壳暗闹委煼椒o防止抑郁癥 藥劑開處方后復(fù)發(fā)的特別措施，僅止于降低施用藥物的含量而持續(xù)施用的水平。因此，對(duì)于 壓力所致的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的矯正有卓越的效果的物質(zhì)的開發(fā)重要。此 外，還有很多對(duì)為治療壓力所致的抑郁癥而回避訪問器官，由于壓力而誘發(fā)5-羥色胺神經(jīng) 系統(tǒng)紊亂和腦損傷等等忽略的傾向，從而，實(shí)際上具有壓力性抑郁癥治療功能的功能性食 品的必要性非常大。世界各國已經(jīng)致力于開發(fā)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療劑，其代表性的例有，美 國專利第6，020，127號(hào)公開了人的染色體5ql3中編碼神經(jīng)元細(xì)胞凋亡抑制蛋白的基因，美 國專利第6，288，089號(hào)公開了抑制多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞凋亡而可治療神經(jīng)退行性疾病的吡 啶基咪唑。提示了幾種相似再現(xiàn)這樣的多種原因所致的腦損傷機(jī)理的實(shí)驗(yàn)方法，其中之一即 為腦缺血-再灌流方法。此方法所致的腦細(xì)胞損傷機(jī)理可大致提煉為兩種。一種是，腦血 管再灌流后谷氨酸(glutamate)過度增加而隨著鈣離子通道開放而過量的鈣離子流入神 經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，從而神經(jīng)元細(xì)胞死亡的“興奮性細(xì)胞毒性(excitotoxicity)說”(Hagberg， H. et al.，Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8(1) :30_38 (2002))。另一種假說是認(rèn)為 由再灌流時(shí)被誘發(fā)的自由基所致的細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)的破壞所導(dǎo)致的“氧化性壓力說”(Chan. PH. , J Cereb Blood Flow Metab. 21(1) :2_14 (2001))。據(jù)研究，興奮性細(xì)胞毒性和氧自由 基所致的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡并非個(gè)別發(fā)生，而是伴隨發(fā)生，且它們直接作用于神經(jīng)元細(xì)胞 死亡(Won，ΜΗ. et al.，Brain Res. 836 :70_78 (1999))。最近聚焦于在細(xì)胞的死亡出現(xiàn)的 第4天主要被誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子等物質(zhì)。認(rèn)為這樣的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)被小神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)分泌，或者被正在死亡的細(xì)胞分泌而增加細(xì)胞的死亡(Basu，A. et al.，J Neurosci. 22 :6071_6082(2002))。與腦損傷機(jī)理相關(guān)的另一實(shí)驗(yàn)方法著眼于腦細(xì)胞的興奮性氨基酸(紅藻氨酸、 NMDA、使君子氨酸(quisulate)、AMPA、谷氨酸等)所致的興奮毒性導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡， 誘發(fā)腦功能的障礙，是引起如痙攣、腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病、脊髓損傷等的各種 腦疾病的重要的因子的事實(shí)，而將興奮性氨基酸紅藻氨酸注射入腦室內(nèi)的方法。如果將 紅藻氨酸施用于全身或中樞神經(jīng)系統(tǒng)，則癲癇發(fā)作增加，且海馬中合成阿片樣肽(opioid peptide)的強(qiáng)啡肽原(prodynorphin)或前腦啡肽(proenk印halin)mRNA的濃度增加。所 述紅藻氨酸在海馬組織中增加c-fos和c-jun轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)(Kaminska，B. et al.， Acta Biochim Pol. 44 :781_789 (1997))，此外還報(bào)告增加與如IL-I的細(xì)胞因子基因和炎癥 反應(yīng)相關(guān)的iNOS (誘導(dǎo)型氮氧化物合酶)及環(huán)加氧酶-2 (C0X-2)基因的表達(dá)(Kunz，T. and 01iw，EH.，Eur JNeurosci. 13 :569_575 (2001))。利用白色小鼠的紅藻氨酸所致的MAPK信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中被報(bào)告ERK1/2、p38、JNK蛋白的磷酸化在海馬組織中增加，紅藻氨酸誘導(dǎo)的 MAPK的表達(dá)對(duì)于細(xì)胞生存或死亡而言，是誘導(dǎo)下游的多種基因表達(dá)的重要指標(biāo)(Mielke，K et al.，Neuroscience. 91 :471_483(1999))。本說明書通篇參考了多個(gè)論文及專利文獻(xiàn)，已將所述引用表示出。將引用的論文 及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文，以使本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明 的內(nèi)容被更明確地說明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)課題本發(fā)明人通過促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡抑制和/或神經(jīng)元細(xì)胞的生成，致力于開 發(fā)可預(yù)防或治療神經(jīng)疾病，尤其是腦疾病的，可改善認(rèn)知功能的物質(zhì)，其結(jié)果確認(rèn)斯鈣素 2(stanniocalcin 2)表現(xiàn)出所述神經(jīng)關(guān)聯(lián)活性，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是提供含斯鈣素2作為有效成分的腦疾病的預(yù)防或治療用組 合物。本發(fā)明的其他目的是提供含斯鈣素2作為有效成分的認(rèn)知功能的改善用組合物。本發(fā)明的另一目的是提供腦疾病的預(yù)防或治療方法。本發(fā)明的其他目的是提供認(rèn)知功能的改善方法。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)將通過下述發(fā)明的詳細(xì)說明及附圖被更明確說明。解決課題的技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供含斯鈣素2作為有效成分的腦疾病的預(yù)防 或治療用組合物。