專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白酶穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯示出蛋白酶抗性的新型胰島素類(lèi)似物、制備這樣的胰島素類(lèi)似物的 方法、含有本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的胰島素制備物和使用這些胰島素類(lèi)似物治療糖尿病的 方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種代謝失調(diào)，其中部分或完全喪失利用葡萄糖的能力。所有人口中大 約有5%患有糖尿病，該失調(diào)達(dá)到了流行病的比例。人類(lèi)胰島素由兩條多肽鏈組成分別含有21和30個(gè)氨基酸殘基的A和B鏈。A 和B鏈通過(guò)兩個(gè)二硫橋連接在一起。來(lái)自多數(shù)其它物種的胰島素是相似的，但是可能在 一些位點(diǎn)含有氨基酸替換。在糖尿病的治療中，提出并使用了很多胰島素制劑，例如常規(guī) 胰島素、低精蛋白鋅胰島素(稱(chēng)為NPH)、胰島素鋅懸浮液(例如Semilente 、Lente 和 Ultralente )和雙時(shí)相低精蛋白鋅胰島素。也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了人類(lèi)胰島素類(lèi)似物。它們被設(shè)計(jì) 為特定的作用模式，即速效或緩效。包含這樣的胰島素類(lèi)似物的商售產(chǎn)品包括Levemir 、 NovoRapid 、Humalog 、Apidra 禾口 Lantus 。通常，胰島素制劑是通過(guò)皮下注射給予的。但是，由于患者依從、安全和方便性的原因，通過(guò)口服途徑給藥將是有利的。蛋白藥物例如胰島素的口服給藥經(jīng)常引起極低的生物利用度，這是由于以下幾種 障礙，例如胃腸道(GI)中酶的降解、藥物流出泵、從腸粘膜吸收不足和易變、以及肝臟中的 首過(guò)代謝。人類(lèi)胰島素被發(fā)現(xiàn)于胃(胃蛋白酶和胃亞蛋白酶)、腸腔(糜蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶、羧基肽酶等)以及胃腸道粘膜表面(氨基肽酶、羧基肽酶、腸肽酶、二肽基 肽酶、內(nèi)肽酶等)的各種消化酶降解。設(shè)計(jì)為口服遞送的蛋白/肽的最近的制劑包括與蛋 白酶抑制劑、滲透增強(qiáng)劑、基于聚合物的遞送系統(tǒng)和胰島素偶聯(lián)物的聯(lián)合制劑。后者包括己 基_胰島素_單一偶聯(lián)物(HIM2) (Nobex Cooperation和GSK)，其為具有結(jié)合至B29的PEG 7-己基基團(tuán)的人類(lèi)胰島素類(lèi)似物。在例如US 7，030，082、US 6，867，183和US 6, 770,625 中報(bào)道了口服HIM2與胰島素相比具有增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性和生物利用度。蛋白酶抗性胰島素類(lèi)似物與口服蛋白遞送系統(tǒng)的組合代表口服胰島素給藥的理 想策略。此外，不需要在遞送系統(tǒng)中引入酶抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性并保持胰島素生物活性的胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方式中提供了胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys, Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25被
11替代為His，B26被替代為Gly、Glu或Lys，B27被替代為Gly、Glu或LysJP B28被替代為 Asp、His、Gly、Lys 或 Glu ；其選自A8H, A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, A22K, B 16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desBl, desB2, desB3, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A21G，desB27，desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，A14E, A15E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, B27G B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14H, B16H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14H, B16H, B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 A14H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
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130089]A14Q,A22K,B16H,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0090]A14Q,A22K,B16E,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0091]A14Q,A22K,B16H,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0092]A14Q,A22K,B16E,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0093]A14Q,A22K,B25H,B27E,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0094]A14Q,A22K,B16H,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0095]A14Q,A22K,B16E,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0096]A14Q,A22K,B25H,B26G,B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0097]A14Q,A22K,B16H,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0098]A14Q,A22K,B16E,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0099]A14Q,A22K,B16E,B25H,B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0100]A14Q,A22K,B16H,B25H,B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0101]A14Q,A22K,B16H,B25H,desB30人類(lèi)胰島素0102]A14Q,A22K,B16E,B25H,desB30人類(lèi)胰島素0103]A14Q,A22K,B25H,B27E,desB30人類(lèi)胰島素0104]A14Q,A22K,B16H,B25H,B27E, desB30人類(lèi)胰島素0105]A14Q,A22K,B16E,B25H,B27E, desB30人類(lèi)胰島素0106]A14Q,A22K,B25H,B26G,B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素0107]A14Q,A22K,B16H,B25H,B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素0108]A14Q,A22K,B16E,B25H,B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素0109]A14Q,A22K,B16E,B25H,B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素0110]A14Q,A22K,B16H,B25H,B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素0111]A14Q,A22K,B16H,B25H,desB27, desB30人類(lèi)胰島素0112]A14Q,A22K,B16E,B25H,desB27, desB30人類(lèi)胰島素0113]A14P,A22K,B16H,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0114]A14P,A22K,B16E,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0115]A14P,A22K,B16H,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0116]A14P,A22K,B16E,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0117]A14P,A22K,B25H,B27E,B29R, desB30人類(lèi)胰島素0118]A14P,A22K,B16H,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0119]A14P,A22K,B16E,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0120]A14P,A22K,B25H,B26G,B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0121]A14P,A22K,B16H,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0122]A14P,A22K,B 16E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0123]A14P,A22K,B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0124]A14P,A22K,B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素0125]A14P,A22K,B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素0126]A14P,A22K,B16E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素0127]A14P,A22K,B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素0128]A14P,A22K,B16H0129]A14P,A22K,B16E0130]A14P,A22K,B25H0131]A14P,A22K,B16H0132]A14P,A22K,B16E0133]A14P,A22K,B16E0134]A14P,A22K,B16H0135]A14P,A22K,B16H0136]A14P,A22K,B16E0137]A14D,A22K,B16H0138]A14D,A22K,B16E0139]A14D,A22K,B16H0140]A14D,A22K,B16E0141]A14D,A22K,B25H0142]A14D,A22K,B16H0143]A14D,A22K,B16E0144]A14D,A22K,B25H0145]A14D,A22K,B16H0146]A14D,A22K,B16E0147]A14D,A22K,B16E0148]A14D,A22K,B16H0149]A14D,A22K,B16H0150]A14D,A22K,B16E0151]A14D,A22K,B25H0152]A14D,A22K,B16H0153]A14D,A22K,B16E0154]A14D,A22K,B25H0155]A14D,A22K,B16H0156]A14D,A22K,B16E0157]A14D,A22K,B16E0158]A14D,A22K,B16H0159]A14D,A22K,B16H0160]A14D,A22K,B16E0161]A14E,A22K,B16H0162]A14E,A22K,B16E0163]A14E,A22K,B16H0164]A14E,A22K,B16E0165]A14E,B16H,B25H0166]A14E,B16E,B25H
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B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
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B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
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B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
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B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
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B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB30人類(lèi)胰島素
B25H, desB30人類(lèi)胰島素
B27E, desB30人類(lèi)胰島素
B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
desB27, desB30人類(lèi)胰島素
desB27, desB30人類(lèi)胰島素, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素。在另一個(gè)實(shí)施方式中提供了包含通式9的A鏈氨基酸序列和通式10的B鏈氨基 酸序列的胰島素類(lèi)似物Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-XaaA14-Gln-Leu-Glu -Asn-Tyr-Cys-Asn通式(9)(SEQ ID No 9)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-V a 1 -Cys-G Iy-G Iu-Arg-G 1 y-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29通式(10)(SEQ ID No 10)其中XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro、Glu 禾口 Gln ；XaaB24 獨(dú)立地選自 Phe、Gly 和 His ；XaaB25 獨(dú)立地選自 Phe 禾口 Hi s ；XaaB26 獨(dú)立地選自 Tyr、Gly、Glu 和 Lys ；XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys或Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29不存在或者是Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生(derivatized as an amide)；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的 二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物
