專利名稱：含有與透明質(zhì)酸結(jié)合的抗腫瘤藥物的新藥物制劑在治療瘤形成中的治療性應(yīng)用的制作方法
含有與透明質(zhì)酸結(jié)合的抗腫瘤藥物的新藥物制劑在治療瘤
形成中的治療性應(yīng)用發(fā)明目的本發(fā)明描述了生物綴合物在腫瘤學(xué)領(lǐng)域用于治療原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移的新應(yīng)用，所 述生物綴合物是通過透明質(zhì)酸(HA)和化療產(chǎn)品之間的綴合得到的分化劑(在下文中用商 品名稱ONCOFID 表示)，其中，所述化療產(chǎn)品更具體地是伊立替康、多柔比星、紫杉 酚、順鉬和5-氟尿嘧啶(5-FU)。更具體地，在可溶于水的ONCOFID 的衍生物的藥物 制劑的作用機(jī)理、功效和抗性方面，描述了生物性能。更具體地，本發(fā)明涉及基于ONCOFID-S (HA-SN38綴合物)和 ONCOFID-D(HA-多柔比星綴合物)的制劑在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向未轉(zhuǎn)化表型分化中與參照 藥物伊立替康(或CPTll，它的活性形式用SN38表示)和多柔比星相比表現(xiàn)出來的令人 驚奇的生物學(xué)和藥理學(xué)效應(yīng)。 發(fā)明領(lǐng)域近年來，關(guān)于決定腫瘤的開始、發(fā)展、分散和植入及其轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程的逐漸 累積的知識(shí)，不僅為研究人員提供了研究、合成和/或測(cè)試新的化學(xué)分子作為新的抗腫 瘤劑的可能性，而且促進(jìn)了新療法的研究和完善，使得與抗腫瘤藥的毒性有關(guān)的問題得 到克服。實(shí)際上，具有抗腫瘤活性的許多藥物通常具有多個(gè)負(fù)面特征，例如_在水中的低溶解度，因?yàn)樵S多分子是疏水物質(zhì)，它們難以施用；-向腫瘤細(xì)胞的低選擇性，結(jié)果毒性指向非致癌的細(xì)胞；_在全身水平的多種不希望的效應(yīng)；-低血漿半衰期，結(jié)果必須重復(fù)給藥；-腫瘤對(duì)化療處理的抗性的誘導(dǎo)。除了在腫瘤治療中搜尋逐漸更有效的新的有效成分以外，科學(xué)領(lǐng)域平行地嘗試 開發(fā)已知其抑菌活性的極端分子，提高它們的性能，并嘗試減少如上所述的負(fù)面特征。減少抗腫瘤藥物的固有毒性的最廣泛使用的策略之一，與直接地且選擇性地把 有效成分導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞的可能性有關(guān)。通過抗腫瘤藥與具有主動(dòng)尋靶功能的基團(tuán)的化學(xué)綴合，提供了一種有前途的方 案，其通過與贅生細(xì)胞的受體部位的特異性相互作用，確保藥物在腫瘤組織中的高選擇 性。一個(gè)不同的方案是連接大分子(即聚合物)，其通過賦予高分子量，實(shí)現(xiàn)有效成分在 瘤形成中的更大積累，這是由于EPR效應(yīng)(增強(qiáng)的保留和滲透)，即與穿過有孔的脈管上 皮有關(guān)的積累，其供給被淋巴系統(tǒng)不適當(dāng)?shù)嘏懦龅哪[瘤(被動(dòng)尋靶)。由于多年來，化學(xué)地修飾在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中使用的許多抗腫瘤藥物，以得到前 藥，即無治療活性的衍生物，其僅在體內(nèi)變得有活性，這歸因于自發(fā)的水解過程和/或 酶促降解，它們導(dǎo)致有效成分的釋放，從而增加它的治療功效?；熕幵谘h(huán)系統(tǒng)中的溶解度，代表了它們的藥理學(xué)作用的基本狀況。實(shí)際 上，有些已經(jīng)證實(shí)在不同類型的腫瘤中非常有效的藥物，諸如，例如喜樹堿、紫杉酚和源自長(zhǎng)春花的生物堿，由于它們的高不溶性，具有靜脈內(nèi)(且，對(duì)于激素和抗_激素，以 及肌肉內(nèi))給藥的問題，這限制了它們的臨床應(yīng)用。鑒于上述原因，已經(jīng)合成了新的化療藥，它們通過經(jīng)典藥物和所謂的“治療聚 合物”之間的化學(xué)連接(直接地或借助間隔物間接地)而產(chǎn)生，這除了賦予有效成分重 要的物理化學(xué)特征(諸如更大的溶解度)以外，能為它提供主動(dòng)和/或被動(dòng)尋靶，增加它 的功效。這些治療聚合物實(shí)際上可以用作藥物的載體，或它們也可以發(fā)揮固有的生物活 性。在這些聚合物中，已經(jīng)證實(shí)透明質(zhì)酸(HA)的應(yīng)用是非常有前景的，它的有利特 征使它成為抗腫瘤劑給藥的適當(dāng)載體。在現(xiàn)有技術(shù)(W02004/035629，W02007/014784)中已知的用商品名稱 ONCOFID 表示的HA和抗腫瘤藥物的新生物綴合物，公開了下述特征-克服了與藥物的固有毒性有關(guān)的問題，因?yàn)樗幬锉恢苯訉?dǎo)向腫瘤細(xì)胞，許多腫 瘤表型會(huì)在它們的表面上過表達(dá)HA特異性的受體CD-44 ；-提高了溶解度，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)，脂溶性藥物與諸如HA等強(qiáng)親水分子的連接， 會(huì)顯著增加藥物自身在循環(huán)系統(tǒng)中的溶解度；-克服了經(jīng)典抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的抗性問題；-新的物理化學(xué)特征(諸如例如提高了藥物穩(wěn)定性，因此提高了它在腫瘤部位的 持久性)。SN-38是伊立替康(喜樹堿的一種藥理學(xué)衍生物)的活性代謝物，它的用途涉及 不同類型的腫瘤的治療，諸如黑素瘤，乳腺癌，卵巢腫瘤，胃、肺、腦、胰腺腫瘤和結(jié) 直腸癌。該藥物具有高抗腫瘤活性，但是它不能原樣施用，因?yàn)樗蝗苡谒?，且因?yàn)樵?原因，已經(jīng)用HA化學(xué)地綴合。結(jié)直腸腫瘤是最有攻擊性的腫瘤形式之一，且代表了西方國(guó)家因瘤形成而死亡 的最常見原因之一。結(jié)腸-直腸中癌的形成，是由于內(nèi)襯在該器官上的粘膜層細(xì)胞的失控增殖，它 的病因仍然未知，盡管流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)鑒別出了可能的危險(xiǎn)因素，諸如-飲食習(xí)慣-遺傳因素-腫瘤息肉_腸炎性疾病。已知，結(jié)腸-直腸的癌和腺瘤的前兆生物因子之一是APC (腺瘤性結(jié)腸息肉)基 因。作為家族性結(jié)腸息肉病的原因，該基因的體細(xì)胞突變代表了結(jié)腸的腺瘤和癌的天然 歷史中的第一個(gè)事件。在正常條件下(在沒有瘤形成的情況下)，APC基因位于染色體5上，并編碼胞 質(zhì)蛋白(APC蛋白)，所述蛋白在細(xì)胞周期中細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間相互作用和粘附、 遷移過程以及腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。最熟知的APC蛋白的功能是，它與GSK_3i3蛋白 (糖原合成酶激酶3β蛋白)結(jié)合，調(diào)節(jié)在細(xì)胞質(zhì)中(和因此，在細(xì)胞核中)存在的游離 β-連環(huán)蛋白的數(shù)量上述蛋白實(shí)際上通過在胞質(zhì)水平磷酸化游離的β-連環(huán)蛋白，促進(jìn) 它的降解。連環(huán)蛋白是能使它自身連接到參與細(xì)胞粘附過程的膜蛋白(Ε-鈣粘蛋白)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上的蛋白。E-鈣粘蛋白-β-連環(huán)蛋白細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物的破壞(與非腫瘤細(xì) 胞向贅生細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)的一個(gè)事件)，造成細(xì)胞間粘附能力的喪失，并因此促進(jìn)轉(zhuǎn)移的 形成。許多科學(xué)演示指出了該過程如何發(fā)生在該第一時(shí)相和不同瘤形成的進(jìn)展中，諸如 在乳腺癌、皮膚癌(尤其黑素瘤)、骨癌、腦和甲狀腺癌中，和在頭和頸腫瘤、淋巴系統(tǒng) 腫瘤、肺癌中，和在間皮、食道、胃、結(jié)腸、結(jié)腸-直腸、胰腺、肝、腎、輸尿管和膀 胱、前列腺、子宮內(nèi)膜和卵巢(以及所有其它腹器)的癌癥中。作為該斷言的證據(jù)，在腫 瘤細(xì)胞系中恢復(fù)E-鈣粘蛋白的正常合成/壓力所實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)證實(shí)了惡性腫瘤形式 向未轉(zhuǎn)化表型的逆轉(zhuǎn)，因此不再是腫瘤性的(BirchmeierW.等人，BiochimBiophys Acta， 1994，1198(1) 11-26 ； DeVitaV.等人，CANCER，第 6 版，2001，第 8 章)。在許多癌中，APC基因的突變?cè)斐僧惓５?、無活性的APC蛋白的形成，所述 APC蛋白不能結(jié)合GSK_3i3蛋白，因此也不能調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白，后者因此從細(xì)胞質(zhì)遷 移進(jìn)細(xì)胞核，并在其中積累，與轉(zhuǎn)錄因子(諸如Tcf-4)形成復(fù)合物，所述轉(zhuǎn)錄因子起癌 基因生長(zhǎng)激活劑和細(xì)胞增殖的輔激活因子的作用(c-MYC，細(xì)胞周期蛋白D1)，還造成胞 外蛋白酶(MMP7)的形成，其促進(jìn)侵入過程和皿(參見

