專利名稱：用于增加骨礦物質(zhì)密度的藥物組合物的制備的制作方法
用于增加骨礦物質(zhì)密度的藥物組合物的制備背景本發(fā)明涉及用于增加骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density, BMD)的藥物組合物 的制備。骨礦物質(zhì)密度的降低例如在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)生。骨質(zhì)疏松癥是確認的且定義明確 的疾病，它影響歐洲、日本和美國中超過7千5百萬人，并且每年僅在歐洲和美國就引起超 過2百3十萬的骨折。骨組織的低骨礦物質(zhì)密度和微結(jié)構(gòu)退化導致骨脆性的增加。骨礦物質(zhì)密度的丟失 隨著年齡的增長而發(fā)生，并且骨折率隨著年齡而顯著地增加，從而導致重大的發(fā)病率和一 定的死亡率。骨質(zhì)疏松癥不僅引起骨折，它還導致人由于繼發(fā)的并發(fā)癥而變得臥床不起，所述 繼發(fā)的并發(fā)癥在老年人中可能是危及生命的。因為骨質(zhì)疏松癥也引起背痛和身高降低，所 以該疾病及其相關(guān)骨折的預防對于在老年人中維持健康、生活質(zhì)量和獨立性是必需的。骨質(zhì)疏松癥在女性中的常見程度為在男性中的3倍，這部分地是因為女性具有更 低的峰值骨量，并且部分地是由于在絕經(jīng)期時發(fā)生的激素變化。雌激素在成年期期間保存 骨量(bone mass)方面具有重要功能，并且骨丟失隨著水平下降而發(fā)生，通常從約50歲開 始。此外，女性比男性活得更長，并因而具有更大的骨量減少。骨質(zhì)疏松癥本身沒有特殊癥狀。它的主要后果是骨折的風險增加。骨質(zhì)疏松性骨 折是這樣的骨折，所述骨折在健康人通常不會折斷骨頭的情形下發(fā)生。典型的脆性骨折發(fā) 生在脊柱、髖和腕中。另外，與衰老相關(guān)的增加的摔倒風險也可能導致骨折。已知各種藥物(例如，在治療乳腺癌中所使用的那些)引起骨丟失。骨礦物質(zhì)密 度也可以通過不活動(例如由臥床休息所引起的)而降低。在這些情況下的骨丟失常常是 可逆的。本發(fā)明的目標是提供用于增加骨礦物質(zhì)密度的新型療法，特別是用于在治療骨質(zhì) 疏松癥和可逆的骨丟失(例如，由于藥物使用或不活動而引起的)中使用。可卡因禾口苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine-regulated transcript, CART)是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(下丘腦、垂體)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中表達 的肽/神經(jīng)遞質(zhì)。另外，CART也在胰腺(內(nèi)分泌細胞)、胃腸道(G細胞)和卵巢中表達。 CART被認為參與了攝食、藥物獎賞、應(yīng)激和心血管功能。在Elefteriou 等人(Nature 434 :514_520 (2005))中，CART 進一步被描述為在骨 吸收中起作用，Elefteriou等人在分析缺乏瘦蛋白((ob/ob)小鼠)或其受體((db/db)小 鼠)的小鼠時鑒定出了 CART。這些突變型小鼠的特征在于表型異常，例如是肥胖的和不育 的，并且具有低交感緊張性和高骨量。CART主要在下丘腦中表達，但在垂體、胰腺和腎上腺 中也觀察到表達。下丘腦神經(jīng)元中的表達通過瘦蛋白注射而增加，并且在ob/ob小鼠中不 存在。CART敲除的小鼠沒有明顯的表型異常，但主要特征在于低骨量(減少了 50%的 BV/TV (骨體積/組織體積))。還已在Mc4R-/_小鼠中分析了CART表達。Deok Ahn等人(Endocrinology 147(7)3196-3202(2006))公開了，缺乏Mc4r的等位基因的人或小鼠展示出骨吸收參數(shù)的下降、高 骨量、以及CART血清水平和/或下丘腦表達的增加。此外，還描述了，CART信號傳導是造 成骨吸收下降的原因。發(fā)明概述在導致本發(fā)明的研究中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過使用緩釋系統(tǒng)用rCART55_102肽 治療小鼠導致BMD和其他相關(guān)骨參數(shù)的強烈增加。嚙齒類動物(例如大鼠和小鼠)是關(guān)于 骨質(zhì)疏松癥的廣泛接受的動物模型，并且其中所獲得的結(jié)果因此可以外推至人。上文所提及的文獻研究全都旨在CART的下丘腦CART表達的內(nèi)源性增加。根據(jù)本 發(fā)明，顯示了，血清中外源CART的外周增加導致骨礦物質(zhì)密度的增加。鑒于上述文獻，這是 無法預期的。