16的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈中的(多個(gè))突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn) B25的氨基酸替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選 自 Lys、Arg 禾口 Pro。在另一個(gè)實(shí)施方式中提供了藥物組合物，其包含生物學(xué)活性數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的 胰島素類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受的載體。還提供了用于治療受試者中的糖尿病和/或降低哺乳動(dòng)物中的血液葡萄糖水平 的方法，包括給予所述受試者或哺乳動(dòng)物根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物或藥物組合物。發(fā)明描述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中提供了具有增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性并保持胰島素生 物活性的胰島素類(lèi)似物。本發(fā)明人鑒定了對(duì)于消化蛋白酶具有改善的穩(wěn)定性的幾種胰島素類(lèi)似物。由于與 未經(jīng)修飾的人類(lèi)胰島素相比這些胰島素類(lèi)似物具有針對(duì)蛋白水解降解的增強(qiáng)的抗性，所以 在胃或胃腸道中具有增加的生物利用度，因此，這些胰島素類(lèi)似物可用于口服糖尿病治療?？梢酝ㄟ^(guò)使用人類(lèi)胰島素、各種胰島素類(lèi)似物、消化酶和提取物(胃、腸和胰腺) 進(jìn)行消化物的HPLC分析，從而表征胰島素類(lèi)似物的蛋白水解穩(wěn)定性?？梢酝ㄟ^(guò)重組表達(dá)和 突變或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于人類(lèi)胰島素顯示出在存在 胃蛋白酶的情況下的延長(zhǎng)的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物選自A8H, A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，A14E, A15E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E，B28E，desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desBl, desB2, desB3, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A21G, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物選自desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30 人類(lèi)胰島素desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素 B24G, desB30人類(lèi)胰島素
B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B29R, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 B25H, desB30人類(lèi)胰島素 B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素 B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素
B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B28E, desB30人類(lèi)胰島素
B28H, desB30人類(lèi)胰島素，
其中所述胰島素類(lèi)似物進(jìn)一步包含選自下列的
A14D
A14E
A14H
A14P
A14Q
A21G
A14D,A22K
A14D,B16E
A14D,B16H
A14E,A15E
A14E,A21G
A14E,A22K
A14E,BlOE
A14E,B16D
A14E,B16E
A14E,B16H
A14E,B22K
A14H,A22K
A14H,B16E
A14H,B16H
A14P,A22K
A14P,B16E
A14P,B16H
A14Q,A22K
A14Q,B16E
A14Q,B16H
A8H, A14E, A22K
A8H, A14E, BlOE
A8H, A14E, BlOE
A8H, A14E, BlOH
A8H, A14E, B22K
A8H, A14H, A22K
A8H, A14H, B16H
A14D, A22K, B16E
20
A14D, A22K, B16HA14E, A22K, B16EA14E, A22K, B16HA14P, A22K, B16EA14P, A22K, B16HA14Q, A22K, B16EA14Q, A22K, B16HA14E, B16E, B22KA14E, B16H, B22KA14E, B16H, B24HA14E, A18Q, A21G, B3QA14E，desBl，desB2，des3。以下是實(shí)施方式的非限制性列舉，在本文的其它地方進(jìn)一步描述實(shí)施方式1 一種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys、Glu、Arg、Asp、Pro和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B25被替代為His，B26被替代 為 Gly 或 Glu, B27 被替代為 Gly 或 Lys, ^P B28 被替代為 Asp、His、Gly、Lys 或 Glu ；其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與一個(gè)氨基酸替代 的組合組成，所述一個(gè)氨基酸替代是位點(diǎn)B25的氨基酸被替代為His，則胰島素類(lèi)似物的A 鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、Arg和Pro。實(shí)施方式2.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B25H、B26E、B26G、B27G、B27K、B28D、B28G、B28E、 B28H、B28K、B29K、desB26、desB27、desB28 和 desB29。實(shí)施方式3.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其中所述的B鏈中的兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式。實(shí)施方式4.根據(jù)實(shí)施方式3的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B25H、B26E、B26G、B27G、B27K、B28D、B28G、B28E、 B28H、B28K、B29K 和 desB26。實(shí)施方式5.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其中所述的B鏈中的兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B30的氨基酸刪除和位點(diǎn)B25的氨基酸被替代為His的組合的形式。實(shí)施方式6.根據(jù)實(shí)施方式5的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B26E、B26G、B27G、B27K、B28D、B28G、B28E、B28H、 B28K、B29K、desB26、desB27、desB28 和 desB29。實(shí)施方式7.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其中所述的B鏈中的兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B30的氨基酸刪除和位點(diǎn)B26的氨基酸被替代為Glu或Gly的組合的形式。實(shí)施方式8.根據(jù)實(shí)施方式7的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或
21多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B25H、B27G、B27K、B28D、B28G、B28E、B28H、B28K、 B29K、desB26、desB27、desB28 和 desB29。實(shí)施方式9.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其中所述的B鏈中的兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B30的氨基酸刪除和位點(diǎn)B27的氨基酸被替代為Gly或Lys的組合的形式。實(shí)施方式10.根據(jù)實(shí)施方式9的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B25H、B26E、B26G、B28D、B28G、B28E、B28H、B28K、 B29K、desB26、desB27、desB28 和 desB29。實(shí)施方式11.根據(jù)實(shí)施方式1的胰島素類(lèi)似物，其中所述的B鏈中的兩個(gè)或更多 個(gè)突變是位點(diǎn)B30的氨基酸刪除和位點(diǎn)B28的氨基酸被替代為ASp、HiS、Gly、LyS或Glu的 組合的形式。實(shí)施方式12.根據(jù)實(shí)施方式11的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè) 或多個(gè)突變A22K、B16D、B16E、B16H、B24H、B25H、B26E、B26G、B27G、B27K、B29K、desB26、 desB27、desB28 和 desB29。實(shí)施方式13. —種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys, Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25 被替代為His, B26被替代為Gly、Glu或Lys, B27被替代為Gly、Glu或Lys, ^P B28被替代 為 Asp、His、Gly、Lys 或 Glu ；其選自A8H, A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E，B28H，desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desBl, desB2, desB3, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素
A21G, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，A14E, A15E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素。實(shí)施方式14.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A8H、A18Q、A21A、A21G、A21Q、A22K、B3G、B3A、B3Q、B10E、B10D、B16H、B16E、B16D 和 B22K。實(shí)施方式15.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或
23多個(gè)突變B16H、B16E和B16D。實(shí)施方式16.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含A22K或B22K。實(shí)施方式17.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變A21A、A21G和A21Q。實(shí)施方式18.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變B3Q、B3G、B3A。實(shí)施方式19.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含A18Q。實(shí)施方式20.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含A8H。實(shí)施方式21.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其進(jìn)一步包含選自下列的一個(gè)或 多個(gè)突變:B10E和B10D.實(shí)施方式22.根據(jù)實(shí)施方式13的胰島素類(lèi)似物，其中所述母體胰島素是人類(lèi)胰島
ο實(shí)施方式23.包含通式1的A鏈氨基酸序列和通式2的B鏈氨基酸序列的胰島素 類(lèi)似物Gly-11 e-Val-Glu-Gln-Cy s-Cy s-XaaA8-Ser-I Ie-Cy s-Ser-Leu-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cy s-XaaA21-XaaA22通式(1)(SEQ ID No 1)Phe-Val-Xaae3-Gln-Hi s-Leu-Cy s-Gl y-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-
LGU-Vsl-Cy S—Gly—GlU—X&&g22_Gly—通式(2)(SEQ ID No 2)其中XaaA8 獨(dú)立地選自 Thr 禾口 His ；XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro、Gln 和 Glu ；XaaA15 獨(dú)立地選自 Gln 和 Glu ；XaaA21 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；XaaA22 不存在或是 Lys ；XaaB3 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；
XaaB10 獨(dú)立地選自 Hi s、Glu 禾口 Asp ；XaaB16 獨(dú)立地選自 Tyr、Asp、His 和 Glu ；XaaB22不存在或獨(dú)立地選自Arg和Lys ；XaaB24不存在或獨(dú)立地選自Phe、Gly和His ；XaaB25不存在或獨(dú)立地選自Phe、Asn、Ala和His ；XaaB26不存在或獨(dú)立地選自Tyr、Gly、Lys和Glu ；XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys和Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29 不存在或是 Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物 的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn)B25的氨基 酸被替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、 Arg 禾口 Pro。實(shí)施方式24.包含通式3的A鏈氨基酸序列和通式4的B鏈氨基酸序列的胰島素 類(lèi)似物Gly-I Ie-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-I Ie-Cy s-Ser-Leu-XaaA14-XaaA15-Leu-G Iu-Asn-Tyr-Cy s-XaaA21-XaaA22通式(3)(SEQ ID No 3)Phe-Val-Xaae3-Gln-Hi s-Leu-Cy s-Gly-Ser-Hi s-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Le通式(4)(SEQ ID No 4)其中XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro、Gln 和 Glu ；
XaaA15 獨(dú)立地選自 Gln 和 Glu ；XaaA21 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；XaaA22 不存在或是 Lys ；XaaB3 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；XaaB16 獨(dú)立地選自 Tyr、Asp、His 和 Glu ；XaaB22不存在或獨(dú)立地選自Arg和Lys ；XaaB24不存在或獨(dú)立地選自Phe、Gly和His ；XaaB25不存在或獨(dú)立地選自Phe、Asn、Ala和His ；XaaB26不存在或獨(dú)立地選自Tyr、Gly、Lys和Glu ；XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys和Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29 不存在或是 Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的 二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物 的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn)B25的氨基 酸被替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、 Arg 禾口 Pro。實(shí)施方式25.包含通式5的A鏈氨基酸序列和通式6的B鏈氨基酸序列的胰島素 類(lèi)似物