圖1)。圖1顯示了正常細(xì)胞 (右)和腫瘤細(xì)胞(左)中β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)的圖解。β-連環(huán)蛋白因此具有癌蛋白的所有特征，而復(fù)合物APC/GSK_3i3由于它的調(diào) 節(jié)β-連環(huán)蛋白活性的能力，被定義為腫瘤抑制因子(Kollings F.等人，Digestion，2002， 66 131-144)。在細(xì)胞核中積累的β-連環(huán)蛋白的快速下調(diào)，實(shí)際上歸因于APC(當(dāng) 沒有突變時(shí))和GSK_3i3蛋白的作用，它們?cè)谝苿?dòng)進(jìn)細(xì)胞核中時(shí)結(jié)合癌蛋白，降解它 和/或把它再運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)水平，在這里它被磷酸化，然后降解(Neufeld K.等人，EMBO reports, 2000，1，6 519-523)。在腫瘤細(xì)胞中不存在該過程，APC/GSK-3 β復(fù)合物在 腫瘤細(xì)胞中是無活性的，因此，連環(huán)蛋白在細(xì)胞核中的數(shù)量和活性的無調(diào)節(jié)，是惡性 瘤形成的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的最重要的事件?；熢谀[瘤的治療中具有基本作用。在結(jié)腸-直腸癌患者的治療中，在轉(zhuǎn)移階 段，已經(jīng)采用了多種治療方法全身化療，局部區(qū)域化療，燒蝕療法和外科手術(shù)?；熖幚泶砹嗽摶颊呷后w可利用的治療可能性的頂點(diǎn)。用化療得到的客觀應(yīng) 答百分比等于20%，具有短應(yīng)答持續(xù)時(shí)間和低百分比的完全應(yīng)答(僅5%)；疾病的穩(wěn)定 是約 30-40% ο近40年來，5-FU是晚期結(jié)腸_直腸癌可利用的唯一治療武器。近年來，在提高轉(zhuǎn)移性腺瘤和結(jié)腸-直腸癌患者的存活時(shí)間的嘗試中，已經(jīng)研 究了與或不與5-FU結(jié)合的新藥物。其中，伊立替康和奧沙利鉬起基礎(chǔ)作用。與僅用 5-FU治療的患者相比，與5-FU結(jié)合的伊立替康，近年來已經(jīng)表現(xiàn)出更大的客觀應(yīng)答百 分比和進(jìn)展時(shí)間，總存活時(shí)間是約17個(gè)月。伊立替康也稱作CPT-11，可以鹽酸化物的形式得到，它通過形成三元藥 物-DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶I復(fù)合物來起作用，所述復(fù)合物是在DNA轉(zhuǎn)錄或復(fù)制操作中將超包 封的DNA分子轉(zhuǎn)化成沒有扭應(yīng)力的DNA分子的酶。含有上述喜樹堿的三元復(fù)合物的形 成，穩(wěn)定化DNA扭曲階段的系統(tǒng)，并確保細(xì)胞不再自我復(fù)制，通過細(xì)胞凋亡造成死亡。伊立替康自身是無活性的，但是氨基甲酸鍵的體內(nèi)水解，導(dǎo)致活性代謝物SN38 的釋放(圖2)，所述SN38是產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的真實(shí)藥物，但是，由于它不溶于水，它的施用需要特定的權(quán)宜之計(jì)。圖2分別顯示了伊立替康《和SN38的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，申請(qǐng)人描述了在W02004/035629和W02007/014784中所述的用 商品名稱ONCOFID 表示的HA-抗腫瘤藥物綴合物的新的生物學(xué)和藥理學(xué)性能，因?yàn)樗?實(shí)質(zhì)上不同于未綴合的參照藥物所表現(xiàn)出的性能，因?yàn)樗碌闹委熀退幮卣?。本發(fā)明因此描述并要求保護(hù)基于ONCOFID 的制劑在促進(jìn)抗增殖(因此抗腫瘤) 治療作用中得到的令人驚奇的且意外的生物學(xué)和藥理學(xué)效應(yīng)，這是由于腫瘤細(xì)胞向未轉(zhuǎn) 化表型的分化/逆轉(zhuǎn)，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。發(fā)明詳述已知，如前指定的ONCOFID 的衍生物會(huì)賦予抗腫瘤藥物有利的特征，諸如 在水中的溶解度、穩(wěn)定性、對(duì)腫瘤組織的選擇性、對(duì)化療抗性的降低和藥理學(xué)功效的增強(qiáng)。已知，最廣泛傳播的致死腫瘤之一是結(jié)直腸癌或腺瘤，在該瘤形成的治療中， 最有效的療法之一是基于腹膜內(nèi)施用CPT-Il的療法。如上面所指出的，已知在這類腫 瘤中，APC基因的突變/失活導(dǎo)致一系列事件，它們導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核積累， 并因此導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子的激活。本發(fā)明描述并要求保護(hù)基于ONCOFID 的新制劑、尤其是用HA-SN38生物綴合 物表示的ONCOFID-S和用HA-多柔比星生物綴合物表示的ONCOFID-D在腫瘤學(xué)領(lǐng)域 中的新治療用途。含有特定濃度的上述生物綴合物的基于ONCOFID-S和ONCOFID-D的制劑實(shí)際 上在結(jié)直腸腫瘤和黑素瘤的體外和體內(nèi)治療中產(chǎn)生了令人驚奇的且完全意外的結(jié)果，具 有與未綴合的藥物完全不同的作用機(jī)理，從而實(shí)現(xiàn)了生物綴合物的不同應(yīng)用，因?yàn)樗?不同于目前認(rèn)為有治療活性的那些的劑量是特別有效的。在實(shí)施例10中指出的對(duì)細(xì)胞增殖的影響的評(píng)價(jià)，已經(jīng)令人驚奇地揭示了 ONCOFID 會(huì)造成可歸因于贅生細(xì)胞分化效應(yīng)的細(xì)胞增殖機(jī)理的阻斷，所述贅生細(xì)胞因 此經(jīng)歷惡性贅生細(xì)胞表型向未轉(zhuǎn)化表型(即非腫瘤的)的逆轉(zhuǎn)過程，這借助于l.APC/GSK_3i3蛋白復(fù)合物的激活，2. β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核中積累的減少；和3.與β _連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白的作用有關(guān)的過程的調(diào)節(jié)，從而重建未轉(zhuǎn)化分 化細(xì)胞特有的細(xì)胞粘附能力和接觸抑制，結(jié)果，不是通過細(xì)胞凋亡(這是已知的，對(duì)于 SN38，則不然)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。在它們的細(xì)胞周期的末期，上述細(xì)胞死亡，不產(chǎn)生 新的轉(zhuǎn)移，且不促成原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。此外，在以后的實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人證實(shí)了 ONCOFID綴合物能從根本上修飾贅生細(xì) 胞的不同生命時(shí)相，造成時(shí)相1(定義為間隙1)和時(shí)相S的急劇減少，增加細(xì)胞在其中
