專利名稱：用于受試者中活組織的增加和再生的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合用于受試者中活組織的增加(augmentation)和再生的組合物和 方法。
背景技術(shù)：
使用細(xì)胞移植的組織工程方法是已知，并且例如可牽涉例如開放性關(guān)節(jié)手術(shù)(例 如，開放性膝手術(shù))，在關(guān)節(jié)手術(shù)的情況下，涉及較長(zhǎng)時(shí)期的相對(duì)殘疾以使患者復(fù)原從而確 保獲得最佳結(jié)果。此類方法非常昂貴，并且需要多方面的醫(yī)療方法例如康復(fù)和物理療法。使用不同形式的支架技術(shù)的方法(其中將支架(具有或不具有在支架中生長(zhǎng)的細(xì) 胞)插入缺損)在進(jìn)行完全由關(guān)節(jié)鏡檢查指導(dǎo)的細(xì)胞移植過(guò)程中遭遇到困難。關(guān)節(jié)鏡下自體細(xì)胞植入(Arthroscopic Autologous Celllmplantation，稱為使 用小手術(shù)干預(yù)的AACI或ACI)是治療軟骨或骨缺損的外科手術(shù)，通過(guò)該外科手術(shù)將支架插 入缺損處，同時(shí)相伴地使用針例如“鈍”針或?qū)Ч軐⒓?xì)胞懸浮液或細(xì)胞混合物與前體固定劑 (precursor fixative) 一起施加入所述缺損處。通過(guò)關(guān)節(jié)鏡顯現(xiàn)和指導(dǎo)該植入步驟。WO 2004/110512公開了可用于治療哺乳動(dòng)物中軟骨或骨缺損的內(nèi)窺鏡法，其包括 確定缺損位置和將軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞施加入軟骨或骨缺損。將細(xì)胞 與可固化支持材料例如可溶性凝血酶和纖維蛋白原或膠原混合物一起使用。預(yù)期對(duì)于凸關(guān) 節(jié)或凹關(guān)節(jié)中的手術(shù)，可將多孔膜置于缺損部位，但一旦血纖蛋白/細(xì)胞混合物在合適的 位置凝固時(shí)即其取出。WO 2004/110512中公開的方法使得組織能夠在關(guān)節(jié)鏡下修復(fù)，即不 需要開關(guān)節(jié)手術(shù)(例如開膝手術(shù))。支架是可向其中摻入細(xì)胞的多孔結(jié)構(gòu)。它們可由生物相容性、生物可降解性的材 料組成并且可被加入至組織以在形成功能性組織的過(guò)程中指導(dǎo)細(xì)胞的組織、生長(zhǎng)和分化。 使用的材料可以是天然或合成來(lái)源的。WO 2007/028169涉及用于通過(guò)細(xì)胞移植進(jìn)行的組織工程的方法，其包括在缺損部 位原位使用支架，其中只在將支架插入在組織缺損部位后才將治療性細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈恢霉?定至支架內(nèi)。WO 2007/101443提供了用于本發(fā)明部分的方法和試劑盒的優(yōu)選支架材料。微粒已用作用于組織增加和支持的可注射支架。WO 96/02209報(bào)導(dǎo)了用于與潤(rùn)滑液或凝膠結(jié)合以用于增加尿道括約肌的可注射生 物相容性光滑表面化碳包被的金屬顆粒(大小100-1000微米)。Xu 和 Reid 等人(Annals New York Academy of Sciences 第 944 卷144_159， 2001))公開了使用直徑20至40微米和100至300微米的多孔生物相容性和生物可降解 的(PLGA)微載體珠粒(球)附著肝細(xì)胞瘤細(xì)胞以在培養(yǎng)物中形成三維細(xì)胞可降解的微載 體集落。Kang 等人(J. Biomater. Sci. Polymer Edn，第 17 卷，No 8，pp925_939 (2006)公開 了 PLGA微球體的制造和其作為用于兔子膝部軟骨再生的可注射載體的用途。將珠粒過(guò)濾 至30至80微米珠粒的范圍內(nèi)。棄去更小的珠粒，因?yàn)樗鼈兛稍谥踩牒筮w移至遠(yuǎn)處的器官。
本發(fā)明提供了用于受試者中活組織的增加和再生的新型和改進(jìn)型組合物。附圖概述

圖1 實(shí)驗(yàn)1的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖2 實(shí)驗(yàn)2的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖3 實(shí)驗(yàn)3的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖4 實(shí)驗(yàn)4的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖5 實(shí)驗(yàn)5的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖6 實(shí)驗(yàn)6的光學(xué)顯微鏡檢查、SEM和粒度分布。圖7a 來(lái)自實(shí)驗(yàn)2的顆粒。圖7b 來(lái)自實(shí)驗(yàn)3的顆粒。