Gly-IIe-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-XaaA14-Gln-Leu-Glu -Asn-Tyr-Cy s-XaaA21-XaaA22通式(5)(SEQ ID No 5)Phe-Val-XaaB3-Gln-Hi s-Leu-Cy s-Gly-Ser-Hi s-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Le u~Va 1 -Cys-G Iy-G Iu-Arg-G 1 y-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29通式(2)(SEQ ID No 6)其中XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro、Gln 和 Glu ；XaaA21 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；XaaA22 不存在或是 Lys ；XaaB3 獨(dú)立地選自 Asn、Gin、Gly 和 Ala ；XaaB16 獨(dú)立地選自 Tyr、Asp、His 和 Glu ；XaaB24不存在或獨(dú)立地選自Phe、Gly和His ；XaaB25不存在或獨(dú)立地選自Phe、Asn、Ala和His ；XaaB26不存在或獨(dú)立地選自Tyr、Gly、Lys和Glu ；
XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys和Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29 不存在或是 Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的 二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物 的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn)B25的氨基 酸被替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、 Arg 禾口 Pro。實(shí)施方式26.包含通式7的A鏈氨基酸序列和通式8的B鏈氨基酸序列的胰島素 類(lèi)似物Gly-IIe-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-XaaA14-Gln-Leu-Glu -Asn-Tyr-Cy s-Asn-XaaA22通式(7)(SEQ ID No 7)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-V al-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Le u~Va 1 -Cys-G Iy-G Iu-Arg-G 1 y-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29通式(8)(SEQ ID No 8)其中XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro 禾口 Glu ；XaaA22 不存在或是 Lys ；XaaB16 獨(dú)立地選自 Tyr、Asp、His 和 Glu ；
26
XaaB24 獨(dú)立地選自 Phe 禾口 Hi s ；XaaB25 獨(dú)立地選自 Phe 禾口 Hi s ；XaaB26 獨(dú)立地選自 Tyr、Gly 和 Glu ；XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys和Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29 不存在或是 Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的 二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物 的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn)B25的氨基 酸被替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、 Arg 禾口 Pro。實(shí)施方式27.包含通式9的A鏈氨基酸序列和通式10的B鏈氨基酸序列的胰島 素類(lèi)似物Gly-IIe-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-XaaA14-Gln-Leu-Glu -Asn-Tyr-Cys-Asn通式(9)(SEQ ID No 9)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-V a 1 -Cys-G Iy-G Iu-Arg-G 1 y-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29通式(10)(SEQ ID No 10)其中XaaA14 獨(dú)立地選自 Asp、His、Lys、Arg、Pro、Glu 和 Gln ；XaaB24 獨(dú)立地選自 Phe，Gly 禾口 His ；XaaB25 獨(dú)立地選自 Phe 禾口 His ；XaaB26 獨(dú)立地選自 Tyr、Gly、Glu 和 Lys ；XaaB27不存在或獨(dú)立地選自Gly、Lys和Thr ；XaaB28 不存在或獨(dú)立地選自 Pro、Gly、His、Lys、Asp 和 Glu ；XaaB29 不存在或是 Lys ；C末端可以任選地作為酰胺衍生；其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列通過(guò)A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位 點(diǎn)7的半胱氨酸之間、以及A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間的 二硫橋連接，并且其中A鏈的位點(diǎn)6和11的半胱氨酸通過(guò)二硫橋連接；其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物 的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變；并且其中，如果胰島素類(lèi)似物B鏈的突變由位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與位點(diǎn)B25的氨基 酸被替代為His的組合組成，則胰島素類(lèi)似物的A鏈的位點(diǎn)A14的至少一個(gè)突變選自Lys、Arg 禾口Pro。實(shí)施方式28. —種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys, Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25 被替代為His，B26被替代為Gly，B27被替代為Gly、His、Thr或Lys和B28被替代為His、 Gly、Lys 或 Glu ；其選自B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，和B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素，其中所述胰島素類(lèi)似物進(jìn)一步包含選自下列的替代A14EA14DA14HA14E, A22KA14D, A22KA14H, A22KA14D, B16HA14E, B16H
28
A14H, B16HA14E, A22K, B16HA14H，A22K，B16H，禾口A14D, A22K, B16H。實(shí)施方式29. —種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys, Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25 被替代為His，B26被替代為Gly，B27被替代為Gly、His、Thr或Lys和B28被替代為His、 Gly、Lys 或 Glu ；其選自desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30 人類(lèi)胰島素desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素B24G，desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27E, desB30人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B29R, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
B25H,B27G, desB30人類(lèi)胰島素
B25H,B28G, desB30人類(lèi)胰島素
B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素
B25H,desB30人類(lèi)胰島素
B27K,desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B26G,desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B26G,B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B27G,desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B27G,B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B27G,B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
B27G,B28G, B29K, desB30 人類(lèi)胰島素
B28E,desB29, desB30人類(lèi)胰島素
B28E,desB30人類(lèi)胰島素
B28H,desB30人類(lèi)胰島素，
其中所述胰島素類(lèi)似物進(jìn)一步包含選自下列的替代
A14D
A14E
A14H
A14P
A14Q
A14D,A22K
A14D,B16E
A14D,B16H
A14E,A15E
A14E,A21G
A14E,A22K
A14E,BlOE
A14E,B16D
A14E,B16E
A14E,B16H
A14E,B22K
A14H, A22KA14H, B16EA14H, B16HA14P, A22KA14P,B16EA14P, B16HA14Q, A22KA14Q, B16EA14Q, B16HA8H, A14E, A22KA8H, A14E, BlOEA8H, A14E, BlOEA8H, A14E, BlOHA8H, A14E, B22KA8H, A14H, A22KA8H, A14H, B16HA14D, A22K, B16EA14D, A22K, B16HA14E, A22K, B16EA14E, A22K, B16HA14P, A22K, B16EA14P, A22K, B16HA14Q, A22K, B16EA14Q, A22K, B16HA14E, B16E, B22KA14E, B16H, B22KA14E, B16H, B24HA14E, A18Q, A21G, B3QA14E，desBl，desB2，des3。實(shí)施方式30. —種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于 位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys, Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè) 突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸 替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25 被替代為His，B26被替代為Gly，B27被替代為Gly、His、Thr或Lys和B28被替代為His、 Gly、Lys 或 Glu ；其選自desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
31
desB27, desB30 人類(lèi)胰島素desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素B24G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H，desB27，desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B25H, desB30 人類(lèi)胰島素B28E，desB29，desB30 人類(lèi)胰島素B28E，desB30 人類(lèi)胰島素B28H，desB30 人類(lèi)胰島素，其中所述胰島素類(lèi)似物進(jìn)一步包含選自下列的替代A14DA14EA14PA14E, A15EA14E, A21GA14E, A22KA14E,BlOEA14E,B16DA14E, B16E
A14E, B16HA14E, B22KA14H, B16HA8H, A14E, A22KA8H, A14E, BlOEA8H, A14E, BlOEA8H, A14E, BlOHA8H, A14E, B22KA8H, A14H, A22KA8H, A14H, B16HA14E, A22K, B16EA14E, A22K, B16HA14E, B16E, B22KA14E, B16H, B22KA14E, B16H, B24HA14E, A18Q, A21G, B3QA14E，desBl，desB2，des3。實(shí)施方式31.根據(jù)實(shí)施方式28-30任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中所述胰島素類(lèi)似 物不是A14E，B25H，desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B27G, B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，或A14E, B27G, B28G, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素。實(shí)施方式32.根據(jù)實(shí)施方式29的胰島素類(lèi)似物，其選自A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素
33
A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14K, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素。實(shí)施方式33.根據(jù)實(shí)施方式29的胰島素類(lèi)似物，其選自
A8H, A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, A22K, B 16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，A14E, A15E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, B25H, B26E, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B26G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B27G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E，B28E，desB30 人類(lèi)胰島素A14E，B28H，desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desBl, desB2, desB3, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B24H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H, B24H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A21G，desB27，desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素。實(shí)施方式34.根據(jù)實(shí)施方式29的胰島素類(lèi)似物，其選自A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B 16E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素
36