“保持阻斷”的時(shí)相2(定義為間隙2)。該結(jié)果證實(shí)了 ONCOFID綴合物能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì) 胞的所有生命時(shí)相(其中細(xì)胞周期中DNA合成的S時(shí)相大量增加)，使它們分化，并阻 斷新DNA的合成期，從而阻斷活躍的細(xì)胞增殖。從而實(shí)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)過程和轉(zhuǎn)移過 程的阻斷。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢瑢?shí)施例13清楚地證實(shí)了與施用相同劑量的未綴合的藥物相比， ONCOFID-S綴合物的最大體內(nèi)抗-腫瘤功效。
如結(jié)果所示，主題藥物作為瘤形成的新藥理學(xué)療法的應(yīng)用是可行的，因?yàn)?HA-SN38綴合物會(huì)造成SN38的全身毒性的顯著降低，從而增加藥物本身的治療指數(shù)， 因?yàn)樗扇苡谒以诒扰R床常用劑量低得多的劑量更有效。本發(fā)明公開并要求保護(hù)由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物的下 述用途 用于制備使贅生細(xì)胞向未轉(zhuǎn)化的非腫瘤表型分化的試劑，所述試劑用于治療 腫瘤病狀； 用于制備藥劑，所述藥劑用于治療與β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞核積累有關(guān)的腫瘤 病狀； 用于制備藥劑，所述藥劑用于治療與APC-GSK_3i3復(fù)合物的失活有關(guān)的腫瘤 病狀； 用于制備藥劑，所述藥劑用于治療與腫瘤細(xì)胞生命中S時(shí)相的增加有關(guān)的腫 瘤病狀； 用于制備藥劑，所述藥劑用于治療原發(fā)腫瘤或它的轉(zhuǎn)移。分別與β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞核積累、APC-GSK_3i3復(fù)合物的失活和腫瘤細(xì)胞生 命中S時(shí)相的增加有關(guān)的這些腫瘤病狀的實(shí)例是乳腺癌，皮膚癌(尤其黑素瘤)，骨 癌，腦癌，甲狀腺癌和頭和頸腫瘤，淋巴系統(tǒng)腫瘤，肺和間皮癌，食道、胃、結(jié)腸、結(jié) 腸-直腸、胰腺、肝、腎、輸尿管和膀胱、前列腺、子宮內(nèi)膜和卵巢(以及所有其它腹 器)癌°上述藥物可以全身地(靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、淋巴管內(nèi)、皮下或 口服)、鞘內(nèi)地施用，它可以用于局部施用(透皮吸收或通過氣管內(nèi)滴注)，或它可以通 過直接注射直接施用于腫瘤部位(局部區(qū)域治療)。在下面的實(shí)施例中，申請(qǐng)人已經(jīng)證實(shí)，含有諸如SN38 (ONCOFID-S)和多柔比 星(ONCOFID-D)等抗腫瘤藥物的衍生度為1-20%重量/重量的HA綴合物的制備，生 成ONCOFID衍生物，其可溶于水溶液中，且在2-15mg/ml的濃度是有效的。更具體地，借助于使用結(jié)腸腺癌和人黑素瘤的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)研究 (理解作用機(jī)理所必需的)，申請(qǐng)人已經(jīng)證實(shí)了上述生物綴合物的完全意外的生物學(xué)和藥 理學(xué)性能。從這些數(shù)據(jù)可以推論，以不同于參照藥物的細(xì)胞凋亡作用的機(jī)理，阻斷細(xì)胞 增殖，從而使得ONCOFID 的衍生物，即具有新的治療活性且在不同劑量得到高得多的 功效的藥物，用于治療瘤形成，諸如乳腺腫瘤，皮膚腫瘤(尤其黑素瘤)，骨腫瘤，腦腫 瘤，甲狀腺腫瘤和頭和頸腫瘤，淋巴系統(tǒng)腫瘤，肺和間皮的腫瘤，食道、胃、結(jié)腸、結(jié) 腸-直腸、胰腺、肝、腎、輸尿管和膀胱、前列腺、子宮內(nèi)膜和卵巢(以及所有其它腹 器)的腫瘤。為了證實(shí)，申請(qǐng)人提供了體內(nèi)施用綴合物后從外植組織得到的離體研究結(jié) 果，和體內(nèi)研究結(jié)果，它們已經(jīng)揭示了 ONCOFID 的令人驚奇的腫瘤抑制能力。ONCOFID (如前所述的)鑒別出了一組新的生物綴合物，其基于透明質(zhì)酸 (HA)和通過間隔物共價(jià)結(jié)合的抗腫瘤藥物，其包含-抗代謝藥，諸如例如，葉酸類似物(尤其是甲氨蝶呤)，嘧啶類似物(尤其是 5-氟尿嘧啶和1- β -D-阿拉伯糖-呋喃-胞嘧啶，(Ara-C))；-生物堿/天然產(chǎn)物，諸如例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿(長(zhǎng)春花的生物堿)，伊立替康的活性代謝物SN38，紫杉烷類諸如紫杉酚和多西他賽；-抗生素和類似的產(chǎn)物，諸如例如，多柔比星和表柔比星；-生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；- 二萜類化合物；-烷化劑，例如，亞硝基脲類；-鉬的配位絡(luò)合物，諸如例如，碳鉬和順鉬；-合成的激素和抗激素，諸如例如，雌二醇。特別適合本發(fā)明目的的是多柔比星、紫杉酚和伊立替康的代謝物SN38。在本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸的分子量是400至3,000,OOODa，優(yōu)選5,000至 1,000,OOODa,更優(yōu)選30,000至500,OOODa ；它可以是提取的、發(fā)酵的或生物合成的起
源。與間隔物的共價(jià)鍵包含聚合物重復(fù)單元的D-葡糖醛酸的羧基，其百分比范圍是 1-100% (取代度)，它與選擇的分子間隔物的官能團(tuán)形成酯或酰胺鍵，所述間隔物因此 起透明質(zhì)酸和化療藥之間的連接物的作用。間隔劑由含有或不含有雜原子的、直鏈或支 鏈的、脂族、芳脂族、脂環(huán)或雜環(huán)鏈組成，其包含羥基、羧基、羰基、胺基團(tuán)(不包括 酰胼和多肽)、環(huán)氧基團(tuán)、?；取€基、腈、鹵素、酐、異氰酸酯和異硫氰酸酯；優(yōu) 選具有C2-Cltl脂族鏈的羧酸的溴化物、碘化物和氯化物，且更具體地，諸如溴代丙酸、 溴代丁酸、溴代丁醇或溴代丙醇等溴化物。取代度優(yōu)選是1-50%重量/重量，更優(yōu)選 1-25%；對(duì)于與多柔比星的綴合，優(yōu)選3-20%的取代度，而對(duì)于SN38，則優(yōu)選重 量/重量。具體地，ONCOFID-P是HA和紫杉酚之間的綴合物，ONCOFID-S是HA和 SN38之間的綴合物，ONCOFID-D是HA和多柔比星之間的綴合物，且ONCOFID-Pt是 HA和順鉬之間的綴合物。更具體地，ONCOFID-S是HA (具有200kDa的分子量)和先前連接到具有4個(gè) 碳原子的間隔物(諸如溴代丁酸)上的SN38的酯衍生物?；谠诤铣呻A段中使用的摩爾 比，取代度可以是1_15%。在專利申請(qǐng)PCT公開號(hào)W02007/014784的詳細(xì)描述中和在實(shí)施例1_2中，充分 描述了 ONCOFID-S的合成。ONCOFID-D是含有間隔物(諸如溴代丁醇或溴代丙醇)的透明質(zhì)酸通過氨基甲 酸鍵結(jié)合多柔比星形成的酯。在專利申請(qǐng)PCT公開號(hào)W02007/014784的詳細(xì)描述中和在實(shí)施例10中，充分 描述了 ONCOFID-D的合成。在專利申請(qǐng)PCT公開號(hào)W02004/035629中，以前已經(jīng)充分描述了 ONCOFID-P。最后，申請(qǐng)人描述了不同水性藥物制劑的制備，其中已經(jīng)證實(shí)了主題生物綴合 物是特別可溶的(即在有β-環(huán)糊精、葡萄糖或脂質(zhì)體存在下)，但是最重要的是，允許 在治療活性劑量施用有效成分而不存在與主題藥物的生物利用度/溶解度有關(guān)的問題的 制劑，因而具有上面所述的和下面證實(shí)的新的化學(xué)/物理/治療性質(zhì)，從而增加功效。為了純粹例證性的且非限制性的目的，在下文中提供了 ONCOFID制劑的一些制 備實(shí)施例，以及一些體外、離體和體內(nèi)研究的實(shí)施例，它們證實(shí)了上述綴合物的特定生物學(xué)性能。實(shí)施例1具有分子量200kDa的透明質(zhì)酸和具有取代度約8%的SN-38的酯衍生物的制備第一階段將500mgSN_38 溶于 DMF 中。依次加入 0.8866g EDC、0.7011 4-溴 丁酸和最后的0.1163g DMAP。使用CHCl3/CH3CN60/40的混合物，借助于TLC (硅膠60 F254)，監(jiān)視反應(yīng)。約Ih后，認(rèn)為反應(yīng)結(jié)束，加入IOml甲醇，并將混合物攪拌約30'。然后在水 中沉淀產(chǎn)物，過濾，加入CHCl3中，并用H2O洗滌，借助于分液漏斗，用HCKpHM)輕 微酸化。干燥的有機(jī)相產(chǎn)生微黃色產(chǎn)物，將其在重力色譜柱中純化，并使用CHCl3 100% 至CHC13/CH30H 95 5，進(jìn)行梯度洗脫。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotavapor)中干燥回收的BrC4SN38，并靜置干燥過夜。第二階段將1.4347g HATBA(200kDa)(透明質(zhì)酸的四烷基銨或四丁基銨鹽)裝 入3頸玻璃夾套反應(yīng)器中，并在磁力攪拌下，溶于IOOml DMSO中；攪拌混合物至完全 溶解，用恒溫器調(diào)節(jié)反應(yīng)器在38°C。將380mg溶解在DMSO中的中間體BrC4SN38加入HATBA溶液中，并在38 °C 攪拌混合物約48小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入14ml飽和的NaBr溶液，并將混合物攪拌約60分鐘，以完 成TBA-Na陽離子的交換，并得到透明質(zhì)酸鈉。然后用乙醇進(jìn)行沉淀；通過在Gooch 4上 過濾，回收得到的固體，并轉(zhuǎn)移至燒杯，隨后用乙醇洗滌，最后在40°C在真空下干燥。實(shí)施例2具有分子量200kDa的透明質(zhì)酸和具有取代度約3.5%的SN-38的酯衍生物的制
