專利名稱：物質(zhì)在制備治療感冒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防鼻病毒所引起的疾病。
背景技術(shù)：
眾所周知，上呼吸道中的正常細(xì)菌菌群，對防止致病菌過度生長和后續(xù)感 染，是非常重要的。正常菌群的大多數(shù)細(xì)菌，是由α-血溶鏈球菌(alpha haemo lyticstreptococci,AHS)組成。已經(jīng)顯示，為了抑制鼻竇炎和中耳炎致病菌，AHS利用的最 重要機(jī)制之一是，產(chǎn)生相當(dāng)量的過氧化氫，H2O2[1]。過氧化氫也是鼻咽粘膜非特異性防御體系的成員之一、乳過氧化物酶(LPO)的底 物。乳過氧化物酶依靠過氧化氫產(chǎn)生亞(hypo)硫氰酸酯，0SCN-，一種更加有效的抗菌物 質(zhì)。包含AHS的正常細(xì)菌菌群和人體粘膜，對過氧化氫和亞硫氰酸酯都有天然保護(hù)[2]。先前已經(jīng)公開了產(chǎn)氫酶在油膏中應(yīng)用，用于皮膚周圍和鼻孔以治療葡萄球菌，本 文則是針對皮膚菌群的治療，一個包含過氧化氫的油膏Microcid 的平行方案。EP 1 490 096公開了產(chǎn)生過氧化氫的鼻噴劑在治療中耳炎中的應(yīng)用，優(yōu)選用于治 療兒童。然而，雖然存在多種可望治療中耳炎的抗生素，但其沒有顯示出可以積極治療鼻病 毒所引起的感冒。發(fā)明概述本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以使用產(chǎn)生過氧化氫的酶，以使引發(fā)感冒的鼻病毒失活。本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及治療和/或預(yù)防鼻病毒所引發(fā)的疾病的方法，其中有 需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進(jìn)行治療。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶，木糖醇氧 化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶是與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖 氧化酶。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，疾病是感冒。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶在Ringer' s溶液中制備。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述藥物是水溶性的。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述藥物被制成鼻噴劑。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述藥物被制成鼻滴劑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，將酶底物加至所述藥物中。發(fā)明詳述鼻病毒(RV)是引起感冒的最普通的媒介[3]。而且，感冒通常發(fā)生在兒童的中耳 炎之前。RV不是全身性的感染，而是位于鼻腔和鼻咽[4]。已知過氧化氫能使RV失活[5]， 但是，基于下列多種原因，不可能制備為了失活RV感染而包含過氧化氫的鼻噴劑a.噴劑在鼻的散布不能涉及到大多數(shù)病毒顆粒所處的鼻腔的后部[6]。b.粘膜細(xì)胞中豐富的過氧化氫酶，會在過氧化氫到達(dá)鼻后部區(qū)域很早之前，就會 將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣。
c.足量的過氧化氫濃度肯定是高的初始濃度，因此將會相當(dāng)刺激鼻粘膜[7]。除了針對例如流鼻涕有癥狀的減輕之外，目前還沒有針對感冒發(fā)作有文獻(xiàn)證明效 果的藥物。本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以利用產(chǎn)生過氧化氫的酶，以持續(xù)失活鼻病毒。已顯示，溫 育僅30分鐘，可足以失活相當(dāng)量(> IOOTCID5ci)的接種在人氣管細(xì)胞中的鼻病毒。TCID5tl 定義為在至少50%的接種管中顯示出細(xì)胞病變效應(yīng)(=感染)需要的病毒濃度。這表明其 可以治療鼻病毒感染位于鼻腔的后部的感冒。因此，過去不可能預(yù)見產(chǎn)生過氧化氫的酶，例 如G0，將會具有下列特性1.在30分鐘內(nèi)持續(xù)失活鼻病毒。2.可預(yù)防細(xì)胞的進(jìn)一步感染，即使在開始接種后超過兩天時進(jìn)行GO的加入，這意 味著其不僅可以用于預(yù)防感冒，而且可以用于治療癥狀開始之后的感染。3.可在鼻咽維持足量的過氧化氫濃度一段時間，以失活粘膜中的所有病毒場所。 只有那樣，感冒癥狀會消失。驚奇地是，如我們的實(shí)驗(yàn)所示，包含GO和葡萄糖的鼻噴劑滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)。葡糖氧化酶(GO)是產(chǎn)生過氧化氫的酶，其對人類使用具有良好耐受性。它是蜂蜜 的天然成分[8]，并已經(jīng)作為抗菌防腐劑使用了許多年。GO的產(chǎn)氫效應(yīng)，也已經(jīng)在各種漱口 產(chǎn)品(Oral Balance )和牙膏(Zendium )中，用作抗菌添加劑。淀粉葡糖苷酶(AGO)是從淀粉生產(chǎn)葡萄糖的酶，它在溫度50-60°C有其最佳效果。 GO和AGO有時組合使用，以阻止GO在低溫下激活。