A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素實(shí)施方式35.根據(jù)實(shí)施方式29的胰島素類(lèi)似物，其選自A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14Q, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素。實(shí)施方式36. —種藥物組合物，其包含生物活性數(shù)量的根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng) 的胰島素類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受的載體。實(shí)施方式37. —種藥物組合物，其包含兩種或更多種根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的 胰島素類(lèi)似物，其中每種類(lèi)似物通過(guò)具有至少一個(gè)突變來(lái)定義，所述突變?cè)谌魏纹渌凅w 中是不存在的或者是不相同的。實(shí)施方式38.根據(jù)實(shí)施方式36-37任一項(xiàng)的藥物組合物，其還包含藥學(xué)上可接受 的載體和/或賦形劑，和任選的佐劑。實(shí)施方式39.用于治療受試者中的糖尿病的方法，包括給予所述受試者根據(jù)實(shí)施 方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物或根據(jù)實(shí)施方式36-37任一項(xiàng)的藥物組合物。實(shí)施方式40.用于降低哺乳動(dòng)物中的血液葡萄糖水平的方法，包括給予有此治療 需要的患者治療活性劑量的根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物或根據(jù)實(shí)施方式36-37任一項(xiàng)的藥物組合物。實(shí)施方式41.根據(jù)實(shí)施方式39或40的方法，其為口服給藥。實(shí)施方式42.根據(jù)實(shí)施方式39或40的方法，其為非腸道給藥。實(shí)施方式43.根據(jù)實(shí)施方式39或40的方法，其為氣管內(nèi)給藥。實(shí)施方式44.根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述藥物用于 治療或預(yù)防高血糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、和燒 傷、手術(shù)創(chuàng)傷和其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病 和其它心血管失調(diào)，以及治療治療嚴(yán)重的(critically ill)糖尿病和非糖尿病患者。實(shí)施方式45.根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作延緩或阻止2型糖 尿病中疾病進(jìn)展的藥物。實(shí)施方式46.提供了根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述藥 物用于治療或預(yù)防高血糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿 病、和燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷和其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、 冠心病和其它心血管失調(diào)。實(shí)施方式47.編碼根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列、其衍生 物、其部分序列、其簡(jiǎn)并序列或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。實(shí)施方式48.編碼根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的前體的核酸序列、 其衍生物、其部分序列、其簡(jiǎn)并序列或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。實(shí)施方式49.包含根據(jù)實(shí)施方式47-48任一項(xiàng)的核酸的載體，其用于表達(dá)根據(jù)實(shí) 施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物。實(shí)施方式50.包含實(shí)施方式49的載體的宿主細(xì)胞，其用于生產(chǎn)根據(jù)實(shí)施方式1_35 任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物。實(shí)施方式51.通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所討論的胰島素類(lèi)似物的實(shí)施 方式47-48的核酸序列來(lái)生產(chǎn)根據(jù)實(shí)施方式1-35任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的方法。胰島素是由胰腺的β細(xì)胞分泌的多肽激素。胰島素由兩條多肽鏈A和B組成，這 兩條鏈通過(guò)兩個(gè)鏈間二硫橋連接起來(lái)。此外，A鏈具有一個(gè)鏈內(nèi)二硫橋。該激素是作為單鏈前體胰島素原(前胰島素原)合成的，前體胰島素原由24個(gè) 氨基酸的前肽后跟含有86個(gè)氨基酸的胰島素原組成，其結(jié)構(gòu)為前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C是31個(gè)氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是用于切割A(yù)和B鏈的連接肽 的切割位點(diǎn)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)胰島素”意思是結(jié)構(gòu)和性質(zhì)廣為人知的人類(lèi)激素。人類(lèi)胰 島素具有兩條肽鏈，即A鏈和B鏈，其通過(guò)半胱氨酸殘基之間的二硫橋連接。A鏈?zhǔn)?1個(gè) 氨基酸的肽；B鏈?zhǔn)?0個(gè)氨基酸的肽，兩條鏈通過(guò)三個(gè)二硫橋連接一個(gè)位于A鏈的位點(diǎn)6 和11的半胱氨酸之間，第二個(gè)位于A鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)7的半胱氨酸之 間，第三個(gè)位于A鏈的位點(diǎn)20的半胱氨酸和B鏈的位點(diǎn)19的半胱氨酸之間。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“胰島素類(lèi)似物”意思是通過(guò)突變從天然產(chǎn)生的胰島素例如人 類(lèi)胰島素的初級(jí)結(jié)構(gòu)衍生而來(lái)的多肽。通過(guò)刪除和/或替代天然產(chǎn)生的胰島素中的至少一 個(gè)氨基酸殘基和/或通過(guò)添加至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)突變。所添加的和/ 或替代的氨基酸殘基可以是可編碼的(codable)氨基酸殘基或其它天然產(chǎn)生的氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可以是在胰島素的A鏈中包含一個(gè)或多個(gè)突變且在B 鏈中包含兩個(gè)或更多個(gè)突變的人類(lèi)胰島素或其類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于鑒定的蛋 白酶切割位點(diǎn)將胰島素類(lèi)似物設(shè)計(jì)為對(duì)于蛋白酶具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于8個(gè) 的修飾(替代、刪除、添加)。在一個(gè)實(shí)施方式中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于 7個(gè)的修飾(替代、刪除、添加)。在一個(gè)實(shí)施方式中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含 少于6個(gè)的修飾(替代、刪除、添加)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島 素包含少于5個(gè)的修飾(替代、刪除、添加)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母 體胰島素包含少于4個(gè)的修飾(替代、刪除、添加)。根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可以包含進(jìn)一步的突變。胰島素分子中的突變這樣表 示指明鏈(A或B)、位點(diǎn)和編碼替代原始(native)氨基酸的氨基酸的三字符?！癲esB30” 或“B (1-29)，，意思是缺少B30氨基酸殘基的天然胰島素B鏈或其類(lèi)似物；“A(l_21)，，意思 是天然胰島素A鏈。本文中的術(shù)語(yǔ)例如Al、A2、A3等分別代表胰島素A鏈中的位點(diǎn)1、2和3 (從N末 端開(kāi)始數(shù))。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)例如Bi、B2、B3等分別代表胰島素B鏈中的位點(diǎn)1、2和3 (從N 末端開(kāi)始數(shù))。使用氨基酸的單字符，術(shù)語(yǔ)例如A21A、A21G和A21Q代表A21位點(diǎn)的氨基酸 分別是A、G和Q0使用氨基酸的三字符，相應(yīng)的表達(dá)分別為A21Ala、A21Gly和A21Gln。因 此，A14D、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人類(lèi)胰島素是這樣的人類(lèi)胰島素類(lèi)似物 其中A鏈中的位點(diǎn)14突變?yōu)樘於彼?，B鏈中的位點(diǎn)25突變?yōu)榻M氨酸，并且B鏈中的位點(diǎn) 27、28、29和30皆被刪除。術(shù)語(yǔ)“糖尿病”包括1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖癥的其它病況。術(shù)語(yǔ)疾病的“治療”包括治療、預(yù)防或緩解該疾病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，胰島素類(lèi)似物特別適合于口服給藥。根據(jù)本發(fā)明的“胰島素”在本文中理解為人類(lèi)胰島素、胰島素類(lèi)似物或胰島素衍生 物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“母體胰島素”意思是未進(jìn)行本發(fā)明的任何突變的胰島素。母 體胰島素的非限制性例子為，例如，野生型胰島素例如人類(lèi)胰島素或豬胰島素，人類(lèi)胰島素 的類(lèi)似物或人類(lèi)胰島素的衍生物或胰島素類(lèi)似物例如經(jīng)過(guò)聚乙二醇化或乙?；娜祟?lèi)胰 島素或胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的母體胰島素是人類(lèi)胰島素?！暗鞍酌?protease)”或“蛋白酶(protease enzyme) ”是降解蛋白和肽的消化酶， 其被發(fā)現(xiàn)于人身體的各種組織中，例如，如胃(胃蛋白酶)、腸腔(糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、羧基肽酶等)或胃腸道的粘膜表面(氨基肽酶、羧基肽酶、腸肽酶、二肽基肽酶、內(nèi) 肽酶等)、肝臟(胰島素降解酶、組織蛋白酶D等)以及其它組織中。根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可以是蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物。蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物在本文中理解為這樣的胰島素類(lèi)似物其相對(duì)于人 類(lèi)胰島素而言被一種或多種蛋白酶降解得更慢。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白水 解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素而言被一種或多種蛋白酶降解得更慢。在本發(fā)明
40的另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物對(duì)于一種或多種選自下列的酶的降解是 穩(wěn)定的胃蛋白酶(例如，如，同工型胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶 F)、糜蛋白酶(例如，如，同工型糜蛋白酶A、糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)、胰蛋白酶、胰島 素降解酶(IDE)、彈性蛋白酶(例如，如，同工型胰腺?gòu)椥缘鞍酌窱和/或II)、羧基肽酶(例 如，同工型羧基肽酶A、羧基肽酶A2和/或羧基肽酶B)、氨基肽酶(例如，如，丙氨酸氨基肽 酶或賴(lài)氨酸氨基肽酶)、組織蛋白酶D和其它的存在于源自大鼠、豬、狗或人類(lèi)的腸提取物 中的酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物對(duì)于一種或多種選自下列的酶的 降解是穩(wěn)定的糜蛋白酶、胰蛋白酶、胰島素降解酶(IDE)、彈性蛋白酶、羧基肽酶、氨基肽 酶和組織蛋白酶D。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物對(duì)于一種或多種 選自下列的酶的降解是穩(wěn)定的糜蛋白酶、羧基肽酶和IDE。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù) 本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物對(duì)于一種或多種選自下列的酶的降解是穩(wěn)定的糜蛋白酶和羧基肽 酶。根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的半衰期(T1/2)可以按照實(shí)施例中的描述作為根據(jù) 本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物針對(duì)蛋白酶酶類(lèi)例如糜蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A的蛋白 水解酶穩(wěn)定性的測(cè)定來(lái)確定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于人類(lèi)胰島素增加。 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于母體胰島素增加。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì) 于母體胰島素增加。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于母體胰島素增加至少2倍。在進(jìn) 一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于母體胰島素增加至少3倍。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2 相對(duì)于母體胰島素增加至少4倍。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于母體胰島素增加至 少5倍。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，T1/2相對(duì)于母體胰島素增加至少10倍。當(dāng)測(cè)定后進(jìn)行比較時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素可以具有增 加的效力和/或生物利用度。用于測(cè)定胰島素效力的標(biāo)準(zhǔn)分析對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，其中主要包括 (1)胰島素放射受體分析，其中胰島素的相對(duì)效力定義為替換50%的特異性結(jié)合至細(xì)胞膜 例如大鼠肝臟質(zhì)膜組分上存在的胰島素受體的125I-胰島素所需的胰島素與所需的胰島素 類(lèi)似物之比；(2)以例如大鼠脂細(xì)胞進(jìn)行的脂肪生成分析，其中胰島素的相對(duì)效力定義為 達(dá)到[3-3H]葡萄糖50%最大轉(zhuǎn)化為有機(jī)可抽提材料(S卩脂)所需的胰島素與所需的胰島素 類(lèi)似物之比；(3)在分離的脂肪細(xì)胞中進(jìn)行的葡萄糖氧化分析，其中胰島素類(lèi)似物的相對(duì) 效力定義為達(dá)到葡萄糖-1_[14C]50%最大轉(zhuǎn)化為[14CO2]所需的胰島素與所需的胰島素類(lèi) 似物之比；(4)胰島素放射免疫分析，其能夠通過(guò)測(cè)定胰島素或胰島素類(lèi)似物與125I-胰島 素競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合至特異性抗胰島素抗體的有效性來(lái)確定胰島素類(lèi)似物的免疫原性；和(5) 其它分析，其測(cè)定胰島素或胰島素類(lèi)似物與動(dòng)物血液血漿樣品中抗體的結(jié)合，例如具有特 異性胰島素抗體的ELISA分析。每次口服給藥后胰島素類(lèi)似物的生物利用度可以例如按照 每次口服給藥后血漿中的胰島素類(lèi)似物濃度相對(duì)于靜脈內(nèi)給藥后血漿中的胰島素類(lèi)似物 濃度之比來(lái)測(cè)定?；蛘?，皮下給藥可以替代靜脈內(nèi)給藥?？梢酝ㄟ^(guò)例如上述的方法(5)確 定胰島素類(lèi)似物的濃度。任選地可以分析根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的另外的蛋白酶位點(diǎn)，其可以進(jìn)行進(jìn) 一步的替代以親水性氨基酸替代一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸。