因此，本發(fā)明涉及具有人CART的生物學活性的可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽 (CART)衍生肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于增加骨礦物質(zhì)密度以便用 于治療或預防骨量疾病和以便用于骨折修復，其中所述治療包括在待治療的受試者中持續(xù) 提供升高的CART衍生肽的血清水平。附1 人、小鼠和大鼠CART的蛋白質(zhì)比對。*指明了小鼠、大鼠和人CART序列之間 的同源性。以粗體指明了人CART42-89。圖2 在T = 0、28和60天時，來自對照小鼠以及植入有rCART55-102緩釋小丸的 小鼠的股骨遠端的小梁骨礦物質(zhì)密度(BMD)數(shù)據(jù)(*p < 0. 05 ；**p < 0. 01 ;_p < 0. 001)。圖3:在T = 30天時，具有rCART55-102緩釋小丸的小鼠或者以每天注射 rCART55-102肽進行治療的小鼠的遠端股骨的小梁骨礦物質(zhì)密度。圖4:大鼠04肌55-102引起在牛粒層細胞中抑制了？5!1-誘導的17 0-雌二醇(E2) 產(chǎn)生。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了 CART衍生肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于通 過在待治療的受試者中持續(xù)誘導升高的CART衍生肽的血清水平來增加骨礦物質(zhì)密度和/
或骨量。CART是作為哺乳動物中攝食行為和體重調(diào)節(jié)的潛在介體而受到許多關(guān)注的神經(jīng) 肽。人CART基因被作圖至染色體5ql3_14，這是先前已顯示為關(guān)于肥胖的易感性基因座的
基因座。在物種之間，CART是在進化上非常良好地保守的(在大鼠和人之間具有95%的氨 基酸同一性)，其中在該肽的氨基末端區(qū)域中具有100%同一性。這個區(qū)域存在于所有具有 生物學活性的CART肽中，并且包含有在每個物種中嚴格保守的6個半胱氨酸殘基。二硫鍵 的斷裂導致生物學活性的喪失。大鼠的全長pr印ro-CART由129個氨基酸組成。全長人CART包括116個氨基 酸。如果沒有信號肽(殘基1-27)，那么大鼠pro-CART具有102個殘基(長形式)或89 個殘基(短)形式。迄今為止，已描述了許多具有生物學活性的CART肽嚙齒類動物中的 CART55-102 和 CART62-102，以及人中的 CART42-89 和 CART49-89。最廣泛研究的CART前體的產(chǎn)物是rCART55-102，其一般被稱為CART。已在各種生
4物學模型的情形下描述了 rCART55-102的生物學活性，包括例如運動活性、攝食和焦慮前 脈沖抑制。更短的形式也顯示出保留了生物學活性，但還未得到詳細描述。在

圖1中，顯示 了人、小鼠和大鼠的蛋白質(zhì)序列比對以及CART的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一個實施方案中，可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)衍生肽是全長 的可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)本身，特別是分別129和116個氨基酸的大鼠、小鼠 或人形式。全長CART可以重組地獲得(Thim L.等人，F(xiàn)EBS Letters 428 =263-268(1998)； Coucero 等人，Protein expression and purification 32 185-193 (2003))，或者通過肽 合成獲得(Coucero 等人，Protein expression and purification 32:185-193(2003)； Dodson等人，Peptides for the New Millennium,Proceedings of the American Peptide Symposium, 16th, Minneapolis, MN，美國，1999 年 6 月 26 日-7 月 1 日，會議日期 1999 年， 136-137(2000))。在本申請中，除非另有說明，否則術(shù)語CART以廣義進行使用，即它包括全長CART 以及變體，例如其片段、類似物、衍生物或修飾物。變體是例如CART衍生肽或蛋白質(zhì)，其中 一個或多個氨基酸已被一個或多個其他氨基酸置換，或者其中一個或多個氨基酸已被修飾 或刪除。不可能改變變體CART的生物學活性的合適氨基酸置換描述在例如Dayhof，M. D.， Atlas of protein sequence and structure,Nat. Biomed. Res. Found. , Washington D. C., 1978，第5卷，suppl.3中。