當(dāng)溶液達(dá)到體溫時，AGO將開始釋放葡 萄糖，同時GO產(chǎn)生過氧化氫。否則，必須使用兩腔室的系統(tǒng)，以避免酶(GO)與底物(葡萄 糖)的混合。鼻用的合適底物，例如可以是木糖醇(其本身有抗菌效應(yīng))，甘露醇(對某些中 耳炎病原體有粘附效應(yīng))，乳酸(天生存在的物質(zhì))，半乳糖，甘油(對鼻粘膜有益處)和葡 萄糖。這意味著下列產(chǎn)生過氧化氫的酶，適合在抗鼻病毒的鼻噴劑中用作藥物葡糖氧化 酶，木糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶。根據(jù)我們的試 驗(yàn)室研究，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶，對人肺成纖維細(xì)胞(WI 38)是非常溫和的。在另一實(shí)施方式中，產(chǎn)生過氧化氫的酶是與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧化酶。臨床研究顯示，在鼻粘膜的粘膜纖毛系統(tǒng)中，Ringer' s溶液比生理鹽溶液有更 有益的效果[9]。這可能顯示，Ringer' s溶液是鼻腔藥物制劑的優(yōu)選載體溶液。本發(fā)明現(xiàn)在將更緊密聯(lián)系實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行描述。下列說明的目的是表明由酶產(chǎn)生的 抑制性物質(zhì)——過氧化氫，可以失活引起感冒的鼻病毒。鼻病毒(屬于鼻病毒屬的病毒) 是感冒的起因媒介物。先前的研究顯示，有良好抑制活性的AHS可產(chǎn)生對應(yīng)過氧化氫濃度約10mM(= 0. 03% )水平的過氧化氫。產(chǎn)生過氧化氫濃度約0. 05%的葡糖氧化酶濃度，應(yīng)該因此足以 模擬具有極好抑制活性的體內(nèi)正常細(xì)菌菌群的效果。下列試驗(yàn)顯示，低于20U/ml的GO濃 度對鼻病毒感染有作用，這相當(dāng)于高于IOmM的過氧化氫濃度。實(shí)施例1和2中記載的實(shí)驗(yàn)顯示，20U/ml的葡糖氧化酶濃度足以在WI 38細(xì)胞中， 不可逆地失活鼻病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。該失活是在低于30分鐘的溫育時間內(nèi)完成的，這樣 在葡糖氧化酶經(jīng)過鼻和鼻咽期間、在其被咽下之前，將足以失活鼻病毒[10]。在第二個實(shí)施例中，即使葡糖氧化酶加入的時間晚于開始溫育之后2天，也可以預(yù)防鼻病毒進(jìn)一步的細(xì) 胞感染，這可能暗示葡糖氧化酶鼻噴劑，即使在癥狀開始之后也可能具有感冒治療效應(yīng)。第三個實(shí)施例表明，感冒癥狀的顯著減輕，在治療12小時后就已經(jīng)取得。本發(fā)明 人在最近三年在感冒期間使用鼻噴劑，使用方案幾乎通常相同在開始的12小時每隔2小 時，高頻率使用GO鼻噴劑之后，以低頻率使用(在接著的2-3天，每天2-4次)，感冒癥狀在 治療開始之后的12-24小時內(nèi)消失。其他志愿者也報道噴劑的相同效果。這些試驗(yàn)性研究 顯示，GO以足夠的量長時間的存在，以失活位于鼻和鼻咽的RV。過氧化氫酶將過氧化氫迅速轉(zhuǎn)化為氧和水，因此用包含過氧化氫的鼻噴劑來起效 是不可行的，特別是鼻病毒通常位于鼻咽的腺體[5]。過氧化氫酶是催化H2O2轉(zhuǎn)化成O2和 H2O的特異性酶。該反應(yīng)迅速進(jìn)行。將來源于人紅細(xì)胞的純化過氧化氫酶(> 30000U/mg)， 用于本實(shí)驗(yàn)。在模擬感冒的病毒試驗(yàn)中，來自ATCC的兩種標(biāo)準(zhǔn)分離物被使用，即ATCC1117(= 鼻病毒7)和ATCC 1118(=鼻病毒8)。鼻病毒試驗(yàn)中所用的細(xì)胞培養(yǎng)物，為來自于人胎兒 肺成纖維細(xì)胞的推薦WI 38細(xì)胞系，其與鼻病毒一起溫育時，其具有明顯的細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。在用包含葡糖氧化酶的鼻噴劑進(jìn)行的臨床研究中，GO在Ringer' s溶液中以 100U/ml濃度，與于等滲溶液中含有5% β-D葡萄糖的葡萄糖噴劑，一起使用。噴劑每次噴 射施放0. 1ml，在本試驗(yàn)中，從各瓶中的各2次噴射作為一個劑量(1瓶G0，1瓶葡萄糖)。臨床試驗(yàn)性研究提示，與包含5%葡萄糖溶液的鼻噴劑一起使用的、包含100U葡 糖氧化酶/ml的鼻噴劑，被良好耐受，而且顯示可縮短感冒發(fā)作的持續(xù)時間。GO鼻噴劑的結(jié)果迄今為止是非常有前景的，而且本發(fā)明人已經(jīng)得到了倫理委員會 和瑞典醫(yī)藥產(chǎn)品機(jī)構(gòu)的許可，將開始進(jìn)行隨機(jī)、安慰劑對照、雙盲試驗(yàn)，以研究鼻噴劑縮短 感冒發(fā)作的可能性。