圖8-1 與顆粒一起培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的中性紅染色_活細(xì)胞被染成紅色。8-Ia :1 周-IOx ;8_Ib :1 周-40x ；8-Ic 2 周-IOx ；8_Id 2 周 _40x ；8-Ie :4 周-IOx ;8_If :4 周-40x。圖8-II 與顆粒一起培養(yǎng)的肌細(xì)胞的中性紅染色_活細(xì)胞被染成紅色。8-II a :4 周-IOx ；8_IIb 4 周 _40x。圖8-III:無(wú)細(xì)胞的顆粒8-IIIa 第 1 天-IOx ；S-IIIb 第 7 天-IOx ；8-IIIc 第 2 周-IOx ；S-IIIcI 第 2 周 _40x ；8-IIIe 第 4 周-IOx ；S-IIIf 第 4 周 _40x。圖9 實(shí)驗(yàn)5-降解樣品的分子量。圖10 實(shí)驗(yàn)5-降解樣品的標(biāo)準(zhǔn)化面積。圖11-15 實(shí)施例7中描述的實(shí)驗(yàn)7-11的光學(xué)顯微鏡檢查(A)，SEM(B)和粒度分 布(C)。圖16-22 實(shí)施例8中描述的實(shí)驗(yàn)12_18的光學(xué)顯微鏡檢查㈧，SEM⑶和粒度分 布(C)。圖23 在培養(yǎng)14天后附著至MPEG-PLGA微球體的hAC (紅色)。圖24 在培養(yǎng)14天后MPEG-PLGA微球體上由hAC進(jìn)行的ECM合成(藍(lán)色)。發(fā)明_既述本發(fā)明的發(fā)明者已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)包含生物可降解聚合物的微球體和一個(gè)或多 個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體的組合物提供了特別合適的用于受試者中活組織的增加和再生的組 合物。本發(fā)明提供了用于受試者中活組織的增加和再生的組合物，其包含a.生物可降解聚合物的微粒群體，b. 一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體和任選地，生物相容性粘著劑。本發(fā)明提供了用于制備微粒，優(yōu)選具有規(guī)則微粒結(jié)構(gòu)的微粒(例如微球體)的群 體的方法，所述方法包括a.在溶劑中制備聚合物的溶液，
b.將步驟a)中形成的溶液與非溶劑混合，c.在低于室溫(優(yōu)選低于0°C )下將步驟b)中形成的溶液霧化入非溶劑中以形 成微粒，d.收集形成的顆粒，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾收集，e.任選地干燥顆粒，優(yōu)選通過(guò)應(yīng)用真空或通過(guò)冷凍干燥來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明提供了制備微粒，特別地具有不規(guī)則微粒結(jié)構(gòu)的微粒的群體的方法，所述 方法包括a.在溶劑中制備聚合物的溶液，b.將步驟a)中形成的溶液與非溶劑混合，c.冷凍干燥步驟b)中形成的混合溶液，d.收集形成的顆粒，e.任選地對(duì)顆粒進(jìn)行大小分級(jí)，優(yōu)選通過(guò)篩分進(jìn)行。本發(fā)明提供了制備微粒(優(yōu)選具有不規(guī)則結(jié)構(gòu))的群體的方法，所述方法包括a.在溶劑中制備聚合物的溶液，b.在低于室溫(優(yōu)選低于0°C )下將步驟a)中形成的溶液，例如通過(guò)超聲霧化， 霧化入非溶劑中以形成微粒，c.收集所形成的顆粒，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾收集d.任選干燥顆粒，優(yōu)選通過(guò)使用真空或通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行。本發(fā)明提供了制備微粒的群體的方法，所述方法包括a.在可冷凍干燥的溶劑中制備聚合物的溶液；b.將步驟a)中形成的溶液霧化(例如通過(guò)超聲霧化)入冷室，從而將液滴冷凍成 顆粒；c.收集形成的顆粒，d.通過(guò)冷凍干燥干燥顆粒。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法制備的微粒群體。本發(fā)明提供了 MPEG-PLGA的微粒。本發(fā)明提供了 MPEG-PLGA的微粒群體。本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的微粒群體的組合物，其還包含生物相容性粘著 劑，和/或如本文中提及的另外的或其他一種或多種化合物。本發(fā)明提供了用于制備組合物的方法，其中將一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的群體附 著至生物可降解聚合物的微粒群體，所述方法包括以下步驟a)在體外將如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中定義的一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體與 如本文中提及的生物可降解聚合物的微粒群體接觸；和b)在體外將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞與所述生物可降解聚合物的微粒群體一起培養(yǎng)一 段時(shí)間，以使哺乳動(dòng)物附著至微粒。