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多肽例如胰島素的生產(chǎn)在本領(lǐng)域是熟知的。例如可以通過(guò)經(jīng)典的肽合成例如使用 t-Boc或Fmoc化學(xué)的固相肽合成或其它完善建立的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似 物，參見(jiàn)例如 Greene 禾口 Wuts，“Protective Groups Inorganic Synthesis”，John Wiley & Sons，1999。還可以通過(guò)這樣的方法來(lái)生產(chǎn)胰島素類(lèi)似物，所述方法包括在允許胰島素類(lèi) 似物表達(dá)的條件下在合適的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)含有編碼該類(lèi)似物的DNA序列并能夠表達(dá)胰島 素類(lèi)似物的宿主細(xì)胞。對(duì)于包含非天然氨基酸殘基的胰島素類(lèi)似物，應(yīng)該對(duì)重組細(xì)胞進(jìn)行 修飾從而使非天然氨基酸殘基摻入該類(lèi)似物中，例如通過(guò)使用tRNA變體。因此，簡(jiǎn)而言之， 以類(lèi)似于制備已知胰島素類(lèi)似物的方式來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。可以使用幾種方法來(lái)生產(chǎn)人類(lèi)胰島素和人類(lèi)胰島素類(lèi)似物。例如，在 W02008034881中公開(kāi)了用于在微生物中生產(chǎn)胰島素的三種主要方法。其中的兩種涉及大腸 桿菌，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)大的融合蛋白(Frank等人(1981)，Peptides proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds. ), Pierce Chemical Co. ,Rockford,Ill.pp 729-739)，或使用信號(hào)肽以使其分泌到周質(zhì)空間(Chan等人(1981) PNAS 78 5401-5404)。第三種方法利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以使胰島 素前體分泌到培養(yǎng)基中(Thim等人(1986)PNAS 83:6766-6770)?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了很多在 大腸桿菌或釀酒酵母中表達(dá)的胰島素前體，參見(jiàn)US. 5，962，267、W0 95/16708,EP 0055945、 EP 0163529、EP 0347845 和 EP 0741188。通過(guò)廣為人知的技術(shù)例如US 6500645中公開(kāi)的技術(shù)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編 碼所討論的胰島素類(lèi)似物的DNA序列來(lái)生產(chǎn)胰島素類(lèi)似物。胰島素類(lèi)似物是直接表達(dá)的， 或者作為在B鏈具有N末端延伸或在B鏈具有C末端延伸的前體分子表達(dá)。N末端延伸 可以具有增加直接表達(dá)的產(chǎn)物的產(chǎn)率的功能，其可以由長(zhǎng)達(dá)15個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。在從 培養(yǎng)液中分離之后，N末端延伸將在體外被切割，因此將在挨著B(niǎo)l處具有切割位點(diǎn)。在US 5，395，922和EP 765，395中公開(kāi)了適合于本發(fā)明的N末端延伸的類(lèi)型。C末端延伸可以具 有保護(hù)成熟胰島素或胰島素類(lèi)似物分子抵抗速宿主細(xì)胞外切蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解處 理的功能。C末端延伸在培養(yǎng)液中被分泌的活性的羧基肽酶以細(xì)胞外的方式切割，或者在從 培養(yǎng)液分離之后在體外被切割。在WO 08037735中公開(kāi)了生產(chǎn)成熟胰島素和在B鏈具有C 末端延伸的胰島素類(lèi)似物的方法，所述C末端延伸被羧基肽酶除去。該方法的靶胰島素產(chǎn) 物可以是兩條鏈的人類(lèi)胰島素或兩條鏈的人類(lèi)胰島素類(lèi)似物，其可以具有或不具有B鏈的 短的C末端延伸。如果靶胰島素產(chǎn)物在B鏈不具有C末端延伸，則所述C末端延伸應(yīng)該能 夠在進(jìn)一步純化步驟之前從B鏈上被切割掉。通常通過(guò)羧基肽酶活性實(shí)現(xiàn)延伸的切除。通過(guò)這樣的羧基肽酶活性催化的蛋白水 解步驟可以這樣進(jìn)行直接向發(fā)酵液中添加合適的酶類(lèi)以處理結(jié)合至細(xì)胞分泌的前體分子 的B鏈的C末端的剩余氨基酸殘基。除了 B鏈的C末端的延伸之外，可以進(jìn)一步在A-和/或B-鏈對(duì)胰島素分子進(jìn)行 修飾，只要這樣的修飾對(duì)于靶胰島素分子的胰島素活性沒(méi)有有害效應(yīng)。本發(fā)明還涉及編碼要求保護(hù)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式 中，本發(fā)明涉及包含這樣的核酸序列的載體和包含這樣的核酸序列或載體的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)胰島素類(lèi)似物的方法，其包括(i) 培養(yǎng)包含編碼胰島素前體的核酸序列的宿主細(xì)胞；(ii)從培養(yǎng)基中分離胰島素前體；和
42(iii)將胰島素前體通過(guò)體外酶學(xué)轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)胰島素類(lèi)似物的方法，其包括(i) 培養(yǎng)包含編碼胰島素前體的核酸序列的宿主細(xì)胞；(ii)從培養(yǎng)基中分離胰島素前體；和 (iii)將胰島素前體轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是酵母宿主細(xì)胞，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 酵母宿主細(xì)胞選自酵母屬。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，酵母宿主細(xì)胞選自釀酒酵母種。藥物組合物本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的藥物組合物，所述 胰島素類(lèi)似物以0. lmg/ml至500mg/ml的濃度存在，并且其中所述制劑的pH為2. 0至10. 0。 制劑可以進(jìn)一步包含(一種或多種)蛋白酶抑制劑、緩沖劑系統(tǒng)、(一種或多種)防腐劑、 (一種或多種)張度劑(tonicity agent)、( 一種或多種)螯合劑、(多種)穩(wěn)定劑和(多 種)表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，藥物制劑是水性制劑，即包含水的制劑。這 樣的制劑通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，藥物制劑是水性溶液。術(shù) 語(yǔ)“水性制劑”定義為包含至少50% w/w水的制劑。同樣的，術(shù)語(yǔ)“水性溶液”定義為包含 至少50% w/w水的溶液，術(shù)語(yǔ)“水性懸浮液”定義為包含至少50% w/w水的懸浮液。在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物制劑是冷凍干燥的制劑，在使用之前醫(yī)生或患者向其 中加入溶劑和/或稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物制劑是干燥的制劑(例如，冷凍干燥的或噴霧干燥 的)，不需要任何預(yù)先融化即可使用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及藥物制劑，其包含本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的 水性溶液和緩沖劑，其中所述胰島素類(lèi)似物以0. lmg/ml或更高的濃度存在，并且其中所述 制劑的PH為2.0至10. 0?？梢愿鶕?jù)任何已知的方法制備意欲用于口服使用的制劑，這樣的制劑可以包含一 種或多種選自下列的試劑甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供藥學(xué)上雅致的和適口 的制備物。藥片可以包含活性成分與非毒性的藥學(xué)上可接受的適合于生產(chǎn)藥片的賦形劑的 混合物。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，例如甘露醇、麥芽糊精、高嶺土、碳酸鈣、碳酸 鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉；粘合劑，例如淀粉、白明膠、聚 合物或阿拉伯樹(shù)膠；和潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或云母。藥片可以無(wú)包被或者它們可 以通過(guò)已知的技術(shù)進(jìn)行包被以延緩治療活性多肽的崩解或釋放。可以根據(jù)藥物化學(xué)中熟知的方法來(lái)制備并給予本發(fā)明的口服給藥的制劑，參見(jiàn) Remington’ s Pharmaceutical Sciences，17th ed. (A. Osol ed.，1985) 0在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)固體劑型例如藥片和 膠囊的方式給藥。藥片可以通過(guò)濕法制粒、干法制粒、直接壓縮或熔融法制粒來(lái)制備?？梢岳贸Ｒ?guī)壓片技術(shù)來(lái)制備用于本發(fā)明的藥片。一般的生產(chǎn)方法包括將胰島素 類(lèi)似物、水溶性稀釋劑、親水性粘合劑和任選的崩解劑的一部分混合。然后將該混合物與親 水性粘合劑的水溶液或親水性粘合劑的水溶液和表面活性劑制成粒，如果需要的話，進(jìn)行 研磨。將粒進(jìn)行干燥并減小至合適的尺寸。向粒中加入任何其它成分，例如潤(rùn)滑劑(例如 硬脂酸鎂)和另外的崩解劑并混合。然后將該混合物壓縮至合適的尺寸并使用常規(guī)壓片機(jī) 器例如旋轉(zhuǎn)藥片壓縮機(jī)將其塑形?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)以薄膜將藥片包被。[1001]用于口服使用的制劑還可以配制為硬的或軟的白明膠膠囊，其中活性成分與惰性 固體稀釋劑例如如甘露醇、麥芽糊精、碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、高嶺土、磷酸鈣或磷酸鈉混合； 或者配制為軟的白明膠膠囊，其中活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油
混合O可以利用常規(guī)方法來(lái)制備用于本發(fā)明的膠囊。一般的生產(chǎn)方法包括將治療活性 肽、藻酸鹽、水溶性稀釋劑、親水性粘合劑和任選的崩解劑的一部分混合。然后將該混合物 與親水性粘合劑的水溶液或親水性粘合劑的水溶液和水中的表面活性劑制成粒，如果需要 的話，進(jìn)行研磨。將粒進(jìn)行干燥并減小至合適的尺寸。向粒中加入任何其它成分，例如潤(rùn)滑 劑并混合。然后使用常規(guī)膠囊填充機(jī)器將得到的混合物填充至合適尺寸的硬殼白明膠膠囊 中。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，緩沖劑選自醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘氨 肽、組氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)_氨基 甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、三羥甲基甲基甘氨酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸、富馬酸、酒 石酸、天冬氨酸或其混合物。這些特異性緩沖劑中的每一個(gè)構(gòu)成本發(fā)明的可替換的實(shí)施方 式。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。防腐 劑以足以獲得防腐效應(yīng)的量存在。藥物制劑中防腐劑的量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的， 可以從例如本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中確定和/或從防腐劑例如商售產(chǎn)物的中的已知數(shù)量來(lái)確定。這 些特異性防腐劑中的每一個(gè)構(gòu)成本發(fā)明的可替換的實(shí)施方式。在藥物組合物中使用防腐劑 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。可方便地參考Remington :The Science and Practice of Pharmacy,% 19 片反，1995。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含螯合劑。在藥物組合物中使用螯合 劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的?？煞奖愕貐⒖糝emington :The Science and Practice of Pharmacy, % 19 版，1995。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含穩(wěn)定劑。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定 劑”是指向包含多肽的藥物制劑中加入的、為了穩(wěn)定該多肽即增加這樣的制劑的保質(zhì)期和/ 或使用時(shí)間的化學(xué)物質(zhì)。在藥物組合物中使用穩(wěn)定劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的?？煞?便地參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 19 片反，1995。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含表面活性劑。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“表 面活性劑”是指由水溶性(親水性)部分、頭部、和脂溶性(親脂性)部分組成的任何分子 或離子。表面活性劑優(yōu)選在界面處積累，其中親水性部分朝向水(親水相)而親脂性部分 朝向油或疏水相(即玻璃、空氣、油等)。表面活性劑開(kāi)始形成膠團(tuán)的濃度被稱(chēng)為臨界膠團(tuán) 濃度或CMC。此外，表面活性劑降低液體的表面張力。表面活性劑還被稱(chēng)為兩性化合物。術(shù) 語(yǔ)“去污劑”一般用作表面活性劑的同義詞。在藥物組合物中使用表面活性劑對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員是熟知的?？煞奖愕貐⒖?Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 第 19 版，1995。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含蛋白酶抑制劑。其它成分也可以存在于本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物藥物制劑中。這樣的另外的成分可 以包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、膨脹劑、張度調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)載體、蛋白質(zhì)(例如，人類(lèi)血清白蛋白、白明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸，例如甜菜堿、?；?酸、精氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這樣的另外的成分不應(yīng)該對(duì)本發(fā)明的藥物制 劑的總體穩(wěn)定性具有有害影響?？