備第一階段將199mg SN-38溶于100ml ACN中，并向該溶液中加入383mg 1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、258mg4-溴丁酸和60mg DMAP。借 助于TLC色譜法(使用含有熒光指示劑的二氧化硅固定相，氯仿-乙腈洗脫液60 40)， 監(jiān)視溶液的趨勢(shì)。通過在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除溶劑，回收產(chǎn)物，并通過二氧化硅柱上的色 譜法進(jìn)行純化。在室溫在高真空下干燥這樣得到的中間體，并最后稱重。第二階段將160mg BrC4SN38中間體溶于20ml NMP中，隨后加入1.2g HATBA在120ml NMP中的溶液(事先用恒溫器調(diào)節(jié)在38 °C )中。在38 °C放置混合物 72h,然后用5ml水和8ml溴化鈉飽和溶液稀釋。將整個(gè)混合物攪拌1小時(shí)，以完成鈉 與TBA離子的交換。然后通過逐滴加入乙醇，沉淀產(chǎn)物，最后通過在乙醇中洗滌進(jìn)行純 化，并在40°C在真空下干燥。實(shí)施例3具有分子量200kDa的透明質(zhì)酸和具有取代度約10%的多柔比星的酯衍生物的制備第一階段稱量770mg鹽酸多柔比星，并溶于120ml含有770 μ 1三乙胺的無水 DMF中，隨后加入560mg事先用N-羥基琥珀酰亞胺活化的3-溴代丁醇。借助于TLC 色譜法(使用含有熒光指示劑的二氧化硅固定相，氯仿-乙醇洗脫液80 20)，監(jiān)視反應(yīng)，15分鐘后認(rèn)為結(jié)束。在去礦物質(zhì)的水中沉淀產(chǎn)物，并通過在Gooch 5上過濾進(jìn)行回 收。將固體殘余物加入CHCl3中，用H2O洗滌，借助于分液漏斗，用HCKpHM)輕微酸化。干燥的有機(jī)相產(chǎn)生暗紅色產(chǎn)物，將其裝入重力色譜柱，并使用CHCl3 100%至 CHC13/CH3CH20H 95 5梯度洗脫，進(jìn)行純化。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotavapor)中干燥回收的中間體BrC30DOX，并靜置干燥過夜。第二階段將964mgHATBA(200kDa)裝入3頸玻璃夾套反應(yīng)器中，并在磁力攪 拌下，溶于IOOml DMSO中；攪拌混合物至完全溶解，用恒溫器調(diào)節(jié)反應(yīng)器在38°C。將550.5mg在DMSO中的中間體:BrC 30Doxo加入HATBA溶液中；維持反應(yīng)物 在38°C攪拌約48小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，逐滴加入8ml飽和的Naft"溶液，并將混合物攪拌約30分鐘，以 完成TBA-Na陽離子的交換，并得到透明質(zhì)酸鈉。然后用乙醇進(jìn)行沉淀；通過在Gooch 4上過濾，回收得到的固體，并轉(zhuǎn)移至燒杯，隨后用乙醇洗滌，最后在40°C在真空下干
O實(shí)施例4具有分子量200kDa的透明質(zhì)酸和具有取代度約12%的鉬化的化合物的酯衍生物 的制備將200mg順式-二氨基(二氯)鉬(II) (0.666mmol)溶于20ml去礦物質(zhì)的水 中，與2當(dāng)量的要轉(zhuǎn)化進(jìn)二胺(二硝酸鹽)鉬(II)中的AgNO3在60。C反應(yīng)6h。然后加 入140mg溴代琥珀酸(0.7mmol)，并在60°C進(jìn)行配體的交換反應(yīng)24h。圖3顯示了中間 體溴代琥珀酸二氨基-鉬的合成流程圖。將合成中間體沉淀，并純化，用于隨后與透明 質(zhì)酸反應(yīng)。將240mg溴代琥珀酸二氨基_鉬(II)溶于20ml DMSO中，并緩慢加入透明質(zhì) 酸四丁基銨鹽(HATBA)在DMSO(1.750g，150ml)中的溶液中。在38°C反應(yīng)48h，然后 加入14ml飽和的NaBr溶液，攪拌約60分鐘，以完成TBA-Na陽離子的交換，并得到透 明質(zhì)酸鈉。然后用乙醇進(jìn)行沉淀；通過在Gooch 4上過濾，回收得到的固體，用乙醇洗 滌，最后在40°C在真空下干燥。通過ICP (電感耦合等離子體)技術(shù)，測(cè)定綴合物的鉬 含量。實(shí)施例5基于在5% w/v葡糖酸酯溶液中的ONCOFID-Pt的溶液的制備將60mg ONCOFID-Pt(如實(shí)施例4所述得到，在羧基殘基上的取代度是3_15% w/w)溶于29ml含有5% w/v葡萄糖的水溶液中。對(duì)溶液進(jìn)行磁力攪拌，直到綴合物完 全溶解；然后使用0.22 μ m注射器，在再生纖維素(RC)消毒過濾器上過濾。在過濾之 前和之后，通過分光光度法，測(cè)定溶液(3mg/ml，按0NC0FID計(jì))的滴定度，以驗(yàn)證過 濾后綴合物的總回收率。實(shí)施例6基于在1.5% w/v β -環(huán)糊精溶液中的0NC0FID-S的藥物制劑將62mg 0NC0FID_S (如前所述得到，在羧基殘基上的取代度是3_15% w/w)溶 于22ml含有1.5% w/v β -環(huán)糊精的水溶液中。對(duì)溶液進(jìn)行磁力攪拌，直到綴合物完全溶解；然后使用0.22 μ m注射器，在再生纖維素(RC)消毒過濾器上過濾。在過濾之前 和之后，通過分光光度法，測(cè)定溶液(2.8mg/ml，按ONCOFID-S計(jì))的滴定度，以驗(yàn)證 過濾后綴合物的總回收率。實(shí)施例7基于在5% w/v葡萄糖溶液中的ONCOFID-S的藥物制劑將56mg ONCOFID_S (如前所述得到，在羧基殘基上的取代度是3_15% w/w)溶 于20ml含有5%w/V葡萄糖的水溶液中。對(duì)溶液進(jìn)行磁力攪拌，直到綴合物完全溶解； 然后使用0.22 μ m注射器，在再生纖維素(RC)消毒過濾器上過濾。在過濾之前和之后， 通過分光光度法，測(cè)定溶液(2.8mg/ml，按ONCOFID-S計(jì))的滴定度，以驗(yàn)證過濾后綴 合物的總回收率。實(shí)施例8基于在5% w/v葡萄糖溶液中的ONCOFID-P的藥物制劑將IOOmg ONCOFID-P (如專禾Ij W02004035629 的實(shí)施例 5、6、7、9 和 10 所述 得到)溶于20ml含有5%w/V葡萄糖的水溶液中。對(duì)溶液進(jìn)行磁力攪拌，直到綴合物完 全溶解；然后使用0.22 μ m注射器，在再生纖維素(RC)消毒過濾器上過濾。在過濾之 前和之后，通過分光光度法，測(cè)定溶液(5mg/ml，按ONCOFID-P計(jì))的滴定度，以驗(yàn)證 過濾后綴合物的總回收率。實(shí)施例9基于在5% w/v葡糖酸酯溶液中的ONCOFID-D的藥物制劑將60mg ONCOFID_D (如前所述得到，在羧基殘基上的取代度是3_15% w/w) 溶于20ml含有5% w/v葡萄糖的水溶液中。對(duì)溶液進(jìn)行磁力攪拌，直到綴合物完全溶 解；然后使用0.22 μ m注射器，在再生纖維素(RC)消毒過濾器上過濾。在過濾之前和 之后，通過分光光度法，測(cè)定溶液(3mg/ml，按ONCOFID-D計(jì))的滴定度，以驗(yàn)證過濾 后綴合物的總回收率。實(shí)施例10生物綴合物ONCOFID-S在結(jié)腸腺癌臨床前模型中的體外實(shí)驗(yàn)該體外實(shí)驗(yàn)的目 的主要是，確定在實(shí)施例2中在水溶液中配制的由與SN38結(jié)合的HA組成的生物綴合物 的活性，以評(píng)價(jià)/對(duì)比ONCOFID衍生物相對(duì)于參照藥物的抗腫瘤活性，從而測(cè)定它們的 與相當(dāng)?shù)目鼓[瘤劑有關(guān)的藥理學(xué)能力和作用機(jī)理。測(cè)試的產(chǎn)品和測(cè)試的有效成分-SN38 對(duì)照參照產(chǎn)品；-ONCOFID-S:與SN38共價(jià)結(jié)合的HA的酯衍生物，在羧基的酯化％ (w/w)是 3.5%。測(cè)試的藥物制劑-將SN28溶于在室溫的由DMSO/CH3CN/EtOH(l() 45 45)組成的混合物中。-如實(shí)施例6所述制備的ONCOFID-S在β_環(huán)糊精中的溶液。使用的細(xì)胞系大鼠DHD/K12/Trb的結(jié)腸的腺癌細(xì)胞表達(dá)HA CD44的受體