本發(fā)明提供了試劑盒，其包含a.裝有生物可降解聚合物的微粒群體的區(qū)室，和；b.裝有一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體的區(qū)室，和任選地；c.可以與a.中提及的區(qū)室相同或不同的區(qū)室，其包含生物相容性粘著劑，和任選地；d.具有所述生物相容性粘著劑的轉(zhuǎn)換劑的區(qū)室，其中a.中提及的區(qū)室與b.中提及的區(qū)室是隔開的。本發(fā)明提供了用于患者中活組織的再生或增加的方法，所述方法包括制備根據(jù)本 發(fā)明的組合物和將所述組合物施用入待再生或增加的活組織，例如前述實(shí)施方案的任一個(gè) 中提及的活組織。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用作藥劑的根據(jù)本發(fā)明的微 粒、微粒群體或組合物。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于治療與生殖泌尿系統(tǒng) (uro-gynaecological)病癥相關(guān)疾病(例如尿失禁、盆腔臟器脫垂和肛門失禁)。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于治療軟骨缺損。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于治療骨缺損、骨疾病或 用于骨再生。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于制備用于治療與泌尿生 殖系統(tǒng)病癥相關(guān)的疾病(例如尿失禁、盆腔臟器脫垂和肛門失禁)的藥劑的用途。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于制備用于治療軟骨缺損 的藥劑的用途。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的微粒、微粒群體或組合物用于制備用于治療骨缺損、 骨疾病或用于骨再生的藥劑的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒的生物可降解聚合物的微粒。 所述微粒包含生物可降解聚合物，例如本文中描述的生物可降解聚合物，或其組成。在廣泛的方面，本發(fā)明的發(fā)明者預(yù)期所述微粒與根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞一起或根據(jù)本 發(fā)明的組合物可用于增強(qiáng)身體中任何部位的衰弱的組織。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及微粒與能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞一起的樣品。將該樣品注射入對(duì)使 用增加性材料的治療有反應(yīng)的區(qū)域或其周圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，將樣品用于治療尿失禁 或膀胱輸尿管反流(vesicourethral reflux)、泌尿系統(tǒng)疾病，其中當(dāng)對(duì)尿流的抗力已降至 抗力不能再抗住腹內(nèi)壓的點(diǎn)時(shí)發(fā)生尿失禁。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將樣品用于治療肛門括 約肌失禁，微?？稍龃罄s肌，從而改善括約肌功能。可將樣品注射入肛管的組織，其中選 擇的部位可以是例如內(nèi)肛門或外肛門括約肌組織。所造成的組織的膨脹或增大將限制括約 肌或肛道(anal passage)的大小，從而幫助克服大便失禁。申請(qǐng)者還相信本樣品可用于胃 反流應(yīng)用?？蓪⒔M合物注射入上胃腸道的組織，其中選擇的部位可以是例如向食道內(nèi)開放的 胃的賁門口。所造成的組織的膨脹或增大將限制通道的大小，從而幫助克服胃液反流入食 道。對(duì)于所有此類實(shí)例共同的是通過(guò)膨脹效果獲得樣品的瞬即效應(yīng)的事實(shí)。然而，隨著細(xì) 胞生長(zhǎng)和微粒降解，未形成結(jié)締組織，但形成將活躍地參與正常閉合功能的再生的肌肉、軟 骨或其他組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及微粒與能夠再生骨組織的細(xì)胞例如成骨細(xì)胞和 /或間充質(zhì)干細(xì)胞(其具在體內(nèi)有分化成成熟成骨細(xì)胞的能力或可在體外經(jīng)誘導(dǎo)形成成熟成骨細(xì)胞)一起的樣品。細(xì)胞可以是自體、同種異體或異種來(lái)源的，包含此類細(xì)胞和微粒群 體的組合物可用于骨缺損的修復(fù)和用于骨再生。因此可將組合物用于人體的不同骨例如股 骨、脛骨、髖骨、脊椎骨、肱骨、臂骨和尺骨的骨折。