梢栽跀?shù)個(gè)位點(diǎn)給予有此治療需要的患者包含根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的藥 物組合物，所述位點(diǎn)是例如局部位點(diǎn)，例如皮膚和粘膜位點(diǎn)；旁路吸收位點(diǎn)，例如在動(dòng)脈、靜 脈、心臟給藥；涉及吸收的位點(diǎn)，例如在皮膚、皮膚以下、肌肉或腹部給藥?？梢酝ㄟ^(guò)數(shù)種給藥途徑給予有此治療需要的患者根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，例 如，舌、舌下、口腔、口、口服、胃和腸、鼻、肺例如通過(guò)支氣管和肺泡或其組合、表皮、真皮、透 皮、陰道、直腸、眼例如通過(guò)結(jié)膜、輸尿管和非腸道?？梢砸詳?shù)種劑型給予本發(fā)明的組合物，例如，作為溶液、懸浮液、乳液、微乳液、 多乳液、泡沫、油膏(salve)、糊劑、硬膏劑(plaster)、軟膏、片劑、包衣片劑、潤(rùn)洗劑 (rinses)、膠囊例如硬白明膠膠囊和軟白明膠膠囊、栓劑、直腸膠囊、滴液、凝膠、噴霧劑、粉 末、氣霧劑、吸入劑、眼滴液、眼膏、眼潤(rùn)洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道膏、注射溶液、原位轉(zhuǎn) 化溶液例如原位凝膠化、原位凝固、原位沉淀、原位結(jié)晶、灌注溶液和植入物。本發(fā)明的組合物還可以通過(guò)例如共價(jià)、疏水和靜電相互作用配合于或附著于藥物 載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級(jí)藥物遞送系統(tǒng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)胰島素類(lèi)似物化合物的穩(wěn)定性、 提高生物利用度、增加溶解度、減少副作用、達(dá)到本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的慢性治療、增加患 者依從性或其任何組合。本發(fā)明的組合物可用于配制用于胰島素類(lèi)似物的肺部給藥的固體、半固體、粉末 和溶液，使用例如計(jì)量吸入器、干粉吸入器和噴霧器，所有這些設(shè)備對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都是 熟知的。本發(fā)明的組合物還可用于配制控制釋放的、持續(xù)釋放的、延長(zhǎng)釋放的、延遲釋放 的、緩慢釋放的藥物遞送系統(tǒng)。更特別的但不限于，組合物可用于配制本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的非腸道控制釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)(這兩種系統(tǒng)皆造成給藥次數(shù)的很多倍的減少)。更優(yōu) 選的是通過(guò)皮下給藥的控制釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)。不限制本發(fā)明的范圍，有用的控制釋放 系統(tǒng)和組合物的例子有水凝膠、油質(zhì)凝膠、液晶、聚合物膠團(tuán)、微球體、納米顆粒。生產(chǎn)用于本發(fā)明的組合物的控制釋放系統(tǒng)的方法包括但不限于，結(jié)晶、縮合、共結(jié) 晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻質(zhì)、封裝、噴霧干燥、微封裝、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以 產(chǎn)生微球體、擠出和超臨界液體過(guò)程。一般的參考文獻(xiàn)見(jiàn)Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L. , ed. Marcel Dekker, New York,2000)禾口 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99 Protein Formulation and Delivery (MacNally,E. J., ed. Marcel Dekker, New York,2000)。非腸道給藥可以通過(guò)皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行，使用注射器，任選 為筆樣注射器。或者，非腸道給藥可以通過(guò)輸液泵的方式進(jìn)行。另一個(gè)選擇是組合物作為 溶液或懸浮液以給予鼻或肺噴霧劑形式的胰島素類(lèi)似物化合物。作為另一個(gè)選擇，包含本 發(fā)明的胰島素類(lèi)似物化合物的藥物組合物還可以適用于透皮給藥，例如通過(guò)無(wú)針頭注射或 從貼片，任選為離子電滲法貼片或透過(guò)粘膜的，例如口腔給藥。根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可以通過(guò)肺部途徑給藥使用任意已知類(lèi)型的適合 于肺部藥物遞送的設(shè)備將其在載體中作為溶液、懸浮液或干粉給藥。這些的例子包括但不限于，產(chǎn)生氣霧劑的用于肺部藥物遞送的三種一般類(lèi)型，可以包括噴射或超聲噴霧器、計(jì)量 吸人器或干粉吸人器(Cf. Yu J, Chien Yff. Pulmonary drug delivery :Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997)395-453)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可以通過(guò)任何已知的霧化技術(shù)例如氣霧化將制劑霧化， 以達(dá)到10 μ m以下的氣霧劑顆粒的MMAD，更優(yōu)選為1_5 μ m,最優(yōu)選為1_3 μ m。優(yōu)選的顆粒尺 寸是基于將藥物遞送至深肺的最有效的尺寸，其中蛋白質(zhì)被最優(yōu)化吸收(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998)379—385)。任選地，可以通過(guò)使用吸入技術(shù)的改良進(jìn)一步優(yōu)化包含胰島素類(lèi)似物化合 物的肺制劑的深肺沉積，例如，但不限于緩慢吸入速率(例如30L/分鐘)、呼吸暫停 (breath-holding)禾口定時(shí)束(J— (timing of actuation)。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的制劑”是指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或增加的物理 和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。本文使用的蛋白制劑的術(shù)語(yǔ)“物理穩(wěn)定性”是指由于蛋白暴露于熱-機(jī)械壓力和 /或與不穩(wěn)定的界面和表面(例如疏水性表面和界面)的相互作用而導(dǎo)致蛋白形成生物學(xué) 上無(wú)活性的和/或不可溶的蛋白聚集體的趨勢(shì)。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性這樣來(lái)評(píng)價(jià) 在不同的溫度將填充在合適的容器(例如筒或管)中的制劑暴露于機(jī)械/物理壓力(例如 攪動(dòng))中持續(xù)不同的時(shí)間段，然后通過(guò)目測(cè)和/或混濁度測(cè)定的方式來(lái)評(píng)價(jià)物理穩(wěn)定性。制 劑的目測(cè)在具有黑暗背景的清晰聚焦光下進(jìn)行。制劑的混濁度的特征在于對(duì)于渾濁程度等 級(jí)的目視評(píng)分，例如從0至3的級(jí)別(顯示沒(méi)有渾濁的制劑對(duì)應(yīng)于目視0分，在日光下顯示 出目視渾濁的制劑對(duì)應(yīng)于目視3分)。當(dāng)其在日光下顯示出目視渾濁時(shí)，根據(jù)蛋白質(zhì)的聚集 情況將制劑分類(lèi)為物理上不穩(wěn)定的?；蛘?，可以通過(guò)技術(shù)人員熟知的簡(jiǎn)單的混濁度測(cè)定來(lái) 評(píng)價(jià)制劑的混濁度。還可以使用蛋白的構(gòu)象狀態(tài)的分光鏡試劑或探針來(lái)評(píng)價(jià)水性蛋白制劑 的物理穩(wěn)定性。探針優(yōu)選為小分子，其優(yōu)先結(jié)合至蛋白的非天然構(gòu)象。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子 分光鏡探針的一個(gè)例子是Thioflavin T。Thioflavin T是一種廣泛用于檢測(cè)淀粉質(zhì)小纖 維的熒光染料。在小纖維存在的情況下，并且還可能存在其它蛋白構(gòu)象，當(dāng)與小纖維蛋白形 式結(jié)合時(shí)，Thioflavin T在大約450nm處產(chǎn)生新的激發(fā)最大值；在大約482nm處產(chǎn)生增強(qiáng) 的發(fā)射。在該波長(zhǎng)，未結(jié)合的Thioflavin T基本上是無(wú)熒光的。其它小分子可用作蛋白結(jié)構(gòu)從天然向非天然狀態(tài)改變的探針。例如，優(yōu)先與蛋白 的暴露的疏水性綴片結(jié)合的“疏水性綴片”探針。疏水性綴片一般埋藏于蛋白質(zhì)天然狀態(tài) 下的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，但是當(dāng)?shù)鞍组_(kāi)始打開(kāi)折疊或變性時(shí)，其變得暴露。這些小分子分光鏡探針 的例子有芳香族疏水性探針，例如蒽、吖啶、鄰二氮雜菲等。其它的分光鏡探針有金屬-氨 基酸復(fù)合物，例如疏水性氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸等的鈷 金屬?gòu)?fù)合物。本文使用的蛋白制劑的術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價(jià)變化，其 引起與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比具有潛在較低的生物效力和/或潛在升高的免疫原性特性的化 學(xué)降解產(chǎn)物的形成。取決于天然蛋白的種類(lèi)和性質(zhì)以及該蛋白暴露的環(huán)境，可以形成各種 化學(xué)降解產(chǎn)物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那樣，化學(xué)降解的消除在很大程度上不可完全避 免的，在儲(chǔ)存和使用蛋白制劑的過(guò)程中經(jīng)常見(jiàn)到化學(xué)降解產(chǎn)物的數(shù)量的增加。多數(shù)蛋白易
46于脫酰胺化，在該過(guò)程中谷氨酰胺或天冬酰胺殘基中的側(cè)鏈氨基基團(tuán)被水解以形成自由羧 基酸。其它的降解途徑包括高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個(gè)或更多個(gè)蛋白分子通過(guò)轉(zhuǎn) 酰胺作用和/或二硫鍵相互作用彼此共價(jià)結(jié)合從而引起共價(jià)結(jié)合的二體、寡聚體和多聚體 ,角軍Zfe 的 (Stability of Protein Pharmaceuticals，Ahern. Τ· J. & Manning M. C.， Plenum Press,New York 1992)。(例如蛋氨酸殘基)的氧化可以被提及作為化學(xué)降解的另 一種變體。可以在暴露于不同環(huán)境條件(通常例如升高的溫度可以加速降解產(chǎn)物的形成) 之后的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)測(cè)定化學(xué)降解產(chǎn)物的量來(lái)評(píng)價(jià)蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性。通常根據(jù)分 子大小和/或電荷，通過(guò)使用各種層析技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分離降解產(chǎn) 物來(lái)確定每種單獨(dú)的降解產(chǎn)物的數(shù)量。因此，如上所述，“穩(wěn)定的制劑”是指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或 增加的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。一般而言，在使用和儲(chǔ)存過(guò)程中(符合推薦的使用和儲(chǔ) 存條件)，制劑必須是穩(wěn)定的，直至到達(dá)失效期。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，包含胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)6周的 使用和超過(guò)3年的儲(chǔ)存中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，包含胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)4周 的使用和超過(guò)3年的儲(chǔ)存中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)4 周的使用和超過(guò)2年的儲(chǔ)存中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò) 2周的使用和超過(guò)2年的儲(chǔ)存中是穩(wěn)定的。水性懸浮液可以包含活性化合物與適合于生產(chǎn)水性懸浮液的賦形劑的混合物。油質(zhì)懸浮液可以這樣來(lái)配制將活性成分懸浮于植物油中，例如落花生油、橄欖 油、芝麻油或椰子油，或懸浮于礦物油中，例如液體石蠟。油懸浮液可以包含增稠劑，例如蜂 蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢约尤胩鹞秳├缟厦媪谐龅哪切?，和矯味劑，以提供適口的口服 制備物。可以通過(guò)加入抗氧化劑例如抗壞血酸使這些制劑防腐。適合于通過(guò)加水來(lái)制備水性懸浮液的可分散粉末和顆粒提供了活性化合物與分 散劑或潤(rùn)濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。合適的分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑已 經(jīng)在上文中示例給出。另外的賦形劑，例如，甜味劑、矯味劑和著色劑也可以存在。包含用于根據(jù)本發(fā)明的用途的化合物的藥物制劑也可以是水包油乳液的形式。油 相可以是植物油，例如橄欖油或落花生油，或礦物油，例如液體石蠟，或其混合物。合適的 乳化劑可以是天然產(chǎn)生的樹(shù)膠，例如阿拉伯樹(shù)膠或黃芪膠，天然產(chǎn)生的磷脂，例如大豆卵磷 脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯類(lèi)或部分酯類(lèi)，例如單油酸山梨糖醇酯，和所述部分酯 類(lèi)與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯單油酸山梨糖醇酯。乳液還可以包含甜味劑和矯 味劑。糖漿和酏劑可以使用甜味劑來(lái)配制，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。這樣的制 劑還可以包含緩和劑、防腐劑和矯味劑和著色劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含滲透增強(qiáng)劑。膽汁鹽和脂肪酸最經(jīng) 常考慮被用于增強(qiáng)胃腸道的上皮細(xì)胞線的脂雙層膜的口服滲透性。一般而言，滲透增強(qiáng)劑 通過(guò)可逆地改變膜的完整性而增加大分子的細(xì)胞旁路和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。膽汁鹽選自膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、甘膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、熊脫氧膽酸鹽、?；切苊撗跄懰猁}和 鵝脫氧膽酸鹽。脂肪酸選自短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸，例如辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、 棕櫚酸、硬脂酸等。其它的增強(qiáng)劑可以是表面活性劑，例如甘油一酸酯、聚氧乙烯酯、山梨聚 糖表面活性劑(非離子型)和硫酸鹽(陰離子型)。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含粘膜吸附聚合物?？梢酝ㄟ^(guò)使用這 樣的粘膜吸附聚合物獲得藥物遞送系統(tǒng)與胃腸道粘膜的緊密接觸。劑型與膜的緊密接觸似 乎是有利的，因?yàn)榭梢员苊庵委熁钚远嚯脑谶f送系統(tǒng)和吸收膜之間的路途上的酶學(xué)降解。 