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供含斯鈣素2作為有效成分的認(rèn)知功能的 改善用組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括給受試者施用藥學(xué)有效量的含斯鈣 素2作為有效成分的藥學(xué)組合物的步驟的腦疾病的預(yù)防或治療方法。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括給受試者施用藥學(xué)有效量的含斯鈣 素2作為有效成分的藥學(xué)組合物的步驟的認(rèn)知功能的改善方法。本發(fā)明人通過促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡抑制和/或神經(jīng)元細(xì)胞的生成，致力于開發(fā) 可預(yù)防或治療神經(jīng)疾病，尤其是腦疾病的，可改善認(rèn)知功能的物質(zhì)，其結(jié)果確認(rèn)，斯鈣素2 表現(xiàn)出所述神經(jīng)關(guān)聯(lián)活性。本發(fā)明的組合物中作為有效成分被利用的斯鈣素2與斯鈣素1不同，其作用幾乎 未被闡明，預(yù)計(jì)在生物學(xué)上發(fā)揮其他作用(Derek A. JELL INEK et al. , Biochemical J.， 350 :453-461(2000))。斯鈣素(Starmiocalcin)是由在被稱為司登尼亞腺小體的硬骨魚類的腎中發(fā)現(xiàn) 的內(nèi)分泌腺分泌的同型二聚體(homodimeric)糖蛋白激素(Wagner，G.，Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, eds. Hochachka and Mommsen, Elsevier Science, Amersterdam,2(21) :419_434(1993))。人的斯鈣素最近被發(fā)現(xiàn)(Chang et al.，Mol. Cell. Endocrinol. 112 :241-247 (1995)及 Olsen et al. W095/24411)。斯鈣素 2(STC2)與斯鈣 素I(STCl)不同，其作用幾乎未被闡明，預(yù)計(jì)在生物學(xué)上發(fā)揮其他作用(Derek A. JELL INEK etal. ,Biochemical J.，350 :453_461 (2000))。據(jù)發(fā)表，斯鈣素 2 與 STCl 具有約 34%的同 一性(Chang, Α. C. Μ. et al.，Mol. Cell. Endocrinol.，141 :95_99 (1998))。STC2 在哺乳動(dòng) 物組織，例如，胰腺、骨骼肌及小腸等中廣泛表達(dá)。STC2的功能未被確切闡明，但預(yù)測與鈣及 磷酸鹽的代謝相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的最大的特征是STC2抑制神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，令人感興趣的是其促進(jìn)神 經(jīng)元細(xì)胞的生成的新用途。含所述斯鈣素2的本發(fā)明的組合物在神經(jīng)性疾病，尤其是腦疾病的預(yù)防或治療中表現(xiàn)出優(yōu)良的功效。所述本發(fā)明的作用大體上可通過神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)活性表現(xiàn)出。本 說明書中的用語“神經(jīng)元細(xì)胞”包括構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦、腦干、脊髓、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和末 梢神經(jīng)系統(tǒng)的接合部分等的結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元、神經(jīng)支持細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞等。本 說明書中的用語“神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)”是指發(fā)揮減輕或改善(amelioration)神經(jīng)性損傷 (neurologic insult)的作用，或發(fā)揮對(duì)由神經(jīng)性損傷受到損傷的神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)或恢 復(fù)作用。此外，本說明書中的用語“神經(jīng)性損傷”是指由多種原因(例如代謝原因、毒性原 因、神經(jīng)毒性原因及化學(xué)原因等)導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)組織的損傷?？蛇m用本發(fā)明的組合物的疾病的具體例包括神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌流損傷 及精神疾病等，但不限于此。更具體而言，可利用于如阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病及 肌萎縮側(cè)索硬化的神經(jīng)退行性疾?。蝗缒X卒中(尤其是缺血性腦卒中)的缺血或再灌流所 致的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷所致的疾??；及如精神分裂癥、抑郁癥、躁郁癥及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的 精神疾病等的預(yù)防或治療。如下述實(shí)施例所示，本發(fā)明的斯鈣素2大大抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡所致的死亡。例 如，大大抑制誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒性物質(zhì)——紅藻氨酸所致的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。本發(fā)明的斯鈣素2在認(rèn)知功能(cognitive function)的改善中也表現(xiàn)出優(yōu)良的 功效。本發(fā)明的斯鈣素2優(yōu)選在改善或預(yù)防伴隨上述神經(jīng)性疾病的認(rèn)知功能的惡化中表現(xiàn) 出優(yōu)良的功效。此外，本發(fā)明的斯鈣素2在正常人的認(rèn)知功能的改善中也表現(xiàn)出優(yōu)良的功效。另一方面，維持記憶的形成和儲(chǔ)存的最重要部位是腦的海馬。海馬是神經(jīng)元密集 的區(qū)域，新的神經(jīng)元細(xì)胞的生成活潑地發(fā)生，同時(shí)相互交換電刺激來擔(dān)當(dāng)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的 功能。本發(fā)明的斯鈣素2尤其促進(jìn)位于海馬內(nèi)側(cè)的齒狀回的顆粒細(xì)胞層下側(cè)的顆粒細(xì)胞下 層中的神經(jīng)元細(xì)胞生成。