實(shí)施例實(shí)施例1下列實(shí)施例的目的是，顯示產(chǎn)生過氧化氫的酶——葡糖氧化酶，對引起感冒的鼻 病毒的效果。實(shí)驗(yàn)1病毒鼻病毒7，購自ATCC (VR-1117)，其用于代表鼻病毒群。在本試驗(yàn)中，使用10_2 和10_3的稀釋液。當(dāng)與WI 38—起試驗(yàn)時，該濃度應(yīng)與IOOTCID5ci相聯(lián)系，并且在以前的稀 釋系列中，可產(chǎn)生出清晰、清楚的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。將0.3ml各稀釋液加入至瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)將人肺細(xì)胞成纖維細(xì)胞(WI 38，ATCC-CCL-75)，用于病變效應(yīng)檢測。 10-倍系列的稀釋液，從濃縮的病毒懸液制備。0. ImlliT4-IO-5稀釋液，足以在2ml孔中5天 之內(nèi)，產(chǎn)生可見的細(xì)胞病變效應(yīng)。10_3或更高的稀釋液，足以在接種5天后，破壞大多數(shù)的 細(xì)胞。將細(xì)胞首先培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI中，直到孔底部看到鋪平層。接著，將 培養(yǎng)基換為含有2%胎牛血清的RPMI，在試驗(yàn)期間保存使用。將細(xì)胞在37°C、富CO2空氣中 溫育。在試驗(yàn)期間，使用細(xì)胞培養(yǎng)物的第17-18代。過氧化氫酶來自Sigma-Aldrich 。100000U/ml溶液制備自106U/ml的原溶液。
5將0.01ml加至瓶中，可在瓶中獲得1000U/ml。H2O2 將20%的溶液稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS)，至0. 5%和0. 05%溶液。將 0，Iml加至瓶中，即在瓶中為0. 05%或0. 005% ο含有2. 5%葡萄糖的Rehydrex 每瓶使用0. 6ml作為葡糖氧化酶的底物。葡糖氧化酶(GO)來自Sigma-Aldrich ( )。200U/ml和600U/ml的溶液制備自 6000U/ml的原溶液。將0. Iml各稀釋液加至瓶中，可在瓶中獲得20U/ml或60U/ml葡糖氧化酶。為了評價過氧化氫的作用是否是對病毒本身的直接作用或者細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，在病 毒被轉(zhuǎn)移至包含細(xì)胞的孔之前，我們將其與過氧化氫預(yù)先溫育。WI 38細(xì)胞也對過氧化氫敏 感，因此在接種至孔之前，有必要在其中添加過氧化氫酶。而且，通過添加過氧化氫酶失活 RV 7，顯示出該失活的速率。該設(shè)計(jì)也可揭示，抑制效應(yīng)僅僅是病毒抑制效應(yīng)，還是它能夠 不可逆地破壞病毒體。表1列出了 10瓶(Eppendorf)的各瓶內(nèi)含物質(zhì)。將各瓶溫育在加熱器中，保持穩(wěn) 定的37°C溫度。在溫育15，30和60min之后，加入1000U過氧化氫酶。將各瓶2x50 μ 1轉(zhuǎn) 移至雙份細(xì)胞孔(96-孔板)。在對照細(xì)胞孔中，我們使用了(雙份)細(xì)胞+RPMI，細(xì)胞+過 氧化氫酶，細(xì)胞+葡糖氧化酶，細(xì)胞+0. 05 % H2O2，細(xì)胞+rehydrex，過氧化氫酶+RV7。將細(xì) 胞每天檢測，持續(xù)5天，最終溫育到7天之后。表1.各瓶內(nèi)含物質(zhì)
權(quán)利要求
治療和/或預(yù)防鼻病毒所引起的疾病的方法，其中將有需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進(jìn)行治療。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶木糖醇氧化 酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于產(chǎn)生過氧化氫的酶為與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧 化酶。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述疾病是感冒。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其特征在于將產(chǎn)生過氧化氫的酶在Ringer's溶液中 制備。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述藥物是水溶性的。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述藥物被制成鼻噴劑。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述藥物被制成鼻滴劑。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于將酶的底物加至藥物中。
10.產(chǎn)生過氧化氫的酶在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的 方法。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶，木糖醇氧化酶， 甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
12.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶為與淀粉葡糖苷酶組合的葡糖氧化酶。
13.用于權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)方法的產(chǎn)生過氧化氫的酶。
14.權(quán)利要求13的產(chǎn)生過氧化氫的酶，其中產(chǎn)生過氧化氫的酶選自由葡糖氧化酶木 糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防鼻病毒引起的感冒的方法，其中將有需要的患者用包含產(chǎn)生過氧化氫的酶的藥物進(jìn)行治療。
文檔編號A61K38/44GK101977625SQ200980110037
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者克里斯特·坦諾 申請人:克里斯特·坦諾