此外，可以提供吸收膜上的跨度濃度梯度，其代表了被動(dòng)藥物攝取的驅(qū)動(dòng)力。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制劑還包含(一種或多種)蛋白水解酶的抑制 劑以進(jìn)一步避開(kāi)酶屏障并達(dá)到治療活性多肽的遞送，所述蛋白水解酶抑制劑例如氨基肽酶 抑制劑、抑氨肽酶素、貝他定、boroleucine和嘌呤霉素。蛋白酶抑制劑的例子有乙醇酸鈉、 甲磺酸卡莫司他、桿菌肽、大豆胰蛋白酶抑制劑和抑肽酶。包埋和封裝是用于治療活性多肽的藥物遞送系統(tǒng)中使用的技術(shù)，其優(yōu)化遞送性 質(zhì)，包括抵抗酶降解的保護(hù)。包埋和封裝可以是聚合物藥物遞送系統(tǒng)的形式，例如水凝膠和 納米微囊/微球體，和液體藥物遞送系統(tǒng)例如脂質(zhì)體和微乳液。本發(fā)明的制劑可以以幾種劑型來(lái)給藥，例如作為溶液、懸浮液、微和納米懸浮液、 乳液、微乳液、多乳液、泡沫、油膏、糊劑、軟膏、藥片、包衣片劑、發(fā)泡藥片、舌下藥片、口腔藥 片、膠囊例如硬的白明膠膠囊和軟的白明膠膠囊、粉末、顆粒、原位轉(zhuǎn)化溶液例如原位凝膠 化、原位凝固、原位沉淀、原位結(jié)晶、胃漂浮制劑例如漂浮懸浮液、漂浮藥片等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物作為藥物的用途。術(shù)語(yǔ)“糖尿病”或“糖尿病”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病(懷孕期間) 和其它引起高血糖癥的病況。該術(shù)語(yǔ)用于這樣的代謝失調(diào)其中胰腺產(chǎn)生不足量的胰島素， 或者其中身體的細(xì)胞不能對(duì)胰島素產(chǎn)生正確的應(yīng)答，因此，阻止了細(xì)胞吸收葡萄糖。結(jié)果 是，葡萄糖在血液中累積。1型糖尿病，也稱(chēng)為胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)和幼發(fā)性糖尿病，是由B細(xì)胞的破 壞引起的，通常引起絕對(duì)的胰島素缺乏。2型糖尿病，也稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)和成年發(fā)作的糖尿病，其與主 導(dǎo)性胰島素抗性和由此導(dǎo)致的相對(duì)胰島素缺乏和/或具有胰島素抗性的主導(dǎo)性胰島素分 泌缺乏相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用于制備藥物，所述藥物用于治 療或預(yù)防高血糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、和燒 傷、手術(shù)創(chuàng)傷和其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病 和其它心血管失調(diào)，以及治療嚴(yán)重的糖尿病和非糖尿病患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用作延緩或預(yù)防2型糖尿病疾 病進(jìn)展的藥物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述 藥物用于治療或預(yù)防高血糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖 尿病、和燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷和其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中 風(fēng)、冠心病和其它心血管失調(diào)。
48[1047]在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了治療或預(yù)防高血糖癥包括應(yīng)激性高 血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、和燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷和其它的在治療中需 要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、冠心病和其它心血管失調(diào)、中風(fēng)的方法，所述方 法包括給予有此治療需要的患者對(duì)于此種治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。使用根據(jù)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的治療還可以與第二種或更多種藥理學(xué)活性物 質(zhì)組合，例如選自抗糖尿病試劑、抗肥胖試劑、調(diào)節(jié)食欲的試劑、抗高血壓試劑、用于治療和 /或預(yù)防糖尿病引起的或與之相關(guān)的并發(fā)癥的試劑以及用于治療和/或預(yù)防肥胖引起的或 與之相關(guān)的并發(fā)癥和失調(diào)的試劑。這些藥理學(xué)活性物質(zhì)的例子有GLP-1和GLP-I的衍生 物和類(lèi)似物、GLP-2和GLP-2的衍生物和類(lèi)似物、Exendin_4和Exendin_4的衍生物和類(lèi)似 物、胰淀素(amylin)和胰淀素的衍生物和類(lèi)似物、磺脲、雙胍、美格列奈、葡萄糖苷酶抑制 劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽基肽酶IV)抑制劑、參與刺激糖質(zhì)新生和/或肝糖水 解的肝酶的抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂代謝的化合物(例如抗高脂試劑，例如HMG CoA抑制劑(他丁類(lèi)))、降低食物攝取的化合物、RXR激動(dòng)劑和作用于β -細(xì)胞的ATP依賴(lài) 性的鉀通道的試劑；考來(lái)烯胺、考來(lái)替泊、氯貝丁酯、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他 汀、普羅布考、右旋甲狀腺素鈉、那格列奈、瑞格列奈；β-阻滯劑(例如阿普洛爾、阿替洛 爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛和美托洛爾)、ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑(例如貝那 普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴(lài)諾普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利)、鈣離 子通道阻滯劑(例如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉 帕米)和α-阻滯劑(例如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪)；CART (可卡因安非他 明調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本)激動(dòng)劑、ΝΡΥ(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、MC4(黑素皮質(zhì)素4)激動(dòng)劑、阿立新拮抗 劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動(dòng)劑、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動(dòng)劑、CRF BP(促腎 上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、urocortin激動(dòng)劑、β 3激動(dòng)劑、MSH(黑素細(xì)胞 刺激性激素)激動(dòng)劑、MCH(黑素細(xì)胞濃縮性激素)拮抗劑、CCK(縮膽囊素)激動(dòng)劑、5-羥 色胺重?cái)z取抑制劑、5-羥色胺和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑、混合的5-羥色胺和產(chǎn)生去甲 腎上腺素的化合物、5ΗΤ (5-羥色胺)激動(dòng)劑、蛙皮素激動(dòng)劑、甘丙肽拮抗劑、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng) 激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動(dòng)劑、UCP 2或3(未偶聯(lián)的蛋白2或3) 調(diào)節(jié)劑、瘦素激動(dòng)劑、DA激動(dòng)劑、(溴隱亭、doprexin)、脂酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類(lèi)維生素 A X受體)調(diào)節(jié)劑、TR β激動(dòng)劑、組胺Η3拮抗劑、胃泌激素和胃泌激素類(lèi)似物和衍生物。應(yīng)該理解根據(jù)本發(fā)明的變體與一種或多種以上提及的化合物和任選的一種或多 種另外的藥理學(xué)活性物質(zhì)的任何合適的組合被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文引用的所有的參考文獻(xiàn)，包括公開(kāi)物、專(zhuān)利申請(qǐng)和專(zhuān)利，皆通過(guò)引用以其全文 并入本文，仿佛達(dá)到等同于每篇參考文獻(xiàn)均單獨(dú)且明確地被指明通過(guò)引用并入并以其全文 列出的程度(達(dá)到法律允許的最大程度)。本文使用的所有標(biāo)題和小標(biāo)題僅僅是為了方便起見(jiàn)，不應(yīng)該被解釋為以任何方式 限制本發(fā)明。本文提供的任何和所有例子或示例性語(yǔ)言(例如，“例如”)的使用僅僅旨在更好 的解釋本發(fā)明，除非另有要求，否則對(duì)本發(fā)明的范圍不具有限制作用。本說(shuō)明書(shū)中的任何語(yǔ) 言皆不應(yīng)被解釋為表示任何未要求保護(hù)的元素對(duì)于實(shí)施本發(fā)明是必不可少的。在本文中列舉和并入專(zhuān)利文獻(xiàn)僅僅是為了方便起見(jiàn)，不反映關(guān)于這些專(zhuān)利文獻(xiàn)的有效性、可專(zhuān)利性和/或?qū)嵤┬缘娜魏斡^點(diǎn)。本發(fā)明包括隨附的由適用的法律允許的權(quán)利要求中記載的主題的所有修飾和等 同物。
實(shí)施例實(shí)施例1胰島素類(lèi)似物和人類(lèi)胰島素對(duì)于胃蛋白酶的蛋白水解穩(wěn)定性(半衰期)在37°C在IOmM HCl, pH 2. 0以100 μ L的最終體積孵育之后，測(cè)定人類(lèi)胰島素和 胰島素類(lèi)似物(0.06mM，10yL)對(duì)于胃蛋白酶的蛋白水解穩(wěn)定性。在不同的時(shí)間(0、5、15、 30和60分鐘)使用等體積的0. IM TrisHCl, pH8. 0 (最終pH 7. 7)將樣品淬滅并轉(zhuǎn)移至 5°C。制備參考樣品(0分鐘)，其中不加入酶。立即通過(guò)RP-HPLC在214nm處分析人類(lèi)胰島 素和胰島素類(lèi)似物并確定對(duì)應(yīng)于完整蛋白的峰下的面積。從曲線獲得以分鐘測(cè)定的半衰期 (T172)并計(jì)算相對(duì)于人類(lèi)胰島素(用作每個(gè)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參)的倍數(shù)升高/降低(穩(wěn)定性相對(duì) 倍數(shù))。在穩(wěn)定性分析中測(cè)試胰島素類(lèi)似物，通過(guò)根據(jù)上述方法獲得的升高的半衰期鑒定 對(duì)蛋白水解消化表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗性的類(lèi)似物。結(jié)果證明了由于對(duì)蛋白水解降解的抗性增加 和改善的溶解性而具有增加的生物利用度的進(jìn)一步改進(jìn)的胰島素類(lèi)似物的潛力。測(cè)試了以 下胰島素類(lèi)似物與人類(lèi)胰島素相比針對(duì)胃蛋白酶的穩(wěn)定性。表 權(quán)利要求
一種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于位點(diǎn)A14，其被替代為選自Lys、Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè)突變是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸替代的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25被替代為His，B26被替代為Gly、Glu或Lys，B27被替代為Gly、Glu或Lys，和B28被替代為Asp、His、Gly、Lys或Glu；其選自desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素desB27，desB30人類(lèi)胰島素desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B24H，B25H，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B24H，B25H，B26G，B27G，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B24G，B25H，desB30人類(lèi)胰島素B24G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，desB26，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，desB27，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26E，B27E，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，B28K，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，B28G，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，B28G，B29K，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27E，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27T，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，B28G，B29R，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，B27G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B26G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27E，B29R，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27E，B29R，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27E，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，B28K，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，B28G，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B29R，desB27，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，B28G，B29K，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B27G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B28G，desB30人類(lèi)胰島素B25H，B29R，desB30人類(lèi)胰島素B25H，desB30人類(lèi)胰島素B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B26G，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B26G，B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B27G，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B27G，B28K，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B27G，B28G，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B27G，B28G，B29K，desB30人類(lèi)胰島素B28E，desB29，desB30人類(lèi)胰島素B28E，desB30人類(lèi)胰島素B28H，desB30人類(lèi)胰島素其中所述胰島素類(lèi)似物還包含選自下列的替代A14DA14EA14HA14PA14QA14D，A22KA14D，B16EA14D，B16HA14E，A15EA14E，A21GA14E，A22KA14E，B10EA14E，B16DA14E，B16EA14E，B16HA14E，B22KA14H，A22KA14H，B16EA14H，B16HA14P，A22KA14P，B16EA14P，B16HA14Q，A22KA14Q，B16EA14Q，B16HA8H，A14E，A22KA8H，A14E，B10EA8H，A14E，B10EA8H，A14E，B10HA8H，A14E，B22KA8H，A14H，A22KA8H，A14H，B16HA14D，A22K，B16EA14D，A22K，B16HA14E，A22K，B16EA14E，A22K，B16HA14P，A22K，B16EA14P，A22K，B16HA14Q，A22K，B16EA14Q，A22K，B16HA14E，B16E，B22KA14E，B16H，B22KA14E，B16H，B24HA14E，A18Q，A21G，B3QA14E，desB1，desB2，des3其中所述胰島素類(lèi)似物不是A14E，B25H，desB30人類(lèi)胰島素A14H，B25H，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B16E，B25H，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B16H，B25H，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B25H，desB26，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B25H，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B25H，B27K，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B25H，B26G，desB27，desB28，desB29，desB30人類(lèi)胰島素A14E，B27G，B28K，desB29，desB30人類(lèi)胰島素，或A14E，B27G，B28G，desB29，desB30人類(lèi)胰島素。