當(dāng)考慮不伴隨海馬中的神經(jīng)生成的情況下也不伴隨代表性的抗抑 郁劑——丙咪嗪的效果的結(jié)果時(shí)，海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元細(xì)胞生成在壓力改善中 表現(xiàn)出連貫性。另外，當(dāng)考慮抗抑郁劑成分帕羅西汀表現(xiàn)出促進(jìn)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的 神經(jīng)元細(xì)胞生成的功能時(shí)，仍優(yōu)選將斯鈣素2應(yīng)用于抗抑郁癥的治療劑。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的斯鈣素2發(fā)揮的認(rèn)知功能的改善是學(xué)習(xí)能 力和/或記憶力的改善。本說明書中，用語"預(yù)防"是指抑制雖然未被診斷患疾病或疾病，但具有易患這 樣的疾病或疾病的傾向的動(dòng)物中疾病或疾病的發(fā)生。本說明書中的用語“治療”是指(a)疾 病或疾病的發(fā)展的抑制；(b)疾病或疾病的減輕；及(c)疾病或疾病的除去。本說明書中的用語“斯鈣素2”若無特別說明是指人斯鈣素2，且優(yōu)選具有序列表 SEQ ID NO 1的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物是藥學(xué)組合物或食品組合物。當(dāng)本發(fā)明的組合物是藥學(xué)組合物時(shí)，本發(fā)明的組合物含(a)藥學(xué)有效量的斯鈣 素2;及(b)藥學(xué)可接受載質(zhì)。含于本發(fā)明的藥學(xué)組合物中的藥學(xué)可接受載質(zhì)是制劑時(shí)通常被利用的載質(zhì)，包 括碳水化合物(例如乳糖、直鏈淀粉、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、纖維素 等)、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、鹽溶液、醇、阿拉伯樹膠、植物油(例如玉米油、棉籽油、豆油、橄欖油、可可油)、聚乙 二醇、甲基纖維素、羥苯甲酸甲脂、羥苯甲酸丙脂、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但不限于此。 本發(fā)明的藥學(xué)組合物在所述成分之外，還包括潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、 懸浮劑、防腐劑等，但不限于此。合適的藥學(xué)可接受載質(zhì)及制劑詳細(xì)記載于Remington' s Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)中。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可經(jīng)口或非經(jīng)口施用，非經(jīng)口施用情況下，可通過靜脈內(nèi)注 射、皮下注射、肌肉注射及腦室內(nèi)注射等施用。本發(fā)明的藥學(xué)組合物的合適的施用量根據(jù)如制劑化方法、施用方式，患者的年齡、 體重、性別、疾病狀態(tài)、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速度及反應(yīng)感應(yīng)性的要素而多樣，一 般熟練的醫(yī)生可容易決定及開處方所望的對(duì)治療或預(yù)防有效的施用量。例如，本發(fā)明的藥 學(xué)組合物的單日施用量是0. 0001 100mg/kg。本發(fā)明的藥學(xué)組合物根據(jù)所述發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域中具有普通知識(shí)的技術(shù)人員 容易實(shí)施的方法，利用藥學(xué)可接受載質(zhì)和/或賦形劑進(jìn)行制劑化，可制備成單元?jiǎng)┝啃螒B(tài)， 或制備入多容量容器內(nèi)。此時(shí)劑型是油性或水性溶劑中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或是 粉劑，顆粒劑，錠劑，膠囊劑形態(tài)，還可含分散劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的組合物可開發(fā)成食品組合物。本發(fā)明的食品組合物含制備食品時(shí)通常添 加的成分，包括例如，蛋白、碳水化合物、脂肪、營養(yǎng)素、調(diào)味劑及香味劑。所述碳水化合物的 例是單糖，例如，葡萄糖，果糖等；二糖，例如麥芽糖，蔗糖，寡糖等；及多糖，例如糊精，環(huán)糊 精等的通常的糖及木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等的糖醇。香味劑可使用天然香味劑[索 馬汀，甜葉菊提取物(例如甜葉菊苷A，甘草皂苷等)]及合成香味劑(糖精，阿司帕坦等)。 例如，在制備成飲劑的情況，除本發(fā)明的斯鈣素2之外，還可包括枸櫞酸、液態(tài)果糖、白糖、 葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取液、棗提取液、甘草提取液等。如果考慮對(duì)食品的容易 的接近性，本發(fā)明的食品非常有用于神經(jīng)性疾病的治療或預(yù)防，及認(rèn)知功能的改善。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)概述如下(i)本發(fā)明提供含斯鈣素2作為有效成分的神經(jīng)性疾病，尤其是腦疾病的預(yù)防或 治療用組合物及認(rèn)知功能的改善用組合物。(ii)本發(fā)明中被當(dāng)做有效成分利用的斯鈣素2不僅抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，還意想 不到地具有促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生成的活性。


圖1是顯示本發(fā)明中被利用的斯鈣素2(Stanni0Calein 2 :STC2)抑制小鼠海馬的 阿蒙角3區(qū)域(Cornu Ammonis 3 :CA3)中的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡的結(jié)果照片。圖IA和圖IC 是紅藻氨酸(紅藻氨酸KA)單獨(dú)治療組，圖IB和圖ID是KA及STC2聯(lián)用治療組，將它們進(jìn) 行了比較。圖IA中，CA1，CA2及CA3分別表示海馬的阿蒙角(Cornu Ammonis :CA) 1區(qū)域、 阿蒙角2區(qū)域、及阿蒙角3區(qū)域，DG表示齒狀回(dentate gyrus DG)。圖IC中，3個(gè)黑色 箭標(biāo)表示神經(jīng)元細(xì)胞死亡的部分。圖IB和圖ID中，可確認(rèn)由STC2而神經(jīng)元細(xì)胞死亡被抑 制。圖2是將斯鈣素2 (Stanniocalcin 2 :STC2)對(duì)位于小鼠海馬的顆粒細(xì)胞下層(subgranular zone =SGZ)中的神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響根據(jù)免疫組織化學(xué)法