在相關(guān)氨基酸之間的氨基酸替換或者在進化中頻繁發(fā)生的替換 尤其是 Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Arg/Lys、Asp/Asn、Ile/Val?；谠撔畔?，Lipman 禾口 Pearson開發(fā)了用于快速且靈敏的蛋白質(zhì)比較(Science 227，1435-1441，1985)并且測定 同源多肽之間的功能相似性的方法。備選地，CART衍生肽是全長人CART或者具有人CART的生物學活性的大鼠或 鼠類CART的片段、類似物或衍生物。為了測定片段、類似物或衍生物是否仍然保留了人 CART的生物學活性，可以在源自垂體的細胞系A(chǔ)tT20或GH3 (Lakatos等人，Neuroscience Letters384 198-202 (2005))中，或者在牛粒層細胞(Sen 等人，Molecular Endocrinology 22(12) =2655-2676(2008))中測試所述片段、類似物或衍生物對于細胞外信號相關(guān)激酶 (extracellular signal-related kinase, ERK)的束lj■的景id向。 為了仍具有人CART的生物學活性，與沒有CART衍生肽的載體相比較，在所述三種 細胞系的每一種中，使用CART衍生肽進行的處理應(yīng)當至少導致P-ERK1/2以1. 2倍的程度 增加(在10 y M的濃度下)，優(yōu)選地以1. 5倍的程度增加，更優(yōu)選地P-ERK1/2活性以2倍的 程度增加(在0. 1 y M的濃度下)。備選地，可以就其在牛粒層細胞中抑制FSH-誘導的17 0-雌二醇(E2)產(chǎn)生的 能力來測試CART衍生肽的生物學活性，如在實施例3中和由Sen等人(Endocrinology 148 (9) =4400-4410 (2007))所描述的。在1 y M的CART衍生肽的濃度下，用CART衍生肽進 行的處理應(yīng)當至少導致FSH-誘導的17 0-雌二醇產(chǎn)生以1.2倍的程度下降，優(yōu)選地以1.5 倍的程度下降，更優(yōu)選地以2倍的程度下降，和更加優(yōu)選地以3倍的程度下降。最優(yōu)選地， 與載體相比較，在InM的濃度下，用CART衍生肽進行的處理導致E2產(chǎn)生以1. 5倍的程度下 降。通過重復實施例1中所描述的試驗，可以最后證明根據(jù)本發(fā)明的CART活性得到了保持。
按所希望地，大鼠CART片段至少并入有氨基酸55-102、61_102或62-102。按所希 望地，人CART片段至少并入有氨基酸42-89、48-89和49-89。此類CART片段的氨基酸序列 如下大鼠CART 片段 55-102Ile-Pro-Ile-Tyr-Glu-Lys-Lys-Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-G Iu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gl y-Thr-Ser-Cys-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu大鼠CART 片段 61-102Lys-Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-Glu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-Thr-Ser-Cys-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu大鼠CART 片段 62-102Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-Glu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-Thr-Ser-CyS-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu人CART 片段 42-89Val-Pro-Ile-Tyr-Glu-Lys-Lys-Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-G Iu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gl y-Thr-Ser-Cys-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu人CART 片段 48-89Lys-Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-Glu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-Thr-Ser-Cys-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu人CART 片段 49-89Tyr-Gly-Gln-Val-Pro-Met-Cys-Asp-Ala-Gly-Glu-Gln-Cys-Ala-Val-Arg-Lys-Gly-Ala-Arg-Ile-Gly-Lys-Leu-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-Thr-Ser-Cys-Asn-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu。也作為本發(fā)明的一部分的為與上文所列出的肽序列顯示出至少90%，優(yōu)選地至少 95%,更優(yōu)選地至少98%，和最優(yōu)選地至少99%同一性的CART衍生肽的用途。如本文中所 使用的，序列同一性百分比為CART衍生肽和參考序列之間相同的氨基酸的數(shù)目。合適的參 考序列為 RefSeq肽:NP_004282. 1 (人)、NP_001074962. 1 (小鼠同種型 2)、NP_038760. 3 (小 鼠同種型1)、NP_058806. 1(大鼠)。這些序列可以在RefSeq數(shù)據(jù)庫中找到，該數(shù)據(jù)庫是來 自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) 的具有相應(yīng)的特征和文獻注釋的核苷酸和蛋白質(zhì)序列的公共數(shù)據(jù)庫。以CART變體形式的備選的CART衍生肽具有經(jīng)置換、修飾和/或缺失的氨基酸。修 飾優(yōu)選地是這樣的，即使得大鼠CART中半胱氨酸殘基68-86、74-94和88-101之間，以及人 CART中半胱氨酸殘基55-73、61-81和75-88之間的二硫鍵保持完整，并且不干擾CART的生 物學活性(參見圖1)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的增加骨礦物質(zhì)密度是為了用于治療或預防骨質(zhì)疏松癥(包括女性中的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以及男性中的特發(fā)性和原發(fā)性性腺功能減退性骨質(zhì)疏松 癥)、糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥、藥物誘導的骨丟失(包括，由于使用例如芳香酶抑制 劑和GnRH受體調(diào)節(jié)劑或者由于神經(jīng)性食欲缺乏而造成的由雌激素缺乏誘導的骨丟失)、廢 用或固定誘導的骨丟失、牙周炎誘導的骨丟失、骨折(即骨折愈合)、絕經(jīng)后女性中的背痛、 成骨不全。根據(jù)本發(fā)明的治療合適地通過下列方式來實現(xiàn)在待治療的受試者中持續(xù)提供升 高的CART衍生肽的血清水平，特別是通過其在延長的時間段期間的緩慢釋放。CART衍生肽的緩慢釋放可以通過在緩釋制劑中包括所述肽來達到。用于在人中 使用的此類緩釋制劑是本領(lǐng)域已知的，并且例如基于生物可降解的聚合物基質(zhì)(Chan YP等 A,Expert Opin Drug Deliv. 4(4) 441-51 (2007) ；Shimizu T 入，Biochem Biophys Res Commun. 367 (2) : 330-5 (2008))。備選的制劑例如為植入物或陰道環(huán)。植入物和陰道環(huán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 并且例如描述于 Power J 等人，Cochrane Database Syst Rev. 18(3) :CD001326 (2007) ；De Leede LG 等人，Contraception34 (6) :589_602 (1986)；和 Reddy KV 等人，Reproduction 128 117-126(2004)。如本文中所使用的，“延長的時間段”包括1-3個月，優(yōu)選地3-6個月，更優(yōu)選地 6-12個月，更加優(yōu)選地12-24個月。為了達到骨礦物質(zhì)密度的增加，與待治療的受試者中內(nèi)源的CART血清水平相比 較，CART衍生肽的血清水平以至少1. 3倍，優(yōu)選地至少2倍，更優(yōu)選地至少3倍和直至5倍 的程度增加。在一個實施方案中，CART的血清水平為30-650pg/ml。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，當CART的血清水平持續(xù)升高時，獲得了對于骨礦物質(zhì)密度的治 療效果。這可以通過下列方式來達到將CART衍生肽持續(xù)釋放到血清中，或者避免或抑制 CART衍生肽的清除。