實(shí)驗(yàn)方法1)以6xl04細(xì)胞/cm2的濃度，將要檢查的細(xì)胞系涂布在24孔平底平板中；2)24小時(shí)后，將在培養(yǎng)基中適當(dāng)稀釋的待測(cè)溶液加給細(xì)胞；3)處理24或48h后，使用臺(tái)盼藍(lán)(Tripan blue)排除方法，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，染料 被有活力的和有代謝活性的細(xì)胞排出，但是被死亡細(xì)胞保有，它們被染成藍(lán)色。結(jié)果關(guān)于細(xì)胞DHD/K12/Trb的活力與劑量的關(guān)系、以及處理24h后新綴合物 ONCOFID-S的IC50值與未綴合的SN38的IC50值的對(duì)比所得到的結(jié)果，證實(shí)了 ONCOFID-S與SN38相比更大的功效。發(fā)現(xiàn)僅SN38和ONCOFID-S的IC50值分別是 1.4 μ g/ml和0.4 μ g/ml?？紤]到主題綴合物ONCOFID-S是用3.5% (按重量計(jì))的SN38 衍生化，SN38等效物(與HA綴合)的IC50值甚至更低(0.014 μ g/ml)，即活性是參照 藥物的100倍，證實(shí)了當(dāng)與透明質(zhì)酸綴合物時(shí)，它的藥理學(xué)功效的增強(qiáng)。圖4顯示了用0.5 μ g/ml濃度的HA、SN38或ONCOFID-S處理后，細(xì)胞活力圖 與時(shí)間的關(guān)系。由于調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白在結(jié)直腸癌的形成和進(jìn)展中的重要作用，驗(yàn)證了 Oncofid-S處理是否能修飾如前所述的參與上述蛋白的控制過程的分子的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分 布。因此，借助于熒光顯微鏡檢查，分析了 ONCOFID-S處理對(duì)DHD/Trb細(xì)胞中的E-鈣 粘蛋白、β-連環(huán)蛋白、APCeGSK_3i3的細(xì)胞內(nèi)分布的影響。使用上述蛋白的特異性 抗體，并使用與諸如羅丹明和熒光素等熒光染料結(jié)合的第二抗體，使它們顯影。得到的結(jié)果證實(shí)，實(shí)現(xiàn)了生物綴合物Oncofid-S處理的抗增殖作用和因此的抗腫 瘤作用，如圖4所示，這是因?yàn)?APC蛋白禾口 GSK-3 β激酶都易位進(jìn)細(xì)胞核(圖4a)，它們?cè)谶@里能夠借助于磷 酸化(如前面指出的)調(diào)節(jié)連環(huán)蛋白的積累，結(jié)果阻滯細(xì)胞增殖；-β-連環(huán)蛋白從細(xì)胞核(其中，如前所述的，已知積累和激活參與腫瘤細(xì)胞增 殖的癌基因)易位至胞質(zhì)(圖4b)，在這里通過在細(xì)胞膜水平與E-鈣粘蛋白結(jié)合，形成 E-鈣粘蛋白-β-連環(huán)蛋白細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物，它調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，并代表清楚的細(xì)胞分化跡 象；-結(jié)果增加了E-鈣粘蛋白的表達(dá)(圖4b)，即參與細(xì)胞間粘附過程和參與形成 細(xì)胞-細(xì)胞連接的膜蛋白(如已知的，它們?cè)跍y(cè)定接觸抑制和細(xì)胞分化中起基本作用)； E-鈣粘蛋白表達(dá)的增加，實(shí)際上被視作健康結(jié)腸粘膜的非腫瘤上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志；-增加了細(xì)胞角蛋白20的表達(dá)(CK20)，即健康結(jié)腸粘膜的非腫瘤上皮細(xì)胞分化 的第二種標(biāo)志(圖5)。在用未綴合的SN38處理的樣品中，沒有顯示所有上述與細(xì)胞分 化有關(guān)的修飾。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，如圖4所示的用ONCOFID-S處理過的樣品中腫瘤細(xì)胞增 殖的阻滯機(jī)理可以歸因于分化效應(yīng)，而不是象相反對(duì)于SN38已知的通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)大
量細(xì)胞死亡。圖5顯示了通過體外處理誘導(dǎo)的形態(tài)修飾的掃描電子顯微鏡分析(SEM)(針對(duì) 實(shí)驗(yàn)修飾后分析的腫瘤細(xì)胞)，它們證實(shí)了生物綴合物的分化效應(yīng)(腫瘤細(xì)胞向未轉(zhuǎn)化表 型，即非腫瘤的)，因此恢復(fù)了負(fù)責(zé)接觸抑制的細(xì)胞間粘附能力，從而造成腫瘤增殖的阻滯。圖5顯示了處理48h后ONCOFID-S對(duì)CK20表達(dá)和大鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞DHD/K12/ Trb的形態(tài)學(xué)的影響處理后，與未處理的對(duì)照和用透明質(zhì)酸處理過的細(xì)胞培養(yǎng)物相比， 表達(dá)CK20的細(xì)胞數(shù)增加。用生物綴合物處理過的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示出分化的上皮 細(xì)胞的局部特征，諸如更大的基質(zhì)粘附力、更加扁平和存在緊密的細(xì)胞-細(xì)胞連接。Mrk在結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(是CD44受體表達(dá)陽性的)上，在低劑量的ONCOFID-S衍 生物顯示出令人驚奇的抗增殖效應(yīng)，這不歸因于如對(duì)于SN38所觀察到的和已知的細(xì)胞凋 亡的誘導(dǎo)，而是歸因于未轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞(即非腫瘤的)中腺癌細(xì)胞的分化/逆轉(zhuǎn)，因此不 再增殖。它們一旦已經(jīng)結(jié)束它們的細(xì)胞周期，上述細(xì)胞死亡，不會(huì)建立新的轉(zhuǎn)移，也不 會(huì)促進(jìn)瘤形成的生長(zhǎng)。實(shí)施例11生物綴合物ONCOFID-S在結(jié)腸的腺癌臨床前模型中的體外實(shí)驗(yàn)該體外實(shí)驗(yàn)的目的主要是，確定在葡糖酸酯水溶液中配制的具有更高衍生度的 ONCOFID衍生物的活性，以評(píng)價(jià)/對(duì)比相對(duì)于參照藥物的抗腫瘤活性，從而測(cè)定與相當(dāng) 的抗腫瘤劑有關(guān)的藥理學(xué)能力。實(shí)驗(yàn)方案測(cè)試的產(chǎn)品和測(cè)試的有效成分-SN38 對(duì)照參照產(chǎn)品；-ONCOFID-S:與SN38共價(jià)結(jié)合的HA的酯衍生物，在羧基的酯化％ (w/w)是 8%,根據(jù)實(shí)施例1制備。測(cè)試的藥物制劑-將SN28溶于在室溫的由DMSO/CH3CN/EtOH(l() 45 45)組成的混合物中。-如實(shí)施例7所述制備的ONCOFID-S在葡糖酸酯中的溶液。使用的細(xì)胞系大鼠DHD/K12/Trb的結(jié)腸的腺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法1)以6xl04細(xì)胞/cm2的濃度，將要檢查的細(xì)胞系涂布在24孔平底平板中；2)24小時(shí)后，將在培養(yǎng)基中適當(dāng)稀釋的待測(cè)溶液加給細(xì)胞；3)處理24或48h后，使用臺(tái)盼藍(lán)排除方法，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，染料被有活力的和 有代謝活性的細(xì)胞排出，但是被死亡細(xì)胞保有，它們被染成藍(lán)色。MM在下文中以圖形形式(圖6)指出了關(guān)于處理48h后細(xì)胞活力與測(cè)試的 ONCOFID-S的劑量(濃度為0.125，0.25，0.5，1 μ g/ml)的關(guān)系所得到的結(jié)果。250ng/ml的劑量與IC50相對(duì)應(yīng)，并證實(shí)了與根據(jù)實(shí)施例1制備的 ONCOFID-S (IC50等于0.4 μ g/ml,如在實(shí)施例5的結(jié)果中指出的)相比，根據(jù)實(shí)施例2 制備的ONCOFID-S的高得多的功效；結(jié)果，該功效比未綴合的SN38高很多。該結(jié)果可以歸因于與在3.5%衍生化的ONCOFID-S (OF-S)相比，SN38的更高 衍生百分比，即8% (按重量計(jì))。