此外，其可用于具有萎縮性上頌骨或下頌 骨的患者中骨質(zhì)增加的手術(shù)中。該組合物的可注射特征對(duì)于該臨床適應(yīng)癥是特別重要的。 應(yīng)當(dāng)指出，為了用于治療骨缺損或用于骨再生，使用包含羥基磷灰石和/或磷酸鈣的根據(jù) 本發(fā)明的微粒和/或組合物將是有利的，所述組合物還包含羥基磷灰石和/或磷酸鈣(例 如作為可與本發(fā)明的微粒相獨(dú)立(但在組合物內(nèi))的顆粒加入的)。此外，為了用于骨缺損 修復(fù)或骨再生，本發(fā)明的組合物還可包含(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)BMP，此類蛋白是對(duì)成骨細(xì)胞 ^'i'J^ii^^i^^EM^FSgifi (osteogenic differentiated mesenchymal stemcell)胃* 非常強(qiáng)的效應(yīng)的蛋白質(zhì)。微粒還可原位提供柔韌的支架，從而提供可能來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體的細(xì)胞和/ 或來(lái)自圍繞缺損周圍的組織的細(xì)胞可在其上生長(zhǎng)和形成新組織_從而再生活組織的結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)微粒，如本文中所使用的，是指具有1微米至1000微米大小的顆粒。應(yīng)理解 大小在這方面是指顆粒的直徑或平均直徑。群體中微粒可以例如采取薄片、絲、粉末、纖維、桿、球體或上述形式的任何中間體 的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成群體的微粒在形狀上是不規(guī)則的。在一個(gè)實(shí)施方案中，群體中的微粒的表面積/體積比大于相同平均直徑的形狀呈 完全球形的微球體的表面積/體積比，例如其表面積/體積比是相同平均直徑的形狀呈完 全球形的微球體的至少1. 25倍，例如1. 5倍，例如2倍，例如4倍，例如通過(guò)實(shí)施例1中描 述的Malvern顆粒分析儀測(cè)量的。在形狀上大體上非球形的或不規(guī)則的微粒的特征可能在于顯示增強(qiáng)的流動(dòng)粘性 (當(dāng)與球形或大體上球形的微球體的等同群體相比較時(shí))，這樣其在體內(nèi)可能特別有用，其 中期望插入的微粒能夠保持在插入的位置并且提供結(jié)構(gòu)支持和增加。還認(rèn)為這樣的微球體 在體內(nèi)形成在它們與缺損組織表面的相互作用上更穩(wěn)定(從而提供比等同的球形微粒更 高程度的機(jī)械強(qiáng)度)的基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，微粒在形狀上不是球形的或基本球形的。在一個(gè)實(shí)施方案中， 當(dāng)使用掃描電子顯微照片在IOOX的分辨率下分析時(shí)，微粒不具有光滑表面。這樣，在一些應(yīng)用中形狀不規(guī)則和/或具有不規(guī)則表面形態(tài)學(xué)的微粒例如薄片被 認(rèn)為是有利的。此類顆粒彼此相互作用以提供其中細(xì)胞可在機(jī)體中生長(zhǎng)的柔韌但剛性的基 質(zhì)。此類微粒被認(rèn)為在用于軟骨缺損的修復(fù)中是特別有用的，但其還可用于其他組織例如 平滑肌或骨的修復(fù)。不規(guī)則微粒的其他形狀包括薄片、絲、纖維、桿、球體或上述形式的任何中間體的 任何形式。如實(shí)施例和圖1至6中顯示的，可能通過(guò)使用生物可降解的聚合物的超聲處理和 通過(guò)改變使用的溶劑和條件制備不規(guī)則形狀的固體，可形成不同平均直徑和形狀復(fù)雜性的 微粒。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，微粒可以為球形或大體上球形或橢圓形-通常此類微 粒具有規(guī)則形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類微粒被認(rèn)為可用于治療肌肉缺損，例如平滑肌缺
9損例如括約肌失禁。要認(rèn)識(shí)到，盡管球形的特征在于其三維表面上所有點(diǎn)都與一個(gè)固定點(diǎn)等距離(即 完全球形)，但在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)球形可包括與球體相似的形狀，因?yàn)樗鼈儾痪哂腥?何確定的角或邊，但可以不是完全輻射對(duì)稱的，從而可包括具有卵圓形或橢圓形形狀的固 體形狀-此類形狀被認(rèn)為包括在術(shù)語(yǔ)大體上球形中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物和治療方法的背景中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞 或至少一部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞附著至微粒支架上或甚至在微粒支架內(nèi)。這提供了在插入患者 后細(xì)胞與支架錯(cuò)綜復(fù)雜地結(jié)合在一起的優(yōu)點(diǎn)。