如本文中所使用的，“骨礦物質(zhì)密度(BMD)的增加”包括，與用安慰劑治療的受試者 相比較，BMD值以1. 05倍，優(yōu)選地1. 3倍，更優(yōu)選地1. 5倍，更加優(yōu)選地2倍的程度增加，如 用DEXA-掃描所測定的。雙能X射線吸收測定法(DEXA)是測量骨礦物質(zhì)密度(BMD)的方 法，并且是最廣泛使用和最徹底研究的骨密度測量技術(shù)。用于根據(jù)本發(fā)明的用途的CART衍生肽通?？梢砸跃忈屩苿?，特別是緩釋植入物 的形式進行施用。以這種形式，每個月、每幾個月或者每1或2年僅需要1個劑量。本發(fā)明進一步涉及包含可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)衍生肽和合適的賦形 劑的藥物組合物。所述藥物組合物優(yōu)選地是緩釋制劑。為了制造緩釋制劑，考慮使用緩釋 基質(zhì)例如生物可降解的聚合物基質(zhì)和任選地常規(guī)添加劑。一般而言，在本發(fā)明中可以使用 不干擾CART衍生肽的功能的任何藥學上可接受的添加劑。根據(jù)其的進一步方面，本發(fā)明提供了包含CART衍生肽的植入物。在另一個實施方 案中，本發(fā)明涉及包含CART衍生肽的陰道環(huán)。所述植入物和陰道環(huán)合適地含有包含在緩釋 基質(zhì)中的CART衍生肽。本發(fā)明進一步涉及用于增加骨礦物質(zhì)密度的方法，其包括在待治療的受試者中持 續(xù)提供升高的CART衍生肽的血清水平。本發(fā)明還涉及用于治療或預防骨質(zhì)疏松癥(包括 女性中的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以及男性中的特發(fā)性和原發(fā)性性腺功能減退性骨質(zhì)疏松癥)、糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥、藥物誘導的骨丟失(包括，由于使用例如芳香酶抑制劑和 GnRH受體調(diào)節(jié)劑或者由于神經(jīng)性食欲缺乏而造成的由雌激素缺乏誘導的骨丟失)、廢用或 固定誘導的骨丟失、牙周炎誘導的骨丟失、骨折(即骨折愈合)、絕經(jīng)后女性中的背痛、成骨 不全的方法。本發(fā)明將在下面的實施例中進一步舉例說明，所述實施例決不是希望限制本發(fā) 明。
實施例實施例1小鼠中的骨礦物質(zhì)密度增加在小鼠中通過緩釋CART治療而引起的骨礦物質(zhì)密度增加在這個實驗中，用3種不同濃度的CART肽治療小鼠。該實驗在12周齡的 C57B1/6J雌性小鼠中進行，并且由4個實驗組(n = 5只/組)組成。第一組小鼠接受安 ■齊υ·#/]、Λ (SX-999,60 ^#/Jn, Innovative Research of America, Sarasota, Florida)。其他三組用包含 20 μ g、50 μ g或 100 μ g (2 X 50 μ g)大鼠 CART55-102 肽(rCART) (Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Belmont, CA)的 SX-999 緩釋小丸進行治療。通過注射 麻醉齊U (Hypnorm(VetaPharma, Leeds, UK) / 多美康(Dormicum) (Roche, Mijdrecht, The Netherlands))使小鼠鎮(zhèn)靜，并且在頸部以皮下方式植入小丸。在T = 0 時，通過體內(nèi) micro-CT 測量(Skyscanl076 micro-CT 掃描儀，Skyscan, KontichBelgium)測定在股骨遠端處的骨結(jié)構(gòu)和密度。掃描在9 μ m分辨率下進行。在接 近股骨的遠端生長面150 μ m處的2mm切片上進行小梁骨分析。在第28天和第60天時重復 體內(nèi)micro-CT測量。將在T = 0、T = 28和T = 60天時安慰劑組的BMD值設(shè)定為100%， 并且相對于安慰劑組而言來計算20μ g、50y g和100 μ g (2 X 50 μ g) CART治療組的BMD值。 將值表示為獨個數(shù)據(jù)的“平均值+SD”。對于統(tǒng)計學分析，在標準Student T-檢驗(雙尾) 中將治療組與相應(yīng)時間點的安慰劑組進行比較。P < 0. 05被認為是顯著的。結(jié)果顯示在圖2中。結(jié)果顯示，與安慰劑組相比較，在IOOyg CART組中在28天 后小梁骨礦物質(zhì)密度(BMD)增加了 50-60%。在60天后，BMD在100 μ g CART組中進一步 增加，并且此刻在50 μ g CART組中也是顯著增加的。BMD在100 μ g和50 μ g組中分別增力口 80% 禾口 40-50%。這些數(shù)據(jù)顯示，通過緩釋植入物遞送來持續(xù)釋放CART肽28天足以使小梁BMD增 加50%。