下文提供的表顯示了 2種具有不同取代度(3.5和8% )的綴合物和綴合的SN38 各自的等效物的IC50，相對(duì)于未綴合的參照藥物SN38。IC50未綴合的SN38 1.4 μ g/mlOF-S 3.5 % w/w 0.4 μ g/mlSN38 等效物 0.014 μ g/mlOF-S 8 % w/w 0.25 μ g/mlSN38 等效物 0.02 μ g/mlMrkONCOFID-S衍生物顯示出的功效是用未綴合的SN38藥物觀察到的功效的5 倍，但是考慮到等效SN38的濃度，證實(shí)了該功效是參照藥物的功效的約70倍。此外， 與具有更小衍生百分比的綴合物的研究的對(duì)比，證實(shí)了在SN38中衍生化的透明質(zhì)酸越 多，ONCOFID-S的功效越高。實(shí)施例12生物綴合物ONCOFID-S在結(jié)腸的腺癌臨床前模型中的體外實(shí)驗(yàn)上述實(shí)驗(yàn)的目的是，研究ONCOFID-S衍生物對(duì)不同細(xì)胞生命時(shí)相的影響，以 評(píng)價(jià)相對(duì)于參照藥物SN38的活性的它的活性。實(shí)驗(yàn)方案測(cè)試的產(chǎn)品和測(cè)試的有效成分-SN38 對(duì)照參照產(chǎn)品；-ONCOFID-S:與SN38共價(jià)結(jié)合的HA的酯衍生物，在羧基的酯化％ (w/w)是 3.5%,根據(jù)實(shí)施例2制備。測(cè)試的藥物制劑-將SN28溶于在室溫的由DMSO/CH3CN/EtOH(l() 45 45)組成的混合物中。-如實(shí)施例7所述制備的ONCOFID-S在葡糖酸酯中的溶液。使用的細(xì)胞系大鼠DHD/K12/Trb的結(jié)腸的腺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例8和9所述。MM使用細(xì)胞熒光測(cè)定類型的分析，測(cè)定了 ONCOFID-S綴合物(在0.5 μ g/ml的濃 度)的效應(yīng)。在藥理學(xué)處理24h后，在用碘化丙啶對(duì)細(xì)胞染色后，通過DNA含量的細(xì)胞 熒光測(cè)定分析，用FACS-Scan (Becton Dickinson)鑒別細(xì)胞時(shí)相。圖7顯示了得到的結(jié)果主題綴合物的處理，造成間隙1和S時(shí)相的急劇縮減， 而間隙2時(shí)相增加，這將ONCOFID與參照藥物區(qū)分開，所述參照藥物相反地增加第一時(shí) 相和S時(shí)相二者。為了評(píng)價(jià)得到的數(shù)據(jù)是否隨時(shí)間持續(xù)，進(jìn)行了沖洗實(shí)驗(yàn)，其中在治療48h后， 將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基，不進(jìn)行處理然后在定義為TO的點(diǎn)、培養(yǎng)24h后(T24)，再次確定細(xì)胞時(shí)相。得到的結(jié)果如圖8所示它們清楚地證實(shí)，即使在藥理學(xué)懸浮液24小時(shí)后，間 隙1和S時(shí)相的阻滯仍然持續(xù)，表明藥物效應(yīng)因此是不可逆的。Mrk在每個(gè)增殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，它的基因組的復(fù)制和細(xì)胞自身的分裂，發(fā)生在 特定的細(xì)胞生命時(shí)相內(nèi)，指示為間隙1、S、間隙2。在間隙1中，細(xì)胞遇到所有那些生 化修飾，它們必須為它準(zhǔn)備在其中合成新DNA的時(shí)相S:在S中，實(shí)際上，生成細(xì)胞的 遺傳物質(zhì)的精確拷貝，它們通過隨后的有絲分裂過程M，分給2個(gè)子代細(xì)胞。在S之后 且在M之前的時(shí)相被定義為間隙2，它是有絲分裂準(zhǔn)備時(shí)相。得到的結(jié)果證實(shí)生物綴合 物ONCOFID怎樣地有效地大幅減少贅生細(xì)胞的最重要的生命時(shí)相活躍地合成新DNA (用于腫瘤隨后的增殖和生長(zhǎng))的S時(shí)相，與非腫瘤細(xì)胞相比，該S時(shí)相在腫瘤細(xì)胞中顯 著增加。因此，在低劑量，已經(jīng)證實(shí)新藥物能以實(shí)質(zhì)上不同于參照藥物SN38的方式阻斷 腫瘤增殖，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)相。實(shí)施例13生物綴合物ONCOFID-D在人黑素瘤臨床前模型中的體外實(shí)驗(yàn)該體外實(shí)驗(yàn)的目的主要是，確定在葡糖酸酯水溶液中配制的衍生物 ONCOFID-D的活性，以評(píng)價(jià)/對(duì)比相對(duì)于參照藥物的抗腫瘤活性，從而測(cè)定與相當(dāng)?shù)目?腫瘤劑(多柔比星)有關(guān)的藥理學(xué)能力。實(shí)驗(yàn)方案測(cè)試的產(chǎn)品和測(cè)試的有效成分-多柔比星對(duì)照參照產(chǎn)品；-ONCOFID-D:與多柔比星共價(jià)結(jié)合的HA的酯衍生物，在羧基的酯化％ (w/ w)是10%，根據(jù)實(shí)施例3制備。測(cè)試的藥物制劑-將多柔比星溶于在室溫的5%w/v葡萄糖溶液中。-如實(shí)施例9所述制備的ONCOFID-D在葡糖酸酯中的溶液。使用的細(xì)胞系表達(dá)HACD44受體的人黑素瘤細(xì)胞M14。實(shí)驗(yàn)方法1)以6xl04細(xì)胞/cm2的濃度，將要檢查的細(xì)胞系涂布在24孔平底平板中；2)24小時(shí)后，將在培養(yǎng)基中適當(dāng)稀釋的待測(cè)溶液加給細(xì)胞；3)處理24小時(shí)后，通過“Live Dead”細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Molecular Probes, Eugene, OR)染色，在共焦顯微鏡檢查中評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。借助于LEICA TCS SP5共焦顯
微鏡進(jìn)行觀察。MM在下文中以圖形形式(圖9)指出了將黑素瘤細(xì)胞系M14處理24h后 ONCOFID-D(OF-D)和未綴合的多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)與劑量(濃度為0.25、 0.5、20 μ g/ml)的關(guān)系。結(jié)論
證實(shí)了黑素瘤細(xì)胞系是CD44受體表達(dá)強(qiáng)陽性的；在共焦顯微鏡檢查中對(duì)細(xì)胞 毒性的評(píng)價(jià)，指示ONCOFID-D能對(duì)該黑素瘤細(xì)胞系發(fā)揮比對(duì)應(yīng)的未綴合的多柔比星更 大的細(xì)胞毒性效應(yīng)。此外，考慮到在生物綴合物ONCOFID-D中綴合的多柔比星的百分 比是10% (按重量計(jì))，該藥物的活性是10倍高。實(shí)施例14在同源結(jié)腸癌系誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型中進(jìn)行的生物綴合物ONCOFID-S的 體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)評(píng)價(jià)為了確認(rèn)ONCOFID衍生物所表現(xiàn)出的高功效，也借助于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在體外細(xì)胞 毒性作用中，將BDIX大鼠用于誘導(dǎo)腹部腫瘤。腹膜內(nèi)接種細(xì)胞系DHD/K12/Trb，實(shí)際 上造成了腹膜癌擴(kuò)散和腫瘤腹水的形成。然后對(duì)比了兩者都是腹膜內(nèi)施用的濃度為40mg/kg的CPT-Il和濃度為40mg/kg 的ONCOFID-S (它相當(dāng)于3.2mg/kg有效成分SN38，該生物綴合物衍生度為8% )的體 內(nèi)抗腫瘤能力。該體內(nèi)研究的目的如下1.評(píng)價(jià)相對(duì)于對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)和/或腹膜腫瘤損害的消退或消失和腹水的觀 察；2.確認(rèn)在體外研究中得到的抗腫瘤效應(yīng)的結(jié)果；3.評(píng)價(jià)處理造成的血液和組織毒性。