在使用前，通常對(duì)生物可降解聚合物的微粒進(jìn)行滅菌，以及除了加入哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的群體外，在滅菌(無(wú)菌)條件下進(jìn)行本發(fā)明的組合物的制備。這樣可以制備出可直接 用于醫(yī)療的組合物。本發(fā)明提供了制備包含支架(例如MPEG-PLGA)或由其組成的微粒的方法?？扇鐚?shí)施例中所述制備MPEG-PLGA的微粒。一個(gè)優(yōu)選方法包括在合適的溶劑(通 常是有機(jī)溶劑)中制備聚合物的溶液。使該聚合物溶液霧化以形成微粒的懸浮液。任選地 過(guò)濾微粒，然后干燥(例如在真空下)。應(yīng)當(dāng)指出，本文中用于制備微粒的方法不必局限于生物可降解聚合物，而是可用 于其他聚合物或聚合物系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微粒包含選自下述的聚合物或其由組成組成a)乙交 酯、L-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋丙交酯、e-己內(nèi)酯、1，4- 二噁烷-2-酮、d_戊內(nèi)酯、β - 丁 內(nèi)酯、g_ 丁內(nèi)酯、e-癸內(nèi)酯、1，4_ 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、1，5_ 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、1，5， 8，12-四氧雜環(huán)十四烷-7-14- 二酮、1，5_ 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮，6，6_ 二甲基_1，4_ 二噁 烷-2-酮和三亞甲基碳酸酯的均聚物或共聚物；b)單或雙功能聚乙二醇與如上a)所述聚 合物的嵌段共聚物；c)單或雙功能聚亞烷基二醇與如上a)所述聚合物的嵌段共聚物；d) 上述聚合物的混合物；和e)聚酸酐和聚原酸酯。聚合物的微粒還可通過(guò)將非溶劑加入聚合物的溶液中(即在其中不溶的(或基本 上不溶的)的聚合物)直至聚合物顆粒從溶液中析出(即加入非溶劑直至系統(tǒng)達(dá)到非溶劑 邊界)來(lái)形成。在這樣的接近非溶劑邊界的系統(tǒng)中進(jìn)行的顆粒的制備將產(chǎn)生顆粒。關(guān)于術(shù)語(yǔ)‘基本上不溶的’，應(yīng)指出在一些情況下，聚合物的非常微小程度的可溶 性可以是可測(cè)量的，但可溶性的水平不足以在本發(fā)明的方法中阻止微粒的形成。如可在圖1至6中看到的，通過(guò)改變有機(jī)溶劑，可制備具有不同平均大小范圍和可 在大體上球形變化到不規(guī)則形狀之間變化的形狀的不同微粒形式。更具體地，通過(guò)向聚合 物溶液中加入非溶劑，你將最終達(dá)到溶液的溶劑轉(zhuǎn)換成非溶劑以及聚合物開始沉淀的點(diǎn)。 聚合物的良好與較差溶劑之間的邊界稱為Θ-溶劑。在本文中的實(shí)施例中，可看到在與非 溶劑邊界接近或具有一定距離的溶劑系統(tǒng)(丙酮/乙醇)中的聚合物溶液產(chǎn)生球形顆粒。 相反地，良好溶劑中的溶液產(chǎn)生更不規(guī)則形狀的顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的有機(jī)溶劑可選自丙酮和碳酸二甲酯。用于上述聚酯的合適的有機(jī)溶劑在一些實(shí)施方案中可以是氯仿、二氯甲烷、丙酮、 丁酮、四氫呋喃、二噁烷、碳酸二甲酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶劑可選自氯仿、二噁烷、丙酮、乙酸甲酯等。
非溶劑在一個(gè)實(shí)施方案中可選自低級(jí)醇，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁 醇、2-丁醇、異丁醇和叔丁醇、二乙醚、二異丙醚、己烷、烷烴類、環(huán)烷烴類和水。在溶液中制備的聚合物的濃度可以是例如1至20%，例如2至10% (w/v)。因此我們認(rèn)為接近非溶劑邊界的溶劑系統(tǒng)將在相似的條件下產(chǎn)生球形顆粒。用于制備微粒的一種備選方法是通過(guò)冷凍干燥支架的冷凍干燥被認(rèn)為是制備不 規(guī)則形狀微粒例如薄片的一種有利方法。雖然通過(guò)冷凍干燥，然后機(jī)械破碎所制備的固體 聚合物可以制備微粒，但如實(shí)施例中所示，我們提供了一種方法，借助該方法，有可能冷凍 干燥聚合物溶液而形成粉末制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，粉劑以薄片的形式存在。為使冷凍干 燥實(shí)際可行，需要在其凝固點(diǎn)以下具有可觀蒸氣壓的溶劑。較少的溶劑滿足這一標(biāo)準(zhǔn)_溶 劑可恰當(dāng)?shù)鼗谒鼈兊母呷刍瘻囟冗M(jìn)行選擇，例如1，4_ 二噁烷、碳酸二甲酯、苯、DMSO或1， 1，1，3，3，3_六氟-2-丙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于它們是聚酯的良好溶劑來(lái)選擇溶劑，其 實(shí)例有1，4_ 二噁烷或碳酸二甲酯。