這證實了外周施用的CART肽在治療或預防骨質(zhì)疏松癥中的潛力。實施例2CART緩釋制劑vs.每天CART注射在這個實驗中，將CART肽經(jīng)由緩釋制劑改善骨礦物質(zhì)密度的效力與每天注射 CART相比較。該實驗在12周齡的C57B1/6J雌性小鼠中進行，并且由4個實驗組(η = 5只 /組)組成。在第一組小鼠中，在頸部以皮下方式植入2個安慰劑緩釋小丸(SX-999，60天 小丸，Innovative Research of America, Sarasota, Florida)。在第二組中，在頸部以皮下 方式植入各包含 50 μ g 大鼠 CART55-102 (Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Belmont, CA)的 2個SX-999緩釋小丸。另外兩組接受用載體(0.9% NaCl)或者用在0. 9% NaCl中的2 μ g大鼠CART55-102肽進行的每天皮下注射。在T = 0 禾口 T = 30 天時，通過注射麻醉劑(Hypnorm(VetaPharma，Leeds, UK) / 多 美康(Roche, Mijdrecht, The Netherlands))使小鼠鎮(zhèn)靜，并且通過體內(nèi)micro-CT測量 (Skyscanl076micro-CT掃描儀，Skyscan，Belgium)測定在股骨遠端處的骨密度。每周通過 眶穿刺來收集血液以測定血清CART水平。將BMD(g/cm3)表示為獨個數(shù)據(jù)的“平均值+SD”。 使用Student T-檢驗(雙尾)進行統(tǒng)計學分析。P < 0. 05被認為是顯著的。結(jié)果顯示在圖3中。結(jié)果顯示，與安慰劑小丸組相比較，在30天后用CART緩釋小 丸治療的小鼠展示出小梁骨礦物質(zhì)密度(BMD)的50%增加。接受用2iig大鼠CART55-102 進行的每天注射的組沒有顯示出BMD的增加。這些數(shù)據(jù)顯示，通過緩釋植入物遞送而使 CART血清水平持續(xù)增加30天的確顯著增加了小梁BMD。實施例3CART引起在牛粒層細胞中抑制了 FSH-誘導的17 0 -雌二醇產(chǎn)生在本地屠宰場處獲得來自雙肌母牛(double muscled cow)的卵巢，并且從 3-至5-mm卵泡中收集粒層細胞(在發(fā)情周期的隨意階段處)。將卵泡置于在37°C下的 培養(yǎng)基(M505培養(yǎng)基(Gibco Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)中，所述培養(yǎng)基補充有抗 生素(100IU/ml 青霉素和 0. lmg/ml 鏈霉素(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA))、10ng/mL 月夷帛 (Schering-Plough, Oss, The Netherlands) >4ng/mL(Sigma Aldrich, St. Louis, M0, USA)、5ii g/mL 脫鐵運鐵蛋白(Sigma Aldrich, St. Louis, M0, USA)和 1(T7M 雄烯二酮(0rg6, Schering-Plough, Oss, The Netherlands)。用針弄破卵泡，并且使細胞 經(jīng)過細胞濾過器(70iim尼龍，Becton Dickinson, Bedford, USA)。將細胞在340Xg下 離心10分鐘，并且重懸浮于培養(yǎng)基中。在與ouo-6uo-7uo-8uo-\io-10uo-n或10_12M大 U CART55-102 (Phoenix Pharmaceuticals Inc. ， Belmont, CA, USA)才目會且☆的 0、20、100 或 300mUnits FSH(0rg 32489，Schering-Plough, Oss, The Netherlands)存在下，將細胞 (1X105個活細胞/孔)在37°C下于潮濕的氣氛(5%C02，95%空氣)中在96-孔平板中培 養(yǎng)7天。培養(yǎng)基每48小時進行更新。在7天后，通過使用17 0-雌二醇ELISA(Diagnostic Systems Laboratories Inc. , Marburg, Germany)來測定培養(yǎng)基中的 17 3 -雌二醇水平。結(jié)果呈現(xiàn)在圖4中，并且顯示，liiMCART肽可以在lOOmUnits FSH存在下以1.5倍 的程度抑制牛粒層細胞的FSH-誘導的17 0 -雌二醇產(chǎn)生，和在300mUnits FSH存在下以3 倍的程度抑制牛粒層細胞的FSH-誘導的17 0 -雌二醇產(chǎn)生。
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權(quán)利要求