(Immunohistochemistry)，用胸苷類似物-溴脫氧尿苷(Bromodeoxyuridine =BrdU)染
色有絲分裂后神經(jīng)元細(xì)胞(postmitotic neurons)的基因組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。黑色箭標(biāo)表示溴 脫氧尿苷_免疫陽性細(xì)胞(BrdU-immunopositive cells)，可確認(rèn)相比圖2A和圖2C(對(duì)照 組)，圖2B和圖2D(STC2處理組)中的溴脫氧尿苷-免疫陽性細(xì)胞在海馬的顆粒細(xì)胞下層 中增加。圖3是將圖2的實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量而比較的坐標(biāo)圖。對(duì)照是指STC2未施用組的對(duì)照 組，STC2是斯鈣素2施用組?？纱_認(rèn)，相比對(duì)照組，STC2施用組中的溴脫氧尿苷-免疫陽性 細(xì)胞在海馬的顆粒細(xì)胞下層中顯著增加。圖4是將經(jīng)pUC-narK Met_hSTC2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌ToplOF'細(xì)胞破碎后經(jīng)離心分 離回收的沉淀物用SDS-PAGE分析的照片，可在33kDa處確認(rèn)對(duì)應(yīng)于hSTC2的條帶。圖5是經(jīng)純化的hSTC2的SDS-PAGE結(jié)果。可確認(rèn)33kDa的經(jīng)純化的hSTC2條帶。圖6是經(jīng)純化的hSTC2的SDS-PAGE結(jié)果?？纱_認(rèn)33kDa的經(jīng)純化的hSTC2條帶。 泳道1是蛋白大小標(biāo)記物，泳道2是經(jīng)純化的hSTC2。圖7是對(duì)小鼠的Y-maze行動(dòng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，hSTC2施用組的情況下，可確認(rèn)相比KA 單獨(dú)施用組，表示地點(diǎn)記憶力的分值顯著增加(P < 0. 05)。圖8是對(duì)小鼠的找水行動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Water finding test)的結(jié)果，在hSTC2施用組 的情況下，相比KA單獨(dú)施用組，飲水等待時(shí)間顯著減少，可確認(rèn)學(xué)習(xí)記憶力的水平提高(ρ
<0. 05)。圖9是對(duì)小鼠的強(qiáng)制游泳行動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Forced swim test)的結(jié)果，在hSTC2施用組 的情況下，相比施用生理鹽水的對(duì)照組，不動(dòng)時(shí)間顯著減少，從而可確認(rèn)對(duì)憂郁關(guān)聯(lián)行動(dòng)的 改善有效(P < 0. 05)。圖10是對(duì)小鼠的短暫性局部缺血模型中hSTC2施用組的腦損傷程度相比施用 生理鹽水的對(duì)照組顯著減少，從而可確認(rèn)具有減少腦梗塞體積和神經(jīng)性缺乏的效果(P
<0. 05)。實(shí)施方式以下通過實(shí)施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅旨在更具體說明本發(fā)明，本領(lǐng) 域技術(shù)人員知曉，根據(jù)本發(fā)明的精神，本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例材料及方法L 斯鈣素 2 (Stannioealcin 2 :STC2)的制備從HEF (人胚胎成纖維細(xì)胞)得到基因組DNA。將其用BamHI (Takara, Japan)切 斷后作為模板(template)使用，進(jìn)行為了得到編碼斯鈣素2的4個(gè)外顯子DNA片段的PCR。 為了連接各外顯子DAN片段，設(shè)計(jì)引物使連接部位的一部分的19個(gè)堿基可相互形成堿基對(duì) (base pairing)，所有 PCR 中使用 Pr imeSTAR HS DNA 聚合酶(Takara，Japan)。為擴(kuò)增斯 鈣素2的外顯子1、2、3及4的第1次PCR方法如下。以用BamHI (Takara, Japan)切斷的 基因組DNA作為模板共同使用，利用hSTC21U引物(Bioneer，Korea)和hSTC22D引物對(duì)進(jìn) 行PCR(30個(gè)循環(huán)；98°C 10秒鐘，55°C 5秒鐘，72°C 30秒鐘)后，擴(kuò)增獲得169bp的外顯子1。用相同的方法，利用hSTC23U和hSTC24D引物對(duì)得到163bp的外顯子2，利用hSTC25U和 hSTC26D引物對(duì)得到231bp的外顯子3，及利用hSTC 7U和hSTC28D引物對(duì)得到420bp的外
顯子4。第2次PCR中，將用上述方法獲得的外顯子1 (169bp)、外顯子2 (163bp)、外顯 子3(231bp)和外顯子4(420bp)作為模板使用，加入含EcoRI (Takara，Japan)切斷部位 (GAATTC)的hSTC21U和含KpnI切斷部位(GGTACC)的hSTC28D引物對(duì)，重新進(jìn)行PCR(30個(gè) 循環(huán)；980C 10秒鐘，55°C 5分鐘，72°C 1分鐘)而得到926bp的斯鈣素2。將用所述方法得到的編碼斯鈣素2的DNA和pUC_18 (AmershamPharmacia Biotech, Swiss)用 EcoRI 和 KpnI (Takara, Japan)切斷，用 T4DNA 連接酶(Takara, Japan) 連接后，轉(zhuǎn)化ToplOF'菌株。其后，于37°C培養(yǎng)15小時(shí)后，任意選定3個(gè)集落進(jìn)行培養(yǎng)， 用堿裂解方法得到質(zhì)粒后，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳來確認(rèn)大小，再分析堿基序列 (Solgent，韓國)而選擇了所望的質(zhì)粒(pUC-hSTC2)。之后，進(jìn)行連接narK啟動(dòng)子和除去信號(hào)序列的Met-斯鈣素2的PCR，以使連接部 位的18個(gè)堿基相互形成堿基對(duì)連接。第1次PCR方法如下。以pNKmut質(zhì)粒(含-10突變 的narK啟動(dòng)子，(株)Regeron)作為模板，利用0Y-17和r-narK D引物對(duì)進(jìn)行PCR(30個(gè)循 環(huán)；980C 10秒鐘，550C 5秒鐘，72°C 25秒鐘)得到350bp的narK啟動(dòng)子。以所述pUC_hSTC2 作為模板，利用hSTC29U和hSTC28D引物對(duì)進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)；98°C 10秒鐘，55°C 5秒鐘， 720C 55秒鐘)而得到863bp的除去信號(hào)序列的Met-斯鈣素2。