如實(shí)施例中舉例說(shuō)明的，冷凍干燥使它們貫穿整個(gè)顆粒 都是中空/多孔的。在已制備好微粒后，可任選地干燥它們，并且需要時(shí)，將它們進(jìn)行篩分以獲得具有 期望大小或大小范圍的顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，在干燥前通過(guò)濕法篩分篩選微粒。所描述的方法的一個(gè)特別有利方面是它們不依賴于水作為溶劑。對(duì)于大多數(shù)生物 可降解的支架而言，水解是降解過(guò)程(由于水的存在而催化的過(guò)程)的一部分。由于不使 用水，避免了這樣的過(guò)早降解。備選地，已鑒定了有用的揮發(fā)性溶劑。通過(guò)使用此類溶劑， 我們可在低溫下干燥顆粒，從而避免它們的熔化。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體”(其在本文中還可稱為“哺乳動(dòng)物細(xì)胞”或“細(xì)胞”)是 指獲自或來(lái)源于從哺乳動(dòng)物組織獲得的細(xì)胞的任何細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，“哺乳動(dòng) 物細(xì)胞群體”是指來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞克隆(從而在基因型和表型上相同)的細(xì)胞的群體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用多個(gè)類型的細(xì)胞，從而其可稱為一個(gè)或多個(gè)哺 乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞群體。優(yōu)選細(xì)胞是貼壁細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，按照下表使用多個(gè)類型的細(xì)胞
權(quán)利要求
1.一種組合物，其中包含生物可降解聚合物的多孔微粒的群體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中孔隙度是50至95%。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中微粒的大小是20-110μ m。
4.用于受試者中活組織的增加和再生的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其還包含一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體。
6.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其還包含生物相容性粘著劑。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中將一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體附著至所述生物可降解 聚合物的微粒群體。
8.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中微粒以生物可降解聚合物的微球體的形式存在。
9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中微粒以不規(guī)則形狀的形式例如生物可降解聚 合物的薄片形式存在。
10.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述生物可降解聚合物包含選自下述的聚 合物或由其組成a)乙交酯，例如L-丙交酯、DL-丙交酯、內(nèi)消旋丙交酯(聚丙交酯，PLA)、 e-己內(nèi)酯(聚己內(nèi)酯，PCL)、1，4_ 二噁烷-2-酮、d-戊內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、g_ 丁內(nèi)酯、e_癸 內(nèi)酯、1，4_ 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、1，5-二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、1，5，8，12_四氧雜環(huán)十四 烷-7-14- 二酮、1，5- 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮，6，6- 二甲基-1，4- 二噁烷-2-酮和三亞甲基碳 酸酯的均聚物或共聚物；b)單或雙功能聚乙二醇與上述a)的聚合物的嵌段共聚物；c)單 或雙功能聚亞烷基二醇與上述a)的聚合物的嵌段共聚物；d)上述聚合物的混合物；和e) 聚酸酐和聚原酸酯；例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、MPEG-PLGA (甲氧基聚乙 二醇)_聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的共聚物。