具有人CART的生物學活性的可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)衍生肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于增加骨礦物質(zhì)密度以便用于治療或預防骨量疾病和以便用于骨折修復，其中所述治療或預防包括在待治療的受試者中持續(xù)提供升高的CART衍生肽的血清水平。
2.權(quán)利要求1的用途，其中通過在延長的時間段期間從緩釋制劑中緩慢釋放出CART衍 生肽來持續(xù)提供升高的CART衍生肽的血清水平。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述緩釋制劑呈現(xiàn)為植入物特別是皮下植入物的形式，或 者陰道環(huán)的形式。
4.權(quán)利要求2-3中任一項的用途，其中所述緩釋制劑呈現(xiàn)為生物可降解的聚合物基質(zhì) 的形式。
5.權(quán)利要求1或2的用途，其中通過避免或抑制CART衍生肽的清除來持續(xù)提供升高的 CART衍生肽的血清水平。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中所述可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)衍 生肽選自全長可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽、大鼠CART55-102、大鼠CART61-102、大鼠 CART62-102、人 CART42-89、人 CART48-89 和人 CART49-89。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中增加骨礦物質(zhì)密度是為了用于治療或預防骨質(zhì) 疏松癥、藥物誘導的骨丟失、廢用或固定誘導的骨丟失、牙周炎誘導的骨丟失、骨折、絕經(jīng)后 女性中的背痛、成骨不全，特別是為了用于治療或預防女性中的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、男性中 的特發(fā)性和原發(fā)性性腺功能減退性骨質(zhì)疏松癥以及糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥。
8.權(quán)利要求2-7中任一項的用途，其中所述延長的時間段包括1-3個月，優(yōu)選地3-6個 月，更優(yōu)選地6-12個月，更加優(yōu)選地12-24個月。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中與內(nèi)源的CART血清水平相比較，所述升高的 CART衍生肽的血清水平以至少1. 3倍，優(yōu)選地至少2倍，更優(yōu)選地至少3倍和直至5倍的程 度增加。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中所述升高的CART衍生肽的血清水平為 30-650pg/ml 血清。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的用途，其中增加骨礦物質(zhì)密度(BMD)包括，與用安慰劑治 療的受試者相比較，BMD值以1. 05倍，優(yōu)選地1. 3倍，更優(yōu)選地1. 5倍，更加優(yōu)選地2倍的 程度增加，如通過雙能X射線吸收測定法(DEXA)所測定的。
12.用于增加骨礦物質(zhì)密度以便用于治療或預防骨量疾病和以便用于骨折修復的藥物 組合物，其包含有在緩釋制劑中的具有人CART的生物學活性的CART衍生肽以及合適的賦 形劑。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其包含人CART42-89、人CART48-89和人CART49-89中 的一種或多種，以用于治療女性中的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine-regulated transcript，CART)衍生肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于通過在待治療的受試者中持續(xù)提供升高的CART衍生肽的血清水平來增加骨礦物質(zhì)密度。合適地，通過在延長的時間段期間從緩釋制劑中緩慢釋放出CART衍生肽來持續(xù)提供升高的CART衍生肽的血清水平。
文檔編號A61P19/10GK101977624SQ200980109678
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者J·A·戈森, J·P·L·格利茨 申請人:歐加農(nóng)股份有限公司