第2次PCR中，以用上述方法獲得的narK啟動(dòng)子(350bp)和Met-斯鈣素2 (420bp) 作為模板使用，加入含EcoRI切斷部位(GAATTC)的0Y-17和含KpnI切斷部位(GGTACC)的 hSTC28D引物對(duì)重新進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)；98°C 10秒鐘，55°C 5分鐘，72°C 1分鐘)而得到 1195bp的片段(含narK啟動(dòng)子和除去信號(hào)序列的Met-斯鈣素2的片段)。將1195bp的 片段(含narK啟動(dòng)子和除去信號(hào)序列的Met-斯鈣素2的片段)和pUC_rrnB (向pUC18質(zhì) 粒中插入rrnB終止子，(株)Regeron)用EcoRI和KpnI切斷，用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn) 化ToplOF'菌株。其后，于37°C培養(yǎng)15小時(shí)后，任意選定3個(gè)集落進(jìn)行培養(yǎng)，用堿裂解方 法得到質(zhì)粒后，在1 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳來確認(rèn)大小，再進(jìn)行堿基序列分析來選擇所望 的質(zhì)粒(pUC-narK Met_hSTC2)。表1引物堿基序列
引物堿基序列(5’ 一 3’)hSTC21UCCGGAATTCATGTGTGCCGAGCGGC (25 聚體)hSTC22DGGATCTCCGCTGTATTCTGCAGGGACAGG(29 聚體)hSTC23UCAGAATACAGCGGAGATCCAGCACTGTT (28 聚體)hSTC24DATGACTTGCCCTGGGCATCAAATTTTCC (28 聚體)
11hSTC25UGATGCCCAGGGCAAGTCATTCATCAAAGAC(30 聚體)
hSTC26DCACGTAGGGTTCGTGCAGCAGCAAGTC (27 聚體)
hSTC27UGCTGCACGAACCCTACGTGGACCTCGT (27 聚體)
hSTC28DGGGGTACCTCACCTCCGGATATCAGAATAC(30 聚體)
hSTC29UGTATCAGAGGTGTCTATGACCGACGCCACCAACC(34 聚體)
OY-17CCGGAATTCGTAAACCTCTTCCTTCAGGCT(30 聚體)
r-narK DCATAGACACCTCTGATACTCGTTTCG (26 聚體) 將經(jīng)pUC-narK Met_hSTC2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌ToplOF'細(xì)胞IOg懸浮于200ml的5mM EDTA溶液中后，用超聲波破碎細(xì)胞后，將其在10，OOOg離心分離30分鐘來回收沉淀物。將 回收的沉淀物懸浮，將其用SDS-PAGE分析。如圖4所示，可在33kDa處觀察對(duì)應(yīng)于hSTC2的 條帶。此外，將SDS-PAGE上的33kDa部位的條帶洗脫，于37°C用胰蛋白酶(Promega，美國) 切斷16小時(shí)，用MALDI-TOF(Applied Biosystems，美國)分析，從而可確認(rèn)數(shù)據(jù)是MS-Fit 搜索(Protein Prospector)結(jié)果 hSTC2。向所述離心分離的沉淀物中加入蒸餾水200ml，加入100% TritonX 100原液Iml 至0. 5% TritonX 100的濃度，于常溫?cái)嚢?0分鐘后，將其在10，OOOg離心分離30分鐘來 回收沉淀物。向其中加入蒸餾水200ml，于常溫?cái)嚢?0分鐘后，將其在10，OOOg離心分離30 分鐘來回收沉淀物。向其中加入溶液(50mM Tris pH8. 0、6M尿素，10mM2_巰基乙醇)200ml， 于常溫?cái)嚢?0分鐘后，將其在10，OOOg離心分離40分鐘來回收上清。向所述上清中加入蒸餾水200ml稀釋后，使稀釋液通過用緩沖溶液(20mM Tris, ImM EDTA)預(yù)先平衡的DEAE-瓊脂糖柱(GEHealthcare)來使吸附于凝膠，重新使緩沖溶液 (20mM Tris, ImMEDTA)通過來洗滌。其后，使緩沖溶液(20mM Tris, ImM EDTA, 300mM NaCl) 通過來洗脫吸附于凝膠的蛋白。將所述洗脫液用使用緩沖溶液(20mM NaH2PO4, ImM EDTA, pH7. 0)預(yù)先平衡的SuperdeX200(GE Healthcare)進(jìn)行凝膠過濾層析。洗脫出的級(jí)分經(jīng) 15% SDS-PAGE (圖5)而只收集hSTC2純度在90%以上的級(jí)分。最終，將經(jīng)純化的hSTC2 (純 度95%以上)(圖6)使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA:牛血清白蛋白)和分光光度計(jì)(Molecular Device公司Spectra MAX 190)用Bradford Assay測定波長595nm處的結(jié)果，蛋白定量值 是0. 125mg/ml。最終，將經(jīng)純化的hSTC2用于以后的實(shí)驗(yàn)。2.斯鈣素 2 (Stanniocalcin 2 :STC2)腦室內(nèi)灃射(I. C. V)濃度確定將溶于生理鹽水(PBS)的hSTC2(100ng/5y 1)5μ 1腦室內(nèi)注射 (Intracerebroventricular Injection :Ι· C. V)給 ICR 小鼠(DBL，韓國)。3.溴脫氧尿苷(Bromodeoxyuridine :BrdU)腹腔施用給23 25g的4周齡雄性ICR小鼠(DBL，韓國)腹腔施用50mg/kg的溴脫氧尿苷 (Bromodeoxyuridine :BrdU, Sigma)。
4. jffl兌氧,尿昔(Bromodeoxyuridine :BrdU)染盧,給23 25g的4周齡雄性小鼠(DBL，韓國)腦室內(nèi)注射hSTC2后腹腔施用了 BrdU。施用24小時(shí)后，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物利用4 %多聚甲醛灌流液(paraformaldehyde preperfusion solution)灌流固定。迅速摘出經(jīng)固定動(dòng)物的腦后，在同一固定液中4小時(shí)， 后固定(postfixation)后，用30%蔗糖溶液洗滌24小時(shí)后，利用冷凍組織包埋劑(optimum cutting temperature compound OCT compound, Fisher)進(jìn)行冷去P。其后，用冷凍切片機(jī) 制備40 μ m厚度的組織切片，放入冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)溶液盅后，在-20°C下保 存，進(jìn)行BrdU染色。實(shí)驗(yàn)經(jīng)兩天進(jìn)行，第一天的實(shí)驗(yàn)過程是將放在冷凍保護(hù)劑溶液中的腦 組織放入丙烯基平板孔中，用50mM磷酸緩沖液(Phosphate Buffer :PB)以每次5分鐘洗滌 3次后，在0. 5% Triton X-100中處理20分鐘后，用50mM磷酸緩沖液以每次5分鐘洗滌3 次后，利用甲酰胺(100%)和4XSSC(檸檬酸鈉溶液)，將用最終濃度甲酰胺50%+2XSSC 制成的溶液以每玻璃杯加入2ml，移入組織，于65°C在振蕩恒溫水槽中保存2小時(shí)。