11.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中生物可降解的聚合物包含PLGA或 MPEG-PLGA或由其組成。
12.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述微粒通過(guò)冷凍干燥在溶液中包含生物 可降解的聚合物的溶液來(lái)制備。
13.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述微粒通過(guò)超聲霧化來(lái)制備。
14.權(quán)利要求5至13的任一項(xiàng)的組合物，其中所述細(xì)胞相對(duì)于受試者中所述活組織的 細(xì)胞在來(lái)源上是自體的、同源的(同種異體的)或異種的。
15.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中組合物中細(xì)胞的濃度是大約0.IxlO4個(gè)細(xì)胞 至大約IOxlO6個(gè)細(xì)胞/ml。
16.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其還包含促進(jìn)細(xì)胞附著和/或向內(nèi)生長(zhǎng)以使組 織再生至生物可降解聚合物的微粒的成分，例如選自下述的成分硫酸軟骨素、玻尿酸、透 明質(zhì)酸(HA)、硫酸肝素、硫酸類肝素、硫酸皮膚素、生長(zhǎng)因子、血纖蛋白、纖連蛋白、彈性蛋 白、膠原蛋白例如I型和/或II型膠原蛋白、明膠和聚集蛋白聚糖或任何其他合適的細(xì)胞 外基質(zhì)成分。
17.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其還在合成的生物可降解支架中包含化合物，其 中所述化合物是生長(zhǎng)因子，例如胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)，或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如 TGF- α或TGF- β或FGF例如FGF-I或FGF-2或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。
18.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中將透明質(zhì)酸和/或硫酸皮膚素?fù)饺肷锟山到饩酆衔锏奈⒘！?br> 19.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中至少一些微粒包含羥基磷灰石和/或磷酸鈣。
20.用于制備微粒，優(yōu)選具有規(guī)則微粒結(jié)構(gòu)的微粒例如微球體的群體的方法，所述方法 包括a)制備聚合物在溶劑中的溶液；b)將步驟a)中形成的溶液與非溶劑混合；c)在低于室溫(優(yōu)選低于0°C)下將步驟b)中形成的溶液霧化入非溶劑以形成微粒；d)收集形成的顆粒，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾收集；e.任選地干燥顆粒，優(yōu)選通過(guò)應(yīng)用真空或通過(guò)冷凍干燥來(lái)進(jìn)行。
21.用于制備微粒，優(yōu)選具有不規(guī)則微粒結(jié)構(gòu)的微粒的群體的方法，所述方法包括a)制備聚合物在溶劑中的溶液；b)將步驟a)中形成的溶液與非溶劑混合；c)冷凍干燥步驟b)中形成的混合的溶液；d)收集形成的顆粒；e)任選地對(duì)顆粒進(jìn)行大小分級(jí)分離，優(yōu)選通過(guò)篩分進(jìn)行。
22.權(quán)利要求21的方法，其中a)中的溶劑選自1，4_二噁烷、碳酸二甲酯或1，3_ 二氧 戊環(huán)。
23.用于制備微粒，優(yōu)選具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)的微粒的群體的方法，所述方法包括a)制備聚合物在溶劑中的溶液；b)在低于室溫(優(yōu)選低于0°C)下將步驟b)中形成的溶液，例如通過(guò)超聲霧化，霧化 入非溶劑以形成微粒；c)收集形成的顆粒，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行；d)任選地干燥顆粒，優(yōu)選通過(guò)使用真空或通過(guò)冷凍干燥來(lái)進(jìn)行。
24.用于制備微粒的群體的方法，所述方法包括a.制備聚合物在可被冷凍干燥的溶劑中的溶液；b.將步驟a)中形成的溶液，例如通過(guò)超聲霧化，霧化入冷室，從而將液滴冷凍成顆粒；c.收集形成的顆粒，d.通過(guò)冷凍干燥干燥顆粒。
25.權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)的方法，其中聚合物是生物可降解的聚合物。
26.權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中溶劑選自氯仿、1，4_二噁烷、丙酮、乙酸甲 酯等、丁酮、二氯甲烷和1，3_ 二氧戊環(huán)。
27.權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)的方法，其中非溶劑選自低級(jí)醇、二乙醚、二異丙醚、 己烷、烷烴類和環(huán)烷烴類。