實(shí)驗(yàn)方案使用的藥物測(cè)試的有效成分-伊立替康 (ο CPT-11)對(duì)照參照產(chǎn)品；-ONCOFID-S:與SN38共價(jià)結(jié)合的HA的酯衍生物，在羧基的酯化％ (w/w)是 8%,根據(jù)實(shí)施例1制備；測(cè)試的藥物制劑-將伊立替康溶于加熱的(70°Cw/v葡糖酸酯溶液中約1小時(shí)。-如實(shí)施例7所述制備的ONCOFID-S在葡糖酸酯中的溶液。測(cè)試的動(dòng)物根據(jù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將36只雄性大鼠BDIX 7周齡(約200g)分成下 述組(每組包含12只動(dòng)物)1.對(duì)照組接種物 DHD/K12/trb。2.CPT-11 組接種物 DHD/K12/trb+CTP_ll 40mg/Kg 腹膜內(nèi)處理。3.ONCOFID-S 組接種物 DHD/K12/trb+ONCOFID_S 40mg/Kg 腹膜內(nèi)處理。穩(wěn)定14天后，給每只大鼠腹膜內(nèi)地接種IxlO6 DHD/K12/trb細(xì)胞。7天后，開始 計(jì)劃的治療性處理，包括4個(gè)治療周期。在最后一次藥理學(xué)處理后7天，處死動(dòng)物。每 周一次，評(píng)價(jià)動(dòng)物可能出現(xiàn)的毒性癥狀(通過測(cè)量體重)和可能出現(xiàn)的腹水。在處死時(shí)， 在所有動(dòng)物中取心內(nèi)樣品，并評(píng)價(jià)藥理學(xué)處理導(dǎo)致的血液學(xué)毒性。取出腫瘤和腹水，并 測(cè)量。將取出的組織在福爾馬林中固定，用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果腹膜癌擴(kuò)散體積的評(píng)價(jià)在處理末期，評(píng)價(jià)腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)；圖10表明，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?T28)的腫瘤平均體積揭示了與未處理的對(duì)照組(15.5cm3)相比，CPT-Il組(5.9cm3)對(duì)處理的良好應(yīng)答和 ONCOFID-S組(1.8cm3)的優(yōu)異應(yīng)答。血件腹水的存在的評(píng)價(jià)血性腹水是由于腹腔腫瘤的擴(kuò)散；在臨床上，它主要與胃腸道和卵巢起源的腫 瘤有關(guān)。引起惡性腹水形成的機(jī)理最主要的是淋巴排泄的堵塞，但是，已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)腹 水液中的腫瘤細(xì)胞濃度較高(> 4.000/mm3)時(shí)，單純它們的存在可以產(chǎn)生腹水，這是由 于刺激效應(yīng)造成化學(xué)介質(zhì)(細(xì)胞因子、組胺、乳酸)的生成。圖11表明，與腫瘤體積結(jié)果完美一致地，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?T28)，在對(duì)照組中取出 的血性腹水的平均體積(腫瘤的)是46.7ml，CPT-Il處理組是21.5ml，且ONCOFID-S 處理組僅1.9ml。應(yīng)當(dāng)指出，盡管100%和83%的對(duì)照組和CPT-Il處理組動(dòng)物具有血性腹水，僅 16%的ONCOFID-S處理組動(dòng)物具有適度量的腹水。血液學(xué)毒性的評(píng)價(jià)圖12解釋了測(cè)試的動(dòng)物的血細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定分析(在T28時(shí))。指出了主要受化 療處理影響的粒細(xì)胞、白血球群體的值。在沒有腹水的ONCOFID-S處理組，沒有觀察到藥理學(xué)毒性導(dǎo)致的白血球減少 癥，而已經(jīng)發(fā)展適度腹水的動(dòng)物具有落在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的許多粒細(xì)胞，從而證實(shí)了本發(fā)明 的主題生物綴合物沒有毒性。Mrk與從體外研究得到的結(jié)果相一致，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了與HA綴合的藥物相對(duì)于游離 藥物的令人驚奇的功效差異。不僅衍生物ONCOFID-S造成腫瘤塊平均減少了 88% (相 對(duì)于CPT-Il處理組的62% )，而且從血液學(xué)毒性數(shù)據(jù)和腹水體積測(cè)量(腫瘤演化的一個(gè) 指標(biāo))可以觀察到主題處理誘導(dǎo)的減少的藥理學(xué)毒性。實(shí)施例15評(píng)價(jià)生物綴合物ONCOFID-S的作用機(jī)理的離體研究為了證實(shí)表現(xiàn)出分化型(而不是細(xì)胞凋亡型)抗增殖效應(yīng)的ONCOFID衍生物的 令人驚奇的生物學(xué)/藥理學(xué)性能，將如上所述誘導(dǎo)的腫瘤外植，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)研允。實(shí)驗(yàn)方法用生理溶液小心地洗滌在取出后立即外植的腫瘤，用緩沖的福爾馬林固定，處 理包埋在石蠟中，切成4μιη厚的切片。在用蘇木精/曙紅染色的切片上進(jìn)行組織學(xué)分 析，并利用用于研究的蛋白的特異性抗體，進(jìn)行免疫學(xué)分析，在結(jié)合過氧化物酶的第二 抗體的輔助下進(jìn)行顯影分析，這可以用光學(xué)顯微鏡實(shí)現(xiàn)。MM從腹膜內(nèi)腫瘤的離體免疫組織化學(xué)分析，證實(shí)了體外得到的生物綴合物作用機(jī) 理的數(shù)據(jù)，所述作用機(jī)理與E-鈣粘蛋白-β-連環(huán)蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)有關(guān)，其用于誘導(dǎo)分 化效應(yīng)，且因此是非增殖的，而不是細(xì)胞凋亡類型。簡(jiǎn)而言之，從離體分析得到的結(jié)果如下1)在從ONCOFID-S處理的動(dòng)物外植的腫瘤中，可以觀察到癌蛋白/腫瘤抑制因子復(fù)合物的表達(dá)模式，它完全類似于在體外使用的細(xì)胞模型中觀察到的模式，指示腫瘤 表型向正常表型的逆轉(zhuǎn)。在從ONCOFID-S處理的動(dòng)物外植的腫瘤中，β-連環(huán)蛋白實(shí) 際上存在從細(xì)胞核向細(xì)胞-細(xì)胞連接的遷移，而APC蛋白和GSK3i3蛋白移動(dòng)進(jìn)細(xì)胞核 中(圖10)。2)在從ONCOFID-S處理的動(dòng)物外植的腫瘤中，E-鈣粘蛋白和CK20(結(jié)腸粘膜 上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物)具有與對(duì)照動(dòng)物相比增加的表達(dá)，正如在體外處理的細(xì)胞模型 中觀察到的。該增加的表達(dá)也是未分化的腫瘤表型向分化的且不再增殖的表型逆轉(zhuǎn)的指 標(biāo)，因?yàn)樗辉偈悄[瘤(圖13)。Mrk結(jié)果，也在體內(nèi)證實(shí)了 ONCOFID衍生物在阻斷細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向未轉(zhuǎn) 化的非腫瘤表型分化中的特殊生物學(xué)/藥理學(xué)性能。對(duì)于到上面的發(fā)明描述，很明顯這些方法可以變動(dòng)修改。這些修改不應(yīng)當(dāng)視作 偏離本發(fā)明的精神和展望，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白的所有修改都包括在下述權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物用于制備分化試劑的應(yīng)用，所 述分化試劑是使贅生細(xì)胞向非腫瘤未轉(zhuǎn)化表型的分化試劑，用于治療腫瘤病狀。
2.由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物用于制備藥劑的應(yīng)用，所述藥 劑用于治療與連環(huán)蛋白的細(xì)胞核積累有關(guān)的腫瘤病狀。
3.由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物用于制備藥劑的應(yīng)用，所述藥 劑用于治療與APC-GSK_3i3蛋白復(fù)合物的失活有關(guān)的腫瘤病狀。
4.由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物用于制備藥劑的應(yīng)用，所述藥 劑用于治療與腫瘤細(xì)胞生命中S時(shí)相的增加有關(guān)的腫瘤病狀。