其后，用 2 X SSC以每次5分鐘洗滌2次后，移入在37 °C振蕩恒溫水槽中預(yù)加熱30分鐘的2N HCl (PBS 9. 6ml+HCl原液2ml)中后，于常溫振蕩下在0. IM硼酸鈉(pH8. 5)中于25°C中和10分鐘。 其后，用50mM PB以每次5分鐘洗滌3次后，用1 % BSA (牛血清白蛋白)+10 %馬血清(horse serum)培養(yǎng)1小時(shí)后，利用抗-BrdU抗體(Roche)于4°C施行免疫組織化學(xué)染色12小時(shí)。 次日，將腦組織用50mM PB以每次5分鐘洗滌3次后經(jīng)1小時(shí)，與50mM ΡΒ+0. 5% BSA上綴 合生物素的第2抗體——山羊抗-小鼠IgG(l 200，載體)反應(yīng)1小時(shí)后，用50mM PB以 每次5分鐘洗滌3次。其后，與ABC(親和素-生物素復(fù)合物)試劑(1 200)(載體)反 應(yīng)1小時(shí)后，用50mM PB以每次5分鐘洗滌3次后，以二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine DAB)為底物進(jìn)行顯色。將顯色后的組織在混酸甲酚酯(cresyl violet)中染色約2分鐘 后，用常規(guī)方法脫水，澄清后，用polymoimt包埋。5.免疫組織化學(xué)法(ImmunohistochemistiT)給23 25g的4周齡雄性小鼠腦室內(nèi)注射(I. C. V)紅藻氨酸(紅藻氨 酸，Tocoris,0. 1 μ g/5y 1)5μ 1或者紅藻氨酸和hSTC2的混合溶液((紅藻氨酸 0. lygihSTCZlOOngVSy 1)5μ 1，施用24小時(shí)后，利用4%多聚甲醛灌流液將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌 流固定。迅速摘出經(jīng)固定的動(dòng)物的腦后，在同一固定液中后固定4小時(shí)后，用30%蔗糖溶液 洗滌24小時(shí)后，利用OCT化合物冷凍所述腦組織。其后，冷凍切片機(jī)制備40 μ m厚度的組 織切片，放入冷凍保護(hù)劑溶液中后，于-20°C保存后，施行免疫組織化學(xué)法。第一天的實(shí)驗(yàn) 過程是，將腦組織從冷凍保護(hù)劑溶液中取出，用50mM PB以每次5分鐘洗滌3次。其后，為 除去內(nèi)源性過氧化酶(endogenous peroxidase)而用3% H2O2 (在50mM PB中)處理10分 鐘后，并用 50mM PB+1% BSA+0. 2% Triton X-100 處理 30 分鐘。其后，在 50mM ΡΒ+0. 5% BSA+3%正常血清中培養(yǎng)1小時(shí)后，用50mM PB洗滌10分鐘后，利用抗-0X-42單克隆抗體施 行了免疫組織化學(xué)染色。次日，將腦組織用50mM PB以每次5分鐘洗滌3次后經(jīng)1小時(shí)，在 50mM ΡΒ+0. 5% BSA中與第2抗體——山羊抗-小鼠IgG(l 200)反應(yīng)1小時(shí)后，用50mM PB以每次5分鐘3次洗滌。其后，與ABC試劑(1 200)反應(yīng)1小時(shí)后，用50mM PBS以每 次5分鐘洗滌3次后，以DAB為底物進(jìn)行顯色。將顯色后的組織用常規(guī)方法脫水，澄清后， 用 po Iymount 包埋。6. BV2小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
于37°0，5%0)2狀態(tài)下，使用含2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素、10%熱滅活的胎牛血清(FBS)的 DMEM(Dulbeco' s Modified Eagle' s Medium) 培養(yǎng)基(GIBCO BRL,USA)培養(yǎng)小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞株BV2 (Dr. Cho dong-hyup, Department ofNeurobiology and Behavior, Cornell University)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長到鋪滿底部面積的 90%左右，就實(shí)施繼代培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。7.藥物處理為抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)的活性，處理hSTC2至最終濃度達(dá)ΙΟηΜ。作 為小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性劑，處理LPS (脂多糖)至最終濃度達(dá)200ng/ml。
8.氧化氮(Nitric oxide :N0)濃度測定氧化氮(Nitric oxide :N0)的生成通過測定亞硝酸鹽(nitrite =NO2O的濃度來 確定。亞硝酸鹽的濃度利用格里斯試劑(Griess reagent 1 %磺胺0. 1 %萘基乙二胺二鹽 酸鹽/2. 5% H3PO4)通過比色分析法(colorimetric assay)測定。9.小鼠的 Y-maze 4〒動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Y-maze test)將23 25g的4周齡雄性ICR小鼠(DBL，韓國)以各5只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí) 驗(yàn)組兩組，給對(duì)照組紅藻氨酸(紅藻氨酸，TOCOris，0. 1μ g/δμ 1)5μ 1，給實(shí)驗(yàn)組腦室內(nèi)注 射(I.e. V)紅藻氨酸和hSTC2的混合溶液((紅藻氨酸0. lygihSTCZlOOngVSy 1)5μ 1，施 用24小時(shí)后進(jìn)行認(rèn)知功能行動(dòng)實(shí)驗(yàn)Y-maze行動(dòng)實(shí)驗(yàn)。Y-maze裝置由40 (長度)X 12 (寬 度)X 30 (高度)cm的3個(gè)臂(arm)構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)時(shí)的照度在20士51ux下施行。將構(gòu)成Y-maze 的3個(gè)臂分別任意命名為A、B及C后，加入待實(shí)驗(yàn)小鼠，使其頭部向著這些中一個(gè)臂的通道 末端后，使其自由行走通道8分鐘，觀察其移動(dòng)路徑。小鼠的后腳進(jìn)入一個(gè)臂的通道，則認(rèn) 為通過所述臂。如此依次記錄小鼠通過的臂后順序以每3個(gè)綁在一起時(shí)，給小鼠通過路徑 (臂)均不同的賦予1分的分值。例如，小鼠以ABCAC的順序通過了臂，則對(duì)以ABC、BCA及 CAC順序綁定賦予2分。記憶力分值(％)除以總分值(總通過次數(shù)_2)，將其重新用百分 率換算來計(jì)算。