28.由權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)的方法制備的微粒群體。
29.MPEG-PLGA的微粒的群體。
30.權(quán)利要求29的群體，其中顆粒具有50至95%的孔隙度。
31.權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)的群體，其中微粒的大小是20至110μ m。
32.—種試劑盒，其包含a)以形成液體的濃度存在的生物可降解聚合物的多孔微粒；b)用于放置細(xì)胞的裝置。
33.權(quán)利要求32的試劑盒，其中用于放置細(xì)胞的裝置是具有針的注射器。
34.權(quán)利要求32或33的試劑盒，其還以每50-100mg有1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的濃度包含細(xì)胞。
35.權(quán)利要求32至34中任一項(xiàng)的試劑盒，其用于肌肉的修復(fù)。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其用于括約肌的修復(fù)。
37.一種試劑盒，其包含a)以形成糊劑的濃度存在的生物可降解聚合物的多孔微粒；b)用于放置細(xì)胞的裝置；c)組織膠。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中用于放置細(xì)胞的裝置是無(wú)針但具有柔韌的出口的注射ο
39.權(quán)利要求37或38的試劑盒，其還以1百萬(wàn)個(gè)/cm2的濃度包含細(xì)胞。
40.權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的試劑盒，其用于軟骨修復(fù)。
41.用于患者中活組織的再生或增加的方法，所述方法包括制備前述權(quán)利要求中任一 項(xiàng)的組合物和將所述組合物施用入待再生或增加的活組織，例如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中 提及的活組織。
42.權(quán)利要求41的方法，其中通過(guò)注射將組合物施用給所述組織。
43.權(quán)利要求41或42中任一項(xiàng)的方法，其中所述活組織是肌肉組織，并且其中所述一 個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的群體包含成肌細(xì)胞或能夠分化成成肌細(xì)胞的干細(xì)胞的群體。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法是用于治療與生殖泌尿系統(tǒng)病癥相關(guān)的疾病， 例如尿失禁的方法，并且所述活組織是括約肌，例如尿道括約肌。
45.權(quán)利要求41或42中任一項(xiàng)的方法，其中所述活組織是軟骨組織，并且其中所述 一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的群體包含選自下述的細(xì)胞的群體軟骨細(xì)胞例如人關(guān)節(jié)軟骨細(xì) 胞、干細(xì)胞或能夠轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞的等同細(xì)胞例如間充質(zhì)干細(xì)胞。
46.權(quán)利要求41或42中任一項(xiàng)的方法，其中所述活組織是骨組織，并且其中所述一個(gè) 或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的群體包含成骨細(xì)胞或能夠分化成成骨細(xì)胞的干細(xì)胞例如間充質(zhì)干 細(xì)胞的群體。
47.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其用作藥劑。
48.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其用于治療與生殖泌尿系統(tǒng)病癥相關(guān)的疾病例 如尿失禁、盆腔臟器脫垂和肛門失禁。
49.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其用于治療與軟骨缺損相關(guān)的疾病。
50.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其用于治療與骨缺損或疾病相關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于受試者中活組織的增加和再生的組合物，其包含生物可降解的聚合物的多孔微粒的群體、一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體和任選地生物相容性粘著劑。
文檔編號(hào)A61K9/16GK102123745SQ200980110042
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者C·克勞森, H·埃弗蘭德, J·范格, M·R·加勒戈, P·薩繆爾森 申請(qǐng)人:科洛普拉斯特公司