2. 一種胰島素類(lèi)似物，其中胰島素類(lèi)似物的A鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少一個(gè)突變，其中一個(gè)突變位于位點(diǎn) A14，其被替代為選自Lys、Glu、Arg、Asp、Pro、Gln和His的氨基酸；和胰島素類(lèi)似物的B鏈包含相對(duì)于母體胰島素的至少兩個(gè)突變，其中兩個(gè)或更多個(gè)突變 是位點(diǎn)B27、B28、B29和B30的氨基酸刪除的形式，或位點(diǎn)B30的氨基酸刪除與氨基酸替代 的組合，所述氨基酸替代是選自下列位點(diǎn)的氨基酸替代B24被替代為Gly或His，B25被 替代為His，B26被替代為Gly、Glu或Lys，B27被替代為Gly、Glu或LysJP B28被替代為 Asp、His、Gly、Lys 或 Glu ； 其選自A8H, A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A8H, A14H, B16H, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B24G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B28H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desBl, desB2, desB3, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14P, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A21G, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素，A14E, A15E, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A21G, B25H, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16D, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B16E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, B16H, B22K, B25H, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素,desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B22K,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B24G,B25H,desB30人類(lèi)胰島素A14E,B24G,B25H,desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26E,B27E, desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,B27G B28K, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,B27G, desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,B27K, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,B27T, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B26G,desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B27G,B28G, desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B27G,desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B28G,desB30人類(lèi)胰島素A14E,B25H,B29R,desB30人類(lèi)胰島素A14H,B16H,B24H,B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14H,B16H,B24H,B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H,B16H,B25H,desB27, desB28, desB29, desB30 人類(lèi)胰島素A14H,B24H,B25H,B26G,B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B29R, desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B25H,B27E,B29R, desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B25H,B26G,B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B25H,B27E,desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B27E, desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B27E, desB30人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B25H,B26G,B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16H,B25H,B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素A14E,A22K,B16E,B25H,B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素6A14E,A22K,B16E,B25HA14E,A22K,B16H,B25HA14E,A22K,B16H,B25HA14E,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B25H,B27EA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B25H,B26GA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B25H,B27EA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B25H,B26GA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16H,B25HA14Q,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B25H,B27EA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B25H,B26GA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B16E,B25HB26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B25H,B27EA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B25H,B26GA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16H,B25HA14P,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B25H,B27EA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B25H,B26GA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B25H,B27EA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B25H,B26GA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16H,B25HA14D,A22K,B16E,B25HA14E,A22K,B16H,B25HA14E,A22K,B16E,B25HB26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B29R, desB30人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27E, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27E, desB30人類(lèi)胰島素B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27G, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素B26G, B27E, B28G, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素desB27, desB30人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素A14E, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14E, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14P, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14D, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, B29R, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, A22K, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, A22K, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, B16H, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素 A14Q, B16E, B25H, desB27, desB30 人類(lèi)胰島素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素類(lèi)似物，其還包含一個(gè)或多個(gè)選自下列的突變:A8H、A18Q、 A21A、A21G、A21Q、A22K、B3G、B3A、B3Q、B10E、B10D、B16H、B16E、B16D 和 B22K。
4.藥物組合物，其包含生物活性數(shù)量的根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物和藥 學(xué)上可接受的載體。
5.一種治療受試者中的糖尿病的方法，包括給予所述受試者根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng) 的胰島素類(lèi)似物或根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物。
6.一種通過(guò)給予有此治療需要的患者治療活性劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰 島素類(lèi)似物或根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物來(lái)降低哺乳動(dòng)物中血液葡萄糖水平的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述藥物用于治療或預(yù)防高血 糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、和燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷和 其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病和其它心血管失 調(diào)，以及用于治療嚴(yán)重的糖尿病和非糖尿病患者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述藥物用于延緩或阻止2型 糖尿病的疾病進(jìn)展。
9.提供了根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物用作藥物，所述藥物用于治療或預(yù) 防高血糖癥包括應(yīng)激性高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、和燒傷、手術(shù) 創(chuàng)傷和其它的在治療中需要合成代謝效應(yīng)的疾病或損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病和其它心血管失調(diào)。
10.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列、其衍生物、其部分序 列、其簡(jiǎn)并序列或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。
11.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的前體的核酸序列、其衍生物、其部 分序列、其簡(jiǎn)并序列或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型胰島素類(lèi)似物，其包含胰島素A鏈中位點(diǎn)A14和B鏈中位點(diǎn)B27、B28、B29和B30處的(多個(gè))突變并且對(duì)于蛋白酶表現(xiàn)出抗性，還涉及制備這樣的胰島素類(lèi)似物的方法、包含本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的胰島素制備物、以及使用這樣的胰島素類(lèi)似物治療糖尿病的方法。
文檔編號(hào)A61K38/28GK101970477SQ200980109927
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者F·胡巴萊克, I·勞特魯普-拉森, P·K·尼爾森, P·巴爾施密特, S·路德維格森, T·B·謝爾德森 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司