小鼠的找水行動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Water finding test)將23 25g的4周齡雄性ICR小鼠(DBL，韓國)以各5只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn) 組兩組，給對(duì)照組腦室內(nèi)注射(I. C. V)紅藻氨酸(0.1μβ/5μ1)5μ1，給實(shí)驗(yàn)組腦室內(nèi)注射 (I. C. V)紅藻氨酸和hSTC2的混合溶液((紅藻氨酸0. 1 μ g+hSTC2100ng) /5 μ 1) 5 μ 1，施用 24小時(shí)后進(jìn)行了預(yù)測潛在學(xué)習(xí)的找水行動(dòng)實(shí)驗(yàn)。裝置是30 (長度)X 50 (寬度)X 20 (高 度)cm大小的箱子，底部分為10X IOcm的15個(gè)隔間，一側(cè)壁面制造了 10X IOcm門，向其中 插入了水瓶。第一天，向一側(cè)末端放入僅施用紅藻氨酸或施用紅藻氨酸和STC2的小鼠后， 使其學(xué)習(xí)找水。學(xué)習(xí)后，中斷水的供給24小時(shí)。第二天將其重新放入裝置中測定了飲水等 待時(shí)I、司(drinking latency，禾少 中)。小鼠的強(qiáng)制游泳行動(dòng)實(shí)驗(yàn)將23 25g的4周齡雄性4周齡ICR小鼠(DBL，韓國)以各5只隨機(jī)分為對(duì)照 組和實(shí)驗(yàn)組兩組，給對(duì)照組腦室內(nèi)注射(I. C. V)生理鹽水，給實(shí)驗(yàn)組腦室內(nèi)注射(I. C. V) hSTC2(100ng/5y 1)5μ L· 24小時(shí)后施加拘束壓力2小時(shí)。施加壓力后放入裝有25士2°C 水的圓通水槽(直徑10cm，高度20cm)中使其強(qiáng)制游泳6分鐘。從過了 2分鐘后開始計(jì)算， 測定其余4分鐘的過程中小鼠取將臉露出水面上而靜靜地浮在水上不動(dòng)的姿勢的時(shí)間。認(rèn)為不動(dòng)行動(dòng)意味著無助感(helplessness)。對(duì)短晳件大腦局部缺血(Transient Focal Cerebral Ischemia)及短晳件中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion :MCA0)所致的腦損傷的影響給10只雄性成年C57BL/6J小鼠(3月齡，25 30g，DBL，韓國)腹腔內(nèi)注射替來 他明(Tiletamine)、唑拉西泮(Zoletile)和鹽酸塞拉嗪(8mg/kg)，麻醉后固定于立體定位 裝置(Havard Apparatus)，沿中線切開皮膚，在前鹵點(diǎn)的后方0. 2mm，側(cè)方1. 2mm處開孔，以 2. 5mm深度插入了腦注射器(Havard Apparatus) 0腦注射器用牙科用粘固劑固定。3天后， 使用安眠面罩，用2%異氟醚(Tocoris)及氮和氧的混合氣體(70%/30%)麻醉小鼠，用加 熱板及燈將體溫維持在37士0. 5°C。將經(jīng)如上處理的小鼠以各5只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照 組兩組后，通過腦注射器給實(shí)驗(yàn)組腦室內(nèi)注射(I.C.V)hSTC2(100ng/5y 1)5μ 1，及給對(duì)照 組腦室內(nèi)注射(I. C. V)相同體積的生理鹽水，切開正中頸部，暴露外頸動(dòng)脈后，使經(jīng)熱處理 使尖端變鈍而制成的9. Omm長度的5-0手術(shù)用尼龍縫合線(Ethicon，Edinburg，通過外 頸動(dòng)脈插入內(nèi)頸動(dòng)脈來阻斷中腦動(dòng)脈血流，60分鐘后除去尼龍，恢復(fù)血流。局部大腦缺血后 第24小時(shí)時(shí)處死小鼠，摘出腦。利用腦模具(Havard Apparatus)從額葉以Imm厚度切開 摘出的腦來冠狀切片化。將各切片浸于2% TTC (2,3, 5-triphenyltetrazoliumchloride) 中，于37°C培養(yǎng)15分鐘來進(jìn)行染色，利用掃描儀(Hewlett-Packard)以1200dpi進(jìn)行掃描 后，用 ImagePro—Plus 軟件(Media Cybernetics)進(jìn) 分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果紅藻氨酸(kainic acid :KA)誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞死亡中斯鈣素2 (Stanniocalcin 2 :STC2)的影響本研究中確認(rèn)了 KA所致的海馬CA3區(qū)域的錐體神經(jīng)元細(xì)胞死亡(具體為 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡)是否被STC2抑制。將紅藻氨酸和hSTC2的混合溶液((紅藻氨酸 0. 1μ g+hSTC2100ng)/5y 1)5μ 1注射到23 25g的雄性ICR小鼠的腦室內(nèi)，24小時(shí)后摘 出腦。將經(jīng)切片的腦組織用混酸甲酚酯染色來觀察CA3海馬區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果確認(rèn)，KA單獨(dú)處理組中的CA3海馬區(qū)域的錐體神經(jīng)元細(xì)胞死亡，但KA和STC2聯(lián)用處 理組中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡被抑制(圖1)。本研究結(jié)果表明，STC2具有對(duì)谷氨酰胺過度活化 性神經(jīng)毒性的保護(hù)效果。斯鈣素2 (Stanniocalcin 2 :STC2)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞生成的影響已知，即便神經(jīng)元細(xì)胞分化結(jié)束后，在腦的一部分區(qū)域中，神經(jīng)元細(xì)胞仍分裂、分 化，將其稱為神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)。神經(jīng)發(fā)生已知在腦的區(qū)域中擔(dān)當(dāng)記憶和認(rèn)知功能 的海馬齒狀回(dentate gyrus :DG)的顆粒細(xì)胞層(granular cell layer :GCL)下方的顆 粒細(xì)胞下層(subgranular zone SGZ)中發(fā)生，其會(huì)由學(xué)習(xí)等而增加。將STC2 (IOnM)注射到23 25g的雄性ICR小鼠的腦室內(nèi)，并腹腔施用溴脫氧尿苷 (Bromodeoxyuridine =BrdU) (100mg/kg)。24小時(shí)后摘出腦后，進(jìn)行BrdU免疫組織化學(xué)法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相比對(duì)照組，STC2施用組中溴脫氧尿苷-免疫陽性細(xì)胞(BrdU-immimopositive cells)在海馬的SGZ中顯著增加(圖2及3)。本研究結(jié)果表明，STC2發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞形成的作用。