5.由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物用于制備藥劑的應(yīng)用，所述藥 劑用于治療原發(fā)腫瘤和它的轉(zhuǎn)移。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，作為使與β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞核 積累有關(guān)的和與APC-GSK_3i3蛋白復(fù)合物的失活有關(guān)的腫瘤細(xì)胞向非腫瘤表型分化的試 劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，用于制備藥劑，所述藥劑用于 治療乳腺腫瘤，皮膚腫瘤，骨腫瘤，腦腫瘤，甲狀腺腫瘤和頭-頸腫瘤，淋巴系統(tǒng)腫 瘤，肺和間皮中的腫瘤、食道腫瘤、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤、胰腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、 輸尿管腫瘤和膀胱腫瘤、前列腺腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤和卵巢腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，用于制備藥劑，所述藥劑用于治 療結(jié)腸-直腸腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，用于制備藥劑，所述藥劑用于治療黑素瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，用于制備藥劑，所述藥劑適合 全身、局部施用，或可以直接注射進(jìn)腫瘤部位。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述施用通過靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)、肌肉 內(nèi)、透皮、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、淋巴管內(nèi)給藥，氣管內(nèi)滴注給藥，皮下、口服或局部區(qū)域給 藥來進(jìn)行。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的生物綴合物的應(yīng)用，其中通過間隔物共價(jià)連接透明 質(zhì)酸的抗腫瘤藥物選自抗代謝藥，生物堿/天然產(chǎn)物，抗生素和類似的產(chǎn)物，生物應(yīng) 答調(diào)節(jié)劑，二萜類化合物，亞硝基脲類，烷化劑，鉬的配位絡(luò)合物，合成的激素和抗激
13.根據(jù)權(quán)利要求12的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述藥物是SN38，伊立替康的活性 代謝物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述藥物是抗生素諸如多柔比星。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述藥物是碳鉬或順鉬。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的生物綴合物的應(yīng)用，其中在透明質(zhì)酸羧基處的SN38取代度是 1-15%重量/重量。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的生物綴合物的應(yīng)用，其中在透明質(zhì)酸羧基處的多柔比星取代度 是3-20%重量/重量。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述透明質(zhì)酸具有400至3xl06Da的分子量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述透明質(zhì)酸具有優(yōu)選從5,000至 IxlO6Da的分子量。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的生物綴合物的應(yīng)用，其中所述透明質(zhì)酸具有優(yōu)選從30,000至 0.5x106Da的分子量。
21.藥物制劑，其含有由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物綴合物，以及一種 或多種藥理學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑，該制劑作為贅生細(xì)胞向非腫瘤的未轉(zhuǎn)化表 型的分化劑。
22.藥物制劑，其含有作為有效成分的、由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物 綴合物，以及一種或多種藥理學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑，該制劑用于治療與連 環(huán)蛋白的細(xì)胞核積累有關(guān)的腫瘤病狀。
23.藥物制劑，其含有作為有效成分的、由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生 物綴合物，以及一種或多種藥理學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑，該制劑用于治療與 APC-GSK-3 β蛋白復(fù)合物的失活有關(guān)的腫瘤病狀。
24.藥物制劑，其含有作為有效成分的、由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物 綴合物，以及一種或多種藥理學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑，該制劑用于治療與腫瘤 細(xì)胞生命中S時(shí)相的增加有關(guān)的腫瘤病狀。
25.藥物制劑，其含有作為有效成分的、由與抗腫瘤藥物結(jié)合的透明質(zhì)酸組成的生物 綴合物，以及一種或多種藥理學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑，該制劑用于治療原發(fā)腫 瘤和它的轉(zhuǎn)移。
26.藥物制劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求21-23的生物綴合物，作為使與連環(huán)蛋白的 細(xì)胞核積累有關(guān)的和與APC-GSK_3i3蛋白復(fù)合物的失活有關(guān)的腫瘤細(xì)胞向非腫瘤表型分 化的試劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-26的生物綴合物的水性藥物制劑，其含有環(huán)糊精或脂質(zhì)體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的生物綴合物的水性藥物制劑，其含有1.5%w/V的β-環(huán)糊精。
29.根據(jù)權(quán)利要求21-26的生物綴合物的水性藥物制劑，其含有葡萄糖。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的生物綴合物的水性藥物制劑，其在5%w/v的葡萄糖溶液中。
全文摘要
本發(fā)明描述了生物綴合物在腫瘤學(xué)領(lǐng)域用于治療原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移的新應(yīng)用，所述生物綴合物作為通過透明質(zhì)酸(HA)和化療產(chǎn)品之間的綴合得到的分化劑(在下文中用商品名稱ONCOFID表示)，其中，所述化療產(chǎn)品更具體地是伊立替康、多柔比星、紫杉酚、順鉑和5-氟尿嘧啶(5-FU)。更具體地，在可溶于水的ONCOFID的衍生物的藥物制劑的作用機(jī)理、功效和抗性方面，描述了生物性能。更具體地，本發(fā)明涉及基于ONCOFID-S(HA-SN38綴合物)和ONCOFID-D(HA-多柔比星綴合物)的制劑在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向未轉(zhuǎn)化表型分化中與參照藥物伊立替康(或CPT11，它的活性形式用SN38表示)和多柔比星相比表現(xiàn)出來的令人驚奇的生物學(xué)和藥理學(xué)效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102014966SQ200980116317
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者A·塞拉菲諾, D·雷尼耶, M·卡姆比斯, P·皮埃爾馬奇 申請(qǐng)人:費(fèi)迪亞醫(yī)藥股份公司