斯鈣素2對(duì)施用紅藻氨酸的小鼠的Y-maze行動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Y-mazetest)的影響本實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用嚙齒類的基本特性中的探索和好奇心而檢查地點(diǎn)記憶力的實(shí)驗(yàn)。在KA (紅藻氨酸)單獨(dú)施用組中，記憶力分值是42. 5士5. 4%。同時(shí)施用hSTC2和KA的情況 下，記憶力分值是61. 3士6. 3%，可知由KA減少的記憶力分值被hSTC2大大增加(圖7)。斯鈣素2對(duì)施用紅藻氨酸的小鼠的找水行動(dòng)實(shí)驗(yàn)(ffater findinRtest)的影響本實(shí)驗(yàn)是可評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)、地點(diǎn)記憶及工作記憶的檢查。學(xué)習(xí)及記憶力水平高的情況 下飲水等待時(shí)間(drinking latency)相對(duì)短。相比KA單獨(dú)施用組(143士34秒鐘)，hSTC2 施用組(67士25秒鐘)的飲水等待時(shí)間顯著減少(ρ < 0. 05)(圖8)。
IB丐素2對(duì)小鼠的強(qiáng)制游泳行動(dòng)實(shí)駘(Forced swim test)的影口向本檢查在使用作為抑郁癥動(dòng)物模型而被廣泛使用的模型觀察及評(píng)價(jià)憂郁關(guān)聯(lián)行 動(dòng)中使用。不動(dòng)時(shí)間(immobile time)越長，評(píng)價(jià)為無助感(helplessness)越大。相比對(duì) 照組(113士21秒鐘)，hSTC2施用組(71 士 15秒鐘)的不動(dòng)時(shí)間顯著減少(ρ < 0. 05)(圖9)。斯鈣素2對(duì)小鼠的短晳件大腦局部缺血(Transient Focal Cerebral Ischemia) 及短晳件中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion :MCA0)所致的腦損傷的影響本實(shí)驗(yàn)是為驗(yàn)證在小鼠的短暫性局部缺血模型中hSTC2的施用是否具有減少腦 梗塞體積和神經(jīng)性缺乏的效果的實(shí)驗(yàn)。是為確認(rèn)hSTC2的神經(jīng)保護(hù)效果。相比對(duì)照組 (42.2士3.4%)，施用1^1^2的組(23.8士4.2)的腦梗塞大小顯著減少(ρ < 0. 05)。(圖
10)以上詳細(xì)記載了本發(fā)明的特定部分，本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰，所述具體記載僅為優(yōu) 選實(shí)施方式，本發(fā)明的范圍不受其限制。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍由隨附的權(quán)利要求及其等 價(jià)形式定義。序列表附加序列表電子文件。
權(quán)利要求
腦疾病的預(yù)防或治療用組合物，其含斯鈣素2作為有效成分。
2.認(rèn)知功能的改善用組合物，其含斯鈣素2作為有效成分。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于，所述組合物是藥學(xué)組合物或食品組合物。
4.權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于，所述組合物具有神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)活性。
5.權(quán)利要求4的組合物，其特征在于，所述神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)活性表現(xiàn)為抑制神經(jīng)元 細(xì)胞凋亡。
6.權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于，所述組合物具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的活性。
7.權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，所述腦疾病選自神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌流 損傷及精神疾病。
8.權(quán)利要求7的組合物，其特征在于，所述精神疾病是抑郁癥或躁郁癥。
9.權(quán)利要求2的組合物，其特征在于，所述認(rèn)知功能是學(xué)習(xí)能力，記憶力或集中力。
10.腦疾病的預(yù)防或治療方法，其包括給受試者施用藥學(xué)有效量的含斯鈣素2作為有 效成分的藥學(xué)組合物的步驟。
11.認(rèn)知功能的改善方法，其包括給受試者施用藥學(xué)有效量的含斯鈣素2作為有效成 分的藥學(xué)組合物的步驟。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于所述組合物是藥學(xué)組合物或食品組合物。
13.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于，所述組合物具有神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于，所述神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)活性表現(xiàn)為抑制神經(jīng)元 細(xì)胞凋亡。
15.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于，所述組合物具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的活性。
16.權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述腦疾病選自神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌流 損傷及精神疾病。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述精神疾病是抑郁癥或躁郁癥。
18.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述認(rèn)知功能是學(xué)習(xí)能力，記憶力或集中力。
全文摘要
本發(fā)明涉及可通過促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡抑制和/或神經(jīng)元細(xì)胞的生成來預(yù)防或治療神經(jīng)精神疾病，尤其是腦疾病，及改善認(rèn)知功能的組合物，涉及含斯鈣素2作為有效成分的神經(jīng)性疾病，尤其是腦疾病的預(yù)防或治療用組合物及認(rèn)知功能的改善用組合物。
文檔編號(hào)A61K38/22GK101969982SQ200980109126
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者卞鐘善, 吳達(dá)均, 李均永, 李熙濟(jì), 